用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法和核酸的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了用于確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法、核酸及試劑盒。本發(fā)明公開(kāi)了基因組序列，其甲基化模式具有用于下列的應(yīng)用：改進(jìn)的對(duì)所述病癥的檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的對(duì)患者的診斷和治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法和核酸
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可用于以下的基因組DNA標(biāo)志物:確定癌癥對(duì)象的預(yù)后；確定癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定來(lái)自癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象；或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)。一些特定實(shí)施方案提供了可用于確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法、核酸、核酸陣列以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]用于確定癌癥患者之預(yù)后的方法并且因而用于確定癌癥患者之治療的方法和試劑包括基于多種標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定腫瘤的分期。通常來(lái)說(shuō)，該確定包括侵入性方法以觀察組織形態(tài)學(xué)的組織學(xué)變化及腫瘤侵襲進(jìn)入相鄰組織和轉(zhuǎn)移的水平。
[0003]特別地，結(jié)直腸癌在歐洲和美國(guó)是第二常見(jiàn)的癌癥(在2006年，分別為412,900例和150，000例)。在75%的病例中，通過(guò)手術(shù)除去疾病。但是，有30%至40%的II至III期結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)，大多數(shù)在最初診斷的3至5年內(nèi)。此外，只有16%至66%的患者在復(fù)發(fā)診斷時(shí)是有癥狀的，并且在這些腫瘤中，只有1.7%至7%可切除。因此，93%至98.3%的復(fù)發(fā)病例是在切除足以除去所有腫瘤或腫瘤細(xì)胞的時(shí)間之后鑒定出來(lái)的。參見(jiàn)Fakih，M.G MD, CEA Monitoring in Colorectal Cancer, What You Should Know,第 20 卷:第 6期:2006。
[0004]目前有關(guān)II期和更晚期腫 瘤的切除后監(jiān)視的現(xiàn)有操作指南包括:每3至6個(gè)月監(jiān)測(cè)CEA (癌胚抗原)，進(jìn)行2年，然后每6個(gè)月，進(jìn)行總計(jì)5年；和/或在1年后進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，任選地每?jī)赡曛貜?fù)。就在手術(shù)前對(duì)CEA呈陽(yáng)性的結(jié)直腸I期和II期患者而言，通過(guò)基于CEA的監(jiān)測(cè)只能監(jiān)測(cè)3%至32%的患者，剩下68%至97%的用CEA根本無(wú)法監(jiān)測(cè)的I&II期患者。此外，CEA靈敏度取決于復(fù)發(fā)部位，使得3%至32%的可以被監(jiān)測(cè)的患者中只有一部分可以獲益。
[0005]目前，在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌(CRC)患者之結(jié)局中唯一有效的預(yù)后標(biāo)志物是腫瘤-結(jié)-轉(zhuǎn)移(Tumor-Node-Metastasis, TNM)分期體系。該體系的參數(shù)一般是定性的，并且不為進(jìn)一步區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)患者的風(fēng)險(xiǎn)(其構(gòu)成大多數(shù)II期結(jié)腸癌)提供信息。約30%的結(jié)腸癌患者患有II期疾病?，F(xiàn)有國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(Current National ComprehensiveCancer Network, NCCN)指南不推薦對(duì)所有II期結(jié)腸癌患者常規(guī)地使用輔助化學(xué)治療，而是在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的情況下考慮輔助治療。估計(jì)整個(gè)II期患者群體的5年存活率為75%至80%。盡管單獨(dú)采用手術(shù)具有這些相對(duì)高的治愈率，但癌癥將在顯著比例的II期患者中復(fù)發(fā)。將具有低疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者與具有較高疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者區(qū)分開(kāi)的標(biāo)志物的鑒定將有助于鑒定可以成為輔助化學(xué)治療候選的那些患者。到目前為止，II期結(jié)腸癌的生物標(biāo)志物仍限于臨床診斷，并未用于預(yù)后或臨床結(jié)局。
[0006]為了試圖改善預(yù)后信息以及預(yù)測(cè)全身治療的益處，已描述了若干蛋白質(zhì)和遺傳標(biāo)志物。不同于其他類(lèi)型的癌癥，到目前為止，所研究的標(biāo)志物均未進(jìn)入結(jié)直腸癌的臨床管理(KRAS突變除外)。
[0007]CpG島甲基化:CpG島的異常甲基化已示出導(dǎo)致先前已與多種細(xì)胞增殖病癥(包括癌癥)的發(fā)病機(jī)制相關(guān)聯(lián)之某些基因的轉(zhuǎn)錄沉默。CpG島是富含CpG 二核苷酸的序列，并且通?？梢?jiàn) 于全部人基因中約50%的5’區(qū)。在這些島中胞嘧啶的甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)喪失，并且在X染色體的失活和基因組印記(genomic imprinting)中已有報(bào)道。
[0008]DNA甲基化和疾病預(yù)后:在許多公開(kāi)例如EP1692316和W02007/085497中，已示出DNA甲基化與患者預(yù)后相關(guān)。
[0009]需要更好的方法來(lái)確定患者的預(yù)后、臨床結(jié)局、腫瘤負(fù)荷、癌癥負(fù)擔(dān)、和/或在從初始診斷開(kāi)始并在治療過(guò)程期間持續(xù)的任意點(diǎn)納入治療組中，包括使用最低侵入性測(cè)試技術(shù)來(lái)確定再發(fā)、緩解或復(fù)發(fā)狀態(tài)的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括以下步驟:測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加指示所述癌癥是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或所述對(duì)象的存活時(shí)間減少。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括以下步驟:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；b)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；以及c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示不良預(yù)后，因此，所述對(duì)象需要額外的癌癥治療。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定癌癥對(duì)象的預(yù)后，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示不良預(yù)后，因此，所述對(duì)象需要額外的癌癥治療。
[0011]穩(wěn)定的或者甚至水平提高的甲基化基因組DNA優(yōu)選地指示所選治療未能除去釋放甲基化DNA片段的癌細(xì)胞，或者盡管經(jīng)歷了治療，這些癌細(xì)胞的數(shù)目仍增加，即，癌進(jìn)一步生長(zhǎng)。與此相反，水平降低的甲基化基因組DNA優(yōu)選地指示癌細(xì)胞的數(shù)目減少，即，該治療成功地減少了患者的腫瘤負(fù)荷。特別地，降低至低于檢出水平之水平指示可能已經(jīng)從患者清除了所有癌細(xì)胞，即，癌癥的治愈。通常來(lái)說(shuō)，認(rèn)為對(duì)治療應(yīng)答不良的癌癥是侵襲性的。
[0012]如果所施用的癌癥治療是局部治療，則甲基化基因組DNA的水平降低至低于檢出限的水平優(yōu)選地指示癌癥的治愈。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)臨床研究的結(jié)局(outcome)，可以定義用于定義患者之“治愈”的其他閾值水平?？梢酝ㄟ^(guò)(醫(yī)學(xué))統(tǒng)計(jì)學(xué)領(lǐng)域中常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這樣的閾值水平的建立。
[0013]但是，如果在局部治療之后測(cè)量的甲基化基因組DNA的水平高于該檢出水平，則其優(yōu)選地指示局部治療不足以實(shí)現(xiàn)完全治愈。如果癌癥已擴(kuò)散超出受局部治療影響的區(qū)域，則通常是這種情況。因此，即使在甲基化基因組DNA水平降低的情況下，可檢測(cè)水平的甲基化基因組DNA的持續(xù)存在也指示不良預(yù)后，這是因?yàn)閿U(kuò)散超過(guò)其最初部位的癌癥通常更難以治療。
[0014]對(duì)癌癥患者的進(jìn)一步治療進(jìn)行選擇取決于該患者的預(yù)后。如果預(yù)后良好，則后續(xù)治療無(wú)需具有像不良預(yù)后一樣的攻擊性。因?yàn)榛颊叩念A(yù)后是對(duì)癌癥患者進(jìn)一步治療進(jìn)行選擇的一個(gè)重要參數(shù)，所以本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象之醫(yī)學(xué)治療的方法，其包括以下步驟:測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于確定哪種醫(yī)學(xué)治療適于癌癥對(duì)象的方法，其包括以下步驟:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；b)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；以及c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定哪種醫(yī)學(xué)治療適于癌癥對(duì)象，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。
[0015]優(yōu)選地，甲基化基因組DNA的治療后水平降低至低于檢出水平指示不需要進(jìn)一步醫(yī)學(xué)治療。在這些情況下，監(jiān)測(cè)患者的復(fù)發(fā)可能就足夠了。但是，如果甲基化基因組DNA的治療后水平未降低或者甚至提高，那么額外的醫(yī)學(xué)治療可能是必需的。因?yàn)榧谆蚪MDNA水平提高表示治療失敗，所以該情況優(yōu)選地指示需要轉(zhuǎn)變成不同種類(lèi)的治療。
[0016]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，癌癥患者之合適治療的選擇不能只基于單一實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的結(jié)果。該決定優(yōu)選地基于患者病癥的醫(yī)學(xué)判斷。除通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果以外，所述判斷還優(yōu)選地包括常規(guī)診斷方法(例如影像方法)的結(jié)果以及特定患者的一般健康狀態(tài)。
[0017]本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少的方法，其包括:測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示癌癥是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少的方法，其包括:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平山)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；以及c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟C)的比較結(jié)果確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少，由此與治療前樣品相t匕，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少。
[0018]此外，本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否是侵襲性的和/或具有轉(zhuǎn)移潛能的方法，其包括以下步驟:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平山)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示所述腫瘤是侵襲性的和/或具有轉(zhuǎn)移潛能。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否是侵襲性的和/或具有轉(zhuǎn)移潛能，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示所述腫瘤是侵襲性的和/或具有轉(zhuǎn)移潛能。
[0019]本發(fā)明提供了用于檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式癌癥的方法，其包括:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；b)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加指示所述癌癥為侵襲性形式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式癌癥的方法，其包括:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；b)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，以及c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后 水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加指示所述癌癥為侵襲性形式。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA或片段的量增加指示所述癌癥為侵襲性形式。
[0020]本發(fā)明提供了用于為癌癥治療選擇癌癥對(duì)象的方法，其包括:測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA的量增加指示進(jìn)行額外的癌癥治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于為額外癌癥治療選擇癌癥對(duì)象的方法，其包括:測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相當(dāng)指示需要額外的癌癥治療。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果選擇用于額外癌癥治療的癌癥對(duì)象，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相當(dāng)指示需要進(jìn)行額外的癌癥治療。
[0021]因此，本發(fā)明提供了用于確定在對(duì)象中抗癌治療之成功的方法，其包括以下步驟:
a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和
b)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此(i)與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量減少指示治療是成功的，和(ii)與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相當(dāng)指示治療不成功。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定在對(duì)象抗癌治療之成功，由此，(i)與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量減少指示治療是成功的，和
(ii)與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相當(dāng)指示治療不成功。
[0022]優(yōu)選地，“成功”的治療實(shí)現(xiàn)了以下效果中的至少之一:癌癥的緩解；癌癥復(fù)發(fā)時(shí)間的增加；腫瘤進(jìn)展時(shí)間的增加；癌癥癥狀的緩解；腫瘤質(zhì)量的減少和腫瘤數(shù)目的減少。更優(yōu)選地，“成功的治療”的特征在于癌癥的治愈，即，完全清除可檢測(cè)和不可檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞。癌癥治愈的一個(gè)優(yōu)選的指標(biāo)是患者在無(wú)復(fù)發(fā)的情況下存活至少5年，或者更優(yōu)選至少10年。
[0023]優(yōu)選地，“不成功”的治療未能實(shí)現(xiàn)任意上述目的。
[0024]本發(fā)明提供了用于確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷(tumor load)或癌癥負(fù)擔(dān)(cancerburden)的方法，其包括:測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA的量增加指示所述對(duì)象具有增加或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)或者腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)之發(fā)展的方法，其包括:a)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；b)測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平；以及c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相當(dāng)指示所述對(duì)象具有增加或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，或者腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定對(duì)象中腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)的發(fā)展，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的量增加或者所述DNA或其片段的量相當(dāng)指示對(duì)象具有增加或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，或者腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。`
[0025]本發(fā)明提供了用于確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)的方法，其包括:將在獲自對(duì)象的生物樣品中的基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平與基因之甲基化基因組DNA或片段的治療前水平進(jìn)行比較，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA的量增加指示所述對(duì)象具有增加或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，或者腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將甲基化DNA的所測(cè)量的治療后水平與所測(cè)量的治療前水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，由此與治療前樣品相比，治療后樣品中基因之甲基化基因組DNA的量增加指示所述對(duì)象具有增加或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，或者腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。
[0026]本發(fā)明的基因之甲基化DNA水平一般可用作癌癥性質(zhì)(例如侵襲性或腫瘤負(fù)荷)的標(biāo)志物。因此，在不同時(shí)間點(diǎn)獲取的甲基化DNA水平的比較獨(dú)立于正在進(jìn)行的治療指示癌癥性質(zhì)如何隨時(shí)間發(fā)展。
[0027]出于該原因，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測(cè)選自腫瘤負(fù)荷、癌癥負(fù)擔(dān)、癌癥侵襲性和癌癥對(duì)象預(yù)后的癌癥性質(zhì)的方法，其包括以下步驟:a)在獲自患癌癥對(duì)象的第一生物樣品中測(cè)量基因之甲基化基因組DNA或其片段的水平；b)在獲自所述對(duì)象的另一生物樣品中測(cè)量基因之甲基化基因組DNA或其片段的水平；以及c)將在所述另一樣品與第一樣品中所測(cè)量的甲基化DNA水平進(jìn)行比較，其中，在所述另一樣品中基因之甲基化DNA或其片段的水平提高指不癌癥的腫瘤負(fù)荷、腫瘤負(fù)擔(dān)或侵襲性提聞或者患者的預(yù)后變差；和(ii)在所述另一樣品中基因之甲基化DNA或其片段水平降低指示癌癥的腫瘤負(fù)荷、腫瘤負(fù)擔(dān)或侵襲性降低，或者患者的預(yù)后改善。
