用于組織樣本中核酸的局部或空間檢測(cè)的方法和產(chǎn)品的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種組織樣本中的核酸的局部或空間檢測(cè)的方法和產(chǎn)物，尤其是一種對(duì)組織樣本中的核酸的局部檢測(cè)方法，包括（a）提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，所述探針每種在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端，以能以探針作為引物來(lái)引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其中所述捕獲探針的每種都包括核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：（i）定位域，所述定位域與陣列上的探針位置相對(duì)應(yīng)，和（ii）捕獲域；（b）令所述陣列與組織樣本相接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，并允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交；（c）以所述捕獲探針為延長(zhǎng)引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子生成DNA分子，其中所述延長(zhǎng)后或連接后的DNA分子以定位域標(biāo)記；（d）可選地，生成所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記的DNA；（e）從陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；以及（f）直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于組織樣本中核酸的局部或空間檢測(cè)的方法和產(chǎn)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及組織樣本中核酸的局部或空間檢測(cè)。所述核酸可以是RNA或DNA。因此，本發(fā)明提供的方法可用于檢測(cè)和/或分析RNA (例如RNA轉(zhuǎn)錄體)或基因組DNA，以獲取組織樣本(例如個(gè)體細(xì)胞)中有關(guān)基因定位、分布或表達(dá)的空間信息，或確切地說(shuō)，任何基因組變異(不一定非得是基因中的變異)的定位或分布的空間信息。因此，本發(fā)明使空間基因組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究成為可能。
[0002]一種定量和/或定性的方法，能夠分析組織樣本中的基因組序列分布、位置或表達(dá)，其中所述組織樣本中保有空間表達(dá)、分布或定位格局。因此，所述新方法提供了一種實(shí)施“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)”或“空間基因組學(xué)”研究的流程，令使用者能同時(shí)測(cè)定組織樣本中所含的已表達(dá)表達(dá)基因、基因或基因組位點(diǎn)的表達(dá)格局或定位/分布格局。
[0003]具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是基于陣列技術(shù)與高通量DNA測(cè)序技術(shù)的聯(lián)用，捕獲并以定位標(biāo)記來(lái)標(biāo)記組織樣本中的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)，尤其是mRNA或DNA。然后，合成DNA分子，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和分析，以確定該組織樣本的任何部分中哪些基因獲得了表達(dá)。優(yōu)選地，可以同時(shí)獲取該組織樣本中每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)、分開(kāi)、特定的轉(zhuǎn)錄組。因此，本發(fā)明的方法可說(shuō)是提供了組織樣本中個(gè)體細(xì)胞高度并行的綜合轉(zhuǎn)錄組簽名，且不會(huì)丟失所述受測(cè)組織樣本中的空間信息。本發(fā)明還提供了一種實(shí)施本發(fā)明方法的陣列及制作本發(fā)明陣列的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]人體含有超過(guò)1 00萬(wàn)億個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞組成了超過(guò)250個(gè)不同的器官和組織。我們還遠(yuǎn)未理解大腦等復(fù)雜器官的發(fā)育和組織，因此，還有必要利用量化的方法剖析這些組織中所表達(dá)基因的表達(dá)形式，確定控制這些組織發(fā)育和功能的基因。這些器官自身便是分化細(xì)胞的混合體，所述細(xì)胞使得如營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、防御等各種身體機(jī)能得到協(xié)同和維持。因此，細(xì)胞功能取決于該細(xì)胞在特定組織結(jié)構(gòu)中的位置和它與該組織中其它細(xì)胞間直接和間接的相互作用。因此，有必要理清這些相互作用如何在轉(zhuǎn)錄水平上影響組織中的每個(gè)細(xì)胞。
[0005]RNA深度測(cè)序的最新發(fā)現(xiàn)表明，人體細(xì)胞系中的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄體都能被檢測(cè)，且大部分(75%)的人類(lèi)蛋白質(zhì)編碼基因都在大多數(shù)組織中有所表達(dá)。類(lèi)似地，一項(xiàng)針對(duì)1%的人類(lèi)基因組的詳細(xì)研究表明，染色體進(jìn)行的是泛轉(zhuǎn)錄，全部堿基中有大部分被包含在初級(jí)轉(zhuǎn)錄體中。因此，可以說(shuō)該轉(zhuǎn)錄機(jī)制在全局水平上是混雜的。
[0006]眾所周知，轉(zhuǎn)錄體僅是蛋白質(zhì)豐度的近似指標(biāo)，因?yàn)閺娜魏我粋€(gè)轉(zhuǎn)錄體生成的蛋白質(zhì)數(shù)量都受到RNA翻譯、降解速度等的影響。對(duì)此，最近有一項(xiàng)人體器官和組織的免疫分析暗示，組織特異性是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)水平的精確時(shí)間、空間控制來(lái)獲得的，且身體不同組織獲取其獨(dú)有特質(zhì)的途徑，并非通過(guò)控制蛋白質(zhì)表達(dá)的種類(lèi)，而是通過(guò)控制每種蛋白質(zhì)的表
達(dá)數(shù)量。
[0007]然而，接下來(lái)有全局研究比較了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的相關(guān)性，證明全體基因中的大部分都得到了表達(dá)。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體基因產(chǎn)物的RNA變化和蛋白質(zhì)水平間存在高相關(guān)性，這就表明，對(duì)個(gè)體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究對(duì)了解蛋白質(zhì)的功能角色上具有生物學(xué)意義。
[0008]的確，對(duì)生物組織的細(xì)胞組織和表達(dá)格局的分析，是生物醫(yī)學(xué)研究和診斷學(xué)上的里程碑。細(xì)胞組織學(xué)運(yùn)用各種染色技術(shù)，在一個(gè)多世紀(jì)前便首先確定了健康器官的基本結(jié)構(gòu)機(jī)制和常見(jiàn)病理學(xué)變化。該領(lǐng)域的發(fā)展，帶來(lái)了以免疫組織化學(xué)和原位雜交的基因表達(dá)來(lái)研究蛋白質(zhì)分布的可能性。
[0009]但是，愈發(fā)先進(jìn)的組織學(xué)和基因表達(dá)技術(shù)并行發(fā)展，卻導(dǎo)致了成像技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組分析的分離，因而在本發(fā)明提供的方法之前，還沒(méi)有任何將空間分辨率用于全轉(zhuǎn)錄組分析的可行辦法。
[0010]作為原位技術(shù)的替代方式或補(bǔ)充方式，蛋白質(zhì)和核酸的體外分析方法也得到了發(fā)展，即:從完整組織樣本、單一細(xì)胞類(lèi)型或甚至單個(gè)細(xì)胞中提取分子，并在所述提取物中通過(guò)ELISA、qPRC等方法對(duì)特定分子進(jìn)行定量。
[0011]基因表達(dá)分析的最新發(fā)展，為利用微陣列或RNA測(cè)序評(píng)估組織的完整轉(zhuǎn)錄組提供了可能，這些發(fā)展有助于我們對(duì)生物過(guò)程的理解和診斷學(xué)研究。然而，典型的轉(zhuǎn)錄組分析以從整塊組織(或者甚至完整生物體)提取的mRNA為實(shí)施對(duì)象，但是要收集較小的組織區(qū)域或個(gè)體細(xì)胞用于轉(zhuǎn)錄組分析，卻一般非常費(fèi)力、費(fèi)錢(qián)且精確度低。
[0012]因此，大多數(shù)基于微陣列或下一代RNA測(cè)序的基因表達(dá)研究，都采用包含許多細(xì)胞的代表性樣本，由此一來(lái)，研究結(jié)果代表的是受測(cè)基因的平均表達(dá)水平。在某些情況下，除全局基因表達(dá)平臺(tái)外，還對(duì)具有顯著差異的細(xì)胞進(jìn)行了分離(Tang F et al，NatProtoc.2010;5:516-35;Wang D & Bodovitz S,Trends Biotechnol.2010;28:281-90),獲得了關(guān)于細(xì)胞間差異的非常精確的信息。然而，至今為止，還沒(méi)有以高分辨率來(lái)研究完整組織中的轉(zhuǎn)錄活性的高通量方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]因此，基因表達(dá)格局分析的現(xiàn)有技術(shù)一次僅能提供一個(gè)或幾個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄信息，或在提供同一樣本中的所有基因信息的同時(shí)損失其位置信息。因此，顯然需要能夠同時(shí)、分另O、特異測(cè)定樣本中每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的方法，即是說(shuō)，需要能夠提供含空間分辨率的轉(zhuǎn)錄信息的組織樣本全局基因表達(dá)分析方法，而本發(fā)明就滿(mǎn)足了這一需要。
[0014]本發(fā)明中所述方法和產(chǎn)物的創(chuàng)新途徑，采用了目前業(yè)已完善的陣列和測(cè)序技術(shù)來(lái)獲得一個(gè)樣本中全部基因的轉(zhuǎn)錄信息，且同時(shí)保留每個(gè)轉(zhuǎn)錄體的位置信息。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，這顯然是生命科學(xué)中的一個(gè)里程碑。該新技術(shù)開(kāi)創(chuàng)了所謂“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)”的新領(lǐng)域，并可能將對(duì)我們對(duì)所有多細(xì)胞生物的組織發(fā)育和組織、細(xì)胞功能方面的認(rèn)識(shí)帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。顯然，這樣的技術(shù)在促進(jìn)對(duì)疾病狀態(tài)的成因和發(fā)展的理解和開(kāi)發(fā)針對(duì)這些疾病的有效治療措施方面將尤其有用，例如癌癥。本發(fā)明的方法還可應(yīng)用在許多疾病的診斷中。
[0015]雖然如下具體所述，本發(fā)明最初的目的在于轉(zhuǎn)錄組研究，本發(fā)明的原理和方法還可以應(yīng)用于DNA分析，由此也能用于基因組分析(“空間基因組學(xué)”)。由此一來(lái)，在最廣泛意義上，本發(fā)明主要可用于核酸的檢測(cè)和/或分析。
[0016]陣列技術(shù)，特別是微陣列，發(fā)源于斯坦福大學(xué)的研究，該研究將少量DNA寡核苷酸成功地貼附在玻璃表面，呈有序排列，即所謂的“陣列”，并用其監(jiān)控了 45個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄(Schena M et al, Science.1995;270:368-9，371)。
[0017]自此以后，全世界的科學(xué)家們運(yùn)用微陣列技術(shù)已經(jīng)發(fā)表了超過(guò)3萬(wàn)篇論文。多種微陣列被開(kāi)發(fā)出來(lái)，以適應(yīng)各種應(yīng)用，例如，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或基因型或重新測(cè)序突變基因組，且微陣列技術(shù)的一項(xiàng)重要應(yīng)用是基因表達(dá)分析。的確，基因表達(dá)微陣列的發(fā)明目的是用作一種分析特定樣本中已表達(dá)基因材料水平的方法，但其真正的成功卻在于為同時(shí)比較許多基因的表達(dá)水平帶來(lái)了可能。針對(duì)此類(lèi)實(shí)驗(yàn)，市場(chǎng)上有若干現(xiàn)成的微陣列平臺(tái)商品，但也可以制作定制的基因表達(dá)陣列。
[0018]雖然微陣列在基因表達(dá)研究中的應(yīng)用現(xiàn)已普及，但顯然，更加先進(jìn)并全面的所謂“下一代DNA測(cè)序”(NGS)技術(shù)正開(kāi)始替代DNA微陣列在許多應(yīng)用中的位置，例如，深度轉(zhuǎn)錄組分析。
[0019]用于超快速基因組測(cè)序的NGS技術(shù)的開(kāi)發(fā)，是生命科學(xué)中的一座里程碑(Petterson E et al, Genomics.2009;93:105-11)。這些新技術(shù)已經(jīng)急劇地降低了 DNA 測(cè)序的成本，并能在前所未有的速度下測(cè)定高等生物的基因組，包括特定個(gè)體的基因組(WadeCM et al Science.2009; 326:865-7; Rubin J et al, Nature2010; 464: 587-91 )。高通量基因組學(xué)的新進(jìn)展已給生物學(xué)研究格局帶來(lái)了天翻地覆的變化，除基因組完整鑒定外，還能用數(shù)字化定量的方式來(lái)研究全轉(zhuǎn)錄組。近年來(lái)，用于此類(lèi)全方位數(shù)據(jù)組的可視化和整合的生物信息學(xué)工具也得到了顯著的進(jìn)步。
[0020]然而，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于以二維空間分辨率為其信息特征的組織樣本來(lái)說(shuō)，利用細(xì)胞組織學(xué)技術(shù)、微陣列技術(shù)和NGS技術(shù)的獨(dú)特結(jié)合，可從該樣本的多個(gè)細(xì)胞獲得全面的轉(zhuǎn)錄或基因組信息。因此，從一個(gè)極端角度來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法可用于分析樣本中單一細(xì)胞的單一基因的表達(dá)，同時(shí)保留該細(xì)胞在其組織樣本中的空間信息；而從另一個(gè)極端及本發(fā)明的優(yōu)選方面來(lái)說(shuō)，所述方法可用于同時(shí)確定一個(gè)樣本中每個(gè)細(xì)胞，或基本上所有細(xì)胞的每個(gè)基因的表達(dá)，即:一個(gè)組織樣本中的全局空間表達(dá)格局。顯然，本發(fā)明的方法也可用于中間分析。
[0021]以下簡(jiǎn)要說(shuō)明本發(fā)明的最簡(jiǎn)化形式。本發(fā)明需要反轉(zhuǎn)錄(RT)引物，該引物還包括獨(dú)有的定位標(biāo)記(結(jié)構(gòu)域)，并將該引物在如玻璃載片等目標(biāo)基板上排列產(chǎn)生“陣列”。這些獨(dú)有的定位標(biāo)記對(duì)應(yīng)于該RT引物在陣列上的位置(陣列特征)。將組織薄片放置于陣列上，并在目標(biāo)載片上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。該RT引物與組織樣本中的RNA結(jié)合(或雜交)，以結(jié)合的RNA作為模版并延長(zhǎng)獲得cDNA，所得cNDA也因此貼附在所述陣列表面。由于RT引物的獨(dú)一無(wú)二定位標(biāo)記的存在，每個(gè)cDNA序列都載有模版RNA在組織切片中的位置信息。在cDNA合成步驟之前或之后，可通過(guò)染色或拍照等方法令該組織薄片可視化或成像，令cDNA分子中的定位標(biāo)記得以與組織樣本中的某個(gè)位置相關(guān)聯(lián)。對(duì)該cDNA進(jìn)行測(cè)序，獲得含有準(zhǔn)確位置信息的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。該過(guò)程的示意圖如圖1所示。然后，可將測(cè)序數(shù)據(jù)與組織樣本中的某個(gè)位置配對(duì)，令測(cè)序數(shù)據(jù)與組織切片共同可視化，如借由電腦，例如，展示整個(gè)組織上任何感興趣的基因的表達(dá)格局(圖2)。類(lèi)似地，還可以在電腦屏幕上標(biāo)記組織切片的不同區(qū)域，選取任意感興趣的區(qū)域并獲得所選區(qū)域間不同的表達(dá)基因的信息。顯然，本發(fā)明的方法可獲得的數(shù)據(jù)與運(yùn)用研究mRNA群的現(xiàn)有方法獲得的數(shù)據(jù)具有鮮明對(duì)比。舉例來(lái)說(shuō)，基于原位雜交的方法僅能提供單一 mRNA轉(zhuǎn)錄體的相對(duì)信息。因此，本發(fā)明的方法比現(xiàn)有的原位技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的方法可獲得的全局基因表達(dá)信息還可包括共表達(dá)信息和轉(zhuǎn)錄豐度的定量估計(jì)。顯然，本方法是一種廣泛適用的方法策略，可應(yīng)用于任何物種，例如，動(dòng)物、植物和真菌的任何組織的分析。
[0022]如上所述，并將在下文中詳細(xì)論述，該基本方法顯然還可以容易地?cái)U(kuò)展應(yīng)用于基因組DNA分析，例如，用于包含一個(gè)或多個(gè)特異突變的組織樣本的細(xì)胞鑒定。舉例來(lái)說(shuō)，可以將基因組DNA斷裂成片段，并與引物(相當(dāng)于如上所述的RT引物)雜交，該引物能捕獲DNA片段(例如，可在所述DNA片段上連接一個(gè)具有所述引物的互補(bǔ)序列的接合物，或可用酶促等方法延長(zhǎng)DNA片段，向其序列末端加入額外的核苷酸，如poly-A尾，來(lái)生成能與該引物互補(bǔ)的序列)并引導(dǎo)對(duì)捕獲分子的互補(bǔ)鏈的合成。該分析的余下步驟可如上所述。因此，下文中基于轉(zhuǎn)錄體分析的背景來(lái)描述的本發(fā)明具體實(shí)施例，也可在適宜情形下用于基因組DNA的分析方法中。
[0023]從以上說(shuō)明中可以看出，與位置信息結(jié)合的轉(zhuǎn)錄組或基因組信息具有巨大的價(jià)值。舉例來(lái)說(shuō)，它能夠以高分辨率進(jìn)行全局基因表達(dá)繪圖，而這一技術(shù)可應(yīng)用于許多方面，例如包括癌癥研究和診斷學(xué)研究。
[0024]進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，顯然本發(fā)明所述方法與前述用于組織樣本全轉(zhuǎn)錄組分析的方法間具有顯著差異，且這些差異具有眾多優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明基于一項(xiàng)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即:使用組織薄片并不會(huì)干擾由貼附于陣列表面的引物(例如反轉(zhuǎn)錄引物)所引導(dǎo)的DNA (例如，cDNA)的合成。
[0025]因此，在其首要且最廣泛的意義上，本發(fā)明提供一種組織樣本中的核酸局部檢測(cè)方法，包括:
[0026](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類(lèi)所述探針在所述陣列中 各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針能作為引導(dǎo)延長(zhǎng)反應(yīng)或連接反應(yīng)的引物,其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子,所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0027](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和
[0028](ii)捕獲域；
[0029](b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，并允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0030](c)以所述捕獲探針作為延長(zhǎng)引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子上產(chǎn)生DNA分子，其中所述被延長(zhǎng)或連接的DNA分子以定位域標(biāo)記；
[0031 ] (d)可選地，生成所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記DNA ；
[0032](e)從陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或它們的互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；
[0033](f)直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。
[0034]本發(fā)明的方法與本領(lǐng)域其他空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法相比具有顯著優(yōu)勢(shì)。例如，本發(fā)明描述的方法可獲得組織樣本中所有轉(zhuǎn)錄體的全局和空間分布；此外，還可以量化陣列上的每個(gè)位置或特征上的每個(gè)基因的表達(dá)，因此能在一個(gè)簡(jiǎn)單陣列的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上實(shí)施多種分析。因此，本發(fā)明的方法使檢測(cè)和/或量化單一組織樣本的所有基因的空間表達(dá)成為可能。此外，由于轉(zhuǎn)錄體的豐度非直接可視，例如，通過(guò)熒光反應(yīng)，與標(biāo)準(zhǔn)微陣列相似，即使同一樣本中的所述轉(zhuǎn)錄體以迥然相異的濃度存在，也可以測(cè)量單一樣本中的基因表達(dá)。[0035]相應(yīng)地，在另一個(gè)更具體的方面，本發(fā)明可看作提供了一種用于測(cè)定和/或分析組織樣本轉(zhuǎn)錄組的方法，包括:
[0036](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類(lèi)所述探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針能作為反轉(zhuǎn)錄(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0037](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和
[0038](ii)捕獲域；
[0039](b)令所述組織樣本與陣列接觸，以使陣列上的捕獲探針的位置與組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，且允許該組織樣本上的RNA與所述捕獲探針上的捕獲域雜交；
[0040](C)利用所述捕獲探針作為RT引物，從已捕獲的RNA分子生成cDNA分子，且可選地，擴(kuò)增所述cDNA分子；
[0041](d)從陣列表面釋放至少部分所述cDNA分子和/或可選地，其擴(kuò)增子，其中所述被釋放的分子可以是cDNA的 第一和/或第二鏈分子或其擴(kuò)增子，且其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；
[0042](e)直接或間接地分析被釋放分子的序列。
[0043]如下文所述，所述分析步驟中可以采用任何核酸分析方法。典型地，該步驟可以包括測(cè)序，但進(jìn)行序列測(cè)定實(shí)際上并非必要步驟。舉例來(lái)說(shuō)，可以采用序列特異性分析方法。例如，可以實(shí)施序列特異性擴(kuò)增反應(yīng)，比如通過(guò)使用引物，且該引物對(duì)所述定位域和/或一種特定的目標(biāo)序列，例如，一種待測(cè)的特定目標(biāo)DNA (即:與一種特定的cDNA/RNA或基因相對(duì)應(yīng)等)，具有特異性。一種典范性的分析方法是序列特異性的PCR反應(yīng)。
