自細(xì)胞的提取的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于釋放細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)間隙的內(nèi)含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液中溫育所述細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種制備重組多肽的基本上純的樣品的方法。所述方法可應(yīng)用于從細(xì)菌細(xì)胞回收物質(zhì)如蛋白質(zhì)。
【專利說明】自細(xì)胞的提取
[0001]本發(fā)明涉及用于改善從細(xì)胞回收物質(zhì)的方法。
[0002]生物加工工業(yè)在生物治療藥物和生物【技術(shù)領(lǐng)域】已經(jīng)歷了巨大成長，并且在近年來，在使用這樣的方法制備的生物醫(yī)藥產(chǎn)品(例如疫苗和單克隆抗體)的數(shù)量方面有很大增長。最近的數(shù)據(jù)顯示了全部藥物的約44%是生物醫(yī)藥產(chǎn)品。
[0003]生物加工的技術(shù)由多個步驟組成。制備可以合成目的生物藥物產(chǎn)品的宿主細(xì)胞。在宿主細(xì)胞發(fā)酵(“生物反應(yīng)器步驟”)后，產(chǎn)物通常從所述細(xì)胞分泌和/或提取，即“產(chǎn)物釋放步驟”。接著具體產(chǎn)物需要通過下游加工純化，如過濾、離心和各種色譜法步驟。這樣的方法可以用來制備用于治療應(yīng)用的生物藥物產(chǎn)品。所述產(chǎn)物釋放步驟和隨后的這樣的產(chǎn)物的回收在生物加工技術(shù)中是關(guān)鍵階段。
[0004]由于各種各樣的原因，選擇用于生產(chǎn)生物藥物以及其他目的重組蛋白的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)。大腸桿菌(E.coli)是革蘭氏陰性菌。這些細(xì)胞可以容易生長，并且含有相對簡單的基因組。這些細(xì)胞的遺傳學(xué)可以易于操控，這使得它們在微生物學(xué)、生物技術(shù)和生物加工領(lǐng)域中很重要。
[0005]像通常細(xì)胞膜一樣，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌含有額外的外膜，該外膜含有脂多糖和脂蛋白以及磷脂和膜蛋白。脂多糖由連接于O-多糖的共價結(jié)合的脂質(zhì)A分子組成，這給外膜提供強(qiáng)負(fù)電荷。在內(nèi)膜和外膜之間存在間隙，稱為周質(zhì)間隙，其在革蘭氏陰性菌中含有薄的肽聚糖基質(zhì)層-已知其在細(xì)胞壁中提供結(jié)構(gòu)功能。肽聚糖基質(zhì)層由兩種糖即N-乙酰胞壁酸和(β1_4)Ν-乙酰葡糖胺組成，這兩種糖在所述層的結(jié)構(gòu)中交替。所述N-乙酰胞壁酸單體含有具有由若干氨基酸殘基構(gòu)成的肽鏈的側(cè)鏈。這種肽鏈具有結(jié)合另一個N-乙酰胞壁酸單體中的另一個肽鏈 的潛力，以致所述肽聚糖可以形成’網(wǎng)狀’層。這種肽聚糖層還含有小孔或開口，這可以足夠達(dá)以用于蛋白通過。
[0006]在有機(jī)體如大成桿菌中，一些蛋白可以運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)外和各種其他膜隔室中，包括周質(zhì)間隙。預(yù)定從細(xì)胞質(zhì)輸出的蛋白含有“信號肽”，其是蛋白N-端的延伸。這些’信號肽’含有三個保守區(qū)域；N-端區(qū)域，核心區(qū)域和C-端區(qū)域。一旦所述蛋白已到達(dá)其需要的目的地，則信號肽可以通過稱為信號肽酶的酶從成熟蛋白裂解，由此在細(xì)胞膜的指定隔室(例如周質(zhì))中釋放成熟多肽。
[0007]蛋白至周質(zhì)間隙的易位已由生物加工工業(yè)開發(fā)以有助于生物藥物產(chǎn)品的回收。這是為了使從細(xì)胞質(zhì)釋放的污染物的量最小，并且還避免細(xì)胞的微粉化。
[0008]文獻(xiàn)中有大量現(xiàn)有方法用于釋放周質(zhì)蛋白，但沒有一個是理想的。使用去污劑(如Triton X-100)和氯仿對細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)處理導(dǎo)致外膜的透過性增大，而且還導(dǎo)致低的蛋白純度，因此增加關(guān)于下游加工的成本。用陰離子表面活性劑處理大腸桿菌細(xì)胞也可以導(dǎo)致大量周質(zhì)蛋白釋放，包括青霉素?；浮Ｍ饽ひ部梢酝ㄟ^用甘氨酸處理被透化以釋放細(xì)菌的內(nèi)含物，包括α -淀粉酶，獲得這種蛋白的70-80%回收。滲透壓休克的技術(shù)也已在從大腸桿菌細(xì)胞的周質(zhì)釋放青霉素酰化酶中顯示前景。盡管這些方法在實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模上顯示了相對成功，但是使這些技術(shù)在更大規(guī)模上可行的上升顯示很少的前景。