[0028]在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括如下步驟c)和d):c)將在所述另一樣品與第一樣品中所測(cè)量的甲基化DNA水平進(jìn)行比較，和d)基于步驟c)的比較結(jié)果確定癌癥的腫瘤負(fù)荷、腫瘤負(fù)擔(dān)或侵襲性提高還是降低或者患者的預(yù)后變差還是改善。
[0029]第一樣品和第二樣品 可以在任何時(shí)間獲取，前提是第二樣品在第一樣品之后獲取。優(yōu)選地，第二樣品在第一樣品之后至少1個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少6個(gè)月、至少9個(gè)月或至少12個(gè)月獲取。
[0030]用于監(jiān)測(cè)癌癥性質(zhì)的上述方法尤其適于監(jiān)測(cè)其癌癥之前已經(jīng)歷治療的患者之癌癥的復(fù)發(fā)和/或惡化。因此，在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述患者是對(duì)其的治療看起來(lái)治愈了癌癥的癌癥患者。在治療之后于不同時(shí)間點(diǎn)獲取的至少2個(gè)樣品中進(jìn)行的本發(fā)明的基因之甲基化的確定可用于檢測(cè)所述癌癥的復(fù)發(fā)。癌癥治療領(lǐng)域的一個(gè)普遍問(wèn)題是治療可能是表面上有效是，即，其將患者的腫瘤負(fù)擔(dān)降低為低于使用可用的診斷方法(特別是影像方法)可檢測(cè)的水平。但是，盡管表面上是成功的治療，但少數(shù)癌細(xì)胞可能仍然存在。這些細(xì)胞可以增殖并導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)，甚至在表面上成功的治療之后的若干年內(nèi)。因此，在治療之后對(duì)所治療患者進(jìn)行一段時(shí)間的隨訪是良好的醫(yī)療實(shí)踐以盡可能早地檢測(cè)到復(fù)發(fā)。因?yàn)楸景l(fā)明的方法不僅靈敏(特別地，Septin9可用于檢測(cè)結(jié)腸癌的早期階段)、易于實(shí)施而且無(wú)侵入性，所以其特別適于在隨訪期間監(jiān)測(cè)經(jīng)歷過(guò)治療的癌癥患者。
[0031]在本發(fā)明方法的一個(gè)方面中，所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO:1)或RASSF2a(SEQID NO:16)。
[0032]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO:1)。
[0033]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述基因是RASSF2A(SEQ ID NO:16)。
[0034]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述方法基于SEPTIN9和RASSF2A 二者的甲基化DNA水平的測(cè)量。
[0035]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述癌癥選自:結(jié)腸癌和結(jié)直腸癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥所處的階段是I期結(jié)直腸癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥所處的階段是II期結(jié)直腸癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是III期結(jié)直腸癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是IV期結(jié)直腸癌。
[0036]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述治療選自:手術(shù)或切除；免疫療法；放射治療；化學(xué)治療；靶向?qū)嶓w腫瘤的治療；靶向軟組織腫瘤的治療；以及靶向血細(xì)胞的治療。
[0037]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述治療局限于對(duì)象中癌/腫瘤的區(qū)域。在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述治療不局限于對(duì)象中癌/腫瘤的區(qū)域。 [0038]術(shù)語(yǔ)“局部治療”優(yōu)選地指腫瘤的手術(shù)切除和/或放射治療。術(shù)語(yǔ)“非局部治療”等同于全身性治療并且優(yōu)選地指化學(xué)治療和/或免疫治療。
[0039]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，所述生物樣品選自:組織、血液、糞便、尿和肺灌洗流體、乳腺、前列腺、結(jié)腸、直腸、或這些組織的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是血清或血漿。優(yōu)選使用血清或血漿。
[0040]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，定量地測(cè)量或部分定量地測(cè)量甲基化基因組DNA或其片段。在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，定性地測(cè)量或部分定性地測(cè)量甲基化基因組DNA或片段。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，部分定量地和部分定性地或半定量地測(cè)量甲基化基因組DNA或片段。
[0041]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面中，測(cè)量甲基化基因組DNA或片段包括使來(lái)自生物樣品的基因組DNA與至少一種試劑或一系列試劑相接觸，所述至少一種試劑或一系列試劑區(qū)分基因組DNA的至少一個(gè)靶區(qū)域中的甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸，其中所述靶區(qū)域包含SEQ ID NO:1、2、3或16的至少9個(gè)、至少16個(gè)或至少25個(gè)連續(xù)核苷酸序列或者在嚴(yán)格條件下與所述連續(xù)核苷酸序列雜交，其中所述連續(xù)核苷酸包含至少一個(gè)CpG二核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，接觸b)中的基因組DNA或其片段包括使用選自包括以下之組的試劑:重亞硫酸鹽(bisulfite)、亞硫酸氫鹽(hydrogen sulfite)、焦亞硫酸鹽(disulfite)及其組合。
[0042]本發(fā)明方法的另一個(gè)方面包括:a)從生物樣品中提取或以其他形式分離基因組DNA或其片段；b)用一種或更多種試劑處理所提取或分離的基因組DNA或其片段以將其5位非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛟陔s交性質(zhì)方面可檢測(cè)地不同于胞嘧啶的另一堿基；c)使經(jīng)處理的基因組DNA或經(jīng)處理的片段與擴(kuò)增酶及至少一種引物相接觸，所述引物包含至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)核苷酸的連續(xù)序列，該連續(xù)序列與經(jīng)處理的序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)或者在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下與經(jīng)處理的序列或其互補(bǔ)序列雜交，其中經(jīng)處理的基因組DNA或其片段被擴(kuò)增以產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物，或者未被擴(kuò)增；以及d)基于所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或量或性質(zhì)確定所述基因的至少一個(gè)CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)或水平，或者反映所述基因的多個(gè)CpG 二核苷酸的平均甲基化狀態(tài)或水平的平均值或值。上文中提及的經(jīng)處理的基因組DNA優(yōu)選地選自:SEQID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19 以及 20。
[0043]本發(fā)明方法的另一個(gè)方面包括:a)從生物樣品中提取或以其他形式分離基因組DNA或其片段；b)用一種或更多種甲基化敏感性限制酶消化所提取或分離的基因組DNA或其片段；c)使b)的DNA限制酶消化產(chǎn)物與擴(kuò)增酶及至少兩種適于擴(kuò)增包含所述基因的至少一個(gè)CpG 二核苷酸之序列的引物相接觸；和d)基于擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或類(lèi)別確定所述基因的至少一個(gè)CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)或水平。
[0044]關(guān)于用于測(cè)量甲基化基因組DNA之水平的優(yōu)選方法的其他信息可進(jìn)一步在本申請(qǐng)的下文中找到。在本發(fā)明的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于測(cè)量基因組DNA之甲基化水平的方法是MethyLight?、HeavyMethl?或甲基化特異性PCR。
[0045]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的甲基化基因組SEPTIN9核酸或包含該核酸的至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的甲基化基因組RASSF2A核酸或包含該核酸的至少9個(gè)、至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段及其互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌。
[0046]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了甲基化基因組SEPTIN9核酸或包含該核酸的至少9個(gè)、至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段及其互補(bǔ)序列在確定癌癥對(duì)象之預(yù)后中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌。
[0047]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的經(jīng)重亞硫酸鹽處理的基因組SEPTIN9或RASSF2A DNA核酸，其包含至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，經(jīng)重亞硫酸鹽處理的SEPTIN9或RASSF2ADNA 的序列由 SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19 或 20 來(lái)定義。在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)堿 基序列包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸序列。
[0048]在另個(gè)方面中，本發(fā)明提供了試劑盒，其用于:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定癌癥對(duì)象之醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象；或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，該試劑盒包含:a)多個(gè)能夠在嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下與基因或甲基化基因組DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的寡核苷酸或多核苷酸；和b)用于檢測(cè)雜交的工具。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因或甲基化基因組DNA是SEPTIN9。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因或甲基化基因組DNA是RASSF2A。
[0049]在另個(gè)方面中，本發(fā)明提供了試劑盒，其用于:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定癌癥對(duì)象之醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象之腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象；或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，該試劑盒包含:a)重亞硫酸鹽試劑；b)至少一組含有兩個(gè)寡核苷酸的寡核苷酸，在每種情況下，所述兩個(gè)寡核苷酸與SEPTIN9序列或RASSF2A基因的至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或者在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交。
[0050]在另一些方面中，本發(fā)明提供了本文所述方法、本文所述核酸和/或本文所述試劑盒在確定癌癥對(duì)象之預(yù)后中的用途。[0051]本發(fā)明提供了用于在對(duì)象中確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括:確定至少一個(gè)基因或基因組序列的表達(dá)水平，其中所述基因組序列在癌癥中是甲基化的，而在非癌組織中是非甲基化的。編碼基因的基因組DNA之甲基化或者特別是其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化降低所述基因的表達(dá)。因此，所討論之基因的甲基化提供與其低表達(dá)相類(lèi)似的診斷信息。因此，分離自所述對(duì)象之生物樣品中基因的甲基化/或表達(dá)的水平或量指示所述對(duì)象的預(yù)后。本發(fā)明的多個(gè)方面提供了遺傳標(biāo)志物，由此所述標(biāo)志物的表達(dá)分析使得能夠確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的存在、不存在或水平來(lái)確定所述表達(dá)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)由所述基因或其序列編碼的多肽的存在、不存在或水平來(lái)確定所述表達(dá)水平。
[0052]本發(fā)明提供了用于在對(duì)象中確定患有結(jié)直腸癌(CRC)或結(jié)腸癌之對(duì)象的預(yù)后的方法，其包括:確定分離自所述對(duì)象之血漿中的S印tin9(S印tin9)或RASSF2A的DNA甲基化水平，其中在切除原發(fā)性腫瘤之后，甲基化狀態(tài)指示所述對(duì)象的預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述切除是有療效的。
[0053]本文所述的實(shí)施例示出Septin 9生物標(biāo)志物在切除原發(fā)性腫瘤的約73%的所研究II期CRC患者中減少，并且僅在20%的III期患者中減少?？梢詫⒃谝灾委煘槟康倪M(jìn)行治療之后的CRC患者中Septin 9的存在用作疾病復(fù)發(fā)的早期預(yù)后指標(biāo)。在切除原發(fā)性腫瘤之后仍然可檢測(cè)到Septin 9的事實(shí)表示腫瘤細(xì)胞存在(例如，微轉(zhuǎn)移)的高風(fēng)險(xiǎn)，腫瘤細(xì)胞仍然在患者的身體中并且可以被S印tin9靈敏地檢測(cè)到。
[0054]在另一些實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)所述基因中CpG甲基化的存在、不存在或量來(lái)確定所述表達(dá)，由此推斷出所述癌癥對(duì)象的預(yù)后。所述方法包括以下步驟:i)使分離自獲自對(duì)象的生物樣品之基因組DNA與至少一種試劑或一系列試劑相接觸，所述試劑區(qū)分基因組DNA的至少一個(gè)靶區(qū)域中的甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸，其中所述靶區(qū)域的核苷酸序列包含至少一個(gè)基因的至少一個(gè)CpG 二核苷酸序列或該組基因的基因組序列，和ii)確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后`。優(yōu)選地，所述祀?yún)^(qū)域包含至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸序列或者在嚴(yán)格條件下與所述連續(xù)核苷酸序列雜交。
[0055]所述基因的用途可以通過(guò)基因表達(dá)分析、mRNA表達(dá)分析或蛋白質(zhì)表達(dá)分析來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，患癌癥對(duì)象之預(yù)后的確定通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn):在癌組織中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一個(gè)基因或基因組序列的甲基化狀態(tài)的分析，所述至少一個(gè)基因或基因組序列包括同工型、片段、啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件及其反義形式。
[0056]本發(fā)明提供了用于分析生物樣品與癌癥進(jìn)展相關(guān)的特征的方法，該方法的特征在于:使核酸或其片段與能夠在基因組序列中區(qū)分甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸的試劑或一系列試劑相接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因是SEPTIN9或RASSF2A。
[0057]優(yōu)選地，SEPTIN9的序列由SEQ ID NO:1、2或3所定義。更優(yōu)選地，SEPTIN9的序列由SEQ ID NO:2或3所定義。優(yōu)選地，RASSF2A的序列由SEQ ID NO:16所定義。
[0058]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定SEPTIN9和/或RASSF2A之啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定由SEQ ID NO:32和/或34所定義的基因組序列所包含的至少一個(gè)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定選自 SEQ ID NO:32 的第 21、28、30、37 以及 39 位和 SEQ ID NO:34 的第 25、29、46、52、58、70,74,79以及89位的胞嘧啶中的至少一個(gè)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定SEQ ID NO:32和/或34中所有前述位置胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。
[0059]本發(fā)明提供了用于確定與癌癥發(fā)展相關(guān)的基因組DNA的表觀遺傳學(xué)參數(shù)(epigenetic parameter)的方法。
[0060]受試樣品的來(lái)源是組織或體液，例如選自以下的組織和體液:組織、血液、血漿、血清、尿、肺泡灌洗流體、糞便、肺、乳腺、結(jié)腸、直腸、腸及其組合。
[0061]特別地，本發(fā)明提供了適合用于預(yù)后工具的用于確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括:獲得包含基因組核酸的生物樣品；使所述核酸或其片段與足以區(qū)分對(duì)象核酸的靶序列中甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸序列的試劑或多種試劑相接觸，其中所述靶序列包含所述基因的至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的序列或者在嚴(yán)格條件下與之雜交，所述連續(xù)核苷酸包含至少一個(gè)CpG 二核苷酸序列；以及至少部分地基于所述區(qū)分確定至少一個(gè)靶CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)或反映多個(gè)靶CpG 二核苷酸序列的平均甲基化狀態(tài)的平均值或值。
[0062]區(qū)分靶序列中甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸序列包括至少一個(gè)這樣的CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)依賴(lài)性轉(zhuǎn)變或未轉(zhuǎn)變?yōu)檫x自以下的序列中相應(yīng)的已轉(zhuǎn)變的或未轉(zhuǎn)變的二核苷酸序列:重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的基因的有義鏈和反義鏈以及對(duì)應(yīng)于靶序列的其連續(xù)區(qū)。
[0063]另一些實(shí)施方案提供了用于確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括:獲得具有對(duì)象基因組DNA的生物樣品；提取基因組DNA ;用一種或更多種試劑處理所述基因組DNA或其片段以將5位非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛟陔s交性質(zhì)方面可檢測(cè)地不同于胞嘧啶的另一堿基；使經(jīng)處理的基因組DNA或經(jīng)處理的其片段與擴(kuò)增酶及至少兩種引物相接觸，在每種情況下，所述 引物包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)核苷酸的連續(xù)序列，所述連續(xù)序列與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈及其互補(bǔ)序列的序列互補(bǔ)或在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下雜交，其中經(jīng)處理的DNA或其片段被擴(kuò)增以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，或者未被擴(kuò)增；基于所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或者類(lèi)別或性質(zhì)確定基因組序列的至少一個(gè)但更優(yōu)選多個(gè)CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)或反應(yīng)其平均甲基化水平的平均值或值。