[0044]按照步驟(e)所得到的的序列分析信息可被用于獲得樣本中RNA的空間信息。換句話(huà)說(shuō)，該序列分析信息可以提供有關(guān)樣本中RNA的位置信息。該空間信息可從測(cè)得的序列分析信息的性質(zhì)來(lái)推定，例如，其可以揭示一種特定RNA的存在，而該RNA可能在所用組織樣本的環(huán)境中本身就具有空間信息意義，以及/或者可以結(jié)合陣列上組織樣本的位置和測(cè)序信息來(lái)推定空間信息(例如，空間定位)。因此，本方法可以?xún)H包括將序列分析信息與組織樣本的某個(gè)位置相關(guān)聯(lián)的步驟，例如，利用定位標(biāo)記和其與組織樣本上某位置間的關(guān)聯(lián)性。但是，如上所述，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，可以通過(guò)關(guān)聯(lián)序列分析數(shù)據(jù)和組織樣本圖像來(lái)便利地獲得空間信息。相應(yīng)地，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法還可以包括一個(gè)步驟，即:
[0045](f)將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中該組織樣本在步驟(C)之前或之后成像。
[0046]從其最廣義上來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法可以用于組織樣本中某一核酸的局部檢測(cè)。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可用于測(cè)定和/或分析組織樣本中的全部轉(zhuǎn)錄組或基因組，例如，組織樣本的全轉(zhuǎn)錄組。但是，本方法并不局限于此，而是包括測(cè)定和/或分析全部或部分轉(zhuǎn)錄組或基因組。因此，本方法可以包括測(cè)定和/或分析轉(zhuǎn)錄組或基因組的部分或子集，例如與一個(gè)基因子集相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組，又如，一個(gè)特定基因子集，如與一種特定的疾病或癥狀、組織類(lèi)型等相關(guān)的基因子集。
[0047]從另一方面來(lái)看，如上所述的本方法步驟可以看作是提供了一種用于獲取具有空間限定的轉(zhuǎn)錄組或基因組的方法，特別是含空間限定的組織樣本全局轉(zhuǎn)錄組或基因組。
[0048]從另一方面來(lái)看，本發(fā)明的方法可被看做是一種用于組織樣本中的核酸(即DNA或RNA)的局部或空間檢測(cè)方法，或用于組織樣本核酸(DNA或RNA)的局部或空間測(cè)定和/或分析的方法。特別地，本方法可用于組織樣本中基因表達(dá)或基因組變異的局部或空間檢測(cè)、確定和/或分析。該局部/空間檢測(cè)/確定/分析意味著可對(duì)RNA或DNA在組織樣本的細(xì)胞或組織中的天然位置或位點(diǎn)進(jìn)行定位。因此，舉例來(lái)說(shuō)，可將RNA或DNA定位于樣本上的一個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群或細(xì)胞類(lèi)型，或組織樣本中的特定區(qū)域。所述RNA或DNA的天然位點(diǎn)或位置(或者換句話(huà)說(shuō)，所述RNA或DNA在組織樣本中的位點(diǎn)或位置),例如，一個(gè)已表達(dá)的基因或基因組位點(diǎn)，可得到確定。
[0049]本發(fā)明還可被看作是提供了一種用于本發(fā)明的方法中的陣列，包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類(lèi)所述探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針能作為反轉(zhuǎn)錄(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上含有:
[0050](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和
[0051](ii)捕獲域，用于捕獲與所述陣列相接觸的組織樣本的RNA。
[0052]在一個(gè)相關(guān)方面上，本發(fā)明還提供了一種陣列的用途，該陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類(lèi)所述探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針具有反轉(zhuǎn)錄(RT)引物的功能，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)包括一個(gè)核酸分子，該核酸分子從5’端至3’端的方向上含有:
[0053](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和
[0054](ii)捕獲域；
[0055]用于捕獲與所述陣 列相接觸的組織樣本的RNA。
[0056]優(yōu)選地，所述用途是用于測(cè)定和/或分析組織樣本的轉(zhuǎn)錄組，特別是全轉(zhuǎn)錄組，且進(jìn)一步包括以下步驟:
[0057](a)以所述捕獲探針作為RT引物，從已捕獲的核酸分子生成cDNA分子，且可選地，擴(kuò)增所述cDNA分子；
[0058](b)從所述陣列表面釋放至少部分所述cDNA分子和/或可選地，其擴(kuò)增子，其中所述被釋放的分子可以是cDNA分子的第一和/或第二鏈或其擴(kuò)增子，且其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；
[0059](c)直接或間接地分析被釋放分子的序列；且可選地
[0060](d)將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中所述組織樣本在步驟(a)之前或之后成像。
[0061]因此可知曉，本發(fā)明的陣列可用于捕獲RNA，例如與所述陣列接觸的組織樣本的mRNA。所述陣列還可以用于測(cè)定和/或分析組織樣本的全轉(zhuǎn)錄組或部分轉(zhuǎn)錄組，或用于獲取組織樣本中含空間限定的部分或全局轉(zhuǎn)錄組。本發(fā)明的方法因此可看作組織樣本中一個(gè)和多個(gè)基因的空間表達(dá)的量化方法。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)組織樣本中一個(gè)或多個(gè)基因的空間表達(dá)。再換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的方法可用于同時(shí)測(cè)定組織樣本中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。更進(jìn)一步，本發(fā)明的方法可看作是用二維空間分辨率對(duì)組織樣本進(jìn)行部分或全局轉(zhuǎn)錄組分析的方法。[0062]所述RNA可以是細(xì)胞中存在的任何RNA分子。因此，它可以是mRNA、tRNA、rRNA、病毒 RNA、核內(nèi)小 RNA (snRNA)、核仁小 RNA (snoRNA)、微小 RNA (miRNA)、小干涉 RNA (siRNA)、與Piwi蛋白相互作用的RNA (piRNA)、核糖體RNA、反義RNA或非編碼RNA。但是，優(yōu)選為mRNA ο
[0063]上述方法中(與上述優(yōu)選使用形式中的步驟(a)相對(duì)應(yīng)的)步驟(C)，從已捕獲的RNA為模板生成cDNA,可看作涉及cDNA的合成。其包括已捕獲的RNA的反轉(zhuǎn)錄步驟，以已捕獲的RNA為模板，延長(zhǎng)具有RT引物功能的捕獲探針。該步驟產(chǎn)生所謂的cDNA第一鏈。下面將詳細(xì)敘述，在從陣列上釋放cDNA第一鏈之后，可以可選地在陣列上進(jìn)行cDNA第二鏈的合成，或在一個(gè)分開(kāi)的步驟中進(jìn)行。下面還將詳細(xì)敘述，在某些實(shí)施例中，第二鏈的合成可以發(fā)生在被釋放的cDNA分子第一鏈擴(kuò)增的第一個(gè)步驟中。
[0064]下文將討論及描述陣列在核酸分析中的一般應(yīng)用和在DNA分析中的具體應(yīng)用。在此描述的運(yùn)用于RNA環(huán)境下的陣列和捕獲探針的具體細(xì)節(jié)和實(shí)施方式，(在適當(dāng)情況下)同樣適用于所有此類(lèi)陣列，包括用于DNA的陣列。
[0065]本發(fā)明中的措辭“多種”意為兩種或以上，或至少兩種，例如，3、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、400、500、1000、2000、5000、10000，或更多，等等。因此，
舉例來(lái)說(shuō)，捕獲探針的數(shù)目可以是上述任意兩個(gè)數(shù)字之間的任一整數(shù)。但是，可知曉，根據(jù)設(shè)想，也可以使用含有成百、上千、上萬(wàn)、十萬(wàn)或甚至百萬(wàn)個(gè)捕獲探針的傳統(tǒng)型陣列。
[0066]因此，在此概述的方法采用了高密度核酸陣列，所述陣列含有“捕獲探針”，用以捕獲和標(biāo)記組織樣本中所 有單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄體，，所述組織樣本例如組織樣品薄片，即“切片”。用于分析的組織樣本或切片以高度平行的方式制備，以保存所述切片中的空間信息。每個(gè)細(xì)胞中已捕獲的RNA (優(yōu)選為mRNA)分子，或“轉(zhuǎn)錄組”，被轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行cDNA分析，例如，進(jìn)行高通量測(cè)序?？赏ㄟ^(guò)整合在排布于陣列中的核酸探針上的所謂識(shí)別碼序列(或ID標(biāo)記，在此定義為定位域)，將所得數(shù)據(jù)與切片等原始組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)。
[0067]高密度核酸陣列或微陣列，是在此所述的空間轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記方法的核心部分。微陣列是一種用于分子生物學(xué)的多重技術(shù)。一個(gè)典型的微陣列包括一系列陣列排布的寡核苷酸微點(diǎn)(一個(gè)陣列上可整合成千上萬(wàn)個(gè)微點(diǎn)，通常為上萬(wàn)個(gè))。每個(gè)核酸(寡核苷酸)微點(diǎn)的不同位置(每一種類(lèi)的寡核苷酸/核酸分子)稱(chēng)為“特征”(因此上述方法中捕獲探針的每一種類(lèi)皆可看作是陣列的一個(gè)特定特征；每一特征在陣列上占有不同的位置)，且典型地，每個(gè)單獨(dú)的特征含有皮摩爾(10_12摩爾)量級(jí)的特定DNA序列(一種“種類(lèi)”)，即所稱(chēng)的“探針”(或“報(bào)告子”)。典型情況下，所述探針可以是一小段基因或其他核酸成分，能夠在高嚴(yán)格度的雜交條件下與cDNA或cRNA樣本(即“目標(biāo)”)進(jìn)行雜交。但是，如下所述，本發(fā)明中的探針不同于標(biāo)準(zhǔn)微陣列中的探針。
[0068]在基因表達(dá)微陣列中，以探針為目標(biāo)的雜交反應(yīng)常通過(guò)對(duì)視覺(jué)信號(hào)的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)和量化，例如連接在所有目標(biāo)上的熒光團(tuán)、銀離子或化學(xué)熒光標(biāo)記。該視覺(jué)信號(hào)的強(qiáng)度與樣本中每個(gè)目標(biāo)核酸的相對(duì)豐度有關(guān)。由于一個(gè)陣列可以含有上萬(wàn)個(gè)探針，一個(gè)微陣列實(shí)驗(yàn)可以完成許多基因的并行測(cè)試。
[0069]在標(biāo)準(zhǔn)微陣列中，探針與環(huán)氧硅烷、氨基硅烷、賴(lài)氨酸或聚丙烯酰胺等化學(xué)基質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合附著在固體表面或基板上。典型的基板是玻璃、塑料、硅質(zhì)芯片或載片，但也有其他的已知微陣列平臺(tái)，例如微珠。[0070]探針可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ǜ街诒景l(fā)明的陣列上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，探針通過(guò)化學(xué)固定法固定在基板上，所述化學(xué)固定法可以是基板(支撐材料)和探針間基于化學(xué)反應(yīng)的相互作用。這樣的化學(xué)反應(yīng)一般不依賴(lài)于熱或光的能量輸入，但可以通過(guò)施加熱量(例如給予化學(xué)反應(yīng)的某個(gè)理想溫度)或某波長(zhǎng)的光來(lái)促進(jìn)反應(yīng)。舉例來(lái)說(shuō)，基板上的功能基團(tuán)和探針上的對(duì)應(yīng)功能要素之間可以發(fā)生化學(xué)固定反應(yīng)。探針的此類(lèi)對(duì)應(yīng)功能要素可以是探針?biāo)逃械幕瘜W(xué)基團(tuán)，例如羥基，或另外引入的基團(tuán)。此類(lèi)功能基團(tuán)的一個(gè)例子是胺基。典型情況下，待固定的探針含有功能性胺基，或通過(guò)化學(xué)修飾引入了功能性胺基。此類(lèi)化學(xué)修飾的方法和途徑已被熟知。
[0071]待固定的探針中的所述功能基團(tuán)的定位，可用于控制和塑造探針的結(jié)合行為和/或方向，例如，該功能基團(tuán)可以放置于探針的5’端、3’端或探針序列之中。待固定的探針的典型基板含有能與該探針相結(jié)合的基團(tuán)，例如，能與胺基功能化的核酸相結(jié)合的基團(tuán)。此類(lèi)基板的示例包括羧基、醛類(lèi)或環(huán)氧基板。此類(lèi)材料已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。能在由于引入胺基而具有化學(xué)活性的探針間引發(fā)連接反應(yīng)的功能基團(tuán)，以及陣列基板，都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉。
[0072]可用于探針固定的可選基板可能需要經(jīng)過(guò)化學(xué)活化，例如，對(duì)陣列基板上的功能基團(tuán)的活化。術(shù)語(yǔ)“活化的基板”涉及一種材料，該材料含有能夠相互作用或具有反應(yīng)活性的化學(xué)基團(tuán)，且所述基團(tuán)已通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的化學(xué)修飾步驟建立或啟動(dòng)。例如，一種含有羧基的基板必須經(jīng)過(guò)活化才能使用。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，有現(xiàn)成的含有能與核酸探針已有特定基團(tuán)相反應(yīng)的功能基團(tuán)的基板。
[0073]可選地，所述探針可以直接在基板上合成。此類(lèi)方法的適當(dāng)步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如,Agilent Inc.>Affymetrix Inc.、Roche Nimblegen Inc.或 Flexgen BV PJf開(kāi)發(fā)的制造技術(shù) 。典型情況下，采用激光和鏡組對(duì)待添加核苷酸的微點(diǎn)進(jìn)行特定活化。此類(lèi)方法可以提供如30 μ m或以上的光斑大小(即特征)
[0074]因此，所述基板可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何適當(dāng)基板。該基板可以采取任何恰當(dāng)?shù)男问交蚋袷剑?，可以是扁平的，或彎曲的，如相?duì)于組織樣本和基板發(fā)生相互作用的區(qū)域凸起或凹進(jìn)。特別優(yōu)選地，基板是一種平面，即二維的芯片或載片。
[0075]典型地，基板是固相載體，因此基板上的探針能獲得準(zhǔn)確并可追溯的定位?；宓囊粋€(gè)示例是含有功能性化學(xué)基團(tuán)的固相材料或基板，所述化學(xué)基團(tuán)為例如胺基或胺基功能化基團(tuán)。本發(fā)明所設(shè)想的基板為無(wú)孔基板。優(yōu)選的無(wú)孔基板為玻璃、硅、聚賴(lài)氨酸涂層材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環(huán)狀烯烴共聚物(COCs )、環(huán)狀烯烴高分子(COPs )、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。
[0076]可采用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的適當(dāng)材料。典型情況下采用的是玻璃或聚苯乙烯。聚苯乙烯是疏水性材料，適合用于結(jié)合負(fù)電荷大分子，因?yàn)槠渫ǔ缀醪缓H水性基團(tuán)。對(duì)于固定于玻璃載片上的核酸來(lái)說(shuō)，進(jìn)一步已知，通過(guò)增加玻璃表面的疏水性，可增進(jìn)核酸固定。這一增進(jìn)可允許相對(duì)來(lái)說(shuō)更為密集的陣型。除聚賴(lài)氨酸涂層或表面處理外，該基板，尤其是玻璃基板，還可以進(jìn)行硅烷化處理，例如，進(jìn)行環(huán)氧硅烷或氨基硅烷處理，烷化處理，或聚丙烯酰胺處理。
[0077]市場(chǎng)上有若干現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)陣列商品，其特征的數(shù)量和大小都可以變化。本發(fā)明中，特征的排列可隨著不同組織或器官所具有的細(xì)胞尺寸和/或密度而改變。例如，典型的動(dòng)物細(xì)胞橫斷面在1-100 μ m左右，而典型的植物細(xì)胞的橫斷面可能在1-10000 μ m范圍內(nèi)變化。因此，對(duì)動(dòng)物或真菌的組織樣本，優(yōu)選采用具有多達(dá)210萬(wàn)特征或420萬(wàn)特征，且特征大小為13微米的Nimblegen?|陣列，而對(duì)植物組織樣本來(lái)說(shuō)，其他格式，例如8x130k特征的格式就足夠了。對(duì)于序列分析，尤其是NGS技術(shù)，也有現(xiàn)成的商品陣列，或已知可用于此領(lǐng)域的商品陣列。此類(lèi)陣列亦可用作本發(fā)明范圍中的陣列表面，例如，Illumina微珠陣列。除本身可以定制化的現(xiàn)成商品陣列外，還可以制作定制或非標(biāo)準(zhǔn)的“自制”陣列，且制作陣列的方法已經(jīng)完善確立。無(wú)論標(biāo)準(zhǔn)和非標(biāo)準(zhǔn)陣列，只要含有下文定義的探針，便可在本發(fā)明的方法中使用。
[0078]優(yōu)選地，取決于陣列的化學(xué)基質(zhì)，微陣列上的探針通過(guò)5’或3’端固定在陣列上，即:附著或結(jié)合于陣列上。典型情況下，對(duì)于可購(gòu)得的商品陣列來(lái)說(shuō)，探針通過(guò)3’端的連接實(shí)現(xiàn)附著，因此留下5’端為自由端。但是，也有通過(guò)5’端的連接實(shí)現(xiàn)附著，留下3’端為探針自由端的陣列，且如本發(fā)明其他部分所述，此類(lèi)陣列可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以合成。
[0079]將核酸探針連接在陣列基板上的共價(jià)鍵，既可看作直接連接，也可看作間接連接，因?yàn)殡m然探針的附著是通過(guò)“直接”的共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)的，但可能存在某些化學(xué)部分或連接物，將核酸探針的“第一個(gè)”核苷酸從玻璃或硅質(zhì)等材料的基板上分隔開(kāi)，即:間接連接。就本發(fā)明的目的而言，利用共價(jià)鍵和/或化學(xué)連接物固定到基板上的探針，一般看作是直接固定或附著于基板上。
[0080]本發(fā)明的捕獲探針可以直接或間接固定于陣列或與陣列相互作用，對(duì)此，下文中將會(huì)更詳細(xì)地加以描述。因此，捕獲探針無(wú)需直接結(jié)合在陣列上，而是可以間接地相互作用，例如，與一個(gè)直接或間接地結(jié)合在陣列上的分子相結(jié)合(例如，捕獲探針可以和捕獲探針結(jié)合伴侶相互作用(例如，結(jié)合或與之雜交)，所述結(jié)合伴侶即直接或間接結(jié)合在陣列上的表面探針)。但是，一般來(lái)說(shuō)，捕獲探針將直接或間接(通過(guò)一種或多種中間媒介)地結(jié)合或固定在陣列上。
[0081]本發(fā)明的用途、方法和陣`列可以包括通過(guò)5’或3’端固定的探針。但是，當(dāng)捕獲探針直接固定到陣列基板上時(shí)，其采用的固定方式必須保證捕獲探針的3’端可供自由延長(zhǎng)，例如，通過(guò)5’端固定該探針?？梢蚤g接固定該捕獲探針，以使其具有自由的3'端，即可供延長(zhǎng)的3’端。
[0082]已延長(zhǎng)或可延長(zhǎng)的3’端，意味著可以將更多的核苷酸添加于核酸分子(例如捕獲探針)的3’端末端核苷酸上，以延長(zhǎng)核酸分子的長(zhǎng)度，即:利用標(biāo)準(zhǔn)聚合反應(yīng)來(lái)延長(zhǎng)核酸分子，例如，利用聚合酶催化的模版化聚合反應(yīng)。
[0083]因此，在一個(gè)實(shí)施例中，陣列含有以其3’端直接固定的探針，即下文中定義的所謂表面探針。每一種類(lèi)的表面探針都含有與一種種類(lèi)的捕獲探針互補(bǔ)的區(qū)域，以能令捕獲探針與表面探針雜交，形成具有自由可延長(zhǎng)的3’端的捕獲探針。本發(fā)明的一種優(yōu)選方面中，若陣列含有表面探針，則在陣列上原位合成捕獲探針。
[0084]陣列探針可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸，以及能夠參與Watson-Crick或類(lèi)似類(lèi)型的堿基互配反應(yīng)的合成核苷酸殘基所組成。因此，所述核酸可以是DNA或RNA或其任何修飾產(chǎn)物，例如，PNA或其他含有非核苷酸骨架的衍生物。但是，在轉(zhuǎn)錄組分析環(huán)境中，捕獲探針的捕獲域必須能夠引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成與已捕獲的RNA分子互補(bǔ)的cDNA。下文中會(huì)進(jìn)一步詳細(xì)敘述，在基因組分析環(huán)境中，捕獲探針的捕獲域必須能夠與DNA片段結(jié)合，結(jié)合對(duì)象可以是DNA片段上添加的結(jié)合域。在一些實(shí)施例中，所述捕獲探針的捕獲域可以引導(dǎo)DNA延長(zhǎng)(聚合酶)反應(yīng)，生成與已捕獲的DNA分子互補(bǔ)的DNA。在其他一些實(shí)施例中，捕獲域可以作為模版參與已捕獲的DNA分子和直接或間接固定于基板上的表面探針間的連接反應(yīng)。在其他一些實(shí)施例中，捕獲域可以連接至已捕獲的DNA分子的其中一條鏈上。
[0085]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲探針至少在其捕獲域中含有或只含有脫氧核糖核苷酸(dNTPs )。在一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施例中，整個(gè)捕獲探針都含有或只含有脫氧核糖核苷酸。
[0086]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲探針直接固定在陣列基板上，即:通過(guò)其5’端固定，其3’端自由可延長(zhǎng)。
[0087]本發(fā)明的捕獲探針含有至少兩種結(jié)構(gòu)域，即捕獲域和定位域(或特征標(biāo)識(shí)標(biāo)簽或特征標(biāo)識(shí)域；可選地，所述定位域可定義為標(biāo)識(shí)(ID)域或標(biāo)簽，或定位標(biāo)簽)。捕獲探針可以進(jìn)一步含有如下文中定義的通用域。當(dāng)捕獲探針通過(guò)與表面探針雜交而間接附著于陣列表面時(shí)，捕獲探針需有與表面探針互補(bǔ)的序列(例如，一個(gè)部分或結(jié)構(gòu)域)。此類(lèi)互補(bǔ)序列可以與表面探針的定位/標(biāo)識(shí)域和/或通用域互補(bǔ)。換句話(huà)說(shuō)，定位域和/或通用域可以構(gòu)成探針上與表面探針互補(bǔ)的區(qū)域或部分。但是，捕獲探針還可以含有與表面探針互補(bǔ)的附加域(或區(qū)域、部分或序列)。如下文所述，為便于合成，此類(lèi)與表面探針互補(bǔ)的區(qū)域可以是捕獲域中的部分或捕獲域的延長(zhǎng)部分(此類(lèi)部分或延長(zhǎng)部分自身不用于或不能夠與RNA等目標(biāo)核酸結(jié)合)。
[0088]典型的捕獲域位于捕獲探針的3’端，且含有可供延長(zhǎng)的自由3’端，例如，通過(guò)模版化的聚合反應(yīng)。捕獲域含有能夠跟與陣列接觸的組織樣本中的細(xì)胞的核酸雜交的核苷酸序列，所述核酸例如RNA (優(yōu)選為mRNA )。
[0089]優(yōu)選地，可以對(duì)捕獲域進(jìn)行選擇或設(shè)計(jì)，使其可以選擇性或特異性地結(jié)合(或更寬泛地說(shuō)，可以有能力結(jié)合)特定核酸，例如所需檢測(cè)或分析的RNA。舉例來(lái)說(shuō)，捕獲域可以經(jīng)過(guò)選擇或設(shè)計(jì)來(lái)選擇性地捕獲mRNA,如本領(lǐng)域中熟知,基于與mRNA的poly-A尾的雜交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲域含有poly-T DNA寡核苷酸，即:一系列以磷酸二酯鍵連接的連續(xù)脫氧胸腺喃唳核苷殘基，能夠與mRNA的poly-A尾雜交。可選地,捕獲域可以含有與poly-T功能類(lèi)似或結(jié)構(gòu)類(lèi)似的核苷酸,即有能力選擇性地與poly-A選擇性結(jié)合的核苷酸，例如Poly-U寡核苷酸，或由脫氧胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物組成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸保留了與poly-A結(jié)合的功能特性。在一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲域，或更具體地說(shuō)，捕獲域的poly-T元件，含有至少10個(gè)核苷酸，優(yōu)選為至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，捕獲域，或更具體地說(shuō)，捕獲域的poly-T元件，含有至少25、30或35個(gè)核苷酸。