[0009]迄今周質(zhì)蛋白釋放的最有效方法利用EDTA(乙二胺四乙酸)聯(lián)合溶菌酶。EDTA導(dǎo)致二價陽離子如Ca2+的螯合，其引起膜去穩(wěn)定化，從而允許溶菌酶接近而分解存在于周質(zhì)中的肽聚糖基質(zhì)。這允許釋放更大量的周質(zhì)蛋白，如α-淀粉酶。即使這種方法在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)期間導(dǎo)致增加的周質(zhì)釋放，但是當(dāng)在工業(yè)上規(guī)?；愿篌w積使用時，它已被證明是昂貴的方法。
[0010]因此，仍然需要開發(fā)有效而廉價的方法以釋放革蘭氏陰性菌的周質(zhì)內(nèi)含物。
[0011]本發(fā)明的發(fā)明人決定開發(fā)一種新的周質(zhì)蛋白釋放方法以實(shí)現(xiàn)提取靶向周質(zhì)的治療蛋白的更有效方式。他們已驚人地發(fā)現(xiàn)，苯乙烯馬來酸(SMA)共聚物可以特異地破壞細(xì)菌細(xì)胞的外膜從而釋放周質(zhì)的內(nèi)含物，同時不破壞內(nèi)膜，由此避免來自細(xì)胞質(zhì)的污染蛋白在蛋白樣品中存在。
[0012]因此，本發(fā)明的第一方面提供一種用于釋放細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)間隙的內(nèi)含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液中溫育細(xì)菌細(xì)胞。 [0013]本發(fā)明的發(fā)明人決定研究苯乙烯馬來酸(SMA)是否可以用來從細(xì)胞提取周質(zhì)蛋白。他們已驚人地發(fā)現(xiàn)，SMA特異地破壞細(xì)菌細(xì)胞的外膜但不破壞內(nèi)膜。因此，SMA可以用來選擇性地提取周質(zhì)蛋白同時不釋放來自細(xì)胞質(zhì)的污染蛋白。所述提取方法易于進(jìn)行并且可以易于規(guī)?；链笠?guī)模生物加工過程。所述方法顯著地降低了涉及的成本，因?yàn)樵谙掠渭庸ぶ杏休^少的純化步驟。
[0014]雖然SMA之前已被用來分離和保存跨膜蛋白，以及用于遞送治療劑，但是直至本發(fā)明，還沒有公開或啟示SMA可以用來釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)含物。
[0015]實(shí)踐中，本發(fā)明的方法可以易于用來選擇性地將周質(zhì)間隙的內(nèi)含物釋放到溶液中。周質(zhì)間隙的具體組分，例如用于工業(yè)用途的重組蛋白，然后可以易于從所述溶液分離。因此，本發(fā)明具有明顯有益的和工業(yè)的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明第一方面的方法包括在含有苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液中溫育細(xì)菌細(xì)胞。
[0017]細(xì)菌物種通常可以分成“革蘭氏陽性”和“革蘭氏陰性”物種，區(qū)別具體地可歸因于取決于其細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異的特定染料的保持。
[0018]可以用于所述方法的細(xì)菌細(xì)胞可以是任何合適的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌物種，優(yōu)選是大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌屬物種(Salmonella sp.)、熒光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、志賀氏菌屬物種(Shigella sp.)、耶爾森氏菌屬物種(Yersinia sp.)或克雷伯氏菌屬物種(Klebsiella sp.)。這樣的細(xì)菌物種在本領(lǐng)域是熟知的。這些物種的細(xì)菌細(xì)胞可以易于獲得，例如從商業(yè)供應(yīng)商或生物學(xué)材料保藏中心如ATCC(http://www.lgcstandards-atcc.0rg/)。
[0019]如本領(lǐng)域熟知的，也已制備了這樣的革蘭氏陰性細(xì)菌物種的突變衍生物，其提高了產(chǎn)生的蛋白的量的質(zhì)量和/或數(shù)量。它們因此也被認(rèn)為是因此可以用于本發(fā)明的此方面的細(xì)菌細(xì)胞的實(shí)例。
[0020]制備用于本發(fā)明方法中的細(xì)菌細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是熟知的。如下面進(jìn)一步概述的，在一些情形中，細(xì)菌細(xì)胞將含有重組多肽。在培養(yǎng)基中以足夠時間并且在合適條件下培養(yǎng)上述這樣的細(xì)胞以獲得所述重組多肽的表達(dá)的方法在本領(lǐng)域是熟知的。本文在所附實(shí)施例部分中提供了一種這樣的方法的一個實(shí)例。
[0021]本發(fā)明的第一方面的方法使用含有苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液。[0022]在一些實(shí)施方案中，提供苯乙烯和馬來酸的共聚物包括提供苯乙烯和馬來酸酐的共聚物，和將所述馬來酸酐水解為馬來酸。苯乙烯和馬來酸酐的共聚物以商品名SMA?2000 和SMA? 3000 可獲自 Sartomer Company Inc., Exton PA, USA。合適的水解方法在本領(lǐng)域中是已知的。