[0064]本文所述的方法包括使用選自以下的至少一種方法:1)將至少一種包含至少9個(gè)、至少25個(gè)、或至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)連續(xù)序列的核酸分子與其互補(bǔ)序列雜交，所述連續(xù)序列與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈的序列互補(bǔ)或者在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈的序列雜交；ii)將至少一種包含至少9個(gè)、至少25個(gè)、或至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)連續(xù)序列的結(jié)合至固相的核酸分子與其互補(bǔ)序列雜交，所述連續(xù)序列與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈的序列互補(bǔ)或者在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈的序列雜交；iii)將至少一種包含至少9個(gè)、至少25個(gè)、或至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)連續(xù)序列的核酸分子與其互補(bǔ)序列雜交，所述核苷酸連續(xù)序列與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈的序列互補(bǔ)或者在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下與選自重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的有義鏈和反義鏈的序列雜交，并用至少一個(gè)核苷酸堿基延伸至少一種這樣的雜交的核酸分子；以及iv)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
[0065]另一些實(shí)施方案提供了用于癌癥分析(即，確定疾病進(jìn)展和/或患者預(yù)后)的方法，其包括:猶得具有對(duì)象基因組DNA的生物樣品；提取基因組DNA ;使所述基因組DNA或其片段與一種或更多種甲基化敏感性限制酶接觸，所述基因組DNA或其片段包含選自基因組序列的一個(gè)或更多個(gè)序列或者在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列，其中基因組DNA由此消化以產(chǎn)生消化片段，或者未由此消化；以及基于至少一種這樣的片段的存在、不存在或者類(lèi)別或性質(zhì)確定所述基因組序列的至少一個(gè)CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)或者反映多個(gè)其CpG二核苷酸序列的平均甲基化狀態(tài)的平均值或值。所述消化的或未消化的基因組DNA可以在所述確定之前擴(kuò)增。另一些實(shí)施方案提供了新的經(jīng)化學(xué)修飾基因組核酸序列(genomicandchemically modified nucleic acid seq uences)以及寡核苷酸和 / 或PNA-寡聚體以分析基因組序列中的胞嘧啶甲基化模式。
[0066]附圖簡(jiǎn)述
[0067]圖1至4示出通過(guò)癌分期分選的結(jié)直腸癌患者中手術(shù)后/前(X-軸)Septin9DNA之比(手術(shù)后甲基化S印t9DNA的pg數(shù)除以手術(shù)前甲基化S印t9DNA的pg數(shù))的柱狀圖。只針對(duì)在手術(shù)前示出S印tin9DNA水平> 0的患者繪制所述比例。圖上方的四個(gè)數(shù)字是使用患者的手術(shù)后相對(duì)于手術(shù)前的成對(duì)水平的單側(cè)t檢驗(yàn)的p值。在圖1和3中，I期:虛線和圓圈；11期:短劃線和三角形；ΙΠ期:短劃線/虛線和十字以及IV期:閉合線和菱形。
[0068]圖5和6示出手術(shù)前和手術(shù)后(X軸)結(jié)直腸癌患者中S印tin9DNA的水平(y軸:甲基化Sept9DNA pg數(shù)的loglO)。不同期的癌如下所示。圖5:1期(4名患者):虛線和圓圈；II期(9名患者):短劃線和三角形；111期(4名患者):短劃線/虛線和十字；IV期(2名患者):閉合線和菱形。
[0069]圖7和8示出通過(guò)癌分期分選的結(jié)直腸癌患者中手術(shù)后/前(X-軸)RASSF2A DNA之比(手術(shù)后甲基化S印t9DNA的pg數(shù)除以手術(shù)前甲基化RASSF2A DNA的pg數(shù))的柱狀圖。只針對(duì)在手術(shù)前示出RASSF2A DNA水平>0的患者繪制所述比。圖上方的四個(gè)數(shù)字是使用患者的手術(shù)后相對(duì)于手術(shù)前的成對(duì)水平的單側(cè)成對(duì)t檢驗(yàn)的p值。圖5:1期(4名患者):虛線和圓圈；II期(9名患者):短劃線和三角形；III期(4名患者):短劃線/虛線和十字；IV期(2名患者):閉合線和菱形。
`[0070]圖9至12示出手術(shù)前和手術(shù)后(如在X軸給出)結(jié)直腸癌患者中甲基化RASSF2ADNA的水平(y軸:甲基化RASSF2A DNA pg數(shù)的loglO)。不同期的癌如下所示。I期(4名患者):虛線和圓圈；II期(9名患者):短劃線和三角形；III期(4名患者):短劃線/虛線和十字；IV期(2名患者):閉合線和菱形。
[0071]圖13示出人基因組中的SEPT9基因在染色體17q25上的位置(EnsemblJul2005)。箭頭表示SEQ ID NO:2和3的位置。
[0072]圖14示出來(lái)自CRC患者的手術(shù)前血漿和手術(shù)后血漿的S印tin9甲基化的定量分析。
[0073]圖15示出來(lái)自CRC患者的手術(shù)前血漿和手術(shù)后血漿的RASSF2A甲基化的定量分析。
[0074]發(fā)明詳述
[0075]定義
[0076]術(shù)語(yǔ)“觀察/ 期望比”(Observed/Expected Ratio) ( “0/E 比”)是指特定 DNA 序列中CpG 二核苷酸的頻率，并且對(duì)應(yīng)于[CpG位點(diǎn)數(shù)/(C堿基數(shù)XG堿基數(shù))]/每個(gè)片段的帶長(zhǎng)度。
[0077]術(shù)語(yǔ)“CpG島”是指滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的基因組DNA的連續(xù)區(qū):(1)具有對(duì)應(yīng)于“觀察/期望比” > 0.6的CpG 二核苷酸頻率；和(2) “GC含量” > 0.5。CpG島的長(zhǎng)度通常(但不總是)為約0.2KB至約1KB，或至約2kb。
[0078]術(shù)語(yǔ)“甲基化狀態(tài)”或“甲基化狀況”是指在DNA序列中一個(gè)或多個(gè)CpG 二核苷酸處5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)的存在、不存在或類(lèi)別。DNA序列中一個(gè)或更多個(gè)特定CpG甲基化位點(diǎn)(每個(gè)具有兩個(gè)CpG 二核苷酸序列)處的甲基化狀態(tài)包括“非甲基化”、“完全甲基化”和“半-甲基化”。
[0079]術(shù)語(yǔ)“半-甲基化”或“半甲基化”是指雙鏈DNA中只有其一條鏈被甲基化的甲基化狀態(tài)。
[0080]本文使用的術(shù)語(yǔ)“AUC”是曲線下面積的縮寫(xiě)。特別地，其指受試者工作特征(R0C)曲線的曲線下面積。R0C曲線是針對(duì)診斷測(cè)試的不同可能截?cái)帱c(diǎn)作出的真陽(yáng)性率相對(duì)于假陽(yáng)性率的繪圖。其根據(jù)所選的截?cái)帱c(diǎn)示出靈敏度和特異性之間的平衡(靈敏度的任何提高都將伴隨著特異性的下降)。R0C曲線下面積(AUC)是測(cè)試準(zhǔn)確度的一個(gè)量度(該面積越大越好，最優(yōu)為1，隨機(jī)測(cè)試將具有在對(duì)角線處的面積為0.5的R0C曲線；參見(jiàn):J.P.Egan.Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York,1975)。
[0081 ] 術(shù)語(yǔ)“微陣列”廣義上表示“DNA微陣列”和“DNA芯片” 二者，如在本領(lǐng)域中公知的，其涵蓋所有本領(lǐng)域公知的固相支持物，并且涵蓋所有用于向其附接核酸分子或在其上合成核酸的方法。
[0082]“遺傳學(xué)參數(shù)(genetic parameter) ”是基因和另外為調(diào)節(jié)其所需之序列的突變和多態(tài)性。特別地插入、缺失、點(diǎn)突變、倒位和多態(tài)性并且特別優(yōu)選SNP (單核苷酸多態(tài)性)被命名為突變。
[0083]特別地表觀遺傳`學(xué)參數(shù)(epigenetic parameter) ”是胞嘧唳甲基化。其他表觀遺傳學(xué)參數(shù)包括例如組蛋白乙?；?，但是其無(wú)法通過(guò)使用與DNA甲基化相關(guān)的所述方法直接分析。
[0084]術(shù)語(yǔ)“重亞硫酸鹽試劑”是指如本文所公開(kāi)的可用于區(qū)分甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸序列的試劑，包括重亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或其組合。
[0085]術(shù)語(yǔ)“甲基化測(cè)定”是指任何用于確定DNA序列中一個(gè)或更多個(gè)CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)的測(cè)定。
[0086]術(shù)語(yǔ)“MS.AP-PCR” (甲基化-敏感性隨機(jī)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是指本領(lǐng)域公知的技術(shù)，其允許使用富含CG引物進(jìn)行基因組全局掃描以關(guān)注最可能包含CpG二核苷酸的區(qū)域，并且其由 Gonzalgo 等，Cancer Research57:594-599,1997 描述。
[0087]術(shù)語(yǔ)“MethyLight?” 是指本領(lǐng)域公知的由 Eads 等，Cancer Res.59:2302-2306,1999所述的基于熒光的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。
[0088]在本文實(shí)施的其實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“HeavyMethyl?”是指這樣的測(cè)定:其中覆蓋了擴(kuò)增引物之間或者擴(kuò)增引物所覆蓋的CpG位點(diǎn)的甲基化特異性阻斷探針(也稱(chēng)為阻斷劑)使得可以進(jìn)行核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴(kuò)增。
[0089]在本文實(shí)施的其實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“HeavyMethyl? MethyLight?”測(cè)定是指HeavyMethyl? MethyLight?測(cè)定，其為MethyLight?測(cè)定的一個(gè)變化形式，其中MethyLight?測(cè)定與包含擴(kuò)增引物之間的CpG位點(diǎn)的甲基化特異性阻斷探針相組合。
[0090]術(shù)語(yǔ)“Ms-SNuPE” (甲基化敏感性單核苷酸引物延伸)是指本領(lǐng)域公知的由Gonzalgo&Jones, Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997 所述的測(cè)定。
[0091]術(shù)語(yǔ)“MSP” (甲基化特異性PCR)是指本領(lǐng)域公知的由Herman等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826,1996以及由美國(guó)專(zhuān)利N0.5，786，146所述的甲基化測(cè)定。
[0092]術(shù)語(yǔ)“COBRA” (聯(lián)合重亞硫酸鹽限制分析)是指本領(lǐng)域公知的由Xiong&Laird，Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997 所述的甲基化測(cè)定。
[0093]術(shù)語(yǔ)“MCA”(甲基化 CpG 島擴(kuò)增)是指由 Toyota 等，Cancer Res.59:2307-12,1999和TO00/26401A1所述的甲基化測(cè)定。 [0094]術(shù)語(yǔ)“雜交”應(yīng)理解為寡核苷酸與互補(bǔ)序列沿著DNA樣品中的沃森-克里克堿基配對(duì)的線相結(jié)合，形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。
[0095]如本文所定義的“嚴(yán)格的雜交條件”涉及在68 °C于5 X SSC/5 X Denhardt溶液/1.0% SDS中雜交，并在室溫于0.2XSSC/0.1% SDS中洗滌，或者涉及本領(lǐng)域公知的其等同變化形式(例如以下條件:在60°C于2.5XSSC緩沖液中進(jìn)行雜交，接著在37°C于低緩沖濃度下進(jìn)行若干洗滌步驟，并維持穩(wěn)定)。如本文所定義的中等嚴(yán)格條件涉及包括在42°C于3XSSC中洗滌或者本領(lǐng)域公知的其等同變化形式。可以改變參數(shù)鹽濃度和溫度以獲得探針與靶核酸之間識(shí)別的最佳水平?？紤]到這樣的條件的準(zhǔn)則在本領(lǐng)域中可得，例如通過(guò) Sambrook 等，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress, N.Y ;和 Ausubel 等.(編著)，1995, Current Protocols in Molecular Biology,(John ffiley&Sons, N.Y.)的第 2.10 單兀。
[0096]術(shù)語(yǔ)“甲基化特異性限制酶”或“甲基化敏感性限制酶”應(yīng)理解為依賴(lài)于核酸識(shí)別位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)來(lái)選擇性地消化核酸的酶。對(duì)于識(shí)別位點(diǎn)是非甲基化或半甲基化時(shí)發(fā)生特異性地切割的此類(lèi)限制酶，如果識(shí)別位點(diǎn)是甲基化的則切割將不會(huì)發(fā)生或者效率顯著降低。對(duì)于識(shí)別位點(diǎn)是甲基化時(shí)發(fā)生特異性地切割的此類(lèi)限制酶，如果識(shí)別位點(diǎn)是非甲基化的，則切割將不會(huì)發(fā)生或者效率顯著降低。優(yōu)選甲基化特異性限制酶，其識(shí)別序列包含CG二核苷酸(例如Cgcg或cccggg)。就一些實(shí)施方案而言還優(yōu)選如下限制酶,即如果該二核苷酸中的胞嘧啶在碳原子C5處是甲基化的則不切割。
[0097]“非甲基化特異性限制酶”或“非甲基化敏感性限制酶”是以幾乎相同的效率與甲基化狀態(tài)無(wú)關(guān)地切割核酸序列的限制酶。它們也稱(chēng)為“甲基化非特異性限制酶”。
[0098]在提及復(fù)合陣列序列時(shí)，短語(yǔ)“連續(xù)核苷酸”是指復(fù)合陣列的任何單個(gè)連續(xù)序列的連續(xù)序列區(qū)域，但不包括如上文所定義的包括“結(jié)(node) ”的復(fù)合陣列序列區(qū)域。
[0099]作為癌癥預(yù)后指標(biāo)在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的生物標(biāo)志物的描述應(yīng)理解為包括其所有轉(zhuǎn)錄變體及其所有啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件。此外，因?yàn)橐阎鄠€(gè)SNP在生物標(biāo)志物或基因中，所以該術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為包括所有其序列變體。
[0100]概要:
[0101]本發(fā)明提供了用于確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括在分離自所述對(duì)象的生物樣品中確定至少一種在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的生物標(biāo)志物的甲基化和/或表達(dá)水平，其中甲基化和/或表達(dá)狀態(tài)指示所述患癌癥對(duì)象之預(yù)后。
[0102]用于確定預(yù)后的方法因此用于治療癌癥患者之方法和試劑包括基于多種標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定腫瘤的分期。通常來(lái)說(shuō)，該確定包括侵入性方法以觀察組織形態(tài)學(xué)中的組織學(xué)變化和腫瘤侵襲進(jìn)入相鄰組織和轉(zhuǎn)移的水平。多種癌癥分期或分類(lèi)方法用于使用標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)癌癥的進(jìn)展或狀態(tài)。
[0103]在結(jié)直腸癌中，這些分期方法中的兩種是由美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC癌分期手冊(cè)，第6版，Springer-Verlag, New York, 2002,其通過(guò)引用并入本文)開(kāi)發(fā)的腫瘤-結(jié)-轉(zhuǎn)移(TNM)分期(I至IV期)和經(jīng)修改的Duke' s或Astler-Coller分期系統(tǒng)(A至D期)(Astler V B, Coller F A.，Ann Surgl954 ；139:846-52)。兩種方法都涉及測(cè)量原發(fā)性腫瘤擴(kuò)散通過(guò)結(jié)腸或直腸層至相鄰器官、淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)處的部位以評(píng)價(jià)腫瘤進(jìn)展。結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和治療決定的評(píng)價(jià)目前主要基于腫瘤分期。
[0104]本發(fā)明提供了用于以下的方法和試劑盒:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否表示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者表示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象；或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)；其包括在分離自所述對(duì)象的生物樣品中確定至少一種在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的生物標(biāo)志物的甲基化和/或表達(dá)水平，其中甲基化和/或表達(dá)狀態(tài)指示所述患癌癥對(duì)象的預(yù)后。該方法包括從生物樣品中提取或以其他方式分離基因組DNA或其片段；用一種或更多種試劑處理所提取或分離的基因組DNA或其片段，以將其5’位非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛟陔s交性質(zhì)方面可檢測(cè)地不同于胞嘧啶的另一堿基；使經(jīng)處理的基因組DNA或經(jīng)處理的片段與擴(kuò)增酶及至少一種包含至少9個(gè)、至少18個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)核苷酸的連續(xù)序列的引物相接觸,該連續(xù)序列與經(jīng)處理的序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)或者在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下與經(jīng)處理的序列或其互補(bǔ)序列雜交，其中經(jīng)處理的基因組DNA或其片段擴(kuò)增以產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物，或者不擴(kuò)增；以及基于所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或量或性質(zhì)來(lái)確定基因的至少一個(gè)CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)或水平，或者反映基因的多個(gè)CpG 二核苷酸的平均甲基化狀態(tài)或水平的平均值或值 。
[0105]在本文中進(jìn)一步描述了處理所提取的DNA、擴(kuò)增所述DNA和檢測(cè)所述DNA以及分析所述DNA的方法。
[0106]本發(fā)明提供了在分離自癌癥對(duì)象的生物樣品中檢測(cè)在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的生物標(biāo)志物或基因，以及癌癥對(duì)象的預(yù)后、臨床結(jié)局的確定或醫(yī)學(xué)治療的確定。
[0107]優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括以下步驟:a)在獲自患癌癥對(duì)象的第一生物樣品中測(cè)量基因之甲基化基因組DNA或其片段的水平；b)在獲自所述對(duì)象的另一生物樣品中測(cè)量基因之甲基化基因組DNA或其片段的水平；以及c)將在所述另一樣品和所述第一樣品中所測(cè)量的甲基化DNA的水平進(jìn)行比較。
[0108]在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)和分析在治療前(pre-treatment)樣品中進(jìn)行，并再在治療后(post-treatment)的樣品中進(jìn)行，其中所述治療是使用將減少、除去、縮小、最小化或切除腫瘤的方法或施用對(duì)患者(或患者組織)進(jìn)行的任何治療。這樣的方法包括但不限于手術(shù)切除、免疫治療、放射治療、化學(xué)治療、實(shí)體腫瘤靶向治療、激光治療、軟組織靶向治療以及血液癌癥治療。在該實(shí)施方案中，“治療前樣品”對(duì)應(yīng)于“第一樣品”，“治療后樣品”對(duì)應(yīng)于“另一個(gè)樣品”。
