具有健康益處的多細菌制備物：抗氧化效果、膽固醇濃度降低、抗炎免疫調(diào)節(jié)效果和抑制 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多細菌益生制備物，其包括乳酸細菌NBIMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12、NBIMCC編號8722的植物乳桿菌F12和NBIMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al的新菌株，并具有下列性質(zhì)集合：抗氧化、降膽固醇效果、抗炎免疫調(diào)節(jié)效果、釋放抑制血管緊張素轉(zhuǎn)變酶（ACE，其負責(zé)高血壓）的生物活性肽的能力。本發(fā)明的目標(biāo)還是所述的乳酸細菌的益生菌株和開發(fā)的具有有用性質(zhì)的細菌產(chǎn)品。納入的NBIMCC編號8720的益生菌株加氏乳桿菌7/12具有一些性質(zhì)：對結(jié)腸上皮層的強粘附、降低膽固醇的能力和通過降低促炎性細胞因子白介素-8的水平的抗炎效果。本發(fā)明涉及乳酸細菌菌株和細菌劑在生產(chǎn)意圖影響人和動物健康的起子培養(yǎng)物、食品添加劑、食品、功能性產(chǎn)品和藥學(xué)制備物中的用途。
【專利說明】具有健康益處的多細菌制備物:抗氧化效果、膽固醇濃度
降低、抗炎免疫調(diào)節(jié)效果和抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶的生物
活性肽的釋放
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，并且具體是乳酸細菌的益生株和通過它們獲得的多細菌制備物。本發(fā)明還涉及制備物的復(fù)合有益健康效果和其作為膳食補充劑用于預(yù)防各種疾病的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]益生菌劑是活的可食用的微生物，其對于人健康具有積極效果。大部分益生菌劑是乳酸桿菌(Iactobacilli)和/或雙歧桿菌(bifidobacteria)。它們是非致病性細菌，能夠在胃腸道上形成集落。已經(jīng)證實乳酸桿菌和雙歧桿菌是人微生物區(qū)系(微生物群)的主要組分。兩個屬的代表可以在結(jié)腸的粘膜層形成集落并影響腸生態(tài)系統(tǒng)的平衡維持。它們的存在伴隨有益的健康效果例如抑制有害微生物、改善消化、免疫刺激效果、減少乳糖不耐性、減少血清膽固醇、預(yù)防腹瀉和其它。乳酸桿菌的一些菌株產(chǎn)生生物活性肽，其具有降壓效果以及鈣和鎂吸收效果。通常，益生效果不涉及乳酸桿菌和雙歧桿菌屬，但是是菌株特異性的。為了改善有益效果，在研究期間進行物種和菌株的準(zhǔn)確鑒定。消費包含益生菌株的產(chǎn)品后登記了很多有益健康效果。下面列舉了最重要的益處:
?通過刺激有益細菌并抑制有害微生物對腸道菌群的有利效果乳酸細菌的幾個菌株產(chǎn)生細菌素，其破壞有害微生物，例如酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutiricum)、金黃色葡萄球菌(St.aureus)、單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和其它。
·[0003].短鏈脂肪酸的產(chǎn)生
在健康人體內(nèi)，每天產(chǎn)生約400mM短鏈脂肪酸，作為最重要的是:乙酸、丙酸和丁酸。它們有利地影響腸中的pH。發(fā)現(xiàn)丁酸通過抑制亞硝胺和過氧化氫的遺傳毒性效果而減少發(fā)展結(jié)腸癌的風(fēng)險。并且，丁酸誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤細胞中的凋亡。脂肪酸減少促炎性細胞因子TNFa、IL-Ιβ、IL-6 的表達。
[0004].通過免疫調(diào)節(jié)刺激免疫應(yīng)答和增強遺傳免疫
益生細菌調(diào)節(jié)必需和過量的免疫應(yīng)答間的精巧平衡。導(dǎo)致IL-1O誘導(dǎo)刺激的益生菌株適合用于遭受結(jié)腸炎癥疾病的人。免疫調(diào)節(jié)效果是菌株特異性的。檢查了乳酸桿菌和雙歧桿菌的幾個菌株，其中一些導(dǎo)致TNFa的減少和IL-10的增加(McCarthy, 2003)。
[0005].在宏觀生物體內(nèi)營養(yǎng)吸收的改善
乳酸桿菌和雙歧桿菌具有半乳糖苷酶活性，從而降低乳糖濃度。這對于遭受乳糖不耐性的人是有益的。通過一些雙歧桿菌菌株的B-復(fù)合維生素的產(chǎn)生是顯著的并且在上面提到。乳酸桿菌通過其蛋白水解復(fù)合物促成蛋白降解并從而促進人的蛋白吸收。一些雙歧桿菌可以同化無機氮，并隨后可以降低氨濃度(其在高水平可以是致癌的)。