[0023]作為實(shí)例，可以使用以下方案來制備可以用于本發(fā)明第一方面的方法中的SMA的溶液。
[0024]將SMA2000P (獲自Sartomer)和IM氫氧化鈉(10%w/v)的溶液在室溫在磁力攪拌子上在圓底燒瓶中溫和地混合過夜(25g的SMA2000P溶解在250ml的NaOH中)。然后向圓底燒瓶中加入幾個抗爆沸顆粒，然后將圓底燒瓶置于連接有冷凝器的加熱套上。允許SM/NaOH溶液到達(dá)沸點(diǎn)。在沸騰后，關(guān)閉加熱并且允許該溶液回流2小時，然后轉(zhuǎn)移到冷室達(dá)2天。這些過程在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。在這個冷卻期之后，測量體積并計算SMA的百分比含量，然后等分到50ml falcon管中并儲存在_70°C。
[0025]當(dāng)使用時，優(yōu)選地，所述溶液含有50mM TRIS pH8.0、0.5M NaCl。
[0026]在一些實(shí)施方案中，提供其中苯乙烯:馬來酸比為0.5:1至10:1的苯乙烯和馬來酸的共聚物，包括提供其中苯乙烯:馬來酸比為1:1至5:1的苯乙烯和馬來酸的共聚物。在一些其他實(shí)施方案中，苯乙烯:馬來酸比為1.5:1至4:1，或2:1至3:1。
[0027]應(yīng)理解，由于聚合過程的特性，這樣的單體比是大量平均值，并且不作為對具有指定的單體排布的特定分子結(jié)構(gòu)的描述。然而，一般地預(yù)期單體類型遍布所述共聚物。
[0028]在一些實(shí)施方案中，提供苯乙烯和馬來酸的共聚物包括提供分子量為3000Da至120000Da的苯乙烯和馬來酸的共聚物。在一些其他實(shí)施方案中，所述共聚物的分子量為5000Da至15000Da。在一些其他實(shí)施方案中，所述共聚物的分子量為7000至lOOOODa。
[0029]本發(fā)明的發(fā)明人已研究了可以用來釋放周質(zhì)間隙內(nèi)含物的SMA的濃度范圍。他們已經(jīng)證實(shí)，SMA在溶液中的至少約0.5-4.5%的范圍可以成功地用于該目的。在一個實(shí)施方案中，SMA的濃度為約0.5%-10%、1%-7%或1.5%_5%。在另一個實(shí)施方案中，SMA的濃度為約2-2.5%。
[0030]本發(fā)明的發(fā)明人已研究了 SMA對釋放周質(zhì)間隙內(nèi)含物的時間影響。他們已證實(shí)，至少約15分鐘至6小時溫育時間范圍可以成功用于該目的。優(yōu)選地，溫育時間為約2小時。同樣，優(yōu)選地，所述細(xì)菌細(xì)胞在約37°C用SMA溫育。
[0031]相應(yīng)地，因此根據(jù)本文中提供的信息，本發(fā)明第一方面的一個優(yōu)選實(shí)施方案是其中所述方法包括以下步驟:(i)制備細(xì)菌細(xì)胞的群；(?)將所述細(xì)菌細(xì)胞懸浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:馬來酸比為約2:1并且濃度為約2-2.5%;和(ii)將所述細(xì)菌細(xì)胞在約37°C在所述溶液中溫育約2小時。
[0032]本發(fā)明的發(fā)明人還注意到，在具有SMA的溶液中EDTA(ImM)的存在導(dǎo)致從周質(zhì)間隙釋放的材料的顯著減少。因此，本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案是其中所述溶液基本上不含有EDTA。
[0033]本發(fā)明的發(fā)明人還研究了滲透壓休克對周質(zhì)間隙的內(nèi)含物的釋放效率的作用。如在所附實(shí)施例中顯示的，使用滲透壓休克引起從周質(zhì)間隙釋放的材料增多。因此本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案是其中所述方法包括將細(xì)胞暴露于滲透壓休克。優(yōu)選地，滲透壓休克在細(xì)胞用SMA溶液溫育后進(jìn)行。[0034] 本發(fā)明的方法可以用來釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)含物。周質(zhì)的組成可以包括寡糖、氨基酸、肽和各種小分子。本發(fā)明的方法的操作者可以使用上述方法來從細(xì)胞釋放這些組分，其隨后可以使用本領(lǐng)域熟知的方法從所述溶液進(jìn)一步純化。
[0035]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)靶向周質(zhì)的重組多肽。將重組多肽引向周質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是熟知的。相應(yīng)地，因此本發(fā)明的方法可以用作大規(guī)模生物加工過程的一部分以選擇性地將周質(zhì)的內(nèi)含物(包括這樣的重組多肽)釋放到溶液中用于后
續(xù)純化。