[0109]治療前樣品可以在治療開(kāi)始前的任何時(shí)間獲取。但是，優(yōu)選地在治療開(kāi)始前的不超過(guò)1周、不超過(guò)2周、不超過(guò)4周或不超過(guò)8周獲取。治療后樣品優(yōu)選地在治療開(kāi)始后的任何時(shí)間獲取。如果治療是化學(xué)治療，則明確地設(shè)想治療后樣品在患者的療程完成之前獲取，前提是患者接受過(guò)至少一劑量的至少一種用于化學(xué)治療的藥物化合物。
[0110]結(jié)腸癌的建議治療取決于腫瘤的分期。1、II和III期的特征在于不存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤的手術(shù)切除是治療選擇。至于II B、II C、III以及高風(fēng)險(xiǎn)的IIA期，可以推薦輔助化學(xué)治療。對(duì)于IV期，如果遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的數(shù)目和位置表明存在通過(guò)移除所有腫瘤而完全治愈的機(jī)會(huì)，則只推薦腫瘤手術(shù)切除。在IV期疾病中，手術(shù)切除通過(guò)輔助(adjuvant)和/或新輔助(neoadjuvant)化學(xué)治療來(lái)完成。
[0111]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤是1、II或III期結(jié)腸癌。在這種情況下，示出腫瘤完全移除(優(yōu)選為低于檢出限的水平)的治療后樣品中甲基化基因組DNA的水平表示通過(guò)手術(shù)切除來(lái)治療癌癥是成功的。這等同于患者的良好預(yù)后，并且優(yōu)選地不推薦作為額外治療的輔助化學(xué)治療。
[0112]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療是1、II或III期腫瘤或可手術(shù)的IV期腫瘤的輔助或新輔助化學(xué)治療或者不可手術(shù)的IV期腫瘤的化學(xué)治療，而沒(méi)有作為全身治療的額外治療。在這種情況下，與治療前樣品相比，治療后樣品中甲基化基因組DNA的水平降低優(yōu)選地表示所選化學(xué)治療方案在降低患者的腫瘤負(fù)擔(dān)中是成功的。這等同于表示該化學(xué)治療方案不需要調(diào)整。但是，如果治療后樣品中甲基化基因組序列的水平仍然保持不變或甚至提高，則這優(yōu)選地表示目前的治療不成功，并且該治療方案需要調(diào)整。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選在化學(xué)治療期 間于不同時(shí)間點(diǎn)獲取多于一種治療后樣品，以連續(xù)地確定該化學(xué)治療方案是否仍然成功。
[0113]本發(fā)明提供了用于癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括在原發(fā)性腫瘤已移除時(shí)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，例如通過(guò)上述方法。因此，本發(fā)明用于確定用以移除原發(fā)性腫瘤的方法是否成功和完成。此外，本發(fā)明提供了用于確定腫瘤是否已擴(kuò)散的方法。在歷史上，用于確定腫瘤是否已擴(kuò)散的方法依賴(lài)于確定淋巴結(jié)受累和轉(zhuǎn)移的病理學(xué)和組織學(xué)方法。例如上述癌分期方法。在本發(fā)明中，可以通過(guò)下述方式來(lái)確定這樣的參數(shù)如腫瘤負(fù)荷、癌癥負(fù)擔(dān)、腫瘤擴(kuò)散和/或轉(zhuǎn)移:獲取第一樣品，在所述第一樣品中針對(duì)在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的基因或生物標(biāo)志物的存在評(píng)價(jià)基因組DNA，和獲取第二樣品，在所述第二樣品中針對(duì)在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的基因或生物標(biāo)志物的存在評(píng)價(jià)基因組DNA,以及確定對(duì)象中是否仍然存在腫瘤或癌細(xì)胞，因此進(jìn)一步顯示對(duì)于臨床治療的需要。
[0114]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在除去原發(fā)性腫瘤之后可檢測(cè)水平的生物標(biāo)志物的存在表示腫瘤未被完全移除。更優(yōu)選地，該情況表示腫瘤已局部擴(kuò)散入周?chē)M織或淋巴結(jié)中或者全身性地?cái)U(kuò)散入除結(jié)腸、直腸或闌尾以外的器官中。
[0115]在某些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)方法定量地、部分定量地、定性地、部分定性地或部分定量地且部分定性地進(jìn)行。
[0116]在某些實(shí)施方案中，在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的基因或生物標(biāo)志物是Septin9。在某些實(shí)施方案中，在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的基因或生物標(biāo)志物是RASSF2A。
[0117]人Septin9基因(也稱(chēng)為MLL septin樣融合蛋白、MLL septin樣融合蛋白MSF-A、Slpa、Eseptin、Msf、septin 樣蛋白卵巢 / 乳腺 septin (Ov/Br septin)以及 Septin D1)位于染色體17q25上于重疊群(contig)AC068594.15.1.168501中，并且是Septin基因家族的成員。圖13提供了 Septin9基因的Ensembl注釋?zhuān)⑶沂境?種轉(zhuǎn)錄變體、Septin9變體及Q9HC74變體(其為S印tin9轉(zhuǎn)錄物的截短變體)。SEQ ID NO:1提供了所述基因的序列，其包含S印tin9和Q9HC74轉(zhuǎn)錄物二者的區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是其子區(qū)域，其分別提供Septin9和Q9HC74轉(zhuǎn)錄物的富含CpG的啟動(dòng)子區(qū)的序列。SEQID NO:4和5分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的S印tin9DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1 ( 即，其中CpG 二核苷酸是甲基化的)的序列，如表1所示。SEQ IDNO:10和11分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的S印tin9DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1( 即，其中CpG 二核苷酸非甲基化)的序列，如表1所示。SEQ ID NO:6和7分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的S印tin9DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:2( 即，其中CpG 二核苷酸是甲基化的)，如表1所示。SEQ ID NO:12和13分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的S印tin9DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO:2( 即，其中CpG 二核苷酸是非甲基化的)，如表1所示。SEQ ID NO:8和9分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的Q9HC74DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:3(即，其中CpG 二核苷酸是甲基化的)的序列，如表1所示。SEQ ID NO:14和15分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的S印tin9DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:3( 即，其中CpG 二核苷酸是非甲基化的)的序列，如表1所示。S印tin9以及這些變體也描述于以下中:公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No:US-2009-0075260，授權(quán)為美國(guó)專(zhuān)利No =7,951,563 ;公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No:2006-0286576，授權(quán)為美國(guó)專(zhuān)利No:7, 749，702 ;以及公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No:US-2011-0039719，其因涉及SEPTIN9基因描述和基因信息并入本文。與S印tin9基因相關(guān)的其它序列描述于本文的實(shí)施例和描述中。
[0118]在某些實(shí)施方案中，在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的基因或生物標(biāo)志物是RASSF2A(SEQ ID NO:16) ORASSF2基因位于染色體位20pl3，并且編碼多種mRNA轉(zhuǎn)錄物同工型。Ras蛋白家族的 成員與癌癥相關(guān)，RASSF2與K-Ras相結(jié)合，RASSF2的表達(dá)與受控細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。表達(dá)喪失導(dǎo)致不受抑制的細(xì)胞增殖，因此RASSF2是腫瘤抑制因子(Vos等.J.Biol.Chem.，第 278 期，第 30 卷，28045-28051，2003 年 6 月 25 日)。RASSF2 基因在基因啟動(dòng)子中包含CpG密集區(qū)，跨越第一個(gè)2-非編碼外顯子。該區(qū)已被表征為共甲基化，此外，其甲基化與胃和結(jié)腸癌的發(fā)展相關(guān)。Hesson等(Oncogene.2005年6月.2 ；24(24):3987-94.)通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞系的C0BRA分析和重亞硫酸鹽測(cè)序?qū)pG島表征為是共甲基化的。此外，他們通過(guò)MSP分析證實(shí)，21/30 (70% )的所分析結(jié)腸癌細(xì)胞系在RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)是甲基化的。其它研究表明，RASSF2甲基化可能與胃癌(Endoh等Br J.Cancer.2005年12 月 12 Η ;93 (12):1395-9)及鼻咽癌(Zhang 等 Iht J.Cancer.2007 年 1 月 1 日;120 (1):32-8)相關(guān)。SEQ ID NO: 16提供RASSF2A的序列。SEQ ID NO:17和18分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的RASSF2A DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:16(即，其中CpG 二核苷酸是甲基化的)，如表1所示。SEQ ID NO:19和20分別是經(jīng)化學(xué)(重亞硫酸鹽)處理的RASSF2A DNA有義鏈和反義鏈的序列，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 16 (即，其中CpG 二核苷酸是非甲基化的)的序列，如表1所示。其基因組全基因序列示于SEQ ID NO:16中，其描述于公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No:US-2010-0092953中，其因涉及RASSF2A基因描述和序列信息而并入本文。[0119]使用本發(fā)明的方法，I期或II期對(duì)象的治療后樣品中定量地、部分定量地、定性地、部分定性地或部分定量地且部分定性地確定的基因或生物標(biāo)志物的存在指示不良預(yù)后或需要更有侵襲性的癌癥治療。
[0120]使用本發(fā)明的方法，III期對(duì)象的治療后樣品中相等或較高水平的基因或生物標(biāo)志物指示需要使用本發(fā)明所述的方法持續(xù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)以觀察是否有基因或生物標(biāo)志物的水平提聞的趨勢(shì)。
[0121 ] 本發(fā)明的方法不僅提供對(duì)治療后樣品中基因或生物標(biāo)志物的水平變化的檢測(cè)，還提供對(duì)對(duì)象的治療應(yīng)答或非治療功效(efficacy of non-treatment)的持續(xù)監(jiān)測(cè)或監(jiān)視，并且可用于確定癌癥或腫瘤是否去除或復(fù)發(fā)。
[0122]DNA的重亞硫酸鹽修飾是本領(lǐng)域公知的用于評(píng)定CpG甲基化狀態(tài)的工具。最常用于分析DNA的5-甲基胞嘧啶之存在的方法基于重亞硫酸鹽與胞嘧啶的反應(yīng)，由此在堿水解之后，胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?其對(duì)應(yīng)于堿基配對(duì)行為中的胸腺嘧啶)。但是，顯著地，5-甲基胞嘧啶在這些條件下仍然未被修飾。因此，原始DNA以這樣的方式轉(zhuǎn)變:最初無(wú)法通過(guò)其雜交行為與胞嘧啶區(qū)分開(kāi)的甲基胞嘧啶現(xiàn)在可以使用標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域公知的分子生物學(xué)技術(shù)(例如，通過(guò)擴(kuò)增和雜交，或者通過(guò)測(cè)序)作為僅存的胞嘧啶而被檢測(cè)。所有這些技術(shù)均基于不同的堿基配對(duì)性質(zhì)，其現(xiàn)在可以被完全開(kāi)發(fā)。
[0123]Rein，T.等，Nucleic Acids Res.,26:2255，1998 提供了用于檢測(cè) 5-甲基胞嘧啶之本領(lǐng)域公知方法的綜述。
[0124]重亞硫酸鹽技術(shù)，除了少許例外之外(例如，Zeschnigk M, et al., Eur J HumGenet.5:94-98,1997)，目前只用在研究中。一般來(lái)說(shuō)，在重亞硫酸鹽處理之后擴(kuò)增已知基因的短的特異性片段，完全測(cè)序(Olek&ffalter, Nat Genet.199717:275-6,1997),經(jīng)歷一個(gè)或更多個(gè)引物延伸反應(yīng)(Gonzalgo&Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31,1997 ；W095/00669 ;美`國(guó)專(zhuān)利N0.6，251，594)以分析各個(gè)胞嘧啶位，或者通過(guò)酶促消化處理(Xiong&Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4,1997)。在本領(lǐng)域中還描述了通過(guò)雜交檢測(cè)(Olek等，W099/28498)。此外，使用重亞硫酸鹽技術(shù)來(lái)對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)已有描述(Grigg&Clark, Bioessays, 16:431-6,1994 ；Zeschnigk Μ 等，Hum Mol Genet.，6:387-95,1997 ；Feil R 等，Nucleic Acids Res.，22:695-, 1994 ；Martin V 等，Gene, 157:261-4，1995 ；W09746705 以及 W09515373)。
[0125]本發(fā)明提供了重亞硫酸鹽技術(shù)與一種或更多種甲基化測(cè)定組合在確定基因組序列中的CpG 二核苷酸序列之甲基化狀態(tài)中的用途?；蚪MCpG 二核苷酸可以是甲基化或非甲基化的(或者分別稱(chēng)為上-甲基化(up-methylated)或下-甲基化(down-methylated))。但是，本發(fā)明的方法適于分析生物樣品的異質(zhì)性質(zhì)，例如血液或精液背景中低濃度的腫瘤細(xì)胞。因此，當(dāng)分析這樣的樣品中的CpG位點(diǎn)處的甲基化狀態(tài)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用定量測(cè)量來(lái)確定與甲基化狀態(tài)相對(duì)的特定CpG位點(diǎn)處的甲基化水平(例如，百分比、百分?jǐn)?shù)、比率、比例或程度)。因此，術(shù)語(yǔ)甲基化狀態(tài)或甲基化狀況還應(yīng)理解為意指反映CpG位點(diǎn)處的甲基化程度的值。除非另有指明，否則術(shù)語(yǔ)“高甲基化”或“上甲基化”應(yīng)理解為甲基化水平高于特定截?cái)帱c(diǎn)，其中所述截?cái)嗫梢允潜硎窘o定群體的平均或中值甲基化水平的值，或者優(yōu)選為最佳截?cái)嗨健！敖財(cái)唷痹诒疚闹羞€指“閾值”。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“甲基化”、“高甲基化”或“上甲基化”應(yīng)理解為對(duì)于在癌癥中是甲基化的但在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列中或者與之相關(guān)(例如，在啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)區(qū))的所有CpG位點(diǎn)而言，包括高于零(0)%截?cái)嗟募谆?或其等同形式)。
[0126]根據(jù)本發(fā)明，基因組序列中CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)的確定在確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后中有用。
[0127]甲基化測(cè)定方法。多種甲基化測(cè)定方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。這些測(cè)定允許DNA序列中一個(gè)或多個(gè)CpG 二核苷酸(例如，CpG島)的甲基化狀態(tài)的確定。這樣的測(cè)定涉及經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA的DNA測(cè)序、PCR(用于序列特異性擴(kuò)增)、Southern印跡分析以及使用甲基化敏感性限制酶等等。
[0128]例如，已通過(guò)使用重亞硫酸鹽處理(Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1827-1831,1992)針對(duì)DNA甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布的分析簡(jiǎn)化了基因組測(cè)序。此外，使用從重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的限制酶消化，例如，Sadri&Hornsby (Nucl.Acids Res.24:5058-5059,1996)或 COBRA (聯(lián)合重亞硫酸鹽限制分析，Combined Bisulfite Restriction Analysis)(Xiong&Laird, Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997)所述的方法。
[0129]COBRA.COBRA?分析是可用于確定少量基因組DNA中特定基因座處的DNA甲基化水平的甲基化定量測(cè)定(Xiong&Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997) ? 簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，使用限制酶消化來(lái)披露經(jīng)亞硫酸氫鈉處理之DNA的PCR產(chǎn)物中的甲基化依賴(lài)性序列差異。首先根據(jù) Fro mmer 等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1827-1831,1992)所述的方法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重亞硫酸鹽處理將甲基化依賴(lài)性序列差異引入基因組DNA中。然后使用對(duì)目的CpG島具有特異性的引物進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的DNA的PCR擴(kuò)增，接著進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化、凝膠電泳以及使用特異性帶標(biāo)記的雜交探針進(jìn)行檢測(cè)。初始DNA樣品的甲基化水平由在廣泛的DNA甲基化水平中以線性定量形式消化和未消化的PCR產(chǎn)物的相對(duì)量來(lái)表示。此外，該技術(shù)可以可靠地應(yīng)用于獲自顯微切片的石蠟包埋組織樣品的DNA。
[0130]用于C0BRA?分析的典型試劑(例如，可能見(jiàn)于典型的基于C0BRA?的試劑盒中)可以包括但不限于:特定基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的PCR引物；限制酶和合適的緩沖液；基因雜交寡核苷酸；控制雜交寡核苷酸；寡核苷酸探針的激酶標(biāo)記試劑盒；以及帶標(biāo)記的核苷酸。此外，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變劑可以包括:DNA變性緩沖液；磺化緩沖液；DNA回收劑或試劑盒(例如，沉淀、超濾、親和柱)；去磺化緩沖液以及DNA回收組分。
[0131]優(yōu)選地，測(cè)定例如“MethyLight?” (基于熒光的實(shí)時(shí)PCR技術(shù))(Eads等，Cancer Res.59:2302-2306，1999)、Ms-SNuPE? (甲基化敏感性單寡核苷酸引物延伸)反應(yīng)(Gonzalgo&Jones, Nucleic Acids Res.25:2529_2531，1997)、甲基化特異性 PCR( “MSP”;Herman 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826,1996 ;美國(guó)專(zhuān)利 N0.5,786，146)以及甲基化CpG島擴(kuò)增(“MCA”;Toyota等，Cancer Res.59 =2307-12,1999)單獨(dú)使用或者與這些其它方法聯(lián)合使用。