[0090]如本領(lǐng)域所知，捕獲核酸還可以用隨機(jī)序列，例如，隨機(jī)六聚體或類(lèi)似序列，因此，此類(lèi)隨機(jī)序列可用于組成全部或部分捕獲域。舉例來(lái)說(shuō)，隨機(jī)序列可與poly-T (或poly-T類(lèi)似物等)序列共同使用。因此，含有poly-T (或“poly-T類(lèi)似物”)寡核苷酸的捕獲域，還可以含有隨機(jī)寡核苷酸序列。例如，所述隨機(jī)寡核苷酸序列可以位于poly-T序列的5’或3’端方向，例如位于捕獲探針的3’端，但此類(lèi)隨機(jī)序列的位置并無(wú)關(guān)鍵意義。這樣的結(jié)構(gòu)有利于捕獲mRNA的poly-A尾的起始端。可選地，捕獲域可以整個(gè)是隨機(jī)序列。再者，如本領(lǐng)域所知原理，還可以使用簡(jiǎn)并捕獲域。
[0091]捕獲域能夠選擇性地與所需的核酸亞型或子類(lèi)結(jié)合，舉例來(lái)說(shuō)，RNA，例如某個(gè)特定種類(lèi)的RNA，如前述列舉的mRNA或rRNA等；或者，能夠與指定RNA類(lèi)型的特定子集結(jié)合，例如，一種特定的mRNA，如與某一特定基因或基因群對(duì)應(yīng)的mRNA。此類(lèi)捕獲探針可以基于想要捕獲的RNA的序列來(lái)選擇或設(shè)計(jì)，因此可以是針對(duì)特定RNA目標(biāo)或群體目標(biāo)(目標(biāo)群等)的序列特異性捕獲探針。因此，按照本領(lǐng)域熟知的原理，所述捕獲探針可以是基于特定基因序列或特定序列基元或共有/保守序列等。
[0092]一些實(shí)施例中，捕獲探針通過(guò)例如與表面探針的雜交而間接固定于陣列基板上，其捕獲域可以進(jìn)一步含有能夠與表面探針的5’端雜交的一個(gè)上游序列(位于與RNA等組織樣本核酸雜交的序列的5’端方向)。單獨(dú)來(lái)看，捕獲探針的捕獲域可以看作是捕獲域寡核苷酸，在捕獲探針間接固定在陣列上的實(shí)施例中，所述捕獲域寡核苷酸可用于捕獲探針的合成。
[0093]捕獲探針的定位域(特征標(biāo)識(shí)域或特征標(biāo)識(shí)標(biāo)簽)位于捕獲域的直接上游或間接上游，即靠近捕獲探針核酸分子的5’端。優(yōu)選地，定位域與捕獲域直接相鄰，即捕獲域和定位域之間沒(méi)有間隔序列。在一些實(shí)施例中，定位域構(gòu)成捕獲探針的5’端，能直接或間接固定在序列基板上。
[0094]如上文論述，陣列的每一特征(即不同位置)都含有一種核酸探針的微點(diǎn)，其中每個(gè)特征中存在的定位域都是獨(dú)一無(wú)二的。因此，探針“種類(lèi)”根據(jù)其具有的定位域來(lái)限定；同一種類(lèi)的捕獲探針具有同樣的定位域。但是，并不要求一個(gè)種類(lèi)下的每個(gè)捕獲探針都具有完全相同的序列。特別是，由于捕獲域可以是或可以含有隨機(jī)或簡(jiǎn)并序列，因此一個(gè)種類(lèi)中的個(gè)體探針的捕獲域可能多種多樣。相應(yīng)地，一些實(shí)施例中，捕獲探針的捕獲域相同，每個(gè)特征中存在單一的探針序列，但是在另一些實(shí)施例中，捕獲探針則各不相同，一個(gè)探針?lè)N類(lèi)下的成員不會(huì)含有一模一樣的序列，雖然該種類(lèi)中每個(gè)成員的定位域序列是相同的。需要滿(mǎn)足的要求是:陣列的每個(gè)特征或位置各自具有單一種類(lèi)的捕獲探針(具體來(lái)說(shuō)，每一特征或位置載有的捕獲探針具有等同的定位標(biāo)簽，即每個(gè)特征或位置上具有單一定位域)。每個(gè)種類(lèi)的探針具有不同的定位域，以區(qū)分種類(lèi)。但是，一個(gè)種類(lèi)下的每個(gè)成員，在一些情況下，如在此進(jìn)一步詳細(xì)敘述所說(shuō)，可以具有不同的捕獲域，因?yàn)椴东@域可以是隨機(jī)或簡(jiǎn)并的，或含有隨機(jī)或簡(jiǎn)并的組件。這意味著，在一個(gè)指定的特征或位置上，探針的捕獲域可以不同。
[0095]因此，在其中一些實(shí)施例，但不一定是全部實(shí)施例中，固定在特定特征上的任一探針?lè)肿优c固定于同一特征的其他探針?lè)肿泳哂邢嗤暮塑账嵝蛄?，但每個(gè)特征上的探針與固定在其他各特征的探針的核苷酸序列彼此之間各不相同、差別迥異或可以區(qū)別。優(yōu)選地，每個(gè)特征含有一種不同種類(lèi)的探針。但是，在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，可以制作一個(gè)含有相同種類(lèi)探針的特征群，即制造一個(gè)有效覆蓋陣列某一區(qū)域的特征，該特征大于單一特征，例如，可降低陣列的解析度。在該陣列的其他實(shí)施例中，一個(gè)特定特征上固定的任一探針?lè)肿涌梢院凸潭ㄔ谕惶卣鞯钠渌结樂(lè)肿泳哂邢嗤亩ㄎ挥蚝塑账嵝蛄校洳东@域可以不同。但是，捕獲域通?？梢栽O(shè)計(jì)成捕獲相同種類(lèi)的分子，例如mRNA。
[0096]捕獲探針的定位域(或標(biāo)簽)含有專(zhuān)屬于每個(gè)特征的序列，充當(dāng)定位或空間標(biāo)記(標(biāo)識(shí)標(biāo)簽)。這樣一來(lái)，通過(guò)將某一細(xì)胞中的核酸如RNA (例如轉(zhuǎn)錄體)等連接到陣列中捕獲探針的獨(dú)有定位域序列上，就能利用所述陣列的全陣列空間解析度辨識(shí)組織樣本的每個(gè)區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，例如組織中的每個(gè)細(xì)胞。通過(guò)定位域，陣列中的捕獲探針可以與組織樣本的某一位置相關(guān)聯(lián)，例如，可以與樣本中的某一細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。因此，捕獲探針的定位域可被看作是核酸標(biāo)簽(標(biāo)識(shí)標(biāo)簽)。
[0097]任何合適的序列都可以用作本發(fā)明的捕獲探針的定位域。合適的序列的意思是，其作為定位域，不會(huì)干涉(即抑制或扭曲)組織樣本的RNA和捕獲探針的捕獲域之間的反應(yīng)。例如，定位域應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)為不具有與組織樣本中的核酸分子相雜交的特異性。優(yōu)選地，捕獲探針定位域的核酸序列與組織樣本核酸序列之間的序列一致性低于80%。優(yōu)選地，捕獲探針的定位域與組織樣本中大部分的核酸分子的序列一致性低于70%、60%或40%。序列一致性可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法測(cè)定，例如，使用BLAST比對(duì)算法。
[0098]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，每種捕獲探針的定位域都含有獨(dú)一無(wú)二的識(shí)別碼序列。識(shí)別碼序列可以通過(guò)隨機(jī)序列生成。接下來(lái)，所述隨機(jī)生成的序列可通過(guò)映射于所有種類(lèi)的常見(jiàn)參考基因組和預(yù)設(shè)的Tm間隔、GC含量和與其他識(shí)別碼序列間的限定距差來(lái)進(jìn)行嚴(yán)格篩選，以保證識(shí)別碼序列不會(huì)對(duì)核酸捕獲過(guò)程形成干涉，例如不會(huì)對(duì)來(lái)自組織樣本的RNA的捕獲形成干涉，并且識(shí)別碼序列之間能夠毫無(wú)困難地相互區(qū)分。
[0099]如上所述,在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲探針還包括一個(gè)通用域(或連接域或連接標(biāo)簽)。捕獲探針的通用域位于定位域的直接上游或間接上游，即靠近捕獲探針核酸分子的5’端。優(yōu)選地，通用域與定位域直接相鄰，即定位域和通用域之間沒(méi)有間隔序列。在一些實(shí)施例中，捕獲探針含有通用域，所述通用域形成捕獲探針的5’端，用以直接或間接固定在陣列基板上。
[0100]本發(fā)明的方法和用途中，通用域可以有多種用途。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法包括從陣列表面釋放(例如移除)至少一部分已合成的(即已延長(zhǎng)或連接的)核酸(例如cDNA)分子的步驟。如本發(fā)明其它部分所述，這一步驟可以用多種方法實(shí)現(xiàn)，其中一種方法包括將核酸(例如cDNA)分子從陣列表面上剪切下來(lái)。因此，通用域自身可以含有一個(gè)剪切域，即:可以通過(guò)化學(xué)方法，或優(yōu)選地，通過(guò)酶促方法，進(jìn)行特異剪切的序列。
[0101]因此，剪切域可以含有可被一個(gè)或多個(gè)具有核酸分子剪切功能(即有能力斷開(kāi)兩個(gè)或以上核苷酸之間的磷酸二酯鍵)的酶所識(shí)別的序列。例如，剪切域可以含有限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)識(shí)別序列。限制性酶在稱(chēng)為“限制性位點(diǎn)”的特異識(shí)別核酸序列處切斷雙鏈或單鏈DNA，適用的酶為本領(lǐng)域所熟知。例如，特別優(yōu)選地，可以使用稀有剪切限制酶，即具有長(zhǎng)限制性位點(diǎn)(長(zhǎng)度至少為8個(gè)堿基對(duì))的酶，以降低誤剪cDNA等核酸分子上其他位置的可能性。在此方面，可知曉，移除或釋放至少部分cDNA等核酸分子，需釋放的部分為cDNA等核酸分子中含有定位域的部分及其下游的整個(gè)序列，即:定位域后3’端方向的整個(gè)序列。因此，cDNA等核酸分子的剪切應(yīng)當(dāng)在定位域的5’端方向?qū)嵤?br> [0102]舉例來(lái)說(shuō)，剪切域可以含有po I y-U序列，對(duì)所述po I y-U序列的剪切可以用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和市場(chǎng)上稱(chēng)為USER?酶的DNA糖基化酶-裂解酶核酸內(nèi)切酶VIII。
[0103]剪切域的進(jìn)一步運(yùn)用示例可見(jiàn)于捕獲探針間接(即通過(guò)表面探針)固定在陣列基板上的實(shí)施例。其中，剪切域可以含有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的核苷酸，即:表面探針的互補(bǔ)部分和捕獲探針并非100%互補(bǔ)。此類(lèi)錯(cuò)配通過(guò)例如MutY和T7核酸內(nèi)切酶I來(lái)識(shí)別，結(jié)果為對(duì)錯(cuò)配位點(diǎn)的核酸分子的剪切。[0104]本發(fā)明的一些實(shí)施例中，捕獲探針的定位域含有剪切域，其中所述剪切域位于定位域的5’端。
[0105]通用域還可以含有擴(kuò)增域，作為剪切域的附加或替代部分。本發(fā)明的一些實(shí)施例中，如本發(fā)明其他部分所述，優(yōu)選地，可以在核酸分子(如cDNA)從陣列基板釋放(例如移除或切除)后對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。但是可知曉，擴(kuò)增的初始循環(huán)，或者以及其后的任一或全部的后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)還可以在陣列上原位實(shí)施。擴(kuò)增域含有能與擴(kuò)增引物雜交的獨(dú)特序列。優(yōu)選地，每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針的通用域的擴(kuò)增域相同。因此，一次擴(kuò)增反應(yīng)將足以擴(kuò)增所有核酸分子(如cDNA等)(無(wú)論所述核酸分子是否在擴(kuò)增反應(yīng)前從陣列基板上釋放)。
[0106]任何合適的序列都可用作本發(fā)明的捕獲探針的擴(kuò)增域。“合適的序列”的意思是，其作為擴(kuò)增域不會(huì)干涉(即抑制或扭曲)組織樣本核酸(如RNA等)和捕獲探針的捕獲域之間的相互作用。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，所述擴(kuò)增域應(yīng)當(dāng)含有與組織樣本核酸(如RNA)的任何序列不同或大體不同的序列，以保證擴(kuò)增反應(yīng)的引物在反應(yīng)的擴(kuò)增條件下僅能同擴(kuò)增域雜交。
[0107]舉例來(lái)說(shuō)，所述擴(kuò)增域應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)為，該擴(kuò)增域或其互補(bǔ)序列不會(huì)與組織樣本中的核酸分子特異雜交。優(yōu)選地，捕獲探針擴(kuò)增域的核酸序列及其互補(bǔ)鏈與組織樣本核酸序列的序列一致性低于80%。優(yōu)選地，捕獲探針的擴(kuò)增域與組織樣本中大部分核酸分子的序列一致性低于70%、60%或40%。序列一致性可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法測(cè)定，例如，使用BLAST比對(duì)算法。
[0108]因此，單獨(dú)來(lái)看，捕獲探針的通用域可以看做是一個(gè)通用域寡核苷酸，在捕獲探針間接固定于陣列上的實(shí)施例中，所述通用域寡核苷酸可用于捕獲探針的合成。
[0109]本發(fā)明的一個(gè)代表性實(shí)施例中，只有每種捕獲探針的定位域是獨(dú)一無(wú)二的。因此，同一實(shí)施例中的任何特定陣 列上，每種捕獲探針的捕獲域和通用域(若適用)分別相同，以保證對(duì)組織樣本核酸(例如RNA)的捕獲具有全陣列一致性。但是,如上文論述,在一些實(shí)施例中，一些捕獲域可能因?yàn)榘穗S機(jī)或簡(jiǎn)并序列而產(chǎn)生區(qū)別。
[0110]在一些實(shí)施例中，捕獲探針間接固定(例如通過(guò)與表面探針雜交)在陣列基板上，此類(lèi)捕獲探針可按下文所述在陣列上合成。
[0111]表面探針直接用其3’端或于其3’端固定在陣列基板上。表面探針的每個(gè)種類(lèi)與陣列上的每個(gè)特征(不同位置)為唯一對(duì)應(yīng)關(guān)系，并與上文中定義的捕獲探針部分互補(bǔ)。
[0112]因此，表面探針的5’端含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域(互補(bǔ)捕獲域)，所述互補(bǔ)捕獲域能與捕獲域中不與組織樣本核酸(如RNA)結(jié)合的部分相互互補(bǔ)。換句話(huà)說(shuō)，所述互補(bǔ)捕獲域能與捕獲域寡核苷酸至少部分雜交。表面探針進(jìn)一步含有一個(gè)與捕獲探針的定位域互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)域(互補(bǔ)定位域或互補(bǔ)特征標(biāo)識(shí)域)，該互補(bǔ)定位域位于互補(bǔ)捕獲域的直接下游或間接下游(即其3’端方向)，即:互補(bǔ)定位域和互補(bǔ)捕獲域之間可以用一個(gè)間隔序列或連接序列相分隔。在一些實(shí)施例中，捕獲探針在陣列表面合成，所述陣列的表面探針總在其3’端方向，SP定位域的直接或間接下游方向，含有一個(gè)與捕獲探針的通用域互補(bǔ)的域(互補(bǔ)通用域)，換句話(huà)說(shuō)，含有一個(gè)能與通用域寡核苷酸至少部分雜交的域。
[0113]本發(fā)明的一些實(shí)施例中，表面探針的序列與定位域和通用域之間，以及與捕獲域中不與組織樣本核酸(如RNA)結(jié)合的部分之間，具有100%的互補(bǔ)性或序列一致性。在其他實(shí)施例中，表面探針序列與捕獲探針的這些結(jié)構(gòu)域之間的序列一致性則可能低于100%，例如，低于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%。本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，互補(bǔ)通用域與捕獲探針的通用域之間的序列一致性低于100%。
[0114]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲探針在陣列基板上合成或生成。在一個(gè)代表性實(shí)施例中(見(jiàn)圖3)，陣列含有如上文定義的表面探針。與捕獲探針的捕獲域和通用域相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸與陣列相接觸，并能夠與表面探針的互補(bǔ)域相雜交。過(guò)量的寡核苷酸可以通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下進(jìn)行洗滌來(lái)移除。所得的陣列含有部分單鏈探針，其中表面探針的5’和3’端均為雙鏈，而互補(bǔ)定位域?yàn)閱捂??？梢杂镁酆厦竵?lái)處理陣列，依靠模版來(lái)延長(zhǎng)通用域寡核苷酸的3’端，以合成捕獲探針的定位域?？衫眠B接酶等連接已合成的定位域的3’端與捕獲域寡核苷酸的5’端，來(lái)生成捕獲探針?？芍獣?，為達(dá)成此目的，可以使捕獲域寡核苷酸的5’端磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)連接反應(yīng)。由于每一種類(lèi)的表面探針都含有獨(dú)一無(wú)二的互補(bǔ)定位域，因此每一種類(lèi)的捕獲探針將含有獨(dú)一無(wú)二的定位域。
[0115]在此使用的術(shù)語(yǔ)“雜交反應(yīng)”或“雜交”，指的是具有足夠的互補(bǔ)性，可通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)結(jié)合成雙鏈的核苷酸序列之間的雙鏈形成反應(yīng)。兩個(gè)核苷酸序列相互“互補(bǔ)”，指的是其分子的堿基配對(duì)具有組織結(jié)構(gòu)同源性。“互補(bǔ)”的核苷酸序列在適當(dāng)?shù)碾s交條件下特異結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈。舉例來(lái)說(shuō)，如果第一條序列上的一部分與第二條序列上的一部分能夠以逆向平行的方式相結(jié)合，其中一個(gè)序列的3’端與對(duì)方序列的5’端相結(jié)合，且序列之一的每個(gè)A、T (U)、G和C都能與對(duì)方序列的T (U)、A、C和G分別結(jié)合，則這兩條序列互補(bǔ)。RNA序列還可以含有互補(bǔ)的G=U或U=G堿基序列。因此，本發(fā)明中的兩個(gè)“互補(bǔ)”序列無(wú)需具有完美的同源性。一般來(lái)說(shuō)，如果兩條序列在其分子的一段指定長(zhǎng)度上，至少有90% (優(yōu)選為至少約95%)的核苷酸的堿基配對(duì)組織結(jié)構(gòu)相同，則這兩條序列具有足夠的互補(bǔ)性。因此，捕獲探針和表面探針的結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域。進(jìn)一步地，捕獲探針的捕獲域中含有一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域，能與組織樣本核酸，例如RNA (優(yōu)選為mRNA)互補(bǔ)。
[0116]還可以利用聚合酶延長(zhǎng)反應(yīng)(與上文所述類(lèi)似)和末端轉(zhuǎn)移酶加“尾”反應(yīng)，在陣列基板上合成捕獲探針，所加的“尾”可以構(gòu)成捕獲域，下文的實(shí)施例7中對(duì)此做了進(jìn)一步描述。使用末端轉(zhuǎn)移酶向寡核苷酸末端添加核苷酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所知，例如，引入一條同聚物尾巴，如poly-T尾。相應(yīng)地，在此類(lèi)合1`成反應(yīng)中，與捕獲探針的通用域?qū)?yīng)的寡核苷酸可以與陣列相接觸，并與表面探針的互補(bǔ)域雜交。過(guò)量的寡核苷酸可以通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下進(jìn)行洗滌來(lái)移除。所得的陣列含有部分單鏈探針，其中表面探針的5’和3’端均為雙鏈，互補(bǔ)定位域?yàn)閱捂??？梢杂镁酆厦竵?lái)處理陣列，依靠模版來(lái)延長(zhǎng)通用域寡核苷酸的3’端，以合成捕獲探針的定位域。然后，要引入捕獲域，例如含有poly-T序列的捕獲域，可通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶來(lái)添加poly-T尾，以生成捕獲探針。
[0117]本發(fā)明的典型陣列以及用于本發(fā)明的方法中的陣列，可以含有多個(gè)微點(diǎn)，或“特征”。特征可定義為陣列基板上的區(qū)域或不同位置，該位置上固定有單一種類(lèi)的捕獲探針。因此，每一特征將含有同一種類(lèi)的多個(gè)探針?lè)肿??？芍獣?，在此設(shè)定下，雖然相同種類(lèi)的每個(gè)捕獲探針可以具有相同的序列，但這并非必要的條件。捕獲探針的每個(gè)種類(lèi)將具有相同的定位域(即:同一種類(lèi)的每個(gè)成員，乃至于同一特征中的每個(gè)探針，都具有相同的“標(biāo)記”)，但同一特征(種類(lèi))的每個(gè)個(gè)體探針的序列可以不同，這是因?yàn)椴东@域的序列可以有區(qū)別。如上所述，可以采用隨機(jī)或簡(jiǎn)并的捕獲域。因此，同一特征中的捕獲探針可以含有不同的隨機(jī)或簡(jiǎn)并序列。陣列上的特征數(shù)量和密度將決定陣列的解析度，即:組織樣本的轉(zhuǎn)錄組或基因組用于分析的細(xì)節(jié)層次。因此，一般來(lái)說(shuō)，特征的密度提高，陣列的解析度也會(huì)隨之增加。
[0118]如上所述，本發(fā)明的陣列特征的大小和數(shù)量取決于組織樣本的性質(zhì)和所需的解析度。因此，如果只想要確定組織樣本內(nèi)的成片細(xì)胞(或樣本含有大細(xì)胞)的轉(zhuǎn)錄組或基因組，便可減少陣列特征的數(shù)量和/或密度(即:減少特征的最大可能數(shù)量)和/或增加特征的大小(即:每個(gè)特征的面積可以大于最小的可能特征)，例如，含有少量大特征的陣列?？蛇x地，如果想要確定樣本中個(gè)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組或基因組，便可能需要使用最大可能數(shù)量且最小可能尺寸的特征，例如，含有許多小特征的陣列。
[0119]雖然單一細(xì)胞解析度可以是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征，但其并非必要目的；細(xì)胞群水平的解析度也是本發(fā)明的目的之一，例如，檢測(cè)或分辨特定的細(xì)胞類(lèi)型或組織區(qū)域，如正常細(xì)胞vs腫瘤細(xì)胞。
[0120]本發(fā)明的代表性實(shí)施例中，陣列可以含有至少2、5、10、50、100、500、750、1000、1500、3000、5000、10000、20000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、300000、400000、500000、750000、800000、1000000、1200000、1500000、1750000、2000000、2100000.3000000,3500000,4000000 或 4200000 個(gè)特征。雖然 4200000 代表了目前可購(gòu)得
的商品陣列的最大可能特征數(shù)量，但根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，本發(fā)明中可以制備特征超過(guò)此數(shù)量的陣列，且此類(lèi)陣列為發(fā)明目的之一。如上所述，可以降低特征大小并在相同或相似面積中提高特征的數(shù)量。舉例來(lái)說(shuō)，這些特征可以被容納在約20cm2、10cm2、5cm2、lcm2、1mm2、orlOO μ m2以下的面積中。
[0121]因此，本發(fā)明的一些實(shí)施例中，每個(gè)特征的面積可以是約I μ m2、2 μ m2、3 μ m2、4ym2、5ym2、10ym2、12ym 2、15ym2、20ym2、50ym2、75ym2、100ym2、150y m2、200 μ m2、250 μ m2、300 μ m2、400 μ m2 或 500 μ m2.[0122]可知曉，本發(fā)明的方法可以用在任何生物體的組織樣本上，例如，植物、動(dòng)物或真菌。本發(fā)明的陣列可用于捕獲細(xì)胞中任何能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸，例如mRNA分子。本發(fā)明的陣列和方法特別適用于分離和分析樣本中的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄體或基因組，且需要獲取轉(zhuǎn)錄組或基因組的空間解析度的時(shí)候，例如，在細(xì)胞相互連通或與相鄰細(xì)胞直接接觸的情況下。然而，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法顯然還可以用于樣本中不同細(xì)胞或不同細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄組或基因組分析，哪怕所述細(xì)胞并無(wú)直接相互作用，例如，血液樣本。換句話(huà)說(shuō)，陣列可適用的細(xì)胞無(wú)需是組織細(xì)胞，也可以單個(gè)細(xì)胞(例如，從未固定組織中分離的細(xì)胞)。所述單個(gè)細(xì)胞無(wú)需是固定在組織的某個(gè)位置上的細(xì)胞，但仍可以放置在陣列的某個(gè)位置上，并可單獨(dú)進(jìn)行辨認(rèn)。因此，在對(duì)無(wú)直接相互作用的細(xì)胞或非組織細(xì)胞進(jìn)行分析的時(shí)候，所述方法的空間性質(zhì)可以用于獲取或檢索個(gè)體細(xì)胞的獨(dú)有或獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄組或基因組信肩、O