[0036]因此本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是其中所述方法還包括從所述溶液回收周質(zhì)間隙的一種組分的至少一部分。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是其中周質(zhì)間隙含有重組多肽。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是其中所述方法還包括從所述溶液回收重組多肽的至少一部分。
[0037]重組多肽可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地從溶液分離，包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜法，磷酸纖維素色譜法，疏水相互作用色譜法，親和色譜法，羥磷灰石色譜法和凝集素色譜法。
[0038]在需要分離已被遺傳改造以包含純化標(biāo)簽(如多個組氨酸殘基，或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)的具體重組多肽的情況中，這樣的多肽可以通過適于所使用的特定純化標(biāo)簽的任何方法進(jìn)行純化，如例如親和色譜法。也可以使用本領(lǐng)域中熟知的其他蛋白純化技術(shù)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。
[0039]本發(fā)明的另一方面提供一種制備重組多肽的基本上純的樣品的方法，所述方法包括:(i)制備包含所述重組多肽的細(xì)菌細(xì)胞的群；(?)將所述細(xì)菌細(xì)胞懸浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:馬來酸比為約2:1并且濃度為約2-2.5%;和(ii)在約37°C將所述細(xì)菌細(xì)胞在所述溶液中溫育約2小時；(iv)從所述溶液回收所述重組多肽。
[0040]為了避免懷疑，本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案還應(yīng)用于本發(fā)明此方面的方法。
[0041]因此作為實(shí)例，以下方案可以用作本發(fā)明的方法一個實(shí)施方案。
[0042]細(xì)菌細(xì)胞的群在適當(dāng)培養(yǎng)條件下生長。如果所述細(xì)菌細(xì)胞合成重組的靶向周質(zhì)的多肽，則所述培養(yǎng)條件是這樣的以促進(jìn)這樣的多肽的表達(dá)和積累。所述細(xì)胞然后使用實(shí)驗(yàn)室方法(例如離心)收獲并懸浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:馬來酸比為約2:1并且濃度為約2-2.5%。細(xì)胞懸浮液在約37°C溫育2小時。然后使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法(例如離心)將所述細(xì)胞從所述溶液除去。所得的溶液含有周質(zhì)間隙的內(nèi)含物。然后可以使用例如本領(lǐng)域已知的親和純化手段分離周質(zhì)間隙的具體組分。
[0043]本發(fā)明的另一方面提供苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)用于釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)含物的用途。
[0044]本發(fā)明的另一方面提供一種試劑盒，所述試劑盒包括:(i)含有苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液；和(ii)操作手冊。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括一種或多種另外的部件，所述一種或多種另外的部件包括蛋白質(zhì)純化柱或樹脂。
[0045]所述操作手冊可以包括涉及例如如本文提供的優(yōu)選的溫育條件和反應(yīng)程序的信息，以及根據(jù)需要的其他這樣的信息。
[0046]本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下的非限制性附圖和實(shí)施例進(jìn)行描述。
【專利附圖】

【附圖說明】[0047]圖1:革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)
[0048]圖2:苯乙烯馬來酸(SMA)
[0049]圖3:通過SMA形成脂質(zhì)納米盤(nanodisk)以保存和分離跨膜蛋白。
[0050]圖4:各種條件對α -淀粉酶的周質(zhì)釋放的影響。
[0051]圖5:自大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞的多種周質(zhì)釋放方法的效率。
[0052]圖6:延長的37°C溫育時間對通過SMA的α -淀粉酶的周質(zhì)釋放的影響。
[0053]圖7:更長的溫育時間對通過SMA的α -淀粉酶的周質(zhì)釋放的影響。
[0054]圖8:自大腸桿菌的多種SMA周質(zhì)釋放方法的效率。
[0055]圖9:增大的SMA脂質(zhì)聚合物濃度對α -淀粉酶從周質(zhì)釋放的影響。
[0056]圖10:變化的SMA脂質(zhì)聚合物濃度對α -淀粉酶從周質(zhì)釋放的影響。