[0132]“HeavyMethyl?”測(cè)定技術(shù)是基于經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA的甲基化特異性擴(kuò)增評(píng)估甲基化差異的定量方法。覆蓋擴(kuò)增引物之間的或者由擴(kuò)增引物所覆蓋的CpG位點(diǎn)的甲基化特異性阻斷探針(在本文中也稱(chēng)為阻斷劑(blocker))使得實(shí)現(xiàn)核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴(kuò)增。
[0133]在本文實(shí)施的其實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“HeavyMethyl? MethyLight?”測(cè)定是指HeavyMethyl? MethyLight? 測(cè)定，其為 MethyLight? 測(cè)定的變化形式，其中 MethyLight?測(cè)定與覆蓋擴(kuò)增引物之間的CpG位置的甲基化特異性阻斷探針聯(lián)合。HeavyMethyl?測(cè)定也可以與甲基化特異性擴(kuò)增引物聯(lián)合使用。
[0134]用于HeavyMethyl?分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于MethyLight?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于特異性基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的PCR引物、阻斷寡核苷酸、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸、以及Taq聚合酶。
[0135]MSP.MSP(甲基化特異性 PCR(methylation_specific PCR))允許評(píng)價(jià) CpG 島內(nèi)幾乎任一組CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),而不依賴(lài)于使用甲基化敏感性限制酶(Herman等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826,1996 ;美國(guó)專(zhuān)利 N0.5，786，146)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)重亞硫酸鈉將所有非甲基化胞嘧啶(而非甲基化胞嘧啶)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?lái)修飾DNA，并隨后使用針對(duì)甲基化DNA特異性的引物以及針對(duì)非甲基化DNA特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增。MSP僅需要少量的DNA，MSP對(duì)給定CpG島基因座的0.1 %甲基化等位基因敏感，并且可針對(duì)提取自石蠟包埋樣品的DNA進(jìn)行。用于MSP分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于MSP的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:針對(duì)特異性基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的甲基化和非甲基化PCR引物、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸、以及特異性探針。
[0136]MethyLight?.MethyLight?測(cè)定是高通量的定量甲基化測(cè)定，其利用在PCR步驟之后不需要進(jìn)一步操作的基于熒光的實(shí)時(shí)PCR(TaqMan?)技術(shù)(Eads等.，Cancer Res.59:2302-2306，1999)。簡(jiǎn)言之，MethyLight?過(guò)程開(kāi)始于基因組DNA的混合樣品，其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(重亞硫酸鹽過(guò)程將非甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?在重亞硫酸鈉反應(yīng)中轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆蕾?lài)性序列差異的混合合并物。然后在“偏倚”(其中PCR引物與已知的CpG 二核苷酸重疊)反應(yīng)中進(jìn)行基于熒光的PCR。序列區(qū)分可發(fā)生在擴(kuò)增過(guò)程的水平和熒光檢測(cè)過(guò)程的水平兩種水平上。
[0137]MethyLight?測(cè)`定可用作基因組DNA樣品中甲基化模式的定量測(cè)試，其中序列區(qū)分發(fā)生在探針雜交的水平上。在這種定量版本中，PCR反應(yīng)提供了在與特定的推定甲基化位點(diǎn)重疊的熒光探針存在下的甲基化特異性擴(kuò)增。通過(guò)其中引物和探針二者都不與任何CpG二核苷酸重疊的反應(yīng)來(lái)提供輸入DNA量的無(wú)偏倚對(duì)照?；蛘?，通過(guò)用不“覆蓋”已知甲基化位點(diǎn)的對(duì)照寡核苷酸(HeavyMethyl?和MSP技術(shù)的基于熒光的版本)或覆蓋潛在甲基化位點(diǎn)的寡核苷酸探測(cè)偏倚PCR合并物來(lái)實(shí)現(xiàn)基因組甲基化的定量測(cè)試。
[0138]MethyLight?過(guò)程可與任意合適的探針(例如，“TaqiVIiin⑨” Jjghtcycler?等)一起使用。例如，用重亞硫酸鈉處理雙鏈基因組dna并使用TaqMan⑩探針(例如，具有MSP引物和/或HeavyMethyl阻斷物寡核苷酸和TaqMail?探針)使其經(jīng)歷兩組PCR反應(yīng)中的一組。用熒光“報(bào)道物”和“淬滅劑”分子雙標(biāo)記TaqMan?探針,并且被設(shè)計(jì)成對(duì)相對(duì)高GC含量的區(qū)域具有特異性，使得其在PCR循環(huán)中在比正向引物或反向引物高約10°c的溫度下解鏈。這允許TaqMan?探針在pcr退火/延伸步驟期間保持完全雜交。因?yàn)門(mén)aq聚合酶在PCR期間酶促合成了新鏈，所以其最終將實(shí)現(xiàn)退火的TaqMan?探針。然后Taq聚合酶5’至3，內(nèi)切核酸酶活性將通過(guò)消化TaqMan?探針來(lái)移除TaqMan?探針,從而釋放熒光報(bào)道物分子以使用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)定量檢測(cè)其現(xiàn)在未淬滅的信號(hào)。
[0139]用于MethyLight?分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于MethyLight?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于特異性基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的pcr引物、TaqMan⑩或UgMcyclerK探針、優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸、以及Taq聚合酶。
[0140]QM?(定量甲基化)測(cè)定是用于基因組DNA樣品中甲基化模式的一種替代性定量測(cè)試，其中序列區(qū)分發(fā)生在探針雜交的水平上。在這種定量版本中，PCR反應(yīng)提供了在與特定的推定甲基化位點(diǎn)重疊的熒光探針存在下的無(wú)偏倚擴(kuò)增。通過(guò)其中引物和探針二者都不與任何CpG 二核苷酸重疊的反應(yīng)來(lái)提供輸入DNA量的無(wú)偏倚對(duì)照?；蛘?，通過(guò)用不“覆蓋”已知甲基化位點(diǎn)的對(duì)照寡核苷酸(HeavyMethyl?和MSP技術(shù)的基于熒光的版本)或覆蓋潛在甲基化位點(diǎn)的寡核苷酸探測(cè)偏倚PCR合并物來(lái)實(shí)現(xiàn)基因組甲基化的定量測(cè)試。
[οι41 ] qm?方法可與任意合適的探針(例如，“TaqlMam信P、Ligltcycler?等)一起用于擴(kuò)增過(guò)程中。例如，用重亞硫酸鈉處理雙鏈基因組DNA并使其經(jīng)歷無(wú)偏倚引物和TaqMan?探針。用熒光“報(bào)道物”和“淬滅劑”分子雙標(biāo)記Taq.\_Ian_允探針，并且被設(shè)計(jì)成對(duì)相對(duì)高gc含量的區(qū)域具有特異性，使得其在pcr循環(huán)中在比正向引物或反向引物高約io°C的溫度下解鏈。這允許TaqMan?探針在pcr退火/延伸步驟期間保持完全雜交。因?yàn)門(mén)aq聚合酶在pcr期間酶促合成了新鏈，所以其最終將實(shí)現(xiàn)退火的TaqMan?探針。然后Taq聚合酶5’至3，內(nèi)切核酸酶活性將通過(guò)消化TaqMan?探針來(lái)除去TaqMan?探
針，從而釋放熒光報(bào)道基因分子以使用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)定量檢測(cè)其現(xiàn)在未淬滅的信號(hào)。
[0142]用于QM?分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于QM?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于特異性基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的PCR引物、TiK丨MmrX:或Ughtcycler?探 針、優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸、以及Taq聚合酶。
[0143]Ms-SNuPE.Ms-SNuPE?技術(shù)是用于評(píng)估特異性CpG位點(diǎn)上的甲基化差異的定量方法，其基于重亞硫酸鹽處理DNA，然后進(jìn)行單核苷酸引物延伸(Gonzalgo&Jones，NucleicAcids Res.25:2529_2531，1997)。簡(jiǎn)言之，使基因組DNA與重亞硫酸鈉反應(yīng)以將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而不改?-甲基胞嘧啶。然后使用特異于經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的DNA的PCR引物進(jìn)行期望靶序列的擴(kuò)增，分離所得產(chǎn)物并用作在目的CpG位點(diǎn)上進(jìn)行甲基化分析的模板?？煞治錾倭康腄NA (例如，顯微切片的病理學(xué)切片)，并且其避免了使用限制酶來(lái)確定CpG位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)。
[0144]用于Ms-SNuPE?分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于Ms-SNuPE?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于特異性基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的PCR引物、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸、凝膠提取試劑盒、陽(yáng)性對(duì)照引物、用于特異性基因的Ms-SNuPE?引物、反應(yīng)緩沖液(用于Ms-SNuPE反應(yīng)的反應(yīng)緩沖液)以及帶標(biāo)記核苷酸。另外，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變?cè)噭┛砂?DNA變性緩沖液、磺化緩沖液、DNA回收試劑或試劑盒(例如，沉淀、超濾、親和柱)、去磺化緩沖液和DNA回收組分。
[0145]用于檢測(cè)在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的生物標(biāo)志物作為血液中癌癥/腫瘤的預(yù)后指示的新用途。
[0146]在一個(gè)方面中，本發(fā)明的方法包括以下步驟:i)確定在癌癥組織中甲基化而在非癌癥組織中非甲基化的至少一種基因或基因組序列的甲基化和/或表達(dá)；以及ii)確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，在身體組織或血液中進(jìn)行所述步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因是SEPTIN9(SEQ ID NO:1至15，以及如本文所述的其他序列)，其基因組序列在非癌組織中是非甲基化而在癌組織中是甲基化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因是RASSF2A(SEQ ID NO: 16至20，以及如本文所述的其他序列)，其基因組序列在非癌組織中是非甲基化而在癌組織中是甲基化的。
[0147]本發(fā)明的方法可通過(guò)由其轉(zhuǎn)錄之RNA的表達(dá)或由所述RNA翻譯的多肽或蛋白質(zhì)的任意分析，優(yōu)選地通過(guò)mRNA表達(dá)分析或多肽表達(dá)分析來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是，在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后可通過(guò)分析至少一種基因或基因組序列和/或所述基因組序列的啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件的甲基化狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述基因組序列在非癌組織中是非甲基化而在癌組織中是甲基化的。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了預(yù)后測(cè)定和方法，其既定量也定性地檢測(cè)對(duì)象中一種或更多種所述基因的表達(dá)并且由其確定所述對(duì)象中患癌癥對(duì)象的預(yù)后。在另一些實(shí)施方案中，一種或更多種所述基因的超甲基化和/或低表達(dá)與癌癥的進(jìn)展和侵襲性有關(guān)。
[0148]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在高于3pg/ml的手術(shù)之前樣品中甲基化S印tin9DNA指示癌癥的存在。優(yōu)選地，手術(shù)之后的陰性S印tin9甲基化信號(hào)指示良好的預(yù)后(Opg/ml甲基化Septin9)。優(yōu)選地,手術(shù)之后甲基化Septin9的存在高于0至3pg/ml樣品指示癌癥復(fù)發(fā)的低風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選地，手術(shù)之后3至30pg/ml血漿的甲基化S印tin9水平指不癌癥復(fù)發(fā)的中等風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選地，手術(shù)之后聞?dòng)?0pg/ml樣品的甲基化Septin9的存在指不聞風(fēng)險(xiǎn)或復(fù)發(fā)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在聞?dòng)?pg/ml的手術(shù)之如樣品中甲基化RASSF2A DNA指示癌癥的存在，優(yōu)選地，手術(shù)之后的陰性RASSF2A甲基化信號(hào)指示良好的預(yù)后(Opg/ml甲基化RASSF2A)。優(yōu)選地，手術(shù)之后甲基化RASSF2A的存在高于0至3pg/ml樣品指示癌癥復(fù)發(fā)的低風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選地，手術(shù)之后3至30pg/ml血漿的甲基化RASSF2A水平指示癌癥復(fù)發(fā)的中等風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選 地，手術(shù)之后甲基化RASSF2A的存在高于30pg/ml樣品指示高風(fēng)險(xiǎn)或復(fù)發(fā)。優(yōu)選的樣品是血液、腫瘤組織和血漿。優(yōu)選地，所述癌癥是結(jié)腸直腸癌。
[0149]為了檢測(cè)編碼基因或基因組序列的mRNA的存在，從對(duì)象中獲得樣品。樣品可以是包含腫瘤細(xì)胞物質(zhì)的任何合適樣品。合適的細(xì)胞類(lèi)型包括組織、血液、血漿或血清及其所有可能的組合。優(yōu)選地，所述樣品類(lèi)型是血液?？商幚順悠芬蕴崛∑渲兴腞NA。然后分析從樣品中得到的核酸。用于確定基因表達(dá)的絕對(duì)水平和相對(duì)水平的許多技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)水平下是已知的，適用于本發(fā)明的常用技術(shù)包括原位雜交(例如，F(xiàn)ISH)，Northern分析、RNase保護(hù)測(cè)定(RPA)、微陣列和基于PCR的技術(shù)(例如定量PCR和差異顯示PCR)或任何其他的核酸檢測(cè)方法?？墒褂媚孓D(zhuǎn)錄/聚合鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)。RT-PCR的方法在本領(lǐng)域是公知的(例如，參見(jiàn)Watson和Fleming,見(jiàn)上)。
[0150]可如下進(jìn)行RT-PCR方法。通過(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)異硫氰酸胍方法分離總細(xì)胞RNA并對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄方法包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶和3’端寡核苷酸dT引物和/或隨機(jī)六聚體引物在RNA的模板上合成DNA。然后通過(guò)PCR擴(kuò)增由此產(chǎn)生的eDNA。(Belyavsky等，NuclAcid Resl7:2919-2932,1989 ;Krug和 Berger,Methods in Enzymology,Academic Press,N.Y.，Vol.152，第316-325頁(yè)，1987，其通過(guò)引入并入本文)。更優(yōu)選的是RT-PCR的“實(shí)時(shí)”變體，其中通過(guò)雜交探針(例如，TaqMan、LightCycler、Molecular Beacons&Scorpion)或SYBR green來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。然后通過(guò)參照標(biāo)準(zhǔn)曲線或者通過(guò)將Ct值與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的值進(jìn)行比較來(lái)定量由探針或SYBR green檢測(cè)的信號(hào)。管家基因的分析常用于歸一化結(jié)果。[0151 ] 在Northern印跡分析中，總mRNA或聚(A) +mRNA在變性瓊脂糖凝膠上運(yùn)行,并通過(guò)在其自身的干燥凝膠中或在膜上與帶標(biāo)記探針雜交來(lái)檢測(cè)。所得信號(hào)與RNA群體中的靶RNA量成比例。
[0152]比較來(lái)自?xún)蓚€(gè)或更多個(gè)細(xì)胞群體或組織的信號(hào)揭示了基因表達(dá)水平中的相對(duì)差異。絕對(duì)定量可通過(guò)比較信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線使用已知量的對(duì)應(yīng)于靶RNA的體外轉(zhuǎn)錄物生成。管家基因(無(wú)論條件如何其表達(dá)水平都期望保持相對(duì)恒定的基因)的分析常用于歸一化結(jié)果，消除了由RNA不等地轉(zhuǎn)移至膜或RNA不等地負(fù)載在凝膠上所造成的任何表觀差異。
[0153]Northern分析中的第一步是從目的細(xì)胞或組織中分離純的完整RNA。因?yàn)镹orthern印跡通過(guò)大小區(qū)分RNA，所以樣品完整性影響信號(hào)定位在單一條帶中的程度。部分降解的RNA樣品將導(dǎo)致信號(hào)變模糊或分布在幾個(gè)條帶中，導(dǎo)致靈敏度的總損失并且可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤解釋。在Northern印跡分析中，可使用DNA、RNA和寡核苷酸探針并且這些探針優(yōu)選是帶標(biāo)記的(例如，放射性標(biāo)記、質(zhì)量標(biāo)記或突光標(biāo)記)。因?yàn)殪隦NA大小而不是探針的大小將決定所檢測(cè)條帶的大小，所以方法例如隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記(random-primedlabelling)(產(chǎn)生可 變長(zhǎng)度的探針)適合于探針合成。因?yàn)樘结樀奶禺愋曰钚詫Q定靈敏度的水平，所以?xún)?yōu)選使用具有高特異性活性的探針。
[0154]在RNase保護(hù)測(cè)定中，使RNA靶標(biāo)與限定長(zhǎng)度的RNA探針在溶液中雜交。雜交之后，用單鏈核酸特異性RNase消化RNA以移除任何未雜交的單鏈靶RNA和探針。使RNase失活，然后例如通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分離RNA。完整RNA探針的量與RNA群體中靶RNA的量成比例。RPA可用于相對(duì)地和絕對(duì)地定量基因表達(dá)，并且也可用于對(duì)RNA結(jié)構(gòu)作圖，例如內(nèi)含子/外顯子邊界和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。RNase保護(hù)測(cè)定優(yōu)于Northern印跡分析，原因是其一般具有較低的檢測(cè)限。
[0155]用于RPA的反義RNA通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄具有限定端點(diǎn)的DNA模板生成并且通常在50至600個(gè)核苷酸的范圍中。使用包含與靶RNA不同源的額外序列的RNA探針使得能夠區(qū)分所保護(hù)片段與全長(zhǎng)探針。通常使用RNA探針代替DNA探針，原因是其容易生成單鏈RNA探針以及用RNase進(jìn)行RNA: RNA雙重消化的重現(xiàn)性和可靠性(Ausubel等.2003)，特別優(yōu)選的是具有高特異性活性的探針。