[0123]因此，樣本可以是死體或活體組織樣本，或可以是培育樣本。代表性的示例包括臨床樣本，例如全血或血制品、血細(xì)胞、組織、活體組織或培育組織、細(xì)胞等等，包括其細(xì)胞懸液。例如，可以用細(xì)胞懸液(例如含有血細(xì)胞)制備人工樣本。可以將細(xì)胞固定在一種基質(zhì)(例如，凝膠基質(zhì)，如瓊脂、瓊脂糖等等)中，然后以常規(guī)方法切片。此類(lèi)操作在本領(lǐng)域的免疫組織化學(xué)中為人所知(例如，見(jiàn)Andersson et al2006, J.Histochem.Cytochem.54(12):1413-23.Epub2006Sep6)ο
[0124]組織制備形式和制得樣本的處理方式，可能對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄組或基因組分析造成影響。另外，各種不同的組織樣本可能具有不同的物理特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)施必要的操作來(lái)獲得本發(fā)明的方法中使用的組織樣本。但是，從本公開(kāi)中，顯而易見(jiàn)，本發(fā)明中可以使用任何適當(dāng)?shù)臉颖局苽浞椒▉?lái)獲得組織樣本。例如，任何厚度在約I個(gè)細(xì)胞或更薄的細(xì)胞層都可以用在本發(fā)明的方法中。在一個(gè)實(shí)施例中，組織樣本的厚度可以薄于細(xì)胞橫截面的0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2或0.1倍。然而，如上所述，本發(fā)明并不限于單一細(xì)胞解析度，因此，并不要求組織樣本的厚度薄于單個(gè)細(xì)胞直徑或更小；如果需要，可以采用較厚的組織樣本。例如，可以采用冷凍切片，其厚度可能是例如10-20 μ m。
[0125]可以用任何基于方便或需要的方式制備組織樣本，本發(fā)明不限于任何特定的組織制備類(lèi)型。新鮮的、冷凍的、固定的、未固定的組織都可以使用?？梢曰谛枰捅憷?，用本領(lǐng)域中知曉、記載的任何方法對(duì)組織樣本進(jìn)行固定或包埋。因此，可以使用任何已知的固定劑或包埋材料。
[0126]作為本發(fā)明中使用的組織樣本的第一個(gè)代表性示例，可以在適合保持或保藏組織結(jié)構(gòu)完整性(即物理特征)的溫度下對(duì)組織進(jìn)行深度冷凍的制備，例如，低于_20°C，優(yōu)選地，低于-25、-30、-40、-50、-60、-70或_80°C?？梢詫?duì)冷凍組織樣本進(jìn)行切片，即以任何方法切成薄片且置于陣列表面。舉例來(lái)說(shuō)，制備組織樣本可以利用冷凍超薄切片機(jī)，溫度設(shè)置適合保持組織樣本結(jié)構(gòu)完整性和樣本核酸化學(xué)性質(zhì)的低溫箱，例如低于_15°C，優(yōu)選為低于-20或-25°C。因此，對(duì)樣本的處理應(yīng)當(dāng)令組織中的核酸(例如RNA)的退化或降解最小化。此類(lèi)操作條件為本領(lǐng)域所熟知，任何程度的降解都可以通過(guò)核酸提取來(lái)監(jiān)控，例如，在組織樣本制備的各階段進(jìn)行總RNA提取和質(zhì)量分析。
[0127]在第二個(gè)代表性示例中，可以用福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)的標(biāo)準(zhǔn)辦法制備組織，所述方法在本領(lǐng)域中已非常完善。在組織樣本固定及以石蠟或樹(shù)脂封閉物包埋之后，可以對(duì)組織樣本進(jìn)行切片，即:切成薄片置于陣列上。如上所述，也可以采用其他固定劑和/或包埋材料。
[0128]顯然，實(shí)施本發(fā)明的方法之前，需要處理組織樣本切片，來(lái)去除樣本上的包埋材料，例如，通過(guò)脫蠟，即去除石蠟或樹(shù)脂。該步驟可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)完成，且本領(lǐng)域中去除樣本上的石蠟或樹(shù)脂或其他材料的方法已經(jīng)建立完善，例如，通過(guò)以適當(dāng)?shù)娜軇?，例如二甲苯?在陣列表面)培養(yǎng)樣本，例如培養(yǎng)兩次，各10分鐘，接著以乙醇淋洗，例如用99.5%的乙醇淋洗2分鐘，96%的乙醇淋洗2分鐘以及70%的乙醇淋洗2分鐘。
[0129]對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，以FFPE或其他固定和包埋方法制備的組織切片中的RNA，顯然比冷凍組織中的RNA更可能產(chǎn)生部分降解。然而，本發(fā)明無(wú)意受到任何特殊理論的限定，因此，采用前者組織對(duì)本發(fā)明方法來(lái)說(shuō)可以是一種優(yōu)選形式。舉例來(lái)說(shuō)，如果樣本中的RNA部分降解，則相對(duì)于未降解的樣本來(lái)說(shuō)，其RNA聚核苷酸的平均長(zhǎng)度更短，且或多或少得到了隨機(jī)化。因此可以推定，在本發(fā)明其他部分中所述的各種處理步驟中，例如，接合體(擴(kuò)增域)的連接反應(yīng)、cDNA分子的擴(kuò)增及測(cè)序中，部分降解的RNA所帶來(lái)的誤差更少。
[0130]因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用FFPE或其他固定和包埋方法制備組織樣本，即與陣列相接觸的組織樣本的切片。換句話(huà)說(shuō)，樣本可以是已固定的，例如，經(jīng)過(guò)固定和包埋的。本發(fā)明的一個(gè)可選實(shí)施例中，通過(guò)深度冷凍來(lái)制備組織樣本。在又一個(gè)實(shí)施例中，可以采用組織的印片，其操作流程為本領(lǐng)域所知。在另外一些實(shí)施例中，可以采用未固定的樣本。[0131]本發(fā)明的方法中使用的組織樣本的厚度，可以依照樣本制備方法和組織物理特性來(lái)決定。因此，本發(fā)明的方法可以使用任何適當(dāng)厚度的切片。本發(fā)明的代表性實(shí)施例中，組織樣本切片的厚度為至少0.1 μ m，進(jìn)一步優(yōu)選為至少0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,1.0,1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或ΙΟμπι。在另外一些實(shí)施例中，組織樣本切片的厚度為至少10、12、13、14、15、20、30、40或50μπι。但是，厚度并不是關(guān)鍵性因素，以上列舉的僅為代表性的數(shù)值?；谛枰头奖悖梢圆捎幂^厚的樣本，例如，70或100 μ m或以上。典型地，組織樣本切片的厚度在 1-1OO μ m、1-50 μ m、1-30 μ m、1-25 μ m、1-20 μ m、1-15 μ m、1-10 μ m、2_8 μ m、3_7 μ m或4-6 μ m之間，但如上所述，還可以使用更厚的樣本。
[0132]當(dāng)組織樣本切片與陣列接觸時(shí)，例如移除包埋材料的步驟如脫蠟以后，組織樣本中的核酸分子(如RNA)將與固定在陣列上的捕獲探針結(jié)合。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地，可以對(duì)核酸分子(如RNA)與捕獲探針的結(jié)合予以促進(jìn)。典型地，促進(jìn)雜交包括改善雜交發(fā)生的條件。能夠改善的主要條件包括反轉(zhuǎn)錄步驟前，在陣列上培養(yǎng)組織切片的時(shí)間和溫度，在本發(fā)明其他部分中有所描述。
[0133]舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)組織樣本切片與陣列相接觸時(shí)，可以將陣列培養(yǎng)至少I(mǎi)小時(shí)，以便允許核酸(如RNA)與捕獲探針相雜交。優(yōu)選地，陣列可以培養(yǎng)2、3、5、10、12、15、20、22或24小時(shí)，或直到組織樣本切片干燥為止。陣列培養(yǎng)時(shí)間并非關(guān)鍵條件，任何方便或需要的時(shí)間都可以被采用。典型的陣列培養(yǎng)時(shí)間可以高達(dá)72小時(shí)。因此，可以用任何適當(dāng)?shù)臏囟冗M(jìn)行培養(yǎng)，例如室溫，但在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，陣列上組織樣本切片的培養(yǎng)溫度至少為25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37°C。本領(lǐng)域中，一般采用至多55°C的培養(yǎng)溫度。在一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，組織樣本切片在陣列上37°C干燥24小時(shí)。一旦組織樣本切片干燥，便可以將陣列在室溫下保存，直至實(shí)施反轉(zhuǎn)錄步驟。可知曉，如果允許組織樣本切片在陣列表面干燥，那么在對(duì)已捕獲的核酸進(jìn)行進(jìn)一步操作前，例如在已捕獲的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟前，須得對(duì)切片進(jìn)行補(bǔ)水。
[0134]因此，本發(fā)明的方法可以含有一個(gè)進(jìn)一步的步驟，即在樣本與陣列接觸后，對(duì)組織樣本進(jìn)行補(bǔ)水。
[0135]在一些實(shí)施例中，優(yōu)選地,在捕獲探針與陣列上的組織樣本相接觸前,對(duì)捕獲探針進(jìn)行封閉(例如，遮蓋或修飾)，尤其是在組織樣本中的核酸在已捕獲于陣列上之前經(jīng)過(guò)修飾的情況下。具體來(lái)說(shuō)，優(yōu)選地，對(duì)捕獲探針的自由3’端進(jìn)行封閉或修飾。在一個(gè)特定實(shí)施例中，組織樣本中的核酸，例如，可以對(duì)基因組DNA片段進(jìn)行修飾，以便其已捕獲探針捕獲。舉例來(lái)說(shuō)，下文中將會(huì)進(jìn)一步詳述，接合體序列(含有能與捕獲探針的捕獲域相結(jié)合的結(jié)合域，)可以被添加到核酸(例如基因組DNA片段)的末端。該步驟可以通過(guò)例如接合體的連接反應(yīng)或核酸的延長(zhǎng)反應(yīng)來(lái)完成,例如,用酶在序列末端追加核苷酸,例如poly-A尾。在組織樣本與陣列接觸前，有必要對(duì)捕獲探針進(jìn)行封閉或修飾，尤其是捕獲探針的自由3’端，以避免捕獲探針受到修飾，例如，避免poly-A尾誤加至捕獲探針的自由3’端。優(yōu)選地，可以在捕獲探針的合成時(shí)向其添加封閉域。但是，也可以在捕獲探針合成后再添加封閉域。
[0136]在一些實(shí)施例中，可以用任何適當(dāng)且可逆的方法來(lái)封閉捕獲探針，以避免在組織樣本與陣列相接觸后，捕獲域在組織樣本核酸修飾過(guò)程中發(fā)生修飾。換句話(huà)說(shuō)，可以可逆地掩蓋或修飾捕獲探針，以使得捕獲探針的捕獲域不含自由3’端，即使得所述3’端被移除、修飾，或不可接觸，以令捕獲探針不會(huì)在組織樣本核酸的修飾過(guò)程中受到影響，例如通過(guò)連接反應(yīng)或延長(zhǎng)反應(yīng)，或移除附加的核苷酸來(lái)露出和/或恢復(fù)捕獲探針的捕獲域的3’端。
[0137]舉例來(lái)說(shuō)，可以用封閉探針與捕獲探針相雜交，以掩蓋捕獲域的自由3’端，所述封閉探針例如是發(fā)夾探針或含部分雙鏈的探針，所述探針的適當(dāng)示例為本領(lǐng)域所知。捕獲域的自由3’端可以用化學(xué)修飾加以封閉，例如，將疊氮甲基作為可逆的化學(xué)頂帽加入，使得捕獲探針不含自由3’端。可選的適當(dāng)化學(xué)頂帽也被本領(lǐng)域熟知，例如捕獲域的末端核苷酸可以是可逆的終止子核苷酸，在捕獲探針合成期間或之后加入到探針中。
[0138]可選地或附加地，可以對(duì)捕獲探針的捕獲域加以修飾，以便移除捕獲探針在組織樣本核酸分子的修飾過(guò)程中獲得的任何修飾，例如，附加核苷酸。舉例來(lái)說(shuō)，捕獲探針可以在捕獲域的下游，即捕獲域的3’端方向，含有一條附加序列，稱(chēng)為封閉域。其形式可以是，例如，限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列或可由特定酶活性切除的核苷酸序列，如尿嘧啶。組織樣本的核酸修飾步驟后，可以對(duì)捕獲探針進(jìn)行酶促剪切，來(lái)移除封閉域或任何在修飾過(guò)程中添加到捕獲探針3’端的附加核苷酸。封閉域的移除可以露出和/或恢復(fù)捕獲探針的捕獲域的自由3’端。封閉域可以作為捕獲探針的一部分來(lái)加以合成，或通過(guò)原位反應(yīng)(即:作為現(xiàn)有陣列的修飾)添加給捕獲探針，例如，通過(guò)與捕獲域之間的連接反應(yīng)。
[0139]可以用上述封閉機(jī)制的任意組合對(duì)捕獲探針進(jìn)行封閉。
[0140]組織樣本的核酸，例如基因組DNA片段，一旦修飾完成，能夠與捕獲探針的捕獲域相雜交，就必須對(duì)捕獲探針進(jìn)行解封，例如，通過(guò)解離封閉寡核苷酸，移除化學(xué)頂帽和/或封閉域。
[0141]為將從陣列的每個(gè)特征獲得的序列分析或轉(zhuǎn)錄組信息或基因組信息與組織樣本的分區(qū)(即:區(qū)域 或細(xì)胞)相關(guān)聯(lián)，參照陣列特征對(duì)組織樣本進(jìn)行定向。換句話(huà)說(shuō)，將組織樣本放置于陣列上，使得陣列上的捕獲探針的位置與組織樣本的位置相關(guān)聯(lián)。由此，便可以辨認(rèn)每個(gè)種類(lèi)捕獲探針的位置(或陣列的每個(gè)特征)在組織樣本中對(duì)應(yīng)的位置。換句話(huà)說(shuō)，即:可以辨認(rèn)每個(gè)種類(lèi)捕獲探針的位置所對(duì)應(yīng)的組織樣本位置。該步驟可以通過(guò)陣列上的定位探針來(lái)完成，如下文所述。為了方便起見(jiàn)，但非必需步驟，可以在組織樣本與陣列接觸后對(duì)其進(jìn)行成像。該步驟可以在組織樣本核酸的處理步驟之前或之后進(jìn)行，例如，在本方法的cDNA生成步驟，尤其是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈的步驟之前或之后。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，組織樣本的成像步驟在釋放陣列上的已捕獲及已合成(即:已延長(zhǎng)或已連接)的DNA (如cDNA)的步驟之前。在一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)組織的成像步驟發(fā)生在組織樣本核酸的處理步驟之后，例如，在反轉(zhuǎn)錄步驟之后；并且，在從陣列上釋放分子(如cDNA)之前，移除(例如，洗滌)了陣列上所有殘余組織。在一些實(shí)施例中，可在處理捕獲核酸的步驟(例如反轉(zhuǎn)錄步驟)中，去除陣列表面的殘余組織，例如，當(dāng)所使用的組織為以深度冷凍制備的組織時(shí)。在此情況下，組織樣本的成像可以在處理步驟前發(fā)生，例如cDNA合成步驟前。一般來(lái)說(shuō)，成像步驟可以在組織樣本與表面接觸后的任何時(shí)候進(jìn)行，但應(yīng)在所有降解或移除組織樣本的步驟之前完成。如上所述，這取決于組織樣本。
[0142]優(yōu)選地，所述陣列可以含有有助于組織樣本或其圖像相對(duì)于陣列特征進(jìn)行定向的標(biāo)記。任何標(biāo)記陣列的適當(dāng)方法都可以使用，只要其能在組織樣本成像時(shí)能夠被檢測(cè)。舉例來(lái)說(shuō)，可以將能夠生成信號(hào)，優(yōu)選為視覺(jué)信號(hào)的分子，例如，熒光分子，直接固定在陣列表面。優(yōu)選地，陣列表面的不同位置上含有至少2種標(biāo)記，進(jìn)一步優(yōu)選地，至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100種標(biāo)記。可以方便地使用幾百或甚至幾千種標(biāo)記。標(biāo)記可以具有格局，例如，形成陣列外圍邊框，如陣列特征的整個(gè)外框；可以是含信息的其他格局，例如陣列的截線，以便于組織樣本圖像與陣列的對(duì)齊，或者一般來(lái)說(shuō)，陣列特征與組織樣本的關(guān)聯(lián)。因此，標(biāo)記可以是被固定的分子，其能與發(fā)送信號(hào)的分子相互作用，產(chǎn)生信號(hào)。在一個(gè)代表性示例中，陣列可以含有標(biāo)記特征，例如，固定在陣列基板上且與被標(biāo)記核酸相雜交的核酸探針。舉例來(lái)說(shuō)，被標(biāo)記的核酸分子，即標(biāo)記核酸，可與能在特定波長(zhǎng)(或波長(zhǎng)范圍)的光線下產(chǎn)生熒光(即被激活)的化學(xué)部分相連接或結(jié)合。此類(lèi)標(biāo)記核酸分子與陣列接觸的時(shí)機(jī)，可以在組織樣本為可視化或成像而進(jìn)行染色之前、之中或之后。但是，標(biāo)記必須在組織樣本成像后能夠被檢測(cè)。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以采用與可視化組織樣本相同的成像條件來(lái)對(duì)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。
[0143]本發(fā)明的一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施例中，陣列含有標(biāo)記特征，且所述標(biāo)記特征與已標(biāo)記，優(yōu)選為已熒光標(biāo)記的標(biāo)記核酸分子(例如，寡核苷酸)相雜交。
[0144]可以使用本領(lǐng)域中任何方便的組織學(xué)方法來(lái)進(jìn)行組織成像步驟，例如，光、明視場(chǎng)、暗視場(chǎng)、相位差、熒光、鏡像、干涉、共聚顯微鏡或其組合。典型情況下，組織樣本在可視化之前先進(jìn)行染色，以在組織樣本不同區(qū)域(例如細(xì)胞間)形成對(duì)比。采用的染色劑類(lèi)型取決于組織類(lèi)型和需染色的細(xì)胞區(qū)域。此類(lèi)染色操作流程為本領(lǐng)域所知。在一些實(shí)施例中，采用了多種染色劑來(lái)可視化(成像)組織樣本的不同方面，例如，組織樣本的不同區(qū)域、特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)(例如，細(xì)胞器)或不同細(xì)胞類(lèi)型。在其他一些實(shí)施例中，可以通過(guò)組織染色以外的方法進(jìn)行組織樣本可視化或成像，例如，在組織樣本已經(jīng)含有色素，能夠提供足夠的對(duì)比，或者采用了特殊形式的顯微鏡的情況下。
[0145]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采用熒光顯微鏡對(duì)組織樣本進(jìn)行可視化或成像。
[0146]如果想要實(shí)施成像且未在反轉(zhuǎn)錄之前實(shí)施成像，則優(yōu)選地，在從陣列釋放cDNA分子的步驟之前移除組織樣本，即在反轉(zhuǎn)錄步驟和可選的成像步驟后仍與陣列基板相接觸的殘余組織。因此，本發(fā)明的方法可以含有一個(gè)洗滌陣列的步驟。殘余組織樣本的移除可以采用任何適當(dāng)?shù)姆椒?，取決于組織樣本。在最簡(jiǎn)單的實(shí)施例中，可以用水洗滌陣列，水中可含有多種添加劑，例如表面活性劑(例如洗滌劑)、酶等，來(lái)幫助清除組織。在一些實(shí)施例中，采用含有蛋白酶(及適當(dāng)?shù)木彌_液)的溶液來(lái)洗滌陣列，例如蛋白酶K。在其他的一些實(shí)施例中，所述溶液還可以含有，或可選地含有，纖維素酶、半纖維素酶或幾丁質(zhì)酶，例如，當(dāng)組織樣本源自植物或真菌的時(shí)候。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，洗滌陣列的溶液溫度可以是例如至少30°C，優(yōu)選為至少35、40、45、50或55°C。顯然，洗滌溶液對(duì)已固定的核酸分子的破壞應(yīng)當(dāng)最小化。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，核酸分子可以間接地固定在陣列基板上，例如，通過(guò)捕獲探針和RNA之間以及/或者捕獲探針和表面探針之間的雜交，因此，洗滌步驟應(yīng)當(dāng)不干擾陣列上已固定的分子間的相互作用，即:應(yīng)當(dāng)不引起核酸分子的變性。
[0147]陣列和組織樣本接觸的步驟之后，在組織樣本的核酸分子，例如RNA(優(yōu)選為mRNA)與捕獲探針相互雜交的適宜條件下，進(jìn)行對(duì)已雜交的核酸分子的固定(獲取)。對(duì)已雜交的核酸的固定或獲取，包括已雜交核酸的互補(bǔ)鏈與捕獲探針間的共價(jià)附著(即:通過(guò)核苷酸鍵，即兩個(gè)緊鄰的核苷酸之間的并置3’ -羥基與5’ -磷酸鹽末端之間形成的磷酸二酯鍵)，由此標(biāo)識(shí)或標(biāo)定已捕獲的 核酸，所述已捕獲的核酸帶有一個(gè)定位域，能與對(duì)其進(jìn)行捕獲的特征進(jìn)行特異結(jié)合。
[0148]在一些實(shí)施例中，對(duì)已雜交的核酸(例如單鏈核酸)進(jìn)行固定，可以包括延長(zhǎng)捕獲探針來(lái)生成已捕獲核酸的副本，例如，從已捕獲(已雜交)的RNA生成cDNA。可知曉，此步驟指的是已雜交核酸的互補(bǔ)鏈的合成，例如，基于已捕獲的RNA模版(即雜交于捕獲探針捕獲域的RNA)生成cDNA。因此，在捕獲探針的延長(zhǎng)反應(yīng)(如cDNA生成)的初始步驟中，已捕獲(已雜交)的核酸(例如RNA)成為延長(zhǎng)步驟(例如反轉(zhuǎn)錄)的模版。在其他一些實(shí)施例中，如下文所述，對(duì)已雜交的核酸(例如含部分雙鏈的DNA)進(jìn)行固定，可以包括在已雜交的核酸(例如DNA片段)與捕獲探針之間進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，例如，通過(guò)連接反應(yīng)，將捕獲探針連接至同捕獲探針相雜交的核酸的互補(bǔ)鏈上。
[0149]反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)涉及利用反轉(zhuǎn)錄酶從RNA，優(yōu)選為mRNA (信使RNA)合成cDNA (DNA互補(bǔ)鏈或DNA副本)的步驟。因此，cDNA可看作是在組織樣本被采集時(shí)存在于細(xì)胞中的RNA的副本，即:所述cDNA呈現(xiàn)的是所述細(xì)胞在隔離時(shí)刻所表達(dá)的全部或部分基因。
[0150]捕獲探針,尤其是捕獲探針的捕獲域,在為雜交于捕獲探針的核酸生成互補(bǔ)鏈時(shí)充當(dāng)引物，如反轉(zhuǎn)錄引物。因此，由延長(zhǎng)反應(yīng)(例如反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))所生成的核酸分子(如cDNA)包含了捕獲探針序列，即是說(shuō)，延長(zhǎng)反應(yīng)(如反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))可以看作是一種對(duì)組織樣本上與陣列的每個(gè)特征相接觸的核酸(例如轉(zhuǎn)錄體)進(jìn)行間接標(biāo)記的方法。因此，所有在特定特征上合成的核酸分子，例如cDNA，將含有相同的核酸“標(biāo)簽”。
[0151]在陣列的每個(gè)特征上合成的核酸分子(如cDNA)，可以代表與該特征相接觸的組織樣本的區(qū)域或面積上的基因組或表達(dá)的基因，例如一種組織、細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞群或其細(xì)胞亞群，還可以進(jìn)一步代表特定條件下所表達(dá)的基因，例如在特定時(shí)刻、特定環(huán)境、特定發(fā)育階段或響應(yīng)特定刺激等。因此，任一單個(gè)特征上的cDNA可能代表著單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因，或，在該特征與樣本的細(xì)胞連接處相接觸的情況下，其cDNA可能代表多個(gè)細(xì)胞中的基因。類(lèi)似地，如果單個(gè)細(xì)胞與多個(gè)特征相接觸，那么每個(gè)特征可能代表所述細(xì)胞中所表達(dá)基因中的一部分。類(lèi)似地，在一些實(shí)施例中，所述已捕獲的核酸是DNA，任一單個(gè)特征可能代表單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因 組?？蛇x地，單個(gè)細(xì)胞的基因組可以由多個(gè)特征所代表。
[0152]捕獲探針的延長(zhǎng)步驟，例如反轉(zhuǎn)錄，可以利用本領(lǐng)域的許多適當(dāng)?shù)拿负筒僮髁鞒讨械娜我环N來(lái)實(shí)施，如下文所述。但是，顯然，無(wú)需為核酸(如cDNA)第一鏈的合成提供引物，因?yàn)椴东@探針的捕獲域即充當(dāng)了該引物，例如反轉(zhuǎn)錄引物。
[0153]優(yōu)選地，本發(fā)明的范圍中，被綁定的核酸(即:與捕獲探針共價(jià)結(jié)合的核酸)(例如cDNA)經(jīng)處理含有雙鏈DNA。但是，在一些實(shí)施例中，已捕獲的DNA可能已經(jīng)含有雙鏈DNA，例如，在含有部分雙鏈的DNA片段與捕獲探針相連接的情況下。從已捕獲核酸生成雙鏈DNA的處理步驟可以在僅生成DNA (如cDNA)第二鏈的單一反應(yīng)中完成，即:只生成雙鏈的DNA分子而不增加雙鏈DNA分子的數(shù)量，或在擴(kuò)增反應(yīng)中生成第二鏈的多個(gè)副本，所述副本可以是單鏈DNA (例如，線性擴(kuò)增)或雙鏈DNA (例如cDNA )(例如，指數(shù)擴(kuò)增)。