[0057]圖11:自大腸桿菌的多種SMA周質(zhì)釋放方法的效率。
[0058]圖12:溫度變化對最佳TSLE釋放方法的作用模式的影響。
[0059]圖13:滲透壓休克 對多種周質(zhì)釋放方法的影響。
[0060]圖14 =EDTA對周質(zhì)α -淀粉酶釋放的各種處理的影響。
[0061]圖15:檢測β -半乳糖苷酶在這些大腸桿菌細(xì)胞中的存在的初始測定。
[0062]圖16:各種條件對β -半乳糖苷酶的釋放的影響。
[0063]圖17:多種條件對從大腸桿菌細(xì)胞提取β -半乳糖苷酶的影響。
[0064]圖18:牛血清清蛋白(BSA)樣品的稀釋系列的線性相應(yīng)。
[0065]圖19:顯示大腸桿菌細(xì)胞的各種周質(zhì)級分的SDS-PAGE凝膠。
[0066]圖20:顯示大腸桿菌細(xì)胞的各種周質(zhì)級分的SDS-PAGE凝膠。
[0067]圖21:提出的TSLE和SMA對大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞的作用模式。
[0068]圖22 =FAB片段從大腸桿菌的周質(zhì)的釋放:⑷顯示從用SMA處理的細(xì)胞釋放的FAB片段的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。(B)顯示從使用滲透壓休克處理的細(xì)胞釋放的FAB片段的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。(C)從使用滲透壓休克處理的細(xì)胞釋放的總蛋白的SDS PAGE。(D)從用SMA處理的細(xì)胞釋放的總蛋白的SDS PAGE。
[0069]實(shí)施例1:SMA選擇性地從周質(zhì)釋放蛋白的用途
[0070]概要
[0071]最近的發(fā)現(xiàn)，即苯乙烯馬來酸(SMA)共聚物可以形成脂質(zhì)/聚合物組裝件(’脂質(zhì)納米盤’)以便分離和保存跨膜蛋白，在生物學(xué)的這個領(lǐng)域具有巨大突破。因此包括圓二色譜在內(nèi)的技術(shù)已被用來表征這些跨膜蛋白以用于結(jié)構(gòu)和功能分析(Knowles等，2009)。
[0072]數(shù)十年來，一直需要有效且廉價的處理以選擇性地從大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)間隙釋放蛋白，所述處理可以在大型生物加工工業(yè)中規(guī)?；?細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)參見圖1)。在本研究期間，本發(fā)明的發(fā)明人使用SMA共聚物作為用于釋放基于周質(zhì)的治療蛋白的方法。這種測定可以通過研究各種因素對蛋白釋放效率的影響來開發(fā)；如改變SMA濃度，使溫育時間不同，滲透壓休克和添加EDTA。在所有實(shí)驗(yàn)中使用陽性對照-通過將這種新方法與使用Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)的最佳釋放方法進(jìn)行比較。周質(zhì)蛋白釋放的這種新方法使用三種生化測定(α -淀粉酶、β -半乳糖苷酶和BCA總蛋白測定)開發(fā)。
[0073]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SMA共聚物可以有效且選擇性地從大腸桿菌細(xì)胞的周質(zhì)釋放蛋白。他們發(fā)現(xiàn)，使用這種共聚物溫育這些細(xì)胞的理想條件是濃度為2-2.5%(在37°C持續(xù)2小時)。因此這些新處理具有被規(guī)?；链笠?guī)模生物加工工業(yè)的巨大潛力。這將顯著降低所涉及的成本-因?yàn)镾MA相對廉價，并且在下游加工中需要更少的純化步驟。
[0074]引言
[0075]本發(fā)明的發(fā)明人決定開發(fā)一種新的周質(zhì)蛋白釋放方法以實(shí)現(xiàn)提取靶向周質(zhì)的治療蛋白的更有效方式。最廣泛使用的周質(zhì)釋放方法使用Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)緩沖液，并且因此在實(shí)驗(yàn)中被用作對照。使用這種TSLE釋放方法，高比例的蛋白可以從周質(zhì)釋放，但這種方法極難規(guī)模化用于大規(guī)模工業(yè)過程，原因在于溶菌酶的量和成本。
[0076]近來的發(fā)現(xiàn)，即被稱為SMA(苯乙烯馬來酸；圖2)的聚合物能夠結(jié)合至脂質(zhì)顆粒以形成SM/脂質(zhì)顆粒(SMALP)在跨膜蛋白研究中是一個巨大突破(Knowles等，2009 ;圖3)。
[0077]因此本發(fā)明的發(fā)明人決定研究SMA共聚物是否可以特異地破壞大腸桿菌細(xì)胞的外膜以選擇性地提取周質(zhì)蛋白同時不釋放來自細(xì)胞質(zhì)的污染蛋白。
[0078]方法和材料
[0079]用來確定總蛋白濃度的BCA ( 二喹啉甲酸)測定
[0080]這種測定基于成紫色的BCA-Cu+反應(yīng)復(fù)合物的比色檢測(在562nm)以確定樣品中的蛋白總量。這種方案結(jié)合了在堿性介質(zhì)中蛋白還原銅離子(Cu2+-->Cu+)(稱為雙縮脲反應(yīng))與單個Cu+離子能夠與兩個BCA分子螯合從而形成紫色反應(yīng)復(fù)合物的能力。