[0006].抗氧化效果在組織中氧自由基增加積累可以導(dǎo)致對細胞的損傷?；钚匝醯男纬煽梢园殡S多種因素，例如某些藥物的使用、增加的乙醇消耗、壓力和其它因素。增加的氧化伴隨一些消化病癥，以及老年、動脈硬化、癌性疾病等。機體具有幾個針對毒性氧的防御，但是重要的是消耗抗氧化劑以改善這些系統(tǒng)的功能發(fā)揮。一些微生物具有抗氧化酶，例如SOD (超氧化物歧化酶)、過氧化氫酶酶類、谷胱甘肽還原酶酶類和其它。
[0007].血清膽固醇的減少
膽固醇通過腸細胞合成并釋放到腸內(nèi)。另一部分膽固醇來自膽汁分泌和食物。微生物群影響膽固醇水平。一些微生物降解膽汁鹽，利用?；撬岷透拾彼?。因此，膽汁鹽的循環(huán)受阻，并且肝動員額外膽固醇用于新膽汁鹽的合成，這導(dǎo)致血清膽固醇的降低。Gilliland等(1985)研究了菌株嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)同化膽固醇的能力。
[0008].具有降壓活性的生物活性肽和改善鈣和鎂吸收的肽的分泌。
[0009]通過分解乳蛋白，乳酸細菌放出低分子肽。發(fā)現(xiàn)它們的一些抑制血管緊張素轉(zhuǎn)變酶(ACE)。ACE從血管緊張素I切割二肽，將其轉(zhuǎn)化為血管緊張素II (誘導(dǎo)醛固酮產(chǎn)生的血管收縮劑)，這導(dǎo)致鈉離子濃度和血壓升高。研究最多的效果是寡肽Ile-Pro-Pix)和Val-Pro-Pro的降壓效果,其在瑞士乳桿菌(L.helveticus)的某些菌株的蛋白水解活性期間釋放。它們誘導(dǎo)ACE的強抑制。降壓效果在臨床實驗中得到證實。
[0010]目前有幾種商品化的益生菌劑成功地使用，例如鼠李糖乳桿菌GG (L.rhamnosusGG) (Saxelin M.Lactobacillus GG - a human probiotic strain with thoroughclinical documentation.Food Rev Int 1997, 13:293-313)。另一種工業(yè)化的益生菌劑是發(fā)酵乳桿菌39 (L.fermentum 39),用于在菌群失調(diào)期間穩(wěn)定腸內(nèi)微生物區(qū)系(I )。
[0011]存在細菌菌株發(fā)酵乳桿菌ME3，具有SOD活性和針對病原的活性(Mikelsaar等，2007)。
[0012]一個專題的問題是乳酸細菌的益生菌株的鑒定和選擇，以及使用它們用于制備具有許多有用的性能，如在胃腸道中高生存、抗氧化效果、對結(jié)腸上皮層強烈粘附、減少膽固醇的能力、免疫調(diào)節(jié)和抗炎效果、ACE抑制活性的多細菌產(chǎn)品。
[0013]發(fā)明公開
本發(fā)明的目標(biāo)是鑒定和選擇具有有益健康性質(zhì)的益生乳酸細菌的菌株，其應(yīng)當(dāng)用于建立具有功能效果組合的益生制備物。
[0014]本發(fā)明的目標(biāo)，益生 制備物，是由乳酸細菌的三種益生菌株組成的多細菌組合:加氏乳桿菌7/12 (Lactobacillus gasseri 7/12)以編號8720保藏在國立銀行工業(yè)微生物和細胞保藏中心(NBMCC)、植物乳桿菌F12 (Lactobacillus plantarum F12)以編號8722保藏在NBIMCC和瑞士乳桿菌Al (Lactobacillus helveticus Al)以編號8721保藏在NBIMCC0所述產(chǎn)品具有一些健康益處:抗氧化效果；由于水解膽汁鹽和直接吸收膽固醇的膽固醇濃度降低；通過降低促炎性細胞因子“白介素_8”的水平的抗炎免疫調(diào)節(jié)效果；釋放抑制負責(zé)高血壓的酶(ACE)的生物活性肽的能力。
[0015]本發(fā)明的目標(biāo)還有NBMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12、NBMCC編號8722的植物乳桿菌F12和NBMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al的新菌株和它們的有益性質(zhì)。
[0016]NBIMCC編號8722的植物乳桿菌F12具有抗氧化活性和對上皮細胞的顯著粘附。
[0017]NBMCC編號8720的益生菌株加氏乳桿菌7/12具有下列有用性質(zhì)的集合:在胃腸道中的高存活、對結(jié)腸上皮層的強粘附、降低膽固醇的能力和通過降低促炎性細胞因子“白介素-8”的水平的抗炎免疫調(diào)節(jié)效果。
[0018]NBIMCC編號8721的益生菌株瑞士乳桿菌Al具有強抗ACE效果。
[0019]本發(fā)明的目標(biāo)是新的益生菌株和益生多細菌制備物在藥學(xué)和食品工業(yè)中的用途以預(yù)防社會顯著的疾病，例如:高血壓，動脈硬化和高膽固醇血癥，腸道中的免疫削弱和炎癥過程，腸道微生物區(qū)系中平衡擾動。