[0154]第二鏈DNA (例如cDNA)的合成步驟可以在陣列上原位進(jìn)行，既可以是單獨(dú)的第二鏈合成步驟，例如如下文中詳述的采用隨機(jī)引物，也可以作為擴(kuò)增反應(yīng)的初始步驟?？蛇x地，可以從陣列上釋放DNA (例如cDNA)的第一鏈(所述第一鏈含有或說(shuō)結(jié)合了捕獲探針)，然后再進(jìn)行第二鏈合成，例如，在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，可以作為一個(gè)單獨(dú)步驟或作為擴(kuò)增反應(yīng)中的一個(gè)步驟。
[0155]當(dāng)?shù)诙満铣稍陉嚵猩?即原位)進(jìn)行時(shí)，本方法可以包括一個(gè)可選的步驟，即在第二鏈合成前移除已捕獲的核酸，如RNA，例如采用RNA硝化酶(RNase)InRNase H。此步驟的操作流程為本領(lǐng)域所熟知并有記載。但是，此步驟一般并無(wú)必要，且在大多數(shù)情況下，RNA會(huì)自然降解。從陣列上除去組織樣本的步驟，一般也會(huì)移除陣列上的RNA。若想要增加RNA移除的強(qiáng)度，可采用RNase H。
[0156]舉例來(lái)說(shuō)，在含有大量RNA的組織樣本中，生成雙鏈cDNA的步驟可以產(chǎn)生足量的cDNA,(從陣列釋放后)可直接用于測(cè)序。在這種情況下，cDNA第二鏈合成可以如下文所述，通過(guò)本領(lǐng)域所知的任何方法來(lái)完成。第二鏈合成反應(yīng)可以在將cDNA固定在陣列上的同時(shí)，或優(yōu)選地，在cDNA從陣列基本上釋放之后，直接在陣列上進(jìn)行，如下文所述。
[0157]在其他的實(shí)施例中，有必要增加(即擴(kuò)增)已綁定的核酸(例如合成的cDNA)，以產(chǎn)生足夠進(jìn)行DNA測(cè)序的數(shù)量。在該實(shí)施例中，已綁定核酸(例如cDNA分子)的第一鏈，還含有陣列特征的捕獲探針，充當(dāng)了擴(kuò)增反應(yīng)中的模版，例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該擴(kuò)增反應(yīng)的第一反應(yīng)產(chǎn)物是DNA (如cDNA)的第二鏈，其自身便可充當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)一步循環(huán)的模版。
[0158]如上所述的任一實(shí)施例中，DNA (如cDNA)的第二鏈含有捕獲探針的互補(bǔ)鏈。如果捕獲探針含有通用域，尤其在該通用域中含有擴(kuò)增域，則其可以用在DNA (例如cDNA)的后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)中，例如該擴(kuò)增反應(yīng)可以包括含有與擴(kuò)增域相同序列的引物，即與擴(kuò)增域的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)(即雜交)的引物。在捕獲探針上，擴(kuò)增域處于定位域的上游(在已綁定的核酸如cDNA第一鏈中)，從此角度來(lái)看， 定位域的互補(bǔ)鏈將并入DNA (例如cDNA分子)的第二鏈中。
[0159]在一些實(shí)施例中，DNA (例如cDNA)的第二鏈在單一反應(yīng)中生成，第二鏈合成可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟ_(dá)成。舉例來(lái)說(shuō)，從陣列基板上釋放的cDNA的第一鏈，優(yōu)選地但非必需地，可以用隨機(jī)引物(例如六聚體引物)和DNA聚合酶，優(yōu)選為鏈置換聚合酶(例如klenow(exo))，在適宜進(jìn)行模版化DNA合成的條件下加以培養(yǎng)。該過(guò)程將產(chǎn)生各種長(zhǎng)度的雙鏈cDNA分子，并不大可能生成完整長(zhǎng)度的cDNA分子，即與作為合成模板的整個(gè)mRNA相對(duì)應(yīng)的cDNA分子。隨機(jī)引物會(huì)與cDNA分子第一鏈的隨機(jī)位點(diǎn)(即在序列中而不是序列末端)雜交。
[0160]倘若想要生成完整長(zhǎng)度的DNA (例如cDNA)分子，即與整個(gè)已捕獲的核酸(例如，RNA分子)相對(duì)應(yīng)的分子(若該核酸如RNA在組織樣本中部分降解，則已捕獲的核酸分子，例如RNA，將不會(huì)是“完整長(zhǎng)度”的轉(zhuǎn)錄體，也不會(huì)與基因組DNA的初始片段長(zhǎng)度相同)，那么，可以對(duì)已O綁定的核酸分子(如cDNA第一鏈)進(jìn)行修飾。舉例來(lái)說(shuō)，可以為cDNA分子的3’端連接一個(gè)連接子或接合體。該步驟可以采用單鏈合成酶來(lái)完成，例如T4RNA連接酶或Circligase? (Epicentre Biotechnologies)。
[0161]可選地，可以利用雙鏈連接酶，例如T4DNA連接酶，將一個(gè)助手探針(能夠與cDNA分子第一鏈的3’端相雜交的部分雙鏈DNA分子)與已綁定的核酸(如cDNA第一鏈)分子的3’端相連接。本領(lǐng)域中還有其他適合用于該鏈接步驟的已知酶,包括例如Tth DNA ligase、Taq DNA Iigase>Thermococcus sp.(strain9° N)DNA ligase (9° N? DNA ligase、NewEngland Biolabs)和 Ampligase? (Epicentre Biotechnologies)。所述助手探針還含有一個(gè)特定序列；利用助手探針與已綁定的核酸(如cDNA第一鏈)相連接的部分的互補(bǔ)鏈作為引物，可從所述特定序列引導(dǎo)DNA (例如cDNA)分子的第二鏈合成。進(jìn)一步，一種可選方法包括使用末端轉(zhuǎn)移酶活性酶來(lái)將聚核苷酸尾(例如poly-A尾)并入被結(jié)合的核酸(例如cDNA第一鏈)分子的3’端。第二鏈合成可以用poly-T引物來(lái)引導(dǎo)，所述引物也可以含有特定擴(kuò)增域，用于進(jìn)一步擴(kuò)增。生成“全長(zhǎng)”雙鏈DNA (例如cDNA)分子(或最大長(zhǎng)度第二鏈合成)的其他方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0162]在一些實(shí)施例中，第二鏈合成可以采用模板轉(zhuǎn)換的方法，例如，采用Clontech?的SMART? 技術(shù)。SMART (RNA 模版 5’端轉(zhuǎn)換裝置，即 Switching Mechanism at5’End of RNATemplate)技術(shù)已在本領(lǐng)域中發(fā)展完善,該技術(shù)基于Superscript? n (Invitrogen)等反轉(zhuǎn)
錄酶能夠在延長(zhǎng)的cDNA分子的3’端添加若干核苷酸的發(fā)現(xiàn)，即生成在3’端懸有單鏈DNA的DNA/RNA雜交產(chǎn)物。該外懸DNA可以提供一條目標(biāo)序列，作為寡核苷酸探針的雜交目標(biāo)，為cDNA分子的進(jìn)一步延長(zhǎng)提供附加的模版。優(yōu)選地，與外懸的cDNA雜交的寡核苷酸探針含有一個(gè)擴(kuò)增域序列，所述擴(kuò)增域序列的互補(bǔ)鏈并入cDNA第一鏈合成產(chǎn)物。含有擴(kuò)增域序列的引物，將與并入cDNA第一鏈的互補(bǔ)擴(kuò)增域序列雜交；可以將所述引物加入反應(yīng)混合物引導(dǎo)第二鏈合成，并使用適當(dāng)?shù)木酆厦负蚦DNA第一鏈作為模版。該方法避免了將接合體連接到cDNA第一鏈3’端的要求。雖然模版轉(zhuǎn)換法最初是為具有5’帽結(jié)構(gòu)的全長(zhǎng)mRNAs而開(kāi)發(fā)，該方法已被證明可以同樣良好運(yùn)用于無(wú)帽結(jié)構(gòu)的截短mRNAs。因此，模板轉(zhuǎn)換可以用于本發(fā)明的方法中，以生成全長(zhǎng)和/或部分或截短的cDNA分子。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第二鏈的合成可以利用模版轉(zhuǎn)換，或通過(guò)模版轉(zhuǎn)換完成。在一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，原位實(shí)施(即在捕獲探針仍舊直接或間接固定于陣列的同時(shí))模版轉(zhuǎn)換反應(yīng)，即進(jìn)一步延長(zhǎng)cDNA第一鏈以并入互補(bǔ)擴(kuò)增域的反應(yīng)。優(yōu)選地，第二鏈合成反應(yīng)也原位實(shí)施。
[0163]在一些實(shí)施例中，可能有必要，或優(yōu)選地，增加、豐富或擴(kuò)增DNA (例如cDNA)分子，則可以將擴(kuò)增域并入DNA (例如cDNA)分子。如上所述，當(dāng)捕獲探針具有含擴(kuò)增域的通用域時(shí)，第一擴(kuò)增域可以并入被綁定的核酸分子，例如cDNA分子的第一鏈。在這些實(shí)施例中，第二鏈合成可以合并第二個(gè)擴(kuò)增域。舉例來(lái)說(shuō)，用于生成cDNA第二鏈的引物，例如，隨機(jī)六聚體引物，poly-T引物、與助手探針互補(bǔ)的引物，可能在5’端含有擴(kuò)增域，即可以與擴(kuò)增引物雜交的核苷酸序列。因此，所得的雙鏈DNA可以在雙鏈DNA (例如cDNA)分子的兩個(gè)5’端，或靠近兩個(gè)5’端的方向上，含有一個(gè)擴(kuò)增域。這些擴(kuò)增域可以用做擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR)中引物的目標(biāo)?？蛇x地，與被綁定的核酸分子(例如cDNA第一鏈分子)的3’端連接的連接子或接合體，可以含有第二個(gè)通用域，所述通用域含有第二個(gè)擴(kuò)增域。類(lèi)似地，第二個(gè)擴(kuò)增域可以通過(guò)模版轉(zhuǎn)換并入cDNA第一鏈分子。
`[0164]在一些實(shí)施例中其捕獲探針不含有通用域，尤其是含有擴(kuò)增域的通用域，則可以按照前文描述合成cDNA分子的第二鏈。所得雙鏈DNA分子產(chǎn)物可以通過(guò)修飾，在DNA (例如cDNA)分子的第一鏈的5’端合并一個(gè)擴(kuò)增域，以及并入DNA (如cDNA)第二鏈的5’端(第二個(gè)擴(kuò)增域)，如果后者未在DNA (如cDNA)第二鏈合成步驟中完成的話(huà)。此類(lèi)擴(kuò)增域可以通過(guò)例如將雙鏈接合體連接至DNA (如cDNA)分子的末端來(lái)并入。該鏈接步驟適用的酶為本領(lǐng)域所知，包括例如TthDNA連接酶、Taq DNA ligase、Thermococcus sp.(9° N菌株)DNA ligase (9。N? DNA 連接酶，New England Biolabs)、Ampligase? (EpicentreBiotechnologies)和T4DNA連接酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一和第二擴(kuò)增域含有不同的序列。
[0165]由上可知，顯然，通用域可以含有擴(kuò)增域，能通過(guò)本領(lǐng)域中的各種方法、技術(shù)及技術(shù)組合添加到已綁定(即已延長(zhǎng)或連接)的DNA (例如cDNA)分子或其互補(bǔ)鏈(例如第二鏈)上，例如，通過(guò)使用含有此域的引物、接合體的連接反應(yīng)、末端轉(zhuǎn)移酶的使用和/或模版轉(zhuǎn)換方法。如上述可知，此類(lèi)結(jié)構(gòu)域可以在DNA分子從陣列上釋放之前或之后添加。[0166]從上文敘述中可見(jiàn)，顯然，從按照本發(fā)明的方法合成的單一陣列中的所有DNA (例如cDNA)分子可以全部含有相同的第一和第二擴(kuò)增域。由此一來(lái)，單一的擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR，便足以擴(kuò)增所有的DNA (例如cDNA)分子。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可以含有一個(gè)DNA (例如cDNA)分子的擴(kuò)增步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，擴(kuò)增步驟在DNA (例如cDNA)分子從陣列基板上釋放之后實(shí)施。在其他的實(shí)施例中，擴(kuò)增反應(yīng)可以在陣列(即:在陣列上原位)上實(shí)施。本領(lǐng)域已知，擴(kuò)增反應(yīng)可以在陣列上實(shí)施，且已有可實(shí)施此類(lèi)反應(yīng)的片上熱循環(huán)儀。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本領(lǐng)域已知作為測(cè)序平臺(tái)或用于任何形式的序列分析(例如,在下一代測(cè)序技術(shù)中)的陣列,均可以用作本發(fā)明的陣列的基礎(chǔ)(例如，11 Iumina微珠陣列等)。
[0167]對(duì)于DNA(例如cDNA)第二鏈的合成，如果從陣列基板上釋放的cDNA含有部分雙鏈核酸分子，則優(yōu)選采用鏈置換聚合酶(例如，Φ29?ΝΑ聚合酶、Bst (exo_)DNA聚合酶、klenow(exo_)DNA聚合酶)。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，捕獲探針通過(guò)表面探針間接固定在陣列基板上，且釋放DNA (例如cDNA)分子的步驟含有一個(gè)剪切步驟，則被釋放的核酸至少為部分雙鏈(例如，DNA:DNA、DNA:RNA或DNA:DNA/RNA雜合物)。為保證cDNA第二鏈合成反應(yīng)將定位域(特征標(biāo)識(shí)域)的互補(bǔ)鏈并入DNA (例如cDNA)第二鏈，鏈置換聚合酶是必要的。
[0168]顯然，從陣列表面或基板上釋放至少部分DNA (例如cDNA)分子或其擴(kuò)增子的步驟，可以通過(guò)許多方法來(lái)完成。該釋放步驟的主要目的在于產(chǎn)生能合并(或包含)捕獲探針的定位域(或其互補(bǔ)鏈)的分子，以便所述DNA (例如cDNA)分子或其擴(kuò)增子能根據(jù)其在陣列上的特征(或位置)被“標(biāo)記”。因此，該釋放步驟從陣列上除去了 DNA (例如cDNA)分子或其擴(kuò)增子，且所述DNA (例如cDNA)分子或其擴(kuò)增子合并了定位域或其互補(bǔ)鏈(通過(guò)借由例如捕獲探針的延長(zhǎng)將其并入已綁定的核酸(例如cDNA第一鏈)，并可選地，如果在陣列上進(jìn)行第二鏈合成，也拷入DNA第二鏈，或者如果在陣列上進(jìn)行擴(kuò)增，便拷入擴(kuò)增子)。因此，為了生成能夠與組織樣本的各種區(qū)域相關(guān)聯(lián)的序列分析數(shù)據(jù)，被釋放的分子中含有捕獲探針的定位域(或其互補(bǔ)鏈)是必要條件。
[0169]由于被釋放的分子可以是DNA (例如cDNA)分子或擴(kuò)增子的第一鏈或第二鏈，且由于捕獲探針可以間接固定在陣列上，可知曉，雖釋放步驟中可能含有將DNA (例如cDNA)分子從陣列上剪切的步驟，所述釋放步驟并非必需核酸剪切步驟；DNA (例如cDNA)分子或其擴(kuò)增子可以?xún)H通過(guò)令雙鏈分子變性來(lái)釋放，例如從cDNA第一鏈釋放cDNA第二鏈，或從模版上釋放擴(kuò)增子，或從表面探針釋放cDNA分子第一鏈(即:已延長(zhǎng)的捕獲探針)。相應(yīng)地，DNA(例如cDNA)分子可以通過(guò)核酸剪切和/或變性(例如，通過(guò)加熱來(lái)令雙鏈分子變性)來(lái)從陣列上釋放。若在陣列上原位實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，則顯然需要將變性釋放擴(kuò)增子包含在循環(huán)反應(yīng)中。
[0170]在一些實(shí)施例中，DNA (例如cDNA)分子在剪切域處由酶促剪切釋放，所述剪切域可以位于捕獲探針的通用域或定位域中。如上所述，該剪切域必須位于定位域的上游(5’端方向)，以便令被釋放的DNA (例如cDNA)分子中含有定位(標(biāo)識(shí))域。適宜用于核酸剪切的酶包括限制性?xún)?nèi)切酶，例如Rsal。其他的酶，例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化-裂解內(nèi)切酶VIII (USER?酶)的混合物，或MutY和T7核酸內(nèi)切酶I的組合，是本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式。
[0171] 在一個(gè)可選實(shí)施例中，DNA (例如cDNA)分子可以通過(guò)物理方法從陣列的表面或基板上釋放。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，捕獲探針間接地(例如，通過(guò)與表面探針雜交)固定在陣列基板上，那么，破壞核酸分子之間的相互作用就足夠了。破壞核酸分子間相互作用的方法，例如令雙鏈核酸分子變性，為本領(lǐng)域所熟知。釋放DNA (例如cDNA)分子的一種直接辦法(即將合成的DNA (例如cDNA)分子從陣列上剝落的方法)是使用能夠干擾雙鏈分子的氫鍵的溶液。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以通過(guò)熱水處理來(lái)釋放DNA (例如cDNA)分子，例如，使用溫度至少在85°C的水或緩沖液，優(yōu)選為至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99°C。除足以破壞氫鍵的溫度外，作為一種替代或補(bǔ)充方式，該溶液還可以含有鹽、表面活性劑等，進(jìn)一步動(dòng)搖核酸分子間的相互作用，達(dá)成DNA (例如cDNA)分子的釋放。
[0172]可知曉，使用高溫溶液，例如90_99°C的水，可能足以破壞用以將捕獲探針或表面探針固定在陣列基板上的共價(jià)鍵。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以通過(guò)向陣列施加熱水，破壞共價(jià)固定的捕獲探針或表面探針的方法來(lái)釋放DNA (例如cDNA)分子。
[0173]不言而喻，被釋放的DNA (例如cDNA)分子(含有被釋放的DNA (例如cDNA)分子的溶液)將被收集起來(lái)，用于進(jìn)一步操作，例如，第二鏈合成和/或擴(kuò)增。盡管如此，本發(fā)明的方法可以含有收集或回收被釋放的DNA (例如cDNA)分子的步驟。如上所述，在原位擴(kuò)增的情況下，被釋放的分子可以包含已綁定的核酸(例如cDNA)的擴(kuò)增子。
[0174]本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可能需要去除所有未延長(zhǎng)或未連接的捕獲探針。例如，該步驟可能處于從陣列釋放DNA分子的步驟之后?？梢杂萌魏蜗胗没蚍奖愕姆椒▉?lái)進(jìn)行此類(lèi)移除，包括，例如，使用酶來(lái)降解未延長(zhǎng)或未連接的探針，例如核酸外切酶。
[0175]DNA(例如cDNA)分子或其擴(kuò)增子從陣列上釋放之后，可能已獲得如上所述的修飾，接著對(duì)其進(jìn)行分析研究(例如，測(cè)定序列，雖然如上所述，并不要求實(shí)際的序列測(cè)定，但可以使用任何序列分析方法)。因此，可以采用任何核酸分析方法。序列分析步驟可以識(shí)別定位域，由此將接受分析的分子定位在組織樣本的某個(gè)位點(diǎn)上。類(lèi)似地，可以測(cè)定分析對(duì)象分子的性質(zhì)或身份。以此方式，可以測(cè)定陣列上乃至組織樣本上指定位置的核酸，例如RNA。由此一來(lái)，該分析步驟可以包括或使用任何方法來(lái)辨認(rèn)分析對(duì)象分子(乃至“目標(biāo)”分子)及其定位域。一般來(lái)說(shuō)，此類(lèi)方法是序列特異性方法。舉例來(lái)說(shuō)，該方法可以使用序列特異性引物或探針，尤其是定位域和/或待檢測(cè)或待分析的特定核酸分子的特異引物或探針，例如，與待測(cè)的核酸分子(如RNA或cDNA)相對(duì)應(yīng)的DNA分子。典型地，在此類(lèi)方法中，可以使用序列特異性擴(kuò)增引物，例如PCR引物。
[0176]在一些實(shí)施例中，可能需要分析目標(biāo)相關(guān)分子的子集或同族，例如，共享序列相似度和/或保守結(jié)構(gòu)域的一種特定蛋白組(例如一種受體蛋白族)的所有編碼序列。因此，此述擴(kuò)增和/或分析方法可以采用簡(jiǎn)并的或基因家族特異性的引物或探針，來(lái)實(shí)現(xiàn)與已捕獲的核酸或其衍生核酸(例如擴(kuò)增子)相雜交。在一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施例中，擴(kuò)增和/或分析方法可以同時(shí)采用通用引物(即:所有已捕獲序列通用的引物)和簡(jiǎn)并或?qū)δ繕?biāo)分子的子集具有特異性的基因家族特異性的引物。
[0177]因此，在一個(gè)實(shí)施例中，采用了基于擴(kuò)增反應(yīng)，特別是基于PCR反應(yīng)的序列分析方法。
[0178]但是，修飾和/或擴(kuò)增被釋放的DNA (例如cDNA)分子的步驟可能在樣本中引入其他的成分，例如，酶、引物、核苷酸等。因此，本發(fā)明的方法，可以在序列分析之前，進(jìn)一步包括一個(gè)對(duì)含有被釋放的DNA (例如cDNA)分子或擴(kuò)增子的樣本的純化步驟，例如，移除可能干擾測(cè)序反應(yīng)的寡核苷酸引物、核苷酸、鹽等?？梢圆捎萌魏芜m當(dāng)?shù)腄NA (例如cDNA)分子純化方法。
[0179]如上所述，可以對(duì)被釋放的DNA進(jìn)行直接或間接的序列分析。因此，序列分析基質(zhì)(可看作是面臨序列分析步驟或流程的分子)可以是直接從陣列上釋放的分子，或可以是其衍生物。因此，舉例來(lái)說(shuō)，在包含測(cè)序反應(yīng)的序列分析步驟中，測(cè)序模版可以是從陣列釋放的分子或其衍生分子。舉例來(lái)說(shuō)，從陣列釋放的DNA (例如cDNA)分子的第一鏈和/或第二鏈可以直接進(jìn)行序列分析(例如測(cè)序)，即可以直接參與序列分析反應(yīng)或過(guò)程(例如測(cè)序反應(yīng)或測(cè)序過(guò)程，或作為測(cè)序分子或以其它方式辨認(rèn)的分子)。在原位擴(kuò)增的情況下，被釋放的分子可以是擴(kuò)增子。可選地，被釋放的分子可以在序列分析(例如，測(cè)序或其他辨認(rèn)方式)前，進(jìn)行第二鏈合成步驟或擴(kuò)增步驟。因此，序列分析基質(zhì)(例如模版)可以是擴(kuò)增子，或從陣列直接釋放的分子的第二鏈。
[0180]雙鏈分子的兩條鏈都可以進(jìn)行序列分析(例如，測(cè)序)，但本發(fā)明并不限于此，還可以分析(例如，測(cè)序)單鏈分子(例如，cDNA)。舉例來(lái)說(shuō)，可以采用各種測(cè)序技術(shù)來(lái)進(jìn)行單分子測(cè)序，例如，Helicos或Pacbio技術(shù)，或正在開(kāi)發(fā)中的納米孔測(cè)序技術(shù)。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，可以對(duì)DNA (例如cDNA)的第一鏈進(jìn)行測(cè)序。DNA (例如cDNA)分子的第一鏈可能需要經(jīng)過(guò)3’端修飾才能進(jìn)行單分子測(cè)序。該步驟可以通過(guò)與處理DNA (例如cDNA)分子第二鏈類(lèi)似的方法完成。此類(lèi)操作為本領(lǐng)域所知。
[0181]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，序列分析會(huì)辨認(rèn)或揭示部分已捕獲的核酸(如RNA)序列和定位域的序列。定位域(或標(biāo)簽)的序列會(huì)標(biāo)識(shí)捕獲mRNA等核酸分子的特征。已捕獲的核酸分子(例如RNA)的序列可以與樣本來(lái)源生物的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，以確定其對(duì)應(yīng)的基因。通過(guò)確定組織樣本的哪一區(qū)域(例如，細(xì)胞)與特征接觸，便可能確定組織樣本的哪一區(qū)域正在表達(dá)所述基因(或含有該基因，例如，在空間基因組學(xué)研究中)。此分析可以用于本發(fā)明的方法中制得的所有DNA (例如cDNA)分子，獲得組織樣本的空間轉(zhuǎn)錄組或基因組。
[0182]在一個(gè)代表性示例中，可以分析測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)將捕獲探針按照特定種類(lèi)分類(lèi)，例如，按照定位域的序列。例如，該步驟可以通過(guò)使用FastX軟件工具盒的FASTQ識(shí)別碼分解器工具，將序列按照捕獲探針定 位域(標(biāo)簽)序列分別歸入單獨(dú)文檔。可以對(duì)每一種類(lèi)(即來(lái)自每一特征)的序列加以分析，以確定轉(zhuǎn)錄體的身份。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用如Bastn軟件來(lái)辨認(rèn)序列，將序列與一種或多種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，優(yōu)選為組織樣本來(lái)源生物的數(shù)據(jù)庫(kù)。若某數(shù)據(jù)庫(kù)序列與本發(fā)明的方法制得的序列相似度最高，則將所述數(shù)據(jù)庫(kù)序列的身份分配給本發(fā)明制得的序列。一般來(lái)說(shuō)，只有確定性為至少le_6，優(yōu)選為le_7、le_8或le_9的匹配會(huì)被看作是成功辨認(rèn)。