[0156]特別優(yōu)選的是使用微陣列。微陣列分析過(guò)程可分為兩個(gè)主要部分。第一個(gè)部分是將已知基因序列固定到載玻片或其他固體支持物上，然后使帶熒光標(biāo)記的cDNA(包含待詢(xún)問(wèn)序列)與固定在載玻片(或其他固定相)上的已知基因雜交。雜交之后，使用熒光微陣列掃描儀掃描陣列。分析不同基因的相對(duì)熒光強(qiáng)度提供了基因表達(dá)差異的度量。
[0157]可通過(guò)將預(yù)先合成的寡核苷酸固定在制備的載玻片或其他固體表面上生成DNA陣列。在這種情況下，使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成和純化方法制造并制備了代表性基因序列。這些合成的基因序列與至少一種基因的RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)，所述至少一種基因在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化并且通常是在25至70個(gè)核苷酸范圍中的較短序列?；蛘撸稍谳d片表面上原位化學(xué)合成固定的寡核苷酸。原位寡核苷酸合成包括將適當(dāng)核苷酸連續(xù)添加到微陣列上的斑點(diǎn)中；在過(guò)程的每個(gè)階段中使用物理或虛擬掩蔽物保護(hù)沒(méi)有接受核苷酸的斑點(diǎn)。優(yōu)選地，所述合成核酸是鎖核酸(locked nucleic acid)。[0158]在表達(dá)譜微陣列實(shí)驗(yàn)中，使用的RNA模板是研究中細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄譜的代表。首先從待比較細(xì)胞群體或組織中分離RNA。然后將每種RNA樣品用作模板以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成帶熒光標(biāo)記的cDNA。cDNA的熒光標(biāo)記可通過(guò)直接標(biāo)記方法或間接標(biāo)記方法來(lái)完成。
在直接標(biāo)記期間，將熒光修飾核苷酸(例如，Cyt 3-或Cyfl 5-dCTP)在逆轉(zhuǎn)錄期間直接結(jié)
合到cDNA中。或者，可通過(guò)以下過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)間接標(biāo)記:在cDNA合成期間結(jié)合氨基烯丙基修飾核苷酸，然后在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成之后使N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-酯染料與氨基烯丙基修飾cDNA綴合?；蛘?，探針可以是未標(biāo)記的，但是可通過(guò)與直接或間接標(biāo)記的配體特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)。用于標(biāo)記配體(和探針)的合適標(biāo)記和方法在本領(lǐng)域是已知的，并且包括例如可通過(guò)已知方法(例如,切口平移或激酶處理(kinasing))結(jié)合的放射性標(biāo)記。另一些合適的標(biāo)記包括但不限于生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(例如，二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)，特別是引發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷)、酶、抗體等。
[0159]為了進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，用Cy?3標(biāo)記由不同RNA樣品生成的CDNAo純化所得
的帶標(biāo)記cDNA以移除未結(jié)合的核苷酸、游離染料和殘余RNA。純化之后，使帶標(biāo)記cDNA樣品與微陣列雜交。雜交期間和洗滌步驟期間的多個(gè)因素(包括溫度、離子強(qiáng)度、時(shí)間長(zhǎng)度和甲酰胺濃度)決定雜交的嚴(yán)格性。例如在Sambrook等(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,1989)中概括了這些因素。使用突光微陣列掃描儀在雜交后掃描微陣列。每個(gè)斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度指示所分析基因的表達(dá)水平；亮斑對(duì)應(yīng)于強(qiáng)表達(dá)基因，并且暗斑指示
[0160]得到圖像后，就必須分析原始數(shù)據(jù)。首先，必須將背景熒光從每個(gè)斑點(diǎn)的熒光中減去。然后將數(shù)據(jù)歸一化至對(duì)照序列例如外源添加的核酸(優(yōu)選RNA或DNA)或管家基因組，以說(shuō)明任何非特異性 雜交、陣列裝置中的陣列缺陷或變可變性、cDNA標(biāo)記、雜交或洗滌。數(shù)據(jù)歸一化允許得到待比較的多個(gè)陣列的結(jié)果。
[0161]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于根據(jù)本發(fā)明方法確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含:用于測(cè)量在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列基因的轉(zhuǎn)錄水平的工具。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述用于測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平的工具包括這樣的寡核苷酸或多核苷酸，其能夠在嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下與在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)選自以下的技術(shù)來(lái)測(cè)定=Northern印跡分析、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實(shí)時(shí)PCR、RNAse保護(hù)和微陣列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于得到和/或存儲(chǔ)對(duì)象生物樣品的工具。優(yōu)選這樣的試劑盒，其還包含最優(yōu)選適合于容納用于測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平的工具和對(duì)象生物樣品的容器，并且可優(yōu)選地還包含針對(duì)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說(shuō)明書(shū)。
[0162]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含(a)多種寡核苷酸或多核苷酸,其能夠在嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下與在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；(b)容器，優(yōu)選地適合于容納寡核苷酸或多核苷酸以及對(duì)象的包含轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物樣品，其中所述寡核苷酸或多核苷酸可在嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交；(C)檢測(cè)(b)的雜交的工具；以及任選地，(d)針對(duì)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說(shuō)明書(shū)。[0163]所述試劑盒還可容納其他組分，例如包裝在單獨(dú)容器中的雜交緩沖液(其中寡核苷酸待用作探針)。或者，當(dāng)寡核苷酸待用于擴(kuò)增靶區(qū)域時(shí)，所述試劑盒可容納包裝在單獨(dú)容器中的聚合酶和反應(yīng)緩沖液，所述緩沖液對(duì)于通過(guò)所述聚合酶介導(dǎo)的引物延伸(例如PCR)是最優(yōu)的。優(yōu)選地，所述聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。更優(yōu)選地，所述試劑盒還容納Rnase試劑。
[0164]本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)由得自于所述對(duì)象之樣品中的所述基因序列編碼的多肽存在的方法。
[0165]在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列編碼的多肽的多肽表達(dá)異常水平與患癌癥對(duì)象的預(yù)后有關(guān)。
[0166]根據(jù)本發(fā)明，所述多肽的低表達(dá)與患癌癥對(duì)象的預(yù)后不良有關(guān)。
[0167]可使用本領(lǐng)域已知的任意方法用于檢測(cè)多肽。這樣的方法包括但不限于質(zhì)譜測(cè)定、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫化學(xué)方法、結(jié)合劑-配體測(cè)定、免疫組織化學(xué)技術(shù)、凝集和補(bǔ)體測(cè)定(例如，參見(jiàn) Basic and Clinical Immunology, Sites 和 Terr 編，Appleton&Lange,Norwalk, Conn.第217-262頁(yè)，1991，其通過(guò)引用并入本文)。優(yōu)選結(jié)合劑-配體免疫測(cè)定方法，其包括使抗體與一個(gè)或更多個(gè)表位反應(yīng)并且競(jìng)爭(zhēng)性替換標(biāo)志物多肽或其衍生物。
[0168]本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括使用這樣的抗體，其特異性針對(duì)由在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列編碼的一種或更多種多肽。
[0169]這樣的抗體可用于確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，可通過(guò)使用由在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列之多肽編碼的表位作為抗原來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。這樣的抗體可進(jìn)而用于檢測(cè)所表達(dá)的多肽。這種多肽的存在水平可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行定量?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法(例如，用熒光配體或放射性配體進(jìn)行標(biāo)記)來(lái)檢測(cè)和定量抗體-多肽結(jié)合。本發(fā)明還包括用于進(jìn)行上述方法的試劑盒，其中這`樣的試劑盒容納所研究多肽的特異性抗體。
[0170]多種競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性多肽結(jié)合免疫測(cè)定在本領(lǐng)域是公知的。在這種測(cè)定中采用的抗體可以是未標(biāo)記的(例如，如用于凝集測(cè)試的)或標(biāo)記的(用于各種各樣的測(cè)定方法)?？墒褂玫臉?biāo)記包括放射性核素、酶、熒光物、化學(xué)發(fā)光物、酶底物或輔因子、酶抑制劑、顆粒、染料等。優(yōu)選的測(cè)定包括但不限于放射免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、熒光免疫測(cè)定等?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法中的任意一種制備多克隆或單克隆抗體或其表位以用于免疫測(cè)定。
[0171]在所述方法的一個(gè)替代實(shí)施方案中，可通過(guò)western印跡分析來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。所述分析在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)的，簡(jiǎn)言之，通過(guò)電泳例如SDS-PAGE來(lái)分離蛋白質(zhì)。然后將經(jīng)分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至合適的膜(或紙)例如硝基纖維素上，保留通過(guò)電泳實(shí)現(xiàn)的空間分離。然后將膜與封閉物一起孵育以結(jié)合膜上剩余的結(jié)合位置，常用的試劑包括通用蛋白質(zhì)(例如，乳蛋白)。然后添加特異于目的蛋白質(zhì)的抗體，所述抗體可例如通過(guò)染料或酶方法(例如，堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶)檢測(cè)標(biāo)記。然后檢測(cè)膜上抗體的位置。
[0172]在所述方法的一個(gè)替代性實(shí)施方案中，可通過(guò)免疫組織化學(xué)(使用抗體來(lái)探測(cè)樣品中的特定抗原)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。所述分析在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)的，其中在組織中檢測(cè)抗原稱(chēng)為免疫組織化學(xué)，而在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)一般稱(chēng)為免疫細(xì)胞化學(xué)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)與其特異性抗原結(jié)合來(lái)檢測(cè)一級(jí)抗體。然后通過(guò)二級(jí)酶綴合抗體來(lái)結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物。在必需底物和發(fā)色團(tuán)存在下，在抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)上根據(jù)著色沉積物來(lái)檢測(cè)結(jié)合酶。存在多種的合適樣品類(lèi)型、抗體-抗原親和力、抗體類(lèi)型和檢測(cè)增強(qiáng)方法。因此，對(duì)于每個(gè)個(gè)例來(lái)說(shuō)，必須由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定用于免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的最優(yōu)條件。
[0173]用于制備多肽的抗體的一種途徑是選擇并制備多肽全部或一部分的氨基酸序列，化學(xué)合成氨基酸序列并將其注射到適當(dāng)動(dòng)物(通常是兔或小鼠)中(Milstein和Kohler Nature256:495-497,1975 ；Gulfre and Milstein， Methods in Enzymology:Immunochemical Techniques73:1-46, Langone 和 Banatis 編，Academic Press，1981，其通過(guò)引用整體并入本文)。用于制備多肽或其表位的方法包括但不限于化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)或從生物樣品中分離。
[0174]在所述方法的最后步驟中，確定對(duì)象的預(yù)后，其中(mRNA或多肽的)低表達(dá)指示患癌癥對(duì)象的預(yù)后。術(shù)語(yǔ)低表達(dá)應(yīng)認(rèn)為是意指檢測(cè)水平小于預(yù)定截止的表達(dá)，所述預(yù)定截止可選自平均值、中值或優(yōu)化的閾值。術(shù)語(yǔ)過(guò)表達(dá)應(yīng)認(rèn)為是意指檢測(cè)水平大于預(yù)定截止的表達(dá)，所述預(yù)定截止可選自平均值、中值或優(yōu)化的閾值。
[0175]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于根據(jù)本發(fā)明方法確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后的試劑盒，其包含:用于檢測(cè)在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列多肽的工具。所述用于檢測(cè)多肽的工具優(yōu)選地包括抗體、抗體衍生物或抗體片段。多肽最優(yōu)選地通過(guò)利用帶標(biāo)記抗體的Western印跡來(lái)檢測(cè)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于得到對(duì)象生物樣品的工具。優(yōu)選的是這樣的試劑盒，其還包含適合于容納用于檢測(cè)對(duì)象生物樣品中多肽之工具的容器，并且最優(yōu)選地還包含針對(duì)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:(a)用于檢測(cè)在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列多肽的工具；(b)適合于容納所述工具和包含多肽的對(duì)象生物樣品的容器，其中所述工具可與多肽形成復(fù)合物；(C)用于檢測(cè)(b)的復(fù)合 物的工具；以及任選地，(d)針對(duì)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說(shuō)明書(shū)。
[0176]所述試劑盒還可容納封裝在單獨(dú)容器中的其他組分，例如適合于封閉、洗滌或包被的緩沖液或溶液。
[0177]甲基化分析
[0178]本發(fā)明的一些特別的實(shí)施方案提供了這樣的新應(yīng)用:能夠區(qū)分患癌癥對(duì)象之預(yù)后的在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列中甲基化水平和/或模式的分析。
[0179]在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)分析在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的一個(gè)或更多個(gè)CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)來(lái)確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后。
[0180]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:i)使得自于對(duì)象的基因組DNA(優(yōu)選地分離自組織、血液、血漿或血清)與至少一種試劑或一系列試劑相接觸，所述試劑區(qū)分在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列(包括啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)元件)內(nèi)的甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸；以及ii)確定所述患癌癥對(duì)象的預(yù)后。
[0181]優(yōu)選的是，在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的所述一個(gè)或更多個(gè)CpG 二核苷酸包含在其各自的基因組靶序列中，如在基因組序列及其互補(bǔ)序列中所提供的。本發(fā)明還提供了一種用于通過(guò)分析胞嘧啶甲基化確定在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列或者根據(jù)對(duì)象內(nèi)所述基因組序列的基因組序列的遺傳學(xué)和/或表觀遺傳學(xué)參數(shù)的方法。所述方法包括使包含得自于所述對(duì)象的生物樣品中的基因組序列的核酸與至少一種試劑或一系列試劑相接觸，其中所述試劑或一系列試劑區(qū)分靶核酸內(nèi)的甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸。
[0182]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:在第一步中，得到待分析組織的樣品。來(lái)源可以是任何合適的來(lái)源，例如組織、血液、血漿或血清及其任何可能的來(lái)源。優(yōu)選地，所述DNA來(lái)源是組織、血液、血漿或血清。
[0183]然后從樣品中分離基因組DNA。基因組DNA可通過(guò)本領(lǐng)域的任何標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)分離，包括使用可商購(gòu)試劑盒。簡(jiǎn)言之，必須通過(guò)酶、化學(xué)或機(jī)械方法使生物樣品中其中封裝了目的DNA的細(xì)胞膜破壞和裂解。然后，可清除DNA溶液中的蛋白質(zhì)和其他污染物(例如，通過(guò)用蛋白酶K消化)。然后從溶液中回收基因組DNA。這可通過(guò)多種方法進(jìn)行，包括鹽析、有機(jī)提取或使DNA與固相支持物結(jié)合。方法的選擇受多種因素影響，包括時(shí)間、費(fèi)用和DNA的需要量。
[0184]當(dāng)樣品DNA沒(méi)有裝在I旲中時(shí)(例如，來(lái)自血液樣品的循環(huán)DNA),可米用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)分離和/或純化DNA。這樣的方法包括使用蛋白質(zhì)變性試劑，例如離液序列高的鹽，例如鹽酸胍或尿素；或去污劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、溴化氰。替代方法包括但不限于借助離心的乙醇沉淀或丙醇沉淀、真空濃縮等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可使用設(shè)備例如過(guò)濾器設(shè)備(例如超濾)、硅膠表面或膜、磁性顆粒、聚苯乙烯材料、聚苯乙烯表面、帶正電表面和帶正電膜、帶電 膜、帶電表面、帶電荷轉(zhuǎn)變的膜、帶電荷轉(zhuǎn)變的表面。
[0185]一旦提取了核酸，就將基因組雙鏈DNA用于分析，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法進(jìn)行甲基化分析，所述方法包括但不限于甲基化敏感性限制酶分析和化學(xué)試劑分析。
[0186]化學(xué)分析
[0187]在所述方法的第二步中，以這樣的方式處理基因組DNA樣品使得在5’位置非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁ⑿叵汆奏せ蛟陔s交行為方面不同于胞嘧啶的另一個(gè)堿基。在本文中這個(gè)理解為‘預(yù)處理’或‘處理’。