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種用于釋放細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)間隙的內(nèi)含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液中溫育所述細(xì)菌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中苯乙烯:馬來酸比為約1:2至10:1.
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中苯乙烯:馬來酸比為約2:1。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述SMA的濃度為約0.5-4.5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述SMA濃度為約2-2.5%。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞用所述SMA溫育約15分鐘至6小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞用所述SMA溫育約2小時。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞在約37°C用所述SMA溫育。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌物種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述革蘭氏陰性細(xì)菌物種是大腸桿菌(E.coli),沙門氏菌屬物種(Salmonella sp.)、突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、志賀氏菌屬物種(Shigella sp.)、耶爾森氏菌屬物種(Yersinia sp.)或克雷伯氏菌屬物種(Klebsiella sp.)。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括以下步驟:(i)制備細(xì)菌細(xì)胞的群；(ii)將所述細(xì)菌細(xì)胞懸浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:馬來酸比為約2:1并且濃度為約2-2.5% ;和(ii)在約37°C在所述溶液中將所述細(xì)菌細(xì)胞溫育約2小時。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶液基本上不含有EDTA。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶液含有50mMTRIS pH8.00.5M NaCl。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括將所述細(xì)胞暴露于滲透壓休克。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括從所述溶液回收所述周質(zhì)間隙的一種組分的至少一部分。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述周質(zhì)間隙含有重組多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述方法包括從所述溶液回收重組多肽的至少一部分。
18.一種制備重組多肽的基本上純的樣品的方法，所述方法包括:(i)制備包含所述重組多肽的細(xì)菌細(xì)胞的群；(ii)將所述細(xì)菌細(xì)胞懸浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:馬來酸比為約2:1并且濃度為約2-2.5% ;和(ii)在約37°C在所述溶液中將所述細(xì)菌細(xì)胞溫育約2小時；(iv)從所述溶液回收所述重組多肽。
19.苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)用于釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)含物的用途。
20.一種試劑盒，所述試劑盒包括:(i)包含苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)的溶液；和(ii)操作手冊。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述試劑盒還包括一個或多個另外的部件，所述一個或多個另外 的部件包括蛋白質(zhì)純化柱或樹脂。
【文檔編號】C12P21/00GK103649325SQ201280033450
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月9日
【發(fā)明者】蒂莫西·達(dá)弗恩, 歐文·羅伯特·蒂里尼斯-托馬斯 申請人:伯明翰大學(xué)