[0183]顯然，任何核酸測(cè)序方法都可以用于本發(fā)明的方法中。但是，所謂的“下一代測(cè)序”技術(shù)在本發(fā)明尤為適用。高通量測(cè)序在本發(fā)明的方法中尤為有用，因?yàn)樗鼘?duì)大量核酸在非常短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行部分測(cè)序。從近期爆發(fā)式增長(zhǎng)的全部或部分得到測(cè)序的基因組數(shù)量來(lái)看，要確定每個(gè)分子所對(duì)應(yīng)的基因，并不是非得對(duì)制得的DNA (例如cDNA)分子進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序不可。舉例來(lái)說(shuō)，DNA (例如cDNA)分子各端的前100個(gè)核苷酸應(yīng)該足夠用來(lái)辨認(rèn)捕獲原核酸(例如mRNA)的特征和所表達(dá)的基因。從DNA (例如cDNA)分子的“捕獲探針端”的序列反應(yīng)可以獲得定位域的序列以及轉(zhuǎn)錄體特異序列數(shù)據(jù)中至少約20個(gè)堿基，優(yōu)選為30或40個(gè)堿基?！胺遣东@探針端”的序列反應(yīng)可以獲得轉(zhuǎn)錄體特異序列數(shù)據(jù)中至少約70個(gè)堿基，優(yōu)選為80、90或100個(gè)堿基。
[0184]在一個(gè)代表性示例中，測(cè)序反應(yīng)可以基于可逆染色終止劑，例如用于Illumina?技術(shù)中。舉例來(lái)說(shuō)，DNA分子可以先在例如玻璃片或硅片上與引物連接并擴(kuò)增，形成局部克隆群落(橋式擴(kuò)增)。加入4種ddNTPs，并洗除未結(jié)合的核苷酸。與焦磷酸測(cè)序不同的是，DNA —次可以只延長(zhǎng)I個(gè)核苷酸。用照相機(jī)對(duì)熒光標(biāo)記核苷酸拍照，然后用化學(xué)方法移除染色劑和DNA上的3’端末端封閉物，以便進(jìn)行下一次循環(huán)?？芍貜?fù)該步驟直至獲得要求的序列數(shù)據(jù)。使用這一技術(shù)，可以在僅僅一塊載片上對(duì)上千核酸進(jìn)行同時(shí)測(cè)序。
[0185]其他高通量測(cè)序技術(shù)也可以同樣適用于本發(fā)明的方法，例如，焦磷酸測(cè)序。該方法中，DNA擴(kuò)增反應(yīng)在油溶液(微乳液PCR)中的水滴中進(jìn)行，每一水滴含有附著于涂有單一引物的微珠之上的單一 DNA模版，然后形成克隆群落。測(cè)序儀器含有許多皮升容量孔，每孔含有一個(gè)微珠及測(cè)序酶。焦磷酸測(cè)序采用熒光素酶發(fā)光來(lái)檢測(cè)添加至新生DNA的個(gè)體核苷酸，并用合并數(shù)據(jù)生成序列讀數(shù)。
[0186]正在開(kāi)發(fā)中的技術(shù)的一個(gè)示例，是對(duì)DNA聚合反應(yīng)中釋放的氫離子的檢測(cè)。用單一種類(lèi)的核苷酸關(guān)注含有待測(cè)序的模版DNA鏈的微孔。若引入的核苷酸與模版的前導(dǎo)核苷酸互補(bǔ)，則將其加入增長(zhǎng)中的互補(bǔ)鏈；隨之釋放的一個(gè)氫離子，觸動(dòng)高靈敏度的離子感應(yīng)器，從而指示反應(yīng)的發(fā)生。如果模版序列中存在同聚物重復(fù)，則單個(gè)循環(huán)中便會(huì)有多個(gè)核苷酸得到結(jié)合，從而引起對(duì)應(yīng)數(shù)量的氫離子的釋放，以及成比例的較高電信號(hào)。
[0187]因此，顯然未來(lái)的測(cè)序形式正在緩慢地成為可用形式；這些平臺(tái)的主要特點(diǎn)之一在于運(yùn)行時(shí)間更短，顯然，其他的測(cè)序技術(shù)將來(lái)也會(huì)用于本發(fā)明的方法中。
[0188]本發(fā)明的一個(gè)必要特點(diǎn)，如上所述，是將已捕獲的核酸分子的互補(bǔ)鏈結(jié)合在捕獲探針上的步驟，例 如，對(duì)已捕獲的RNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為本領(lǐng)域所熟知，且代表性的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，反應(yīng)混合物包括反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP和適當(dāng)?shù)木彌_液。反應(yīng)混合物可以含有其他成分，例如Rnase抑制物。引物和模版分別是捕獲探針的捕獲域和已捕獲的RNA分子，如上所述。在所述方法主題中，典型地，每種dNTP的用量在10-5000 μ M之間，通常是從約20-1000μΜ。顯然，可以使用DNA聚合酶活性的酶，通過(guò)等同的反應(yīng)來(lái)生成捕獲的DNA分子的互補(bǔ)鏈。此類(lèi)反應(yīng)為本領(lǐng)域所熟知，且下文中將會(huì)進(jìn)一步詳細(xì)敘述。
[0189]所需的反轉(zhuǎn)錄酶活性可以由一種或多種不同的酶來(lái)提供，其中適合的例子有:M-MLV>MuLV>AMV>HIV、ArrayScript?>MultiScribe?、ThermoScript? 以及SuperScript? 1、IIIII 酶。
[0190]反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)可以在任何適當(dāng)溫度下進(jìn)行，取決于酶的性質(zhì)。典型地，反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)在37-55°C間實(shí)施，但此范圍之外的溫度也可能適合。反應(yīng)時(shí)間可以短至1、2、3、4或5分鐘，或者長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)。典型地，反應(yīng)時(shí)間在5-120分鐘之間，根據(jù)選擇，優(yōu)選為5-60、5-45或5-30分鐘，或者1-10或1-5分鐘。反應(yīng)時(shí)間并非關(guān)鍵因素，根據(jù)意愿可以采用任何的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)度。
[0191]如上所述，本方法的某些實(shí)施例包括擴(kuò)增步驟，用以增加所制得的DNA(例如cDNA)分子的拷貝數(shù)，例如為了充實(shí)樣本，以更好地表現(xiàn)從組織樣本中捕獲的核酸(轉(zhuǎn)錄體)。根據(jù)需要，擴(kuò)增反應(yīng)可以是線性的或者指數(shù)的，適用的代表性擴(kuò)增反應(yīng)操作流程包括，但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR);等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，等等。
[0192]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為本領(lǐng)域所熟知，如申請(qǐng)?zhí)枮?，683，202 ;4，683，195 ；4，800，159 ；4, 965，188和5，512，462的美國(guó)專(zhuān)利中所述，所述專(zhuān)利以援引的方式并入本公開(kāi)。在代表性的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，反應(yīng)混合物含有上述從陣列釋放的DNA(例如cDNA)分子，所述DNA (例如cDNA)分子與一種或多種用于引物延長(zhǎng)反應(yīng)中的引物合并,例如，與第一和/第二擴(kuò)增域相雜交的PCR引物(例如用于幾何(或指數(shù))擴(kuò)增反應(yīng)的正向引物和反向引物，或用于線性擴(kuò)增反應(yīng)的單個(gè)引物)。與被釋放的DNA (例如cDNA)分子(方便起見(jiàn)，下文中稱(chēng)為模版DNA)相接觸的寡核苷酸引物將具有足夠的長(zhǎng)度，來(lái)支持退火處理?xiàng)l件下與互補(bǔ)模板DNA的雜交反應(yīng)(下文中將更詳細(xì)敘述)。引物的長(zhǎng)度取決于擴(kuò)增域的長(zhǎng)度，但總地來(lái)說(shuō)至少有10bp，通常至少15bp，更常見(jiàn)的是至少16bp長(zhǎng)，且可以長(zhǎng)達(dá)30bp或以上；引物的長(zhǎng)度范圍一般可在18-50bp之間，通常是約20-35bp。模版DNA可以與單個(gè)引物或一對(duì)引物(正向引物和反向引物)接觸，取決于是否需要進(jìn)行模版DNA的引物延長(zhǎng)、線性或指數(shù)擴(kuò)增。
[0193]除上述成分以外，本方法主題中制得的典型反應(yīng)混合物還包括聚合酶和脫氧核糖核酸三磷酸鹽(dNTPs)?？梢酝ㄟ^(guò)一種或多種不同的聚合酶來(lái)提供所需的聚合酶活性。在許多實(shí)施例中，反應(yīng)混合物至少包括A族(Family A)聚合酶,且適用的典型A族聚合酶包括，但不限于:棲熱水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶,包括天然聚合酶(Taq)及其衍生物和同系物，例如 Klentaq(如 Barnes et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA( 1994)91:2216-2220 所述)；嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilus)聚合酶,包括天然聚合酶(Tth)及其衍生物和同系物，以及類(lèi)似物。在某些實(shí)施例中，所實(shí)施的擴(kuò)增反應(yīng)是高保真度反應(yīng)，反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步包括具有3’-5’端核酸外切酶活性的聚合酶，例如，可以有B族(Family B)聚合酶提供該酶活性，且適用的B族聚合酶包括,但不限于:海濱嗜熱球菌(Thermococcus litoralis)DNA 聚合酶(Vent)，如 Perler et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1992) 89:5577-5581 所述；熱球菌屬物種GB_D(Pyrococcus species GB-D)(Deep Vent);如Lundberget al., Gene(1991) 108:1-6所述的激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu),烏茲熾熱球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)以及類(lèi)似物。若反應(yīng)混合物中同時(shí)含有A族和B族聚合酶，則反應(yīng)混合物中的A族聚合酶的含量可以高于B族聚合酶，其活性差通常至少為10倍，更常見(jiàn)的是至少約100倍。一般 來(lái)說(shuō)，反應(yīng)混合物包括4中不同類(lèi)型的dNTPs，與4種天然堿基相對(duì)應(yīng)，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本方法主題中，典型地，每種dNTP的含量范圍約在10-5000 μ Μ,通常在約20-1000 μ M之間。
[0194]本方法主題的反轉(zhuǎn)錄酶和/或擴(kuò)增反應(yīng)步驟中制得的反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步包括一種水性緩沖介質(zhì)，所述介質(zhì)中含有一價(jià)離子源、二價(jià)陽(yáng)離子源和緩沖劑?？梢圆捎萌魏伪阌谑褂玫囊粌r(jià)離子源，例如KC1、醋酸鉀、醋酸銨、谷氨酸鉀、NH4C1、硫酸銨及類(lèi)似物。二價(jià)陽(yáng)離子可以是鎂、錳、鋅及類(lèi)似物，且陽(yáng)離子一般是鎂。任何便利的鎂離子源都可以采用，包括MgCl2、醋酸鎂及類(lèi)似物。緩沖液中Mg2+的含量范圍可以在0.5-10mM之間，但優(yōu)選范圍在3-6mM之間，理想值為5mM。緩沖液中可能存在的代表性緩沖介質(zhì)或鹽類(lèi)包括三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三甲基甘氨酸(Tricine)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、丙磺酸(MOPS)及類(lèi)似物，其中緩沖劑的典型含量范圍在約5-150mM之間，通常為約IO-1OOmM之間，更常見(jiàn)的是約20-50mM，且在某些優(yōu)選實(shí)施例中，緩沖介質(zhì)的含量足以提供約為6.0-9.5的pH范圍，其中最為優(yōu)選的是72°C時(shí)pH為7.3。緩沖介質(zhì)中可以含有的其他介質(zhì)包括螯合劑，例如EDTA、EGTA及類(lèi)似物。
[0195]在本方法主題的各步驟所需的反轉(zhuǎn)錄酶、DNA延長(zhǎng)或擴(kuò)增反應(yīng)混合物的制備中，可以按照任何方便的順序合并各種成分。舉例來(lái)說(shuō)，在擴(kuò)增反應(yīng)中，可以先向緩沖液中加入引物、聚合酶，然后是模版DNA，或者同時(shí)混合所有的各種成分來(lái)制備反應(yīng)混合物。
[0196]如上所述，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以通過(guò)向核酸分子的末端添加擴(kuò)增域來(lái)修飾DNA (例如cDNA)分子，該過(guò)程可以包括連接反應(yīng)。當(dāng)捕獲探針間接固定在陣列表面的時(shí)候，陣列上捕獲探針的原位合成也需要通過(guò)連接反應(yīng)來(lái)完成。
[0197]如本領(lǐng)域中所知，連接酶催化兩個(gè)緊鄰的核酸間并置的3’-羥基和5’-磷酸末端之間的磷酸二酯鍵的形成?？梢圆捎萌魏畏奖愕倪B接酶，其中適用的代表性連接酶包括，但不限于:熱敏性和熱穩(wěn)定性連接酶。熱敏性連接酶包括，但不限于，噬菌體T4DNA連接酶、噬菌體T7連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶包括，但不限于，Taq連接酶、Tth連接酶和Pfu連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶可以從嗜熱或者極端嗜熱的生物中獲得，包括但不限于，原核生物、真核生物或古細(xì)菌。本發(fā)明的方法中可以采用某些RNA連接酶。
[0198]該鏈接步驟中，將適當(dāng)?shù)倪B接酶和根據(jù)必要性和/或醫(yī)院選用的任何試劑與反應(yīng)混合物合并，并在適合相關(guān)寡核苷酸進(jìn)行連接反應(yīng)的條件下維持。連接反應(yīng)條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。連接反應(yīng)中，某些實(shí)施例中的反應(yīng)混合物可以保持在約4°C至約50°C，例如在約20°C至約37°C的溫度下保持一段時(shí)間，所述時(shí)間為約5秒鐘至約16小時(shí)，例如從約I分鐘至約I小時(shí)。但在其他一些實(shí)施例中，反應(yīng)混合物可以在約35°C至約45°C的范圍內(nèi)，例如從約37°C至約42°C，如在(約)38°C、39°C、40°C或41V維持一段時(shí)間，所述時(shí)間范圍在約5秒鐘至約16小時(shí)之間，例如從約I分鐘至約I小時(shí)，包括從約2分鐘至約8小時(shí)。在一個(gè)代表性實(shí)施例中，連接反應(yīng)混合物包括50mM Tris (pH7.5)、IOmM MgCl2UOmM DTTUmMATP、25mg/ml BSA、0.25units/ml RNase 抑制物和 0.125units/ml T4DNA 連接酶。在又一個(gè)代表性實(shí)施例中，采用了 2.125mM鎂離子、0.2units/ml RNase抑制物和0.125units/mlRNase DNA連接酶。反應(yīng)中所用的接合體含量取決于樣本中的DNA (例如cDNA)分子的濃度，通常在DNA (例如cDNA)的摩爾含量的10-100倍之間。
[0199]在一個(gè)代表性示例中，本發(fā)明的方法可以含有以下步驟:
[0200](a)將陣列與組織樣本相接觸，其中所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，且每一種類(lèi)在所述陣列中各占不同位置，且所述探針定向?yàn)榫哂?’自由端，以使所述探針能作為反轉(zhuǎn)錄酶(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0201](i)與陣列上的捕獲探針位置相對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0202](ii)捕獲域；
[0203]以令組織樣本的RNA與所述捕獲探針相雜交。
[0204](b)對(duì)陣列上的組織樣本成像；
[0205](c)對(duì)捕獲的mRNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以生成cDNA分子；
[0206](d)洗滌陣列以去除殘余組織；
[0207]Ce)從陣列表面釋放至少部分cDNA分子；
[0208](f)對(duì)釋放的cDNA分子實(shí)施cDNA第二鏈合成；
[0209]以及
[0210](g)分析(例如測(cè)序)cDNA分子的序列。
[0211]在一個(gè)可選的代表性示例中，本發(fā)明的方法可以含有以下步驟:[0212](a)將陣列與組織樣本相接觸，其中所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了至少兩種捕獲探針，且每一種類(lèi)在所述陣列中各占不同位置，且所述探針定向?yàn)榫哂?’自由端，以使所述探針能作為反轉(zhuǎn)錄酶(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0213](i)與陣列上的捕獲探針位置相對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0214](ii)捕獲域；
[0215]以令組織樣本的RNA與所述捕獲探針相雜交；
[0216](b)可選地，對(duì)組織樣本進(jìn)行補(bǔ)水；
[0217](C)對(duì)已捕獲的mRNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以生成cDNA分子的第一鏈，且可選地，合成cDNA分子的第二鏈；
[0218](d)對(duì)陣列上的組織樣本成像；
[0219](e)洗滌陣列以去除殘余組織；
[0220]Cf)從陣列表面釋放至少部分cDNA分子；
[0221](g)對(duì)釋放的cDNA分子實(shí)施cDNA第二鏈合成；
[0222]以及
[0223](h)分析(例如測(cè)序)cDNA分子的序列。
[0224]在一個(gè)代表性示例中，本發(fā)明的方法可以含有以下步驟:
[0225](a)將陣列與組織樣本相接觸，其中所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，且每一種類(lèi)在所述陣列中各占不同位置，且所述探針定向?yàn)榫哂?’自由端，以使所述探針能充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0226](i)與陣列上的捕獲探針位置相對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0227](ii)捕獲域；
[0228]以令組織樣本的RNA與所述捕獲探針相雜交。
[0229](b)可選地，對(duì)陣列上的組織樣本成像；
[0230](c)對(duì)捕獲的mRNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以生成cDNA分子；
[0231](d)可選地，若未進(jìn)行步驟(b)的成像步驟，則對(duì)陣列上的組織樣本成像；
[0232](e)洗滌陣列以去除殘余組織；
[0233](f)從陣列表面釋放至少部分cDNA分子；
[0234](g)對(duì)已釋放的cDNA分子實(shí)施cDNA第二鏈合成；
[0235](h )擴(kuò)增雙鏈cDNA分子；
[0236]( i )可選地，純化cDNA分子，以除去可能干擾測(cè)序反應(yīng)的成分；
[0237]以及
[0238]( j )分析(例如測(cè)序)cDNA分子的序列。
[0239]本發(fā)明包括上述方法中各步驟的任何適當(dāng)組合?？芍獣?，本發(fā)明還包括這些方法的變形，例如，在陣列上進(jìn)行原位擴(kuò)增，以及包括了省略成像步驟的方法。
[0240]本發(fā)明還可以被看做是包括一種制作或生產(chǎn)陣列的方法，所述陣列(i)用于從與其相接觸的組織樣本上捕獲mRNA;或(ii)用于確定和/或分析組織樣本的(例如，部分或全局)轉(zhuǎn)錄組，所述方法包括在陣列基板上直接或間接地固定多種捕獲探針，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0241](i)與陣列上的捕獲探針位置相對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0242](ii)捕獲域；
[0243]本發(fā)明用于生產(chǎn)陣列的方法可以進(jìn)一步限定為，固定在陣列上的每種捕獲探針都作為一個(gè)特征。
[0244]將捕獲探針固定于陣列的方法，可以采用如上所述的任何適當(dāng)方法來(lái)完成。當(dāng)捕獲探針間接固定在陣列上時(shí)，捕獲探針可以在陣列上合成。所述方法可以含有一個(gè)或多個(gè)以下任意步驟:
[0245](a)將多種表面探針直接或間接固定在陣列基板上，其中表面探針含有:
[0246](i)能夠與部分捕獲域寡核苷酸(不用于捕獲RNA等核酸的部分)相雜交的結(jié)構(gòu)域；
[0247](ii)互補(bǔ)定位域；以及
[0248](iii)互補(bǔ)通用域；
[0249](b)將捕獲域寡核苷酸和通用域寡核苷酸與固定在陣列上的表面探針相雜交；
[0250](c)通過(guò)模版化的聚合反應(yīng)，延長(zhǎng)通用域寡核苷酸，以生成捕獲探針的定位域；以及
[0251](d)將定位域連接至捕獲域寡核苷酸，以生成捕獲寡核苷酸。
[0252]步驟(d)中的連接反應(yīng)可以與`步驟(C)中的延長(zhǎng)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，因此，該反應(yīng)并非必須在單獨(dú)的一步中進(jìn)行，當(dāng)然，根據(jù)意愿也可以這樣做。
[0253]按照本發(fā)明的上述陣列生產(chǎn)方法制造出來(lái)的陣列，其特征可以如上所述進(jìn)行進(jìn)一步限定。
[0254]雖然如上所述，本發(fā)明涉及RNA的檢測(cè)或分析以及轉(zhuǎn)錄組的分析或檢測(cè)，但可知曉，所述原理可以同理應(yīng)用于細(xì)胞DNA的檢測(cè)或分析以及用于基因組研究。因此，從更廣闊的視角來(lái)看，本發(fā)明一般說(shuō)來(lái)可以看做是用于檢測(cè)核酸，從更具體的方面來(lái)說(shuō)，可以看作是提供了 DNA的分析或檢測(cè)方法?？臻g信息可能會(huì)對(duì)基因組學(xué)相關(guān)研究具有價(jià)值，即帶空間解析度的DNA分子檢測(cè)和/或分析。根據(jù)本發(fā)明，這可以通過(guò)基因組標(biāo)簽來(lái)達(dá)成。此類(lèi)局部或空間檢測(cè)方法可以會(huì)在例如組織的不同細(xì)胞或區(qū)域中的基因組變異研究中有用，例如比較正常和病態(tài)細(xì)胞或組織(如正常vs.腫瘤細(xì)胞或組織)，或研究疾病進(jìn)程中的基因組變化等。舉例來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞可以包含具有不同的基因組變異體的細(xì)胞異源種群(例如，變異和/或其他基因異常，如染色體重排、染色體擴(kuò)增/刪除/插入等)。不同細(xì)胞中基因組變異或不同基因組位點(diǎn)的局部檢測(cè)，在這樣的情況下會(huì)有用，例如，研究基因組變異的空間分布。此方法的一個(gè)主要用途在于腫瘤分析。例如，在本發(fā)明的范圍中，可以制備出為捕獲一個(gè)特征的整個(gè)細(xì)胞的基因組所設(shè)計(jì)的陣列。因此，可以比較組織樣本的不同細(xì)胞。顯然，本發(fā)明并不局限于這一設(shè)計(jì)，而可能存在其他可能的變化方式，其中對(duì)DNA進(jìn)行局部檢測(cè)，且陣列上DNA的捕獲位置與組織樣本的某個(gè)位置或位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。
[0255]相應(yīng)地，在一個(gè)更廣泛的方面，本發(fā)明可以看作是提供了組織樣本中核酸的局部檢測(cè)方法,包括:
[0256](a)提供一種陣列，所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，令每一種類(lèi)探針在所述陣列中各占不同位置且定向?yàn)榫哂?’自由端，以使所述探針能充當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)的引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0257](i)與所述陣列上的所述探針的位置對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0258](ii)捕獲域；
[0259](b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上捕獲探針的位置能與所述組織樣本上的某個(gè)位置相關(guān)聯(lián)，并允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0260](c)以所述捕獲探針作為延長(zhǎng)引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子上生成DNA分子，其中所述被延長(zhǎng)或連接的DNA分子通過(guò)定位域來(lái)標(biāo)記；
[0261](d)可選地，產(chǎn)生一條所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈，和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記DNA ；