[0188]這可優(yōu)選地通過(guò)用重亞硫酸鹽試劑處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“重亞硫酸鹽試劑”是指包含重亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或其組合的試劑，如本文所公開(kāi)地可用于區(qū)分甲基化和非甲基化CpG 二核苷酸序列。所述處理的方法在本領(lǐng)域是已知的(例如PCT/EP2004/011715，其通過(guò)引用整體并入本文)。優(yōu)選的是，重亞硫酸鹽處理在變性溶劑(例如但不限于正亞烷基二醇，特別是乙二醇二甲醚(DME))存在下或者在二燒或二》惡燒衍生物存在下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，變性溶劑以在I %至35% (ν/ν)的濃度使用。還優(yōu)選的是，重亞硫酸鹽反應(yīng)在清除劑(scavenger)存在下進(jìn)行,所述清除劑例如但不限于色滿衍生物，例如6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-羧酸或三羥基苯酸及其衍生物，例如沒(méi)食子酸(參見(jiàn):PCT/EP2004/011715，其通過(guò)引用整體并入本文)。重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變優(yōu)選地在30°C至70°C的反應(yīng)溫度下進(jìn)行，其中在反應(yīng)期間使溫度增加至超過(guò)85°C維持短時(shí)間段(參見(jiàn):PCT/EP2004/011715，其通過(guò)引用整體并入本文)。經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA優(yōu)選地在定量之前進(jìn)行純化。這可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(例如但不限于超濾)進(jìn)行，優(yōu)選地通過(guò)MicrocorT (TM)柱(由Millipore'(TM)制造)進(jìn)行。根據(jù)改進(jìn)的制造商方案進(jìn)行純化(參見(jiàn):PCT/EP2004/011715，其通過(guò)引用整體并入本文)。
[0189]在所述方法的第三步中，使用根據(jù)本發(fā)明的引物寡核苷酸集合以及擴(kuò)增酶來(lái)擴(kuò)增經(jīng)處理DNA的片段。幾種DNA區(qū)段的擴(kuò)增可同時(shí)在同一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行。通常，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100至2，000個(gè)堿基對(duì)。所述引物寡核苷酸集合包含至少兩種寡核苷酸，其序列各自與重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的堿基序列至少16個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的區(qū)段反向互補(bǔ)、相同或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交。
[0190]在所述方法的一個(gè)替代實(shí)施方案中，可通過(guò)使用甲基化特異性引物寡核苷酸來(lái)檢測(cè)在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列內(nèi)，并且優(yōu)選檢測(cè)根據(jù)所述基因組序列的核酸序列內(nèi)預(yù)選擇的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。Herman的美國(guó)專(zhuān)利N0.6，265，171描述了這種技術(shù)(MSP)。將甲基化狀態(tài)特異性引物用于擴(kuò)增經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA允許區(qū)分甲基化和非甲基化核酸。MSP引物對(duì)包含與經(jīng)重亞硫酸鹽處理的CpG 二核苷酸雜交的至少一種引物。因此，所述引物的序列包含至少一個(gè)CpG 二核苷酸。特異于非甲基化DNA的MSP引物在CpG的C位置的位置上包含“T”。因此，優(yōu)選地，需要所述序列的堿基序列包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)核苷酸并且與根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的經(jīng)處理核酸序列雜交的序列，其中所述寡聚物的堿基序列包含至少一個(gè)CpG 二核苷酸。所述方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括使用阻斷物寡核苷酸(HeavyMethyl?測(cè)定)。Yu等，BioTechniques23:714_720，1997描述了這種阻斷物寡核苷酸的用途。使阻斷探針寡核苷酸與經(jīng)重亞硫酸鹽處理的核酸雜交同時(shí)與PCR引物雜交。核酸的PCR擴(kuò)增在阻斷探針的5’位置處結(jié)束，使得核酸的擴(kuò)增在存在阻斷探針互補(bǔ)序列時(shí)受到抑制。探針可被設(shè)計(jì)成以甲基化狀態(tài)特異性方式與經(jīng)重亞硫酸鹽處理的核酸雜交。例如，為了檢測(cè)非甲基化核酸群體中的甲基化核酸，在所討論位置處非甲基化的核酸擴(kuò)增的抑制通過(guò)使用在所討論位置處包含‘CpA’或‘ΤρΑ’的阻斷探針來(lái)進(jìn)行，這與如果期望抑制甲基化核酸擴(kuò)增時(shí)的‘CpG’相反。`
[0191]對(duì)于使用阻斷物寡核苷酸的PCR方法，聚合酶介導(dǎo)擴(kuò)增的有效破壞需要聚合酶不延長(zhǎng)阻斷物寡核苷酸。優(yōu)選地，這通過(guò)使用阻斷物3’ -脫氧寡核苷酸或具有除“游離”羥基之外基團(tuán)的在3’位置處衍生的寡核苷酸。例如，3’ -O-乙?；押塑账崾亲钄辔锓肿觾?yōu)選類(lèi)別的代表。
[0192]另外，應(yīng)排除阻斷物寡核苷酸的聚合酶介導(dǎo)分解。優(yōu)選地，這樣的排除包括使用缺少5’ -3’外切核酸酶活性的聚合酶，或者使用在其5’末端具有例如硫橋(tioate bridge)使得阻斷物分子具有核酸酶抗性的經(jīng)修飾阻斷物寡核苷酸。特別應(yīng)用可以不需要阻斷物的這種5’修飾。例如，如果阻斷物結(jié)合位點(diǎn)與引物結(jié)合位點(diǎn)重疊，從而排除了引物(例如，與過(guò)量阻斷物)的結(jié)合，則將基本上排除阻斷物寡核苷酸的降解。這是因?yàn)榫酆厦覆幌虿⑶也煌ㄟ^(guò)(5，-3’方向)阻斷物延伸引物——通常導(dǎo)致雜交阻斷物寡核苷酸降解的過(guò)程。
[0193]出于本發(fā)明的目的并且如本文所實(shí)施的，一個(gè)特別優(yōu)選的阻斷物/PCR實(shí)施方案包括使用肽核酸(PNA)寡聚物作為阻斷寡核苷酸。這樣的PNA阻斷物寡聚物是非常合適的，原因是它們既不被聚合酶分解也不被聚合酶延伸。[0194]因此，優(yōu)選地，需要所述阻斷寡核苷酸的堿基序列包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)核苷酸并且與根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的經(jīng)處理核酸序列雜交的序列，其中所述寡核苷酸的堿基序列包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸。特別優(yōu)選的是，需要所述阻斷寡核苷酸的堿基序列包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)核苷酸并且與根據(jù)SEQ ID NO:5、6、9和10及其互補(bǔ)序列之一的經(jīng)處理核酸序列雜交的序列，其中所述寡核苷酸的堿基序列包含至少一個(gè)TpG或CpA 二核苷酸。
[0195]通過(guò)擴(kuò)增得到的片段可攜帶可直接或間接檢測(cè)的標(biāo)記。優(yōu)選的是以下形式的標(biāo)記:熒光標(biāo)記、放射性核素或具有可在質(zhì)譜儀中檢測(cè)的典型質(zhì)量的可拆分分子片段。當(dāng)所述標(biāo)記是質(zhì)量標(biāo)記時(shí)，優(yōu)選帶標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物具有單個(gè)正靜電荷或負(fù)靜電荷，使得在質(zhì)譜儀中更好地檢測(cè)。檢測(cè)可通過(guò)例如基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜法(MALDI)或使用電噴霧質(zhì)譜法(ESI)進(jìn)行和觀察。
[0196]基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜法(MALD1-T0F)對(duì)于生物分子分析是非常有效的進(jìn)展(Karas&HiIlenkamp, Anal Chem.，60:2299-301，1988)。將分析物包埋在光吸收基質(zhì)中。通過(guò)短激光脈沖使基質(zhì)蒸發(fā)，從而以非片段化方式將分析物分子運(yùn)輸至蒸氣相中。通過(guò)與基質(zhì)分子碰撞使分析物離子化。施加的電子將使離子加速進(jìn)入無(wú)場(chǎng)飛行管中。由于其不同的質(zhì)量，離子以不同速率被加速。較小離子比較大離子更快地到達(dá)檢測(cè)器。MALD1-T0F質(zhì)譜法特別適合于分析肽和蛋白質(zhì)。核酸的分析稍微要困難些(Gut&Beck，Current Innovations and Future Trends, 1: 147-57,1995)。關(guān)于核酸分析的靈敏度比肽小約100倍，并且隨著片段大小增加而不成比例地降低。而且，對(duì)于具有帶多個(gè)負(fù)電荷的骨架的核酸，通過(guò)基質(zhì)的離子化過(guò)程相當(dāng)不有效。在MALD1-T0F質(zhì)譜法中，基質(zhì)的選擇發(fā)揮著特別重要的作用。對(duì)于肽的解吸，已發(fā)現(xiàn)了幾種非常有效的基質(zhì)，其產(chǎn)生非常細(xì)的結(jié)晶。雖然現(xiàn)在有幾種用于DNA的響應(yīng)性基質(zhì)，但是，肽與核酸之間的靈敏度差異仍沒(méi)有降低。但是，可通過(guò)化學(xué)修飾DNA降低靈敏度的這種差異，以這樣的方式使得其變得與肽更加類(lèi)似。例如，可使用簡(jiǎn)單的烷基化化學(xué)將其中骨架通常的磷酸酯被替換為硫代磷酸酯的硫代磷酸酯核酸轉(zhuǎn)變?yōu)閹щ姷闹行訢NA(Gut&Beck，NucleicAcids Res.23:1367-73,1995)。電荷標(biāo)簽與這種經(jīng)修飾DNA的偶聯(lián)導(dǎo)致了 MALD1-T0F靈敏度增加至與對(duì)于肽所發(fā)現(xiàn)的相同的水平。電荷標(biāo)記的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是分析針對(duì)雜質(zhì)的穩(wěn)定性提高，雜質(zhì)使得對(duì)未修飾底物的檢測(cè)要困難得多。
[0197]在所述方法的第四步中，對(duì)所述方法第三步期間得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析以確定處理之前CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)。
[0198]在其中通過(guò)MSP擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物的一些實(shí)施方案中，根據(jù)所述引物的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或類(lèi)別本身指示由所述引物覆蓋的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。
[0199]可通過(guò)基于基礎(chǔ)的方法(例如但不限于陣列技術(shù)和基于探針的技術(shù))以及通過(guò)例如測(cè)序和模板定向延伸的技術(shù)對(duì)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR和甲基化特異性PCR 二者得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。
[0200]在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，隨后使在第三步中合成的擴(kuò)增產(chǎn)物與寡核苷酸和/或PNA探針的陣列或集合雜交。在這種背景下，雜交以以下方式發(fā)生:雜交期間使用的探針集合優(yōu)選地由至少2種寡核苷酸或PNA-寡聚物構(gòu)成；在該過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物充當(dāng)與之前與固相鍵合的寡核苷酸雜交的探針；隨后移除未雜交片段；所述寡核苷酸包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)核苷酸的至少一個(gè)堿基序列，其與本發(fā)明序列表中指明的堿基序列的區(qū)段反向互補(bǔ)或相同；以及所述區(qū)段包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸。雜交核酸的雜交部分通常長(zhǎng)度為至少9、15、20、25、30或35個(gè)核苷酸。但是，更長(zhǎng)的分子具有本發(fā)明的用途，并因此在本發(fā)明的范圍中。
[0201]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述二核苷酸存在于寡聚物的中間三分之一處。例如，當(dāng)寡聚物包含一個(gè)CpG 二核苷酸時(shí)，所述二核苷酸優(yōu)選為自13-mer的5’末端起第五個(gè)至第九個(gè)核苷酸。存在一個(gè)寡核苷酸用于分析選自所述基因組序列的序列中以及重亞硫酸鹽序列中等同位置處的每個(gè)CpG 二核苷酸。所述寡核苷酸也可以以肽核酸的形式存在。然后移除未雜交的擴(kuò)增產(chǎn)物。然后檢測(cè)雜交的擴(kuò)增產(chǎn)物。在該背景下，優(yōu)選與擴(kuò)增產(chǎn)物連接的標(biāo)記在固相中寡核苷酸序列所處的每個(gè)位置處是可檢測(cè)的。
[0202]在所述方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)寡核苷酸探針(如以上詳細(xì)描述的)確定CpG位點(diǎn)的基因組甲基化狀態(tài)，所述寡核苷酸探針與經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA雜交同時(shí)與PCR擴(kuò)增引物雜交(其中所述引物可以是甲基化特異性的或標(biāo)準(zhǔn)的)。
[0203]所述方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是使用基于熒光的實(shí)時(shí)定量PCROfeid等，Genome Res.6 =986-994,1996 ;還參見(jiàn)美國(guó)N0.6，331，393)，其采用雙標(biāo)記熒光寡核苷酸探針(TaqMan? PCR,其使用 ABI Prism7700Sequence Detection System, Perkin ElmerApplied Biosystems, Foster City, California) ? TaqMan? PCR 反應(yīng)米用不可延伸的詢(xún)問(wèn)寡核苷酸，稱(chēng)為T(mén)aqMan?探針，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，其被設(shè)計(jì)成與位于正向與反向擴(kuò)增引物之間富含CpG的序列雜交。TaqMan?探針還包含與TaqMan?寡核苷酸的核苷酸連接的接頭部分(例如，亞磷酰胺)共價(jià)結(jié)合的熒光“報(bào)道基因部分”和“淬滅劑部分”。為了在重亞磷酸鹽處理后分析核酸內(nèi)的甲基化，需要探針是甲基化特異性的，如美國(guó)專(zhuān)利N0.6，331，393所述(其通過(guò)引用整體并入本文)，也稱(chēng)為MethyLightTM?測(cè)定。也適用于所描發(fā)明的TaqMan?檢測(cè)方法的變體包括使用雙探針技術(shù)(LightCycIer?)或熒光擴(kuò)增引物(Sunrise?技術(shù))。這兩種技術(shù)可在某種程度上調(diào)整成適用于經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA，而且適用于CpG 二核苷酸內(nèi)的`甲基化分析。
[0204]在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法的第四步包括使用模板引導(dǎo)的寡核昔酸延伸，例如 Gonzalgo&Jones, Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997 所述的MS-SNuPE。
[0205]在所述方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法的第四步包括對(duì)在所述方法第三步期間生成的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并隨后進(jìn)行序列分析(Sanger F.,等，Proc Natl Acad SciUSA74:5463-5467,1977)。
[0206]在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)以上所述方法的前三步分離并處理基因組核酸，即:
[0207]a)從對(duì)象中得到具有對(duì)象基因組DNA的生物樣品；
[0208]b)提取或以其他方式分離基因組DNA ；
[0209]c)用一種或更多種試劑處理b)的基因組DNA或其片段，以將在其5-位非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛟陔s交性質(zhì)方面可檢測(cè)地不同于胞嘧啶的另一種堿基；以及其中
[0210]d)在c)的處理之后以甲基化特異性方式(即通過(guò)使用甲基化特異性引物或阻斷寡核苷酸)進(jìn)行擴(kuò)增；以及另外，其中
[0211]e)如上所述通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)探針進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)；以及
[0212]f)確定對(duì)象的預(yù)后2;
[0213]g)優(yōu)選地，當(dāng)如上所述通過(guò)甲基化特異性引物進(jìn)行d)的后續(xù)擴(kuò)增時(shí)，所述甲基化特異性序列包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)、至少6個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)核苷酸的序列，其與根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的經(jīng)處理核酸序列雜交，其中所述寡聚物的堿基序列包含至少一個(gè)CpG 二核苷酸。
[0214]所述方法的步驟e)，即如上所述通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)方法進(jìn)行特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，所述擴(kuò)增產(chǎn)物指示根據(jù)基因組序列的一個(gè)或更多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。
[0215]甲基化敏感性限制酶分析
[0216]在本發(fā)明的一個(gè)替代實(shí)施方案中，以上所述的第二步可通過(guò)甲基化敏感性或甲基化特異性限制酶分析進(jìn)行。方法在本領(lǐng)域是已知的，其中甲基化敏感性限制酶試劑或包含甲基化敏感性限制酶試劑的一系列限制酶試劑用于確定甲基化，所述甲基化敏感性限制酶試劑區(qū)分靶區(qū)域中的甲基化CpG 二核苷酸和非甲基化CpG 二核苷酸，所述試劑例如但不限于 DMH。
[0217]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可在用甲基化敏感性限制酶處理之前切割DNA。這樣的方法在本領(lǐng)域是已知的并且可包括物理方法和酶促方法兩種。特別優(yōu)選的是使用一種或多種非甲基化敏感性并且其識(shí)別序列富含AT而不包含CG 二核苷酸的限制酶。使用這樣的酶能夠保留DNA中的CpG島和富含CpG的區(qū)域。非甲基化特異性限制酶優(yōu)選地選自Msel、Bfa1、Csp61、Trull、T vul1、Tru91、Tvu91、MaeI和XspI。特別優(yōu)選的是使用兩種或三種這樣的酶。特別優(yōu)選的是使用Msel、BfaI和Csp6I的組合。
[0218]然后使片段化DNA與適配體寡核苷酸連接以便于后續(xù)的酶擴(kuò)增。寡核苷酸與平末端和粘末端的DNA片段的連接在本領(lǐng)域是已知的，并且通過(guò)使末端脫磷酸(例如使用牛和蝦堿性磷酸酶)并隨后在dATP存在下使用連接酶(例如，T4DNA連接酶)連接來(lái)進(jìn)行。適配體寡核苷酸通常長(zhǎng)度為至少18個(gè)堿基對(duì)。
[0219]在第三步中，然后用一種或更多種甲基化敏感性限制酶消化DNA (或其片段)。進(jìn)行消化使得限制位點(diǎn)上DNA的水解提供了在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的特異性CpG 二核苷酸甲基化狀態(tài)的信息。
[0220]優(yōu)選地，甲基化特異性限制酶選自Bsi EUHga I HinPl、Hpy991、Ava I, Bce Al、Bsa H1、Bis1、BstU1、BshI2361、AccI1、BstFN1、McrBC、Glal、Mvn1、HpaII (HapII)、HhaI,Aci1、Sma1、HinPl1、HpyCH4IV、EagI和以上酶的兩種或更多種的混合物。優(yōu)選的是包含限制酶 BstU1、HpaI1、HpyCH4IV 和 HinPlI 的混合物。