[0020]NBIMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12和NBMCC編號8722的植物乳桿菌F12分離自健康志愿者的腸道。NBMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al分離自自制的白奶酪，這證明了它們的GRAS狀態(tài)(通常認為安全)。三個菌株的種隸屬關(guān)系和菌株身份，通過精確的基于DNA的方法(2) 16S核糖體基因測序，ARDRA，脈沖電泳，AFLP建立。
[0021]使用API 50 CHL系統(tǒng)(BioMerieux，F(xiàn)rance)進行三個菌株的表型鑒定。
[0022]菌株通過AFLP和脈沖電泳的方法分子鑒定。用于三個菌株鑒定和獲得它們菌株特異性DNA概況的兩種主要的分子方法描述于上述文章(Dimitrov Zh.等，2008)。在圖1中表示NBMCC編號8722的植物乳桿菌F12的脈沖電泳DNA概況，在圖2中——NBIMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12的脈沖電泳DNA概況并且在圖3中——NBIMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al的脈沖電泳DNA概況。
[0023]NBIMCC編號8722的植物乳桿菌F12形成大小l_2mm的白色S菌落。細菌細胞是短的(0.9-1.2 X 3-8 um)具有圓角。主要的培養(yǎng)基是MRS液體培養(yǎng)基和瓊脂(0X0ID)。根據(jù)伯杰氏手冊(2009)通過使用Api Web數(shù)據(jù)庫(API 50CHL條)和MicroLog M5.1.1數(shù)據(jù)庫(Biolog AN微孔板)進行鑒定。ARDRA概況對于菌株植物乳桿菌是典型的。可溶的細胞蛋白的概況與植物乳桿菌(ATCC)的概況相同。以0.1%接種后，其在MRS液體培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)在37°C進行約18-24小時。液體培養(yǎng)基和大氣在培養(yǎng)期間不需要任何初步厭氧化。菌株在MRS瓊脂上在厭氧環(huán)境中發(fā)展48小時。
[0024]NBMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12形成大小l_2mm的白色S菌落。細菌細胞是短的(0，6-0.8 X 3.0-5.0 um)具有圓角。主要的培養(yǎng)基是MRS液體培養(yǎng)基和瓊脂(0X0ID)。根據(jù)伯杰氏手冊(2009)通過使用Api Web數(shù)據(jù)庫(API 50CHL條)和MicroLog M5.1.1數(shù)據(jù)庫(Biolog AN微孔板)鑒定菌株。ARDRA概況對于加氏乳桿菌菌株是典型的?？扇艿募毎鞍椎母艣r與加氏乳桿菌33323 (ATCC)的概況相同。以0.1%接種后，加氏乳桿菌7/12在MRS液體培養(yǎng)基上生長。培養(yǎng)在37°C進行約18-24小時。液體培養(yǎng)基和大氣在培養(yǎng)期間不需要任何初步厭氧化。菌株在MRS瓊脂上在厭氧環(huán)境中發(fā)展48小時。
[0025]NBIMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al形成大小l_2mm的白色R菌落。細菌細胞具有3，0-5，O um的長度?；九囵B(yǎng)基是MRS液體培養(yǎng)基和瓊脂(OXOID)和用于微生物學(xué)目的的無菌脫脂乳，10%干物質(zhì)(0X0ID)。根據(jù)伯杰氏手冊(2009)通過使用Api Web數(shù)據(jù)庫(API 50CHL條)和MicroLog M5.1.1數(shù)據(jù)庫(Biolog AN微孔板)鑒定菌株。ARDRA概況對于瑞士乳桿菌是典型的。可溶的細胞蛋白的概況與瑞士乳桿菌15009 (ATCC)的概況相同。以0.1%接種后，瑞士乳桿菌Al在MRS液體培養(yǎng)基上生長。培養(yǎng)在37°C進行約18-24小時。液體培養(yǎng)基和大氣在培養(yǎng)期間不需要任何初步厭氧化。菌株在MRS瓊脂上在厭氧環(huán)境中發(fā)展48小時。以0.1%接種并在37°C培養(yǎng)18-24小時后，該菌株在無菌脫脂乳上發(fā)展。
[0026]NBIMCC編號8722的植物乳桿菌F12的功能性質(zhì) ?抗氧化效果的確定菌株植物乳桿菌F12具有抗氧化性質(zhì)并且就此其選自多于400種乳酸桿菌中。為了進行此關(guān)于抗氧化性質(zhì)的選擇，菌株在MRS液體培養(yǎng)基中孵育24小時并在4°C下在3500g離心10分鐘。用鹽水溶液清洗后，細胞重懸在1.15%KC1中到在Iml中IxlO9個細胞。細胞混懸液在冰浴中接受超聲(Branson B-12 Sonic power Company) 5分鐘,然后在-20°C下10分鐘?；鞈乙涸?°C下在1000Og離心10分鐘。上清液用作無細胞提取物。確定了三種類型的活性:
-總抗氧化活性O(shè)RAC
用于確定總抗氧化活性的主要方法是ORAC (氧化自由基吸收能力)。結(jié)果顯示在IO9微生物細胞的TROLOX等效物中。使用Cao等(1995)的方法。原理如下:底物O1-藻紅蛋白(Sigma Chemical C0.)通過自由基產(chǎn)生劑2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH ;WacoChemical USA)接受氧化劑攻擊。通過在200ml 0.2M磷酸緩沖液(儲備溶液)中溶解5mg物質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液TROLOX ( 6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃_2_羧酸，Trolox ；Aldrich)。通過混合Iml的儲備溶液與9ml磷酸緩沖液獲得工作溶液。
[0027]在存在具有抗氧化性質(zhì)的樣品的情況下，藻紅蛋白的氧化在一定程度上減少。分別使用535nm (激發(fā))和595nm (發(fā)射)長度的波測量相對熒光，進行60分鐘的時期。使用下列公式:
ORAC 值=X K (S 樣品-Sm)/ (Strolox-Sse)
其中X是以微升計的樣品體積，并且K是稀釋系數(shù)。S-熒光曲線的面積。
[0028]-通常的抗自由基活性
對每個菌株基于化合物1，1- 二苯基-2-苦味酰肼(DPPH)的染色強度的減少程度確定捕獲游離自由基的物質(zhì)。自由基捕獲活性的強度與DPPH的紫色的褪色程度成正比。與相應(yīng)菌株一起發(fā)酵的乳離心并且用二乙`醚萃取上清液。該過程隨后是醚層蒸發(fā)并在甲醇中溶解殘余物。0.1ml體積的此溶液與1.4ml的DPPH溶液(40 μ g/ml,甲醇中)混合。自由基捕獲活性定義為空樣品和樣品之間在517nm吸收中的差異[A517 (空)-A517 (樣品)]。
[0029]-SOD 活性
根據(jù)Chang & Hasan, 1997進行測試。菌株在液體培養(yǎng)基(對于鏈球菌是M17，對于乳酸桿菌是MRS)上生長并且孵育后，離心培養(yǎng)物，用含0.1mM EDTA，pH7.8的磷酸緩沖液清洗，重懸在相同的緩沖液中并然后超聲。在17000g離心并對上面的磷酸緩沖液透析24小時。在20000g再次離心。根據(jù)Lowry法確定無細胞提取物的總蛋白濃度。使用專門的測試試劑盒(SIGMA)根據(jù)制造商的說明定義兩種酶活性。通過細胞色素C法在具有黃嘌呤氧化酶的綴合的酶系統(tǒng)中確定S0D。原理是:當(dāng)細胞色素C被還原時,黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤。在存在具有SOD活性的樣品的情況下，細胞色素C的還原在一定程度上被抑制，因為兩個質(zhì)子結(jié)合來自SOD的超氧化物自由基而非轉(zhuǎn)移到細胞色素C上。
[0030]表1表示不同抗氧化活性的確定結(jié)果:通過ORAC測試的總抗氧化活性，總抗自由基活性和SOD活性。
[0031]表1
【權(quán)利要求】
1.多細菌制備物，其特征在于其包括NBMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12{Lactobacillus gasseri 7/12)、NBIMCC 編號 8722 的植物乳桿菌 F12 {Lactobacillusplantarum F12)、NBIMCC 編號 8721 的瑞士乳桿菌 Al {Lactobacillus helveticus Al)的菌株的組合的事實。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多細菌制備物，其包含如下以cfu/g測量的活細胞:加氏乳桿菌7/12至少109，瑞士乳桿菌Al至少2xl09和植物乳桿菌F12至少9xl09。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的多細菌制備物，其特征在于其具有抗氧化、抗炎免疫調(diào)節(jié)效果，降膽固醇效果和降壓效果。
4.細菌制備物，其特征在于其包含選自NBMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12>NBIMCC編號8722的植物乳桿菌_F12、NBMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al的至少一個菌株的事實。
5.NBIMCC編號8720的菌株加氏乳桿菌7/12，其具有圖2中顯示的菌株特異性DNA概況，是細菌制備物的產(chǎn)生者。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的NBIMCC編號8720的菌株加氏乳桿菌7/12，其是細菌制備物的產(chǎn)生者，具有降膽固醇活性和抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。