[0262](e)從所述陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；
[0263](f)直接或間接分析被釋放DNA分子的序列(例如，測(cè)序)。
[0264]如上文中更為詳細(xì)的描述，任何核酸分析方法都可以用來(lái)進(jìn)行分析步驟；典型地，可以包括測(cè)序，但實(shí)施序列確定并不是必要的。例如，可以采用序列特異性的分析方法。例如可以實(shí)施序列特異性的擴(kuò)增方式，如使用定位域特異性的引物和/或針對(duì)特定目標(biāo)序列的引物，例如，待測(cè)的特定目標(biāo)DNA (即:與特定的cDNA/RNA、基因、基因變異體、基因組位點(diǎn)或基因組變異 等相對(duì)應(yīng)的DNA).一種范例分析方法是序列特異性PCR反應(yīng)。
[0265]步驟(f)中獲得的序列分析(例如測(cè)序)信息可以用于獲得樣本的核酸相關(guān)的空間信息。換句話(huà)說(shuō)，序列分析信息可以提供樣本的核酸的位置相關(guān)信息。該空間信息可以來(lái)自已確定或辨認(rèn)的序列等的分析信息，例如可以揭示特定核酸分子的存在，該特定核酸分子的存在可能本身在所用組織樣本中就含有有用空間信息，和/或可以結(jié)合組織樣本在陣列上的位置與序列分析信息來(lái)推定空間信息(例如，空間定位)。但是，如上所述，可以通過(guò)將序列分析數(shù)據(jù)與組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)來(lái)方便地獲取空間信息，這體現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中。
[0266]相應(yīng)地，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本方法還可以包括如下步驟:
[0267](g)將所述陣列分析信息與所述組織樣本圖像相關(guān)聯(lián)，其中組織樣本在步驟(C)之前或之后成像。
[0268]步驟(a)中涉及的引物延長(zhǎng)反應(yīng)可以限定為聚合酶催化的延長(zhǎng)反應(yīng)，其作用在于，獲取與捕獲探針共價(jià)連接的已捕獲核酸分子的互補(bǔ)鏈，也就是，以捕獲探針作為引物和以已捕獲的核酸作為模版，合成互補(bǔ)鏈。換句話(huà)說(shuō)，所述延長(zhǎng)反應(yīng)可以是通過(guò)任何聚合酶來(lái)實(shí)施的任何引物延長(zhǎng)反應(yīng)。所述核酸可以是RNA或DNA。相應(yīng)地，所述聚合酶可以是任何聚合酶；可以是反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶。連接反應(yīng)可以通過(guò)任何連接酶實(shí)施，其作用在于將已捕獲的核酸分子的互補(bǔ)鏈綁定在捕獲探針上，即:其中已捕獲的核酸分子(雜交于捕獲探針上)含部分雙鏈，且其互補(bǔ)鏈與捕獲探針相連接。
[0269]這一方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，即為如上所述用于轉(zhuǎn)錄組的確定和/或分析或者用于RNA測(cè)定的方法。在一個(gè)替代方式的優(yōu)選實(shí)施例中，所述待測(cè)核酸分子為DNA。在此種實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種組織樣本中DNA的局部檢測(cè)方法，包括:
[0270](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，且每一種類(lèi)在所述陣列中各占不同位置，且其方向上具有3’自由端，以使所述探針能作為引物引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0271](i)與所述陣列上的所述探針的位置對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0272](ii)捕獲域；
[0273](b)將所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，并允許所述組織樣本上的DNA與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0274](c)將所述組織樣本中的DNA片段化，其中所述片段化在陣列與組織樣本相接觸的步驟(b)之前、之中或者之后實(shí)施；
[0275](d)以已捕獲的DNA片段作為模版，通過(guò)引物延長(zhǎng)反應(yīng)來(lái)延長(zhǎng)所述捕獲探針，或通過(guò)連接反應(yīng)將已捕獲的DNA片段連接在捕獲探針上，以產(chǎn)生DNA分子，其中所述被延長(zhǎng)或連接的DNA分子通過(guò)定位域來(lái)標(biāo)記；
[0276](e)可選地，產(chǎn)生一條所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記DNA ；
[0277](f)從所述陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括所述定位域或其互 補(bǔ)鏈；
[0278](g)直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。
[0279]該方法還可以進(jìn)一步包括以下步驟:
[0280](h)將所述陣列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中組織樣本在步驟(d)之前或之后成像。
[0281]在空間基因組學(xué)研究中，且目標(biāo)核酸是DNA時(shí)，某些情況下優(yōu)選包括成像步驟以及圖像關(guān)聯(lián)步驟。
[0282]在一些捕獲DNA的實(shí)施例中，所述DNA可以是細(xì)胞中出現(xiàn)的任何DNA分子。因此，它可以是基因組(即細(xì)胞核的)DNA、線粒體DNA或質(zhì)粒DNA，如葉綠體DNA。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述DNA為基因組DNA。
[0283]可知曉，當(dāng)在步驟(b)所述接觸(即在組織樣本放置于陣列上)之后才實(shí)施片段化時(shí)，DNA的片段化發(fā)生于同捕獲域相雜交之前。換句話(huà)說(shuō)，DNA片段與所述捕獲探針的捕獲域相雜交(或更具體地說(shuō)，允許雜交)。
[0284]本發(fā)明在此方面的一個(gè)特定實(shí)施例中，優(yōu)選地，但并非必須地，可以為組織樣本的DNA片段引入一個(gè)結(jié)合域，來(lái)允許或促進(jìn)陣列上的捕獲探針對(duì)所述片段的捕獲。相應(yīng)地，所述結(jié)合域能夠與捕獲探針的捕獲域雜交。因此，所述結(jié)合域可以被看做是捕獲域的互補(bǔ)鏈(即:可以被看做是互補(bǔ)捕獲域)，但并不要求捕獲域和結(jié)合域之間的絕對(duì)互補(bǔ)，僅要求結(jié)合域的互補(bǔ)程度足以允許有效雜交的發(fā)生，即:令組織樣本中的DNA片段能夠與捕獲探針的捕獲域相雜交。引入這樣一個(gè)結(jié)合域，可以保證樣本DNA直到片段化步驟之后才與捕獲探針結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的操作流程向DNA片段提供結(jié)合域，例如，通過(guò)令可含有結(jié)合域的接合體或連接子序列相連接。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用含有一個(gè)伸出端的連接子序列。結(jié)合域可以存在于此連接子的單鏈部分，以便于接下來(lái)該連接子與DNA片段的連接；含有結(jié)合域的單鏈部分能用于與捕獲探針的捕獲域的雜交?？蛇x地，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶引入聚核苷酸尾(例如，同聚體尾，如poly-A結(jié)構(gòu)域)來(lái)引入結(jié)合域。該步驟可以通過(guò)使用與上述RNA方法中引入通用域的類(lèi)似操作來(lái)實(shí)施。因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中，可以引入一個(gè)共同結(jié)合域。換句話(huà)說(shuō)，就是所有DNA片段共同的結(jié)合域，可以用于達(dá)成陣列上的片段捕獲。
[0285]實(shí)施加尾反應(yīng)來(lái)引入(共同)結(jié)合域時(shí)，可以保護(hù)陣列上的捕獲探針不受加尾影響，即:可如前文封閉或遮蔽捕獲探針。該步驟可以通過(guò)，例如用封閉寡核苷酸與捕獲探針雜交來(lái)達(dá)成，例如與捕獲探針的伸出端(如單鏈部分)雜交。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)捕獲域含有Poly-T序列時(shí)，該封閉寡核苷酸可以是poly-A寡核苷酸。該封閉寡核苷酸可以含有已封閉的3’端(即:無(wú)法延長(zhǎng)或加尾的一端)。如上所述，對(duì)捕獲探針，還可以通過(guò)化學(xué)和/或酶促修飾的方法來(lái)加以保護(hù)，即加以封閉。
[0286]當(dāng)按照前文通過(guò)連接子的連接反應(yīng)來(lái)引入結(jié)合域時(shí)，可知曉，與其延長(zhǎng)捕獲探針來(lái)生成一個(gè)含有捕獲探針引物的定位標(biāo)簽的已捕獲DNA片段互補(bǔ)副本，還可以將DNA片段連接至捕獲探針3’端。如上所述，連接反應(yīng)要求待連接的5’端磷酸化。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施例中，新增的連接子的5’端，即將要連接至捕獲探針的一端(即新增至DNA片段的連接子的非伸出端)，會(huì)經(jīng)過(guò)磷酸化。在該連接反應(yīng)的實(shí)施例中，相應(yīng)地，可知曉，可以將一個(gè)連接子連接到雙鏈DNA片段上，所述連接子具有含有結(jié)合域的單鏈伸出3’端。與陣列接觸之時(shí)，所述伸出端便與捕獲探針的捕獲域相雜交。該雜交反應(yīng)將捕獲探針的3’端與新增的連接子的5’端(非伸出端)并置及連接。因此，捕獲探針，乃至定位域，都通過(guò)該連接反應(yīng)并入已捕獲的DNA片段。該實(shí)施例的原理如圖21所示。
[0287]因此，在一種更具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明在該方面的方法可以包括:
[0288](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類(lèi)在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端，以使所述探針能充當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)的引物，其中所述捕獲探針的每一種類(lèi)都包括一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括:
[0289](i)與陣列上的探 針位置對(duì)應(yīng)的定位域，和
[0290](ii)捕獲域；
[0291](b)將所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)；
[0292](c)將所述組織樣本中的DNA片段化，其中所述片段化在陣列與組織樣本相接觸的步驟(b)之前、之中或之后實(shí)施；
[0293](d)為所述DNA片段引入一個(gè)結(jié)合域，所述結(jié)合域可以與所述捕獲域雜交；
[0294](e)允許所述DNA片段與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0295]Cf)以已捕獲的DNA片段作為模版，通過(guò)引物延長(zhǎng)反應(yīng)延長(zhǎng)所述捕獲探針，或通過(guò)連接反應(yīng)將已捕獲的DNA片段連接在捕獲探針上，以生成DNA分子，其中所述被延長(zhǎng)或連接的DNA分子通過(guò)定位域來(lái)標(biāo)記；
[0296](g)可選地，產(chǎn)生一條所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記DNA ；
[0297](h)從所述陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括所述定位域或其互補(bǔ)鏈；
[0298]( i )直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。[0299]可選地，該方法還可以進(jìn)一步包括以下步驟:
[0300]( j )將所述陣列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中組織樣本在步驟(f )之前或之后成像。
[0301]如上所述的核酸或DNA檢測(cè)方法中，生成被標(biāo)記核酸/DNA的互補(bǔ)副本亦或擴(kuò)增被標(biāo)記DNA的可選步驟，可以包括按照前文RNA/轉(zhuǎn)錄組分析/檢測(cè)方法中所述的原理，使用鏈置換聚合酶。適當(dāng)?shù)逆溨脫Q聚合酶如上所述。該步驟的目的在于，保證定位域被復(fù)制引入所述互補(bǔ)副本或擴(kuò)增子，尤其是在捕獲探針通過(guò)與表面探針雜交固定在陣列上的情況下。
[0302]但是，本步驟中，鏈置換聚合酶的使用并不是必要的。舉例來(lái)說(shuō)，可以同時(shí)利用非鏈置換聚合酶和與定位域雜交的寡核苷酸的連接反應(yīng)。該流程類(lèi)同于上述捕獲探針在陣列上的合成。
[0303]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可以用于確定和/或分析組織樣本的全部基因組，例如，組織樣本的全基因組。但是，本方法并不限于此，還包括確定和/或分析全部或部分基因組。因此，本方法可以包括確定和/或分析基因組的部分或子集，例如，對(duì)應(yīng)于染色體的一個(gè)基因子集或基因群的部分基因組，如特定基因群或染色體群、或基因組的特定區(qū)域或部分，例如涉及某一特定疾病、狀況、組織類(lèi)型等。因此，本方法可以用于檢測(cè)或分析腫瘤組織與正常組織相比之下的基因組序列或基因組位點(diǎn)，或者甚至一個(gè)組織樣本中的不同細(xì)胞類(lèi)型。還可以檢測(cè)不同細(xì)胞、細(xì)胞群、組織、局部組織、組織類(lèi)型的不同基因組變異或位點(diǎn)的存在、缺失、分布或定位。
[0304]從另一方面來(lái)看，本方法的上述步驟可以看作是提供了一種獲取關(guān)于核酸的空間信息的方法，例如組織樣本的基因組序列、變異體或位點(diǎn)。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的方法可以用于標(biāo)記(或標(biāo)識(shí))基因組，尤其是個(gè)體或空間分布的基因組。
[0305]從另一 角度來(lái)看，本發(fā)明的方法可以看作是一種組織樣本的DNA的空間檢測(cè)方法，或一種以空間解析度檢測(cè)DNA的方法，或一種對(duì)組織樣本的DNA進(jìn)行局部或空間確定和/或分析的方法。尤其是，本方法可以用于組織樣本中基因或基因組序列或基因組變異體或位點(diǎn)(例如，基因組變異體或位點(diǎn)的分布)的局部或空間檢測(cè)、確定和/或分析。局部/空間檢測(cè)/確定/分析的意思是，可以對(duì)組織樣本DNA在細(xì)胞或組織中的原生位置或位點(diǎn)進(jìn)行定位。因此，舉例來(lái)說(shuō)，可以將DNA在樣本中的一個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群或細(xì)胞類(lèi)型，或組織樣本的特定區(qū)域進(jìn)行定位?？梢源_定DNA (或換句話(huà)說(shuō)，組織樣本中DNA的位點(diǎn)或位置)的原生位點(diǎn)或位置，例如基因組變異體或位點(diǎn)。
[0306]因此，可知曉，本發(fā)明的陣列可以用于捕獲核酸，例如，與所述陣列相接觸的組織樣本DNA。該陣列還可以用于確定和/或分析組織樣本的部分或全局基因組，或用于獲取組織樣本中含空間限定信息的部分或全局基因組。因此，本發(fā)明的方法可以被看做是組織樣本中一種或多種基因組序列(或變異體，或基因位點(diǎn))的空間分布的量化方法。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)組織樣本中一種或多種基因組序列、基因組變異體或基因組基因位點(diǎn)。再換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的方法可用于同時(shí)確定組織樣本中一種或多種基因組序列、基因組變異體或基因組基因位點(diǎn)的位置或分布。更進(jìn)一步地，該方法可以看做是以空間解析度，例如二維空間解析度，對(duì)組織樣本的核酸(如DNA))進(jìn)行部分或全局分析的方法。
[0307]本發(fā)明還可以看作是為本發(fā)明的方法提供一種陣列，所述陣列包括基板，所述基板上含有多種直接或間接固定的捕獲探針，且每種探針在陣列上占據(jù)不同位置并定向?yàn)榫哂凶杂?’端，以能令所述探針具有延長(zhǎng)引物或連接引物的作用，其中所述捕獲探針的每個(gè)種類(lèi)都含有一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在其5’至3’端的方向上含有:
[0308](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，以及
[0309](ii)捕獲域，用于捕獲與所述陣列相接觸的組織樣本的核酸。
[0310]在其中一個(gè)方面中，已捕獲的核酸分子為DNA。捕獲域可以針對(duì)待檢測(cè)的一種特定DNA或DNA的特定種類(lèi)、群組具有特異性，例如，按照前文所述RNA檢測(cè)的類(lèi)同方法，令捕獲域與目標(biāo)DNA特定基元序列，如保守序列，進(jìn)行特異性雜交?？蛇x地，可以為待捕獲的DNA引入一個(gè)結(jié)合域，例如，如上所述的共同結(jié)合域，所述結(jié)合域可以被捕獲探針的捕獲域識(shí)別。因此，如上所述，結(jié)合域可以是例如同聚物序列，如poly-A。同樣地，可以按照類(lèi)似前文所述設(shè)計(jì)RNA/轉(zhuǎn)錄組分析或檢測(cè)的原理和方法來(lái)獲得該結(jié)合域。在此情形下，捕獲域可以與被引入組織樣本DNA分子的結(jié)合域互補(bǔ)。
[0311]如前文RNA相關(guān)內(nèi)容所述，捕獲域可以是一個(gè)隨機(jī)或簡(jiǎn)并序列。因此，可以通過(guò)令DNA與一個(gè)隨機(jī)或簡(jiǎn)并捕獲域結(jié)合，或與含有至少部分隨機(jī)或簡(jiǎn)并序列的捕獲域結(jié)合，來(lái)捕獲 DNA。
[0312]在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明還提供一種陣列的應(yīng)用，包括基板，所述基板上直接或間接固定了多種捕獲探針，每種探針在陣列上居于不同位置且定向?yàn)榫哂?’端自由端，以便使所述探針能夠充當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)或連接反應(yīng)的引物，其中所述探針的每個(gè)種類(lèi)都含有一個(gè)核酸分子，所述核酸分子在5’至3’端的方向上含有:
[0313](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，以及
[0314](ii)捕獲域；
[0315]所述捕獲域用于捕獲與所述陣`列相接觸的組織樣本的核酸，如DNA或RNA。
[0316]優(yōu)選地，所述應(yīng)用用于組織樣本核酸的局部檢測(cè)，且進(jìn)一步包含以下步驟:
[0317](a)利用所述捕獲探針作為延長(zhǎng)引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子生成DNA分子，其中所述被延長(zhǎng)或連接的分子通過(guò)定位域加以標(biāo)記；
[0318](b)可選地，生成所述被標(biāo)記核酸的互補(bǔ)鏈和/或擴(kuò)增所述被標(biāo)記的核酸；
[0319](C)從陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記的DNA分子和/或其互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；
[0320](d)直接或間接分析被釋放的DNA分子的序列；且可選地
[0321](e)將所述的序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中所述組織樣本的成像完成于步驟(a)。
[0322]組織樣本DNA片段化的步驟可以根據(jù)意愿，通過(guò)任何本領(lǐng)域所知方法實(shí)施。因此，可以采用物理方法實(shí)施片段化，例如聲波降解法或超聲處理。相關(guān)化學(xué)方法亦已知曉。還可以采用酶促方法實(shí)現(xiàn)片段化，例如，利用核酸內(nèi)切酶，如限制性酶。同樣地，該步驟的方法和酶為本領(lǐng)域所熟知。片段化可以在制備待用于陣列的組織樣本的步驟(例如制備組織切片的步驟)之前、之中或者之后。方便的是，固定組織的步驟就可能造成片段化。因此，舉例來(lái)說(shuō)，福爾馬林固定可以造成DNA的片段化。其他的固定劑可以帶來(lái)類(lèi)似結(jié)果。
[0323]關(guān)于本發(fā)明的這些方面中制備和使用陣列的細(xì)節(jié)，可知曉，前文中所述RNA方法中給出的描述和細(xì)節(jié)也可同理應(yīng)用于此述的更為廣泛的核酸檢測(cè)和DNA檢測(cè)方法。因此，上述的所有方面和細(xì)節(jié)同理可用。舉例來(lái)說(shuō)，關(guān)于反轉(zhuǎn)錄酶引物和反應(yīng)等的論述可同理適用于上述延長(zhǎng)引物、聚合酶反應(yīng)等的任何方面。同樣地，cDNA第一鏈和第二鏈合成的參考方法也可以同理適用于被標(biāo)記的DNA分子及其互補(bǔ)鏈。序列分析可以采用如上所述的方法。
[0324]舉例來(lái)說(shuō)，捕獲域可以如上述用于捕獲探針。含有或僅含有poly-T的捕獲域可用于，例如，向DNA片段引入含有poly-A序列的結(jié)合域的情況。
[0325]可為捕獲探針/標(biāo)記DNA分子(即:帶標(biāo)記并經(jīng)延長(zhǎng)或連接的分子)引入上述的通用域，例如，用于擴(kuò)增和/或剪切。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0326]下面將結(jié)合非限制性的實(shí)施例并引用如下附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0327]圖1所示為利用“識(shí)別碼”寡脫氧胸苷酸探針的陣列來(lái)從組織切片捕獲mRNA并用于轉(zhuǎn)錄組分析的整體概念。
[0328]圖2所示為相應(yīng)組織切片的轉(zhuǎn)錄體豐度可視化的原理示意圖。
[0329]圖3所示為3’至5’表面探針的構(gòu)成以及間接固定于陣列表面的5’至3’方向的捕獲探針的合成。
[0330]圖4所示為自制陣列的酶促(USER或Rsal)剪切效率和Agilent生產(chǎn)的陣列在99 V熱水中的剪切效率，以探針釋放后，熒光標(biāo)記的探針與陣列表面的雜交反應(yīng)來(lái)測(cè)定。
[0331]圖5所示為Agilent生產(chǎn)的商品陣列在99°C熱水介導(dǎo)下進(jìn)行DNA表面探針釋放后所捕捉的熒光圖像。熱水處理后，進(jìn)行了熒光檢測(cè)探針的雜交。最上方的陣列為未處理的對(duì)照組。
[0332]圖6所示為固定于轉(zhuǎn)錄組捕獲陣列之上的小鼠腦組織切片，已經(jīng)過(guò)cDNA合成并分別以胞質(zhì)染色劑(上，標(biāo)記為NeuN)和核酸染色劑(中，標(biāo)記為Nuclei)處理，兩種染色劑都展示于合并圖像中(下，標(biāo)記為merge)。
[0333]圖7所示為表格，列出了示意圖所示的低密度自制DNA捕獲陣列中按來(lái)源位點(diǎn)分類(lèi)的Read。
[0334]圖8所示為一個(gè)識(shí)別碼微陣列中，以核酸和Map2特異染色劑染色的FFPE小鼠腦組織。
[0335]圖9所示為以核酸染色劑(白色)染色的FFPE小鼠腦嗅球及可見(jiàn)形態(tài)。
[0336]圖10所示為以核酸染色劑(白色)染色的FFPE小鼠腦嗅球(約2x2mm)，與低分辨率陣列的理論點(diǎn)樣格局相重疊。
[0337]圖11所示為以核酸染色劑(白色)染色的FFPE小鼠腦嗅球(約2x2mm),與中等分辨率陣列的理論點(diǎn)樣格局相重疊。
[0338]圖12所示為FFPE小鼠腦嗅球的小球區(qū)域的放大顯示(即圖9右上部)。
[0339]圖13所示為在擴(kuò)增反應(yīng)中，用由B_handle連接的隨機(jī)六聚體引物(R6) (B_R6)進(jìn)行USER釋放的所得產(chǎn)物；產(chǎn)物以生物分析儀繪制。
[0340]圖14所示為 在擴(kuò)增反應(yīng)中，用由B_handle連接的隨機(jī)八聚體引物(R8) (B_R8)進(jìn)行USER釋放的所得產(chǎn)物；產(chǎn)物以生物分析儀繪制。
[0341]圖15所示為一項(xiàng)在覆蓋整個(gè)陣列的FFPE腦組織上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在表面合成及釋放cDNA后，以ID特異性及基因特異性引物(B2M外顯子4)擴(kuò)增的ID5 (左)和ID20(右);擴(kuò)增后的ID5和ID20。[0342]圖16所示為實(shí)施例4中所述方法的原理的示意圖，即固定有載有空間標(biāo)記序列(定位域)的DNA寡核苷酸(捕獲探針)的微陣列的使用。所述微陣列的寡核苷酸的每一特征都載有I)特有的標(biāo)記(定位域)和2)捕獲序列(捕獲域)。