7.NBMCC編號8722的菌株植物乳桿菌F12，其具有圖1中顯示的菌株特異性DNA概況，是細菌制備物的產(chǎn)生者。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的NBIMCC編號8722的菌株植物乳桿菌F12，其是細菌制備物的產(chǎn)生者，具有抗氧化活性。
9.NBMCC編號8721的菌株瑞士乳桿菌Al，其具有圖3中顯示的菌株特異性DNA概況，是細菌制備物的產(chǎn)生者。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的NBMCC編號8721的菌株瑞士乳桿菌Al，其是細菌制備物的產(chǎn)生者，具有降壓活性和針對血管緊張素-轉(zhuǎn)變酶(ACE)的抑制活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的多細菌制備物和根據(jù)權(quán)利要求4的細菌制備物，其特征在于它們的形式一凍干物或液體培養(yǎng)物。
12.獲得根據(jù)權(quán)利要求1的多細菌制備物的方法，包括在由乳組成的培養(yǎng)基里分別培養(yǎng)NBMCC編號8720的加氏乳桿菌7/12 ,NBIMCC編號8722的植物乳桿菌-F12和NBMCC編號8721的瑞士乳桿菌Al，所述培養(yǎng)基用堿性蛋白酶水解，并補充有0.2%酵母自溶物用于營養(yǎng)目的，作為接種物的量是1%并且PH用氫氧化鈉維持在5.7，和在由乳組成的培養(yǎng)基里后續(xù)培養(yǎng)包含植物乳桿菌F12、瑞士乳桿菌Al和加氏乳桿菌7/12的富集的生物量的三種單培養(yǎng)物的組合，所述培養(yǎng)基用堿性蛋白酶水解，并補充有0.2%酵母自溶物用于營養(yǎng)目的，作為接種物的量是2%并且pH用氫氧化鈉維持在5.7。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的多細菌制備物作為益生菌劑的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的多細菌制備物作為用于人和動物的食品添加劑和/或以任何形式包括在用于人和動物的食品中的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的多細菌制備物用于獲得用于食品生產(chǎn)的起子培養(yǎng)物的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的多細菌制備物在意圖影響人和動物的健康的功能性產(chǎn)品和藥學(xué)制備物的組合物中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求4的細菌制備物作為益生菌劑的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的細菌制備物作為用于人和動物的食品添加劑和/或以任何形式包括在用于人和動物的食品中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的細菌制備物用于獲得用于食品生產(chǎn)的起子培養(yǎng)物的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的細菌制備物，在意圖影響人和動物的健康的功能性產(chǎn)品和藥學(xué)制備物的組合物中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的多細菌制備物作為具有抗氧化活性、抗炎免疫調(diào)節(jié)活性、降膽固醇活性和降壓活性的制備物的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求5的NBMCC編號8720的菌株加氏乳桿菌7/12用于產(chǎn)生具有降膽固醇活性和抗炎免疫調(diào)節(jié)活性的細菌制備物的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求7的NBMCC編號8722的菌株植物乳桿菌F12用于產(chǎn)生具有抗氧化活性的細菌制備物的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求9的NBMCC編號8721的菌株瑞士乳桿菌Al用于產(chǎn)生具有降壓活性和針對血管緊張素-轉(zhuǎn)變酶(ACE)的`抑制活性的細菌制備物的用途。
【文檔編號】A23L1/30GK103796660SQ201280033199
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月4日
【發(fā)明者】Z.迪米特羅夫, M.米查洛瓦 申請人:艾比保加里肯股份有限公司