[0343]圖17所示為實(shí)施例5中以預(yù)先片段化為平均大小為200bp的基因組DNA來(lái)實(shí)施所述的空間基因組實(shí)驗(yàn)流程所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在陣列上擴(kuò)增內(nèi)部產(chǎn)物，標(biāo)記并合成了 DNA。測(cè)得的峰值大小符合預(yù)期。
[0344]圖18所示為實(shí)施例5中以預(yù)先片段化為平均大小為700bp的基因組DNA來(lái)實(shí)施所述的空間基因組實(shí)驗(yàn)流程所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在陣列上擴(kuò)增內(nèi)部產(chǎn)物，標(biāo)記并合成了 DNA。測(cè)得的峰值大小符合預(yù)期。
[0345]圖19所示為以預(yù)先片段化為平均大小為200bp的基因組DNA來(lái)實(shí)施實(shí)施例5中所述的空間基因組實(shí)驗(yàn)流程所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以表面寡核苷酸所含的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)通用序列對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。在陣列上進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)記并合成了 DNA。由于隨機(jī)片段化和基因組DNA的末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記會(huì)產(chǎn)生極為多樣化的樣本池，預(yù)期產(chǎn)物具有拖尾。
[0346]圖20所示為以預(yù)先片段化為700bp的基因組DNA來(lái)實(shí)施實(shí)施例5中所述的空間基因組實(shí)驗(yàn)流程所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以表面寡核苷酸所含的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)通用序列對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。在陣列上進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)記并合成了 DNA。由于隨機(jī)片段化和基因組DNA的末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記會(huì)產(chǎn)生極為多樣化的樣本池，預(yù)期產(chǎn)物具有拖尾。
[0347]圖21所示為連接子連接到DNA片段的連接反應(yīng)示意圖，該反應(yīng)在poly-T捕獲域中引入用于雜交的結(jié)合域，以達(dá)成與捕獲探針的后續(xù)連接。
[0348]圖22所示 為高密度捕獲陣列中所采用的5’至3’方向的捕獲探針的構(gòu)成。
[0349]圖23所示為高密度陣列的框架，用于組織樣本的定向，通過(guò)熒光標(biāo)記探針的雜交可視化。
[0350]圖24所示為高密度陣列上已剪切和未剪切的捕獲探針，其中框架探針由于不含尿嘧啶堿基而未被剪切。捕獲探針以與poly-A寡核苷酸鏈接的熒光素加以標(biāo)記。
[0351]圖25所示為以從小鼠嗅球捕獲的轉(zhuǎn)錄體所制備的文庫(kù)的生物分析儀制圖。
[0352]圖26所示為從小鼠嗅球所提取的總RNA中所捕獲的轉(zhuǎn)錄體的Matlab可視化。
[0353]圖27所示為采用Matlab可視化程序?qū)男∈笮崆蚪M織捕獲的Olfr (嗅覺(jué)受體)轉(zhuǎn)錄體的全捕獲陣列可視化。
[0354]圖28所示為自制41-1D-標(biāo)記微陣列的噴點(diǎn)格局。
[0355]圖29所示為捕獲具有poly-A尾的基因組片段再進(jìn)行A431特異性易位后制得的空間基因組文庫(kù)。
[0356]圖30所示為在捕獲陣列上，在10%和50%上具有峰值的含poly-A尾的基因組片段被捕獲后，經(jīng)過(guò)A431特異性易位成為含poly-A尾的U20S基因組片段的檢測(cè)結(jié)果。
[0357]圖31所示為將在41-1D標(biāo)記的自制陣列上從小鼠嗅球組織所捕獲的含ID標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄體，經(jīng)Matlab可視化后，與組織圖像的重疊。為清晰起見(jiàn)，對(duì)辨識(shí)出特定基因的特定特征加以了圈定。
【具體實(shí)施方式】
[0358]實(shí)施例1[0359]陣列的制備
[0360]以下實(shí)驗(yàn)展示了如何將寡核苷酸探針通過(guò)其5'或3'端附著于陣列基板上，來(lái)得到含有能與mRNA雜交的捕獲探針的陣列。
[0361]制備含5'至3'端方向的探針的自制噴點(diǎn)微陣列
[0362]在玻璃載片上點(diǎn)樣20個(gè)各有標(biāo)記序列的RNA捕獲寡核苷酸(標(biāo)記1_20，表1)作為捕獲探針。所述探針以一個(gè)5’-端氨基連接子和一個(gè)C6間隔子合成。所有的探針均由Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)合成。RNA捕獲探針以150mM的磷酸鈉制成濃度為 20 μ M、pH 為 8.5 的懸液，并以 Nanoplotter NP2.1/E 噴點(diǎn)系統(tǒng)(Gesim, Grosserkmannsdorf, Germany)在 CodeLink? Activated 微陣列載片(7.5cm χ2.5cm; Surmodics, EdenPrairie，MN，USA)上點(diǎn)樣。噴點(diǎn)完成后，按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行表面封閉。所述探針在載片上噴為16個(gè)等同陣列，且每個(gè)陣列含有一種預(yù)設(shè)的噴點(diǎn)格局。雜交反應(yīng)中，所述16個(gè)子陣以16 格遮光框(ChipClip? Schleicher&Schuell BioScience, Keene, NH, USA)進(jìn)行分隔。
[0363]
【權(quán)利要求】
1.對(duì)組織樣本中的核酸的進(jìn)行局部檢測(cè)的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個(gè)種類(lèi)的捕獲探針，每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂幸?3’自由端以使所述探針能作為引物引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其中每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針都包括一核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括: (i)定位域，該定位域與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和 (ii)捕獲域； (b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，并允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交； (c)以所述捕獲探針作為延長(zhǎng)引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子上產(chǎn)生DNA分子，其中所述經(jīng)延長(zhǎng)或連接的DNA分子具有定位域標(biāo)記； Cd)可選地，生成被標(biāo)記的DNA的互補(bǔ)鏈，和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記的DNA ； (e)從陣列表面釋放至少一部分被標(biāo)記的DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈或擴(kuò)增子，其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈；及 Cf)直接或間接地分析被釋放的DNA分子的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括步驟(g):將序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中該組織樣本在步驟(c)之前或之后成像。
3.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的方法，該方法作為測(cè)定和/或分析組織樣本的轉(zhuǎn)錄組的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個(gè)種類(lèi)的捕獲探針，每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂幸?3’自由端以使所述探針能作為引物引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其中每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針都包括核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括: (i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和 (ii)捕獲域； (b)令所述組織樣本與陣列接觸，以使陣列上的捕獲探針的位置與組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，且允許組織樣本上的RNA與所述捕獲探針上的捕獲域雜交； (c)以所述捕獲探針為RT引物，從已捕獲的RNA分子合成cDNA分子，且可選地，擴(kuò)增所述cDNA分子； Cd)從陣列表面釋放至少部分所述cDNA分子和/或其擴(kuò)增子，其中所述被釋放的分子可以是cDNA分子的第一和/或第二鏈或其擴(kuò)增子，且其中所述部分包含定位域或其互補(bǔ)鏈； Ce)直接或間接地分析被釋放分子的序列；且可選地 (f)將序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中該組織樣本在步驟(C)之前或之后成像。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針是DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針進(jìn)一步包含通用域，所述通用域在定位域的5’端方向且含有: (i )擴(kuò)增域，用于擴(kuò)增所生成的DNA分子；和/或(ii)剪切域，用于將所生成的DNA分子從陣列表面釋放。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針的定位域都含有獨(dú)一無(wú)二的條形碼序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲域包括至少含10個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷殘基的poly-T DNA寡核苷酸和/或隨機(jī)或簡(jiǎn)并的寡核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針以其5’端直接固定于陣列表面。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針通過(guò)與表面探針雜交而間接固定于陣列表面，其中所述捕獲探針的捕獲域包含上游序列，所述上游序列可與固定在陣列上的表面探針的5’端雜交。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述表面探針的3’端固定在陣列表面。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述表面探針包括與下列各項(xiàng)互補(bǔ)的序列: (i)所述捕獲域的至少一部分； (ii)所述定位域；和 (iii)所述通用擴(kuò)增域的至少一部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任一項(xiàng)中所述的方法，其特征在于，在所述被標(biāo)記的DNA分子或所述cDNA分子從陣列表面釋放之前或之后，生成所述互補(bǔ)鏈或所述cDNA第二鏈。`
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)中所述的方法，其特征在于，cDNA第二鏈的互補(bǔ)鏈的合成中采用了鏈置換聚合酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)中所述的方法，其特征在于，所述互補(bǔ)鏈或cDNA第二鏈的合成中采用了隨機(jī)引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述隨機(jī)引物含有擴(kuò)增域。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述隨機(jī)引物的擴(kuò)增域和捕獲探針的擴(kuò)增域含有不同的核酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，令接合體與被標(biāo)記分子或其互補(bǔ)鏈或cDNA分子的一端或兩端連接。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在序列分析前進(jìn)一步包括對(duì)所標(biāo)記的分子或cDNA分子進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增步驟在被標(biāo)記的DNA或cDNA分子從陣列基板釋放之后實(shí)施，或所述擴(kuò)增步驟在陣列上原位實(shí)施。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增步驟包括PCR。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分子通過(guò)如下方法從陣列表面釋放: (i)核酸剪切； (ii)變性；和/或 (iii)物理方法。
22.根據(jù)權(quán)利要求21(i)所述的方法，其特征在于，所述分子通過(guò)酶切從剪切域釋放，所述剪切域位于捕獲探針的通用域或定位域中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21(ii)或(iii)所述的方法，其特征在于，通過(guò)將熱水或緩沖液應(yīng)用至所述陣列來(lái)釋放所述分子。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在測(cè)序之前進(jìn)一步包括對(duì)被釋放的分子進(jìn)行純化的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述基板選自下列材料:玻璃、硅、多聚賴(lài)氨酸涂層材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環(huán)狀烯烴共聚物(COCs)、環(huán)狀烯烴高分子(COPs )、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織樣本為組織切片。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述組織切片從固定組織制備，例如，以福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織或深度冷凍的組織。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在樣本與陣列接觸之后且步驟(c)之前，進(jìn)一步包括給組織樣本補(bǔ)水的步驟。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述組織樣本來(lái)自植物、動(dòng)物或真菌。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括洗滌陣列以除去殘余組織的步驟，該步驟位于從陣列釋放所述分子之前。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述陣列包含至少一個(gè)定位標(biāo)記，來(lái)為陣列上的組織樣本定向。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其特征在于，所述陣列在陣列表面的不同位置包括至少 10、50、100、200、500、1000 或 2000 個(gè)定位標(biāo)記。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述方法，其特征在于，所述定位標(biāo)記能與帶標(biāo)記的標(biāo)記核酸分子雜交，所述標(biāo)記核酸分子優(yōu)選為帶突光標(biāo)記的標(biāo)記核酸分子。
34.根據(jù)權(quán)利要求2-33中任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述組織樣本的成像是利用光、明視場(chǎng)、暗視場(chǎng)、相位差、熒光、鏡像、干涉或共聚焦顯微鏡或其組合。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述組織樣本的成像利用熒光顯微鏡。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-35所述的方法，其特征在于，所述序列分析步驟包括測(cè)序步驟，且優(yōu)選地，所述測(cè)序步驟包括基于可逆染色終止劑的測(cè)序反應(yīng)。
37.一種用于制作或生產(chǎn)陣列的方法，用于(i)從與所述陣列相接觸的組織樣本上捕獲核酸，或(ii)對(duì)組織樣本的核酸進(jìn)行局部檢測(cè)；所述方法包括將多個(gè)種類(lèi)的捕獲探針直接或間接固定于陣列基板，其中每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針均包括核酸分子，且所述核酸分子從5’至3’的方向上含有: (i)定位域，所述定位域與所述陣列上的所述探針的位置相對(duì)應(yīng)；和 (ii)捕獲域。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針都在所述陣列上居于不同的位置。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟: Ca)直接或間接將多個(gè)表面探針固定在陣列基板上，其中所述表面探針包含: (i)能與捕獲域寡核苷酸部分雜交的結(jié)構(gòu)域(所述部分與核酸的捕獲無(wú)關(guān)); (ii)互補(bǔ)定位域；和(iii)互補(bǔ)通用域； (b)令捕獲域寡核苷酸和通用域寡核苷酸與固定于陣列上的表面探針雜交； (c)利用模版聚合反應(yīng)延長(zhǎng)所述通用域寡核苷酸，以生成捕獲探針的定位域；和 Cd)將定位域連接至捕獲域寡核苷酸，以生成捕獲寡核苷酸。
40.一種陣列，用于(i)從與所述陣列接觸的組織樣本上捕獲核酸對(duì)組織樣本的核酸進(jìn)行局部檢測(cè)；所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多個(gè)種類(lèi)的捕獲探針，每個(gè)種類(lèi)的所述探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針能作為引物引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其中每個(gè)種類(lèi)的捕獲探針都含有核酸分子，所述核酸分子從5’到3’的方向上具有: (i )定位域，與所述陣列上的核酸的位置相對(duì)應(yīng)，和 (ii)捕獲域，用于捕捉與所述陣列相接觸的組織樣本上的核酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求37-39任一項(xiàng)所述的方法或權(quán)利要求40中所述的陣列，其特征在于，所述捕獲探針為根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)中所限定的捕獲探針，所述表面探針為根據(jù)權(quán)利要求10或11中所限定的表面探針，所述基板為根據(jù)權(quán)利要求25所限定的基板，所述組織樣本為根據(jù)權(quán)利要求26、27、28中任一項(xiàng)所限定的組織樣本，所述陣列為根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所限定的陣列，且所述定位標(biāo)記為根據(jù)權(quán)利要求33中所限定的定位標(biāo)記。
42.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，該方法作為對(duì)組織樣本中的DNA進(jìn)行局部檢測(cè)的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個(gè)種類(lèi)的捕獲探針，每個(gè)種類(lèi)的所述探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針能作為引物引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其`中每個(gè)種類(lèi)的所述捕獲探針都包括核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括: (i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和 (ii)捕獲域； (b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)，并允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交； (c)將所述組織樣本中DNA片段化，其中所述片段化步驟實(shí)施于步驟(b)中令陣列與所述組織樣本接觸的之前、之間或之后； Cd)利用已捕獲的DNA片段作為模版，以引物延長(zhǎng)反應(yīng)延長(zhǎng)所述捕獲探針，得到延長(zhǎng)的DNA分子，或以連接反應(yīng)將已捕獲的DNA片段連接至所述捕獲探針上，得到連接后的DNA分子，其中所述延長(zhǎng)或連接后的DNA分子以定位域標(biāo)記； Ce)可選地，產(chǎn)生所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈，和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記DNA ； (f)從所述陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈和/或擴(kuò)增子，其中所述部分包括所述定位域或其互補(bǔ)鏈； (g)直接或間接分析(例如，測(cè)序)被釋放DNA分子的序列；且可選地 (h)將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中所述組織樣本在步驟(d)之前或之后成像。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個(gè)種類(lèi)的捕獲探針，每個(gè)種類(lèi)的所述探針在所述陣列中各占不同位置，且定向?yàn)榫哂?’自由端以使所述探針能作為引物引導(dǎo)引物延長(zhǎng)反應(yīng)或引物連接反應(yīng)，其中每個(gè)種類(lèi)的所述捕獲探針的都包括核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括: (i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對(duì)應(yīng)，和 (ii)捕獲域； (b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關(guān)聯(lián)； (c)將所述組織樣本中DNA片段化，其中所述片段化步驟實(shí)施于步驟(b)中令陣列與所述組織樣本接觸的之前、之間或之后； Cd)為所述DNA片段提供能夠與所述捕獲域雜交的結(jié)合域； Ce)允許所述DNA片段與所述捕獲探針的捕獲域相雜交； Cf)利用已捕獲的DNA片段作為模版，以引物延長(zhǎng)反應(yīng)延長(zhǎng)所述捕獲探針，得到延長(zhǎng)的DNA分子，或以連接反應(yīng)將已捕獲的DNA片段連接至所述捕獲探針上，得到連接后的DNA分子，其中所述延長(zhǎng)或連接后的DNA分子以定位域標(biāo)記； (g)可選地，生成所述被標(biāo)記DNA的互補(bǔ)鏈，和/或可選地，擴(kuò)增所述被標(biāo)記DNA； (h)從所述陣列表面釋放至少部分被標(biāo)記DNA分子和/或他們的互補(bǔ)鏈和/或擴(kuò)增子，其中所述部分包括定位域或其互補(bǔ)鏈； (i)直接或間接地分析(例如，測(cè)序)被釋放DNA分子的序列；且可選地 (j )將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關(guān)聯(lián)，其中所述組織樣本在步驟(f )之前或之后成像。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103781918SQ201280029001
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月13日
【發(fā)明者】喬納斯·弗瑞森, 帕特里克·斯塔爾, 喬亞基姆·倫德貝格 申請(qǐng)人:空間轉(zhuǎn)錄公司