[0221]在第四步中，其是任選的但是是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，對(duì)限制片段進(jìn)行擴(kuò)增。其優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行，并且所述擴(kuò)增產(chǎn)物可攜帶如上所討論的合適的可檢測(cè)標(biāo)記，即熒光標(biāo)記、放射性核素和質(zhì)量標(biāo)記。特別優(yōu)選的是通過(guò)擴(kuò)增酶和至少兩種引物來(lái)擴(kuò)增，所述至少兩種引物在每種情況下均包含長(zhǎng)度為至少16個(gè)核苷酸的與選自所述基因組序列的序列及其互補(bǔ)序列的序列互補(bǔ)或在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下雜交的連續(xù)序列。優(yōu)選地，所述連續(xù)序列的長(zhǎng)度為至少16、20或25個(gè)核苷酸。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，所述引物可與與所述片段連接的任何適配體互補(bǔ)。[0222]在第五步中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的任意方法來(lái)進(jìn)行，例如但不限于凝膠電泳分析、雜交分析、將可檢測(cè)標(biāo)簽引入到PCR產(chǎn)物中、DNA陣列分析、MALDI或ESI分析。優(yōu)選地，所述檢測(cè)通過(guò)與至少一種核酸或肽核酸雜交來(lái)進(jìn)行，所述至少一種核酸或肽核酸在每種情況下均包含長(zhǎng)度為至少16個(gè)核苷酸的與選自所述基因組序列及其互補(bǔ)序列的序列互補(bǔ)或在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下雜交的連續(xù)序列。優(yōu)選地，所述連續(xù)序列的長(zhǎng)度為至少16、20或25個(gè)核苷酸。
[0223]在確定所述基因組核酸的甲基化狀態(tài)或水平之后，基于在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一個(gè)CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)或水平，或者反映甲基化與患癌癥對(duì)象之預(yù)后有關(guān)的基因組序列中多個(gè)CpG 二核苷酸的平均甲基化狀態(tài)的值或平均值，，來(lái)推斷患癌癥對(duì)象的預(yù)后。當(dāng)通過(guò)定量方法來(lái)確定所述甲基化時(shí)，用于確定所述甲基化存在的截止點(diǎn)優(yōu)選為零(即，當(dāng)樣品表現(xiàn)出任何程度的甲基化時(shí)，確定為在所分析CpG位點(diǎn)上具有甲基化狀態(tài))。但是，應(yīng)預(yù)見(jiàn)到，本領(lǐng)域技術(shù)人員可希望調(diào)整所述截止值以提供特別優(yōu)選的靈敏度或特異性的測(cè)定。因此，可增加所述截止值(由此增加特異性)，所述截止值可在選自0%至5%、5%至10%、10%至15%、15%至20%、20%至30%和30%至50%的范圍內(nèi)。特別優(yōu)選的是至少0.1%、1%、10%、15%、25%和30%的截止。
[0224]本文使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”應(yīng)視為意指指示預(yù)測(cè)的疾病進(jìn)展(包括但不限于侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力)和/或預(yù)測(cè)的患者存活時(shí)間。
[0225]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“侵襲性”用來(lái)表示手術(shù)后復(fù)發(fā)的一種或更多種高可能性；低于平均患者存活或低于中值患者存活；低于平均無(wú)疾病存活或低于中值無(wú)疾病存活；低于平均無(wú)復(fù)發(fā)存活或低于中值無(wú)復(fù)發(fā)存活；高于平均腫瘤相關(guān)并發(fā)癥；腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤的快速進(jìn)展。
[0226]除非另有聲明，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)“存活”應(yīng)認(rèn)為包括以下的所有:直至死亡的存活，也稱(chēng)為總存活(其中所述死亡可以是不考慮原因的或腫瘤相關(guān)的)；“無(wú)復(fù)發(fā)存活”(其中術(shù)語(yǔ)復(fù)發(fā)應(yīng)包括局`部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)兩者)；無(wú)轉(zhuǎn)移存活；無(wú)疾病存活(其中術(shù)語(yǔ)疾病應(yīng)包括癌癥和與其相關(guān)的疾病)?？蓞⒖枷薅ǖ钠瘘c(diǎn)(例如，診斷或開(kāi)始治療的時(shí)間)和終點(diǎn)(例如，死亡、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移)來(lái)計(jì)算所述存活的長(zhǎng)度。
[0227]所公開(kāi)的本發(fā)明提供了來(lái)源于所述基因組序列的經(jīng)處理核酸，其中所述處理適合于使基因組DNA序列的至少一個(gè)非甲基化胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛟陔s交方面可檢測(cè)地不同于胞嘧啶的另一種堿基，以用于確定患癌癥或腫瘤對(duì)象的預(yù)后。所討論基因組序列可包含一個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的甲基化CpG位點(diǎn)。所述核酸處理優(yōu)選地包括使用選自重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、焦亞磷酸鹽及其組合的試劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了非天然經(jīng)修飾核酸，其包含選自重亞硫酸鹽序列的，特別是選自如SEQ ID NO:5,7,10至13和18至20所限定序列的，序列長(zhǎng)度為至少16個(gè)連續(xù)核苷酸堿基的序列。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸為所述重亞硫酸鹽序列中所公開(kāi)核酸序列的長(zhǎng)度為至少50、100、150、200、250或500個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段。特別優(yōu)選的是與重亞硫酸鹽序列(但不是基因組序列或其他天然DNA)的全部或一部分相同或互補(bǔ)的核酸分子。
[0228]優(yōu)選的是，所述序列包含至少一個(gè)CpG、TpA或CpA 二核苷酸及其互補(bǔ)序列。重亞硫酸鹽序列的序列提供了根據(jù)所述基因組序列之核酸的非天然修飾版本，其中每個(gè)基因組序列的修飾導(dǎo)致合成了具有獨(dú)特的且不同于如下所述基因組序列之序列的核酸。對(duì)于每條有義鏈基因組DNA，公開(kāi)了四個(gè)轉(zhuǎn)變版本。第一個(gè)版本，其中“C”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癟”但是“CpG”仍然是CpG” (即對(duì)應(yīng)于下述情況:對(duì)于基因組序列，CpG 二核苷酸序列的所有“C”殘基是甲基化的并因此沒(méi)有轉(zhuǎn)變)；第二個(gè)版本公開(kāi)了所公開(kāi)基因組DNA序列的互補(bǔ)序列(B卩，反義鏈)，其中“C”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癟”，但是“CpG”仍然是“CpG” (即對(duì)應(yīng)于下述情況:對(duì)于基因組序列，CpG 二核苷酸序列的所有“C”殘基是甲基化的并因此沒(méi)有轉(zhuǎn)變)?；蚪M序列的‘上甲基化(upmethylated) ’轉(zhuǎn)變序列對(duì)于SEPTIN9對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:4至9，以及對(duì)于RASSF2A對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:17和18。提供了每種基因組序列的第三個(gè)化學(xué)轉(zhuǎn)變版本，其中對(duì)于所有的“C”殘基(包括“CpG” 二核苷酸序列的那些)“C”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癟” (即對(duì)應(yīng)于下述情況:對(duì)于基因組序列，CpG 二核苷酸序列的所有“C”殘基是非甲基化的)；每種序列的最后一個(gè)化學(xué)轉(zhuǎn)變版本公開(kāi)了所公開(kāi)基因組DNA序列的互補(bǔ)序列(即，反義鏈)，其中對(duì)于所有的“C”殘基(包括“CpG” 二核苷酸序列的那些)“C”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癟” (即對(duì)應(yīng)于下述情況:對(duì)于每種基因組序列的互補(bǔ)序列，CpG 二核苷酸序列的所有“C”殘基是非甲基化的)?；蚪M序列的‘下甲基化(downmethylated) ’轉(zhuǎn)變序列對(duì)于SEPTIN9對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 10至15，以及對(duì)于RASSF2A 對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:19 和 20。
[0229]顯著地，迄今為止，根據(jù)重亞硫酸鹽序列的核酸序列和分子不參與患癌癥對(duì)象的預(yù)后或不與其相關(guān)聯(lián)。
[0230]在一個(gè)替代實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了適用于本發(fā)明方法用于檢測(cè)基因組DNA或經(jīng)處理(經(jīng)化學(xué)修飾)DNA中的胞嘧啶甲基化狀態(tài)的寡核苷酸或寡聚物。所述寡核苷酸或寡聚物核酸提供了新的預(yù)后方法。所述寡核苷酸或寡聚物包含長(zhǎng)度為至少九(9)個(gè)核苷酸的核酸序列，其與根據(jù)重亞硫酸鹽序列和/或其互補(bǔ)序列的經(jīng)處理核酸序列或者根據(jù)所述基因組序列和/或其互補(bǔ)序列的基因組序列相同或在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件(如本文以上所定義的)下雜交。
[0231]因此，本發(fā)明包括在中等嚴(yán)格和/或嚴(yán)格雜交條件下與序列的所有或一部分或者與其互補(bǔ)序列雜交的核酸分子(例如，寡核苷酸和肽核酸(PNA)分子(PNA-寡聚物))。特別優(yōu)選的是在中等嚴(yán)格和/或嚴(yán)格雜交條件下與序列重亞硫酸鹽序列(而不與基因組序列或其他人基因組DNA)的所有或一部分雜交的核酸分子。
[0232]雜交核酸的相同部分或雜交部分通常長(zhǎng)度為至少9、16、20、25、30或35個(gè)核苷酸。但是，更長(zhǎng)的分子可用于本發(fā)明，因此其在本發(fā)明的范圍中。
[0233]優(yōu)選地，本發(fā)明雜交核酸的雜交部分與序列或與其一部分或與其互補(bǔ)序列至少95%、或至少98%或100%相同。
[0234]可將本文所述類(lèi)型的雜交核酸用作例如探針(例如，PCR引物)或者預(yù)后探針或引物。優(yōu)選地，寡核苷酸探針與核酸樣品的雜交在嚴(yán)格條件下進(jìn)行并且探針與靶序列100%相同。核酸二聚體或雜交體穩(wěn)定性表示為解鏈溫度或Tm，其是探針從靶DNA上脫離的溫度。該解鏈溫度用于定義所需的嚴(yán)格度條件。
[0235]對(duì)于與基因組序列的對(duì)應(yīng)序列(例如等位基因變體和SNP)相關(guān)并且基本相同(不是相同)的靶序列，首先建立在鹽(例如，SSC或SSPE)的特定濃度下僅發(fā)生同源雜交的最低溫度是有用的。然后，假定1%的錯(cuò)配導(dǎo)致Tm降低I°C，則雜交反應(yīng)的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果試圖使序列與探針具有>95%的同一性，則最終洗滌溫度降低5°C)。實(shí)際上，Tm的變化可在每1%錯(cuò)配0.5°C與1.5°C之間。[0236]如參照本文所述基因組序列和轉(zhuǎn)變序列的多核苷酸位置所指示的，長(zhǎng)度X(以核苷酸為單位)的本發(fā)明寡核苷酸的實(shí)例包括對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)度X的連續(xù)重疊寡核苷酸的集合(有義集合和反義集合)的那些，其中每個(gè)連續(xù)重疊集合(對(duì)應(yīng)于給定的X值)中的寡核苷酸定義為核苷酸位置中Z個(gè)寡核苷酸的有限集合:
[0237]η 至(n+(X-1));
[0238]其中n = l、2、3、......(Y-(X-1))；
[0239]其中Y等于SEQ ID NO:1至20的長(zhǎng)度(核苷酸或堿基對(duì))；
[0240]其中X等于集合中每個(gè)寡核苷酸的共同長(zhǎng)度(以核苷酸為單位)(例如，對(duì)于連續(xù)重疊20-mer的集合，X = 20);并且
[0241]其中對(duì)于長(zhǎng)度Y的給定SEQ ID NO:，長(zhǎng)度X的連續(xù)重疊寡聚物的數(shù)目(Z)等于Y-(X-1)。
[0242]優(yōu)選地，所述集合限于包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸的那些寡聚物。
[0243]本發(fā)明20-mer寡核苷酸的實(shí)例包括本文所述的寡聚物(及與其互補(bǔ)的反義集合)，其通過(guò)參照SEQ ID NO:1至20的多核苷酸位置指示:
[0244]I 至 20、2 至 21、3 至 22、4 至 23、5 至 24 等。
[0245]優(yōu)選地，所述集合限于包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸的那些寡聚物。
[0246]同樣地，本發(fā)明25-mer寡核苷酸的實(shí)例包括XXX寡聚物的以下集合(及與其互補(bǔ)的反義集合)，其通過(guò)參照SEQ ID NO:1至20的多核苷酸位置指示:
[0247]I 至 25、2 至 26、3 至 27、4 至 28、5 至 29 等。
[0248]優(yōu)選地，所述集合限于包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸的那些寡聚物。
[0249]對(duì)于在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的每一種序列(有義和反義)，本發(fā)明包括長(zhǎng)度為X的寡核苷酸或經(jīng)修飾寡核苷酸的多個(gè)連續(xù)重疊集合，其中，例如X=9、10、17、20、22、23、25、27、30 或 35 個(gè)核苷酸。
[0250]根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或寡聚物構(gòu)成可用于確定對(duì)應(yīng)于基因組序列的基因組序列的遺傳學(xué)參數(shù)和表觀遺傳學(xué)參數(shù)的有效工具。這種寡核苷酸或經(jīng)修飾寡核苷酸的集合是與在癌癥中是甲基化的而在非癌組中中非甲基化的序列(及其互補(bǔ)序列)相對(duì)應(yīng)的寡聚物的那些連續(xù)重疊的集合。優(yōu)選地，所述寡聚物包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸。
[0251]特別優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或寡聚物是其中CpG 二核苷酸(或?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)變TpG或CpA 二核苷酸)序列的胞嘧啶在寡核苷酸的中間三分之一中；即，例如當(dāng)寡核苷酸長(zhǎng)度為13個(gè)堿基時(shí)，CpG> TpG或CpA 二核苷酸定位在5’末端的第五個(gè)至第九個(gè)核苷酸。
[0252]本發(fā)明的寡核苷酸也可通過(guò)使寡核苷酸與一個(gè)或更多個(gè)部分或綴合物化學(xué)連接來(lái)修飾，以增強(qiáng)寡核苷酸的活性、穩(wěn)定性或檢測(cè)。這樣的部分或綴合物包括發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、脂質(zhì)如膽固醇、膽酸、硫醚、脂肪鏈、磷脂、聚胺、聚乙二醇(PEG)、棕櫚基部分等，如例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，514，758,5, 565，552,5, 567，810,5, 574，142,5, 585，481,5, 587，371,5, 597，696和5，958，773中所公開(kāi)的。探針也可以以具有特別優(yōu)選配對(duì)性質(zhì)的PNA (肽核酸)的形式存在。因此，寡核苷酸可包含另一些附加的基團(tuán)，例如肽，并且可包含雜交引發(fā)切割劑(Krol等,Bio Techniques6:958-976,1988)或螯合劑(Zon,Pharm.Res.5:539-549,1988)。為此目的，應(yīng)使寡核苷酸與另一種分子綴合，例如發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、肽、雜交引發(fā)交聯(lián)劑、運(yùn)輸劑、雜交引發(fā)裂解劑等。[0253]寡核苷酸還可包含至少一個(gè)本領(lǐng)域已知的修飾糖和/或基礎(chǔ)部分，或者可包含修飾骨架或非天然核苷間連接(internucleoside linkage)。
[0254]根據(jù)本發(fā)明一些特別實(shí)施方案的寡核苷酸或寡聚物通常用于‘集合’中，所述集合包含用于分析基因組序列(選自基因組序列及其互補(bǔ)序列)的每一個(gè)CpG 二核苷酸的至少一個(gè)寡聚物，或者分析根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列中對(duì)應(yīng)的CpG、TpG或CpA 二核苷酸的至少一個(gè)寡聚物。但是，預(yù)期，出于經(jīng)濟(jì)或其他因素，分析所述序列中有限選擇的CpG二核苷酸可能是優(yōu)選的，寡核苷酸集合的內(nèi)容并因此而改變。
[0255]因此，在一些特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)經(jīng)處理基因組DNA(重亞硫酸鹽序列)中或基因組DNA (基因組序列及其互補(bǔ)序列)中胞嘧啶甲基化狀態(tài)的至少兩(2)種(寡核苷酸和/或PNA-寡聚物)的集合。這些探針能夠確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后。寡聚物的集合也可用于檢測(cè)經(jīng)處理基因組DNA(重亞硫酸鹽序列)中或基因組DNA(基因組序列及其互補(bǔ)序列)中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0256]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸集合的至少一個(gè)并且更優(yōu)選所有成員與固相結(jié)合。
[0257]在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了至少兩(2)種寡核苷酸的集合，所述寡核苷酸用作‘引物’寡核苷酸以擴(kuò)增在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的序列及其互補(bǔ)序列或其區(qū)段之一的DNA序列。
[0258]預(yù)期，寡核苷酸可構(gòu) 成“DNA芯片”或“陣列”(即，與固相結(jié)合的不同寡核苷酸和/或PNA-寡聚物的布置)的全部或一部分。這樣的不同寡核苷酸和/或PNA-寡聚物序列的陣列的特征可在于，例如，其以矩形或六方晶格的形式布置在固相上。固相表面可由娃酮、玻璃、聚苯乙烯、鋁、鋼、鐵、銅、鎳、銀或金構(gòu)成。也可使用硝化纖維以及塑料如尼龍，其可以以小球形式存在或者也可以作為樹(shù)脂基質(zhì)?？蓮腘ature Genetics的專(zhuān)刊(Nature GeneticsSupplement,第21卷，1999年I月)中獲悉寡聚物陣列制造的現(xiàn)有技術(shù)的概述。帶突光標(biāo)記探針經(jīng)常用于掃描固定化DNA陣列。Cy3和Cy5染料與特異性探針5’-OH的簡(jiǎn)單連接特別適合于熒光標(biāo)記。雜交探針的熒光檢測(cè)可例如通過(guò)共聚焦顯微鏡來(lái)進(jìn)行。Cy3和Cy5染料(除許多其他的之外)是可商購(gòu)的。
[0259]還預(yù)計(jì)到寡核苷酸或其特定序列可構(gòu)成“虛擬陣列”的所有或一部分，其中，將寡核苷酸或其特定序列用作例如‘說(shuō)明符(specifier) ’作為獨(dú)特帶標(biāo)記探針不同群體的一部分或與其組合，以分析分析物的復(fù)雜混合物。例如，US2003/0013091(2003年I月16日公開(kāi)的美國(guó)序列號(hào)09/898，743)描述了這樣的方法。在這樣的方法中，生成足夠的標(biāo)記使得復(fù)雜混合物中的每種核酸(即，每種分析物)可獨(dú)特地被獨(dú)特標(biāo)簽結(jié)合并因此被檢測(cè)(對(duì)每種標(biāo)記進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，導(dǎo)致了混合物中每種分子物類(lèi)的數(shù)字讀出)。
[0260]特別優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物用于確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后。
[0261]試劑盒
[0262]而且，本發(fā)明的另一個(gè)方面是試劑盒，其包含:用于確定在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列甲基化的工具(means)。用于確定在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列甲基化的工具優(yōu)選地包含含重亞硫酸鹽的試劑；一種或多種寡核苷酸，在每種情況下其序列與選自重亞硫酸鹽序列之序列的至少9個(gè)、至少18個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交；以及任選的用于進(jìn)行并評(píng)價(jià)所述甲基化分析方法的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的堿基序列包含至少一個(gè)CpG、CpA或TpG 二核苷酸。
[0263]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還可包含用于進(jìn)行CpG位點(diǎn)特異性甲基化分析的標(biāo)準(zhǔn)試劑，其中所述分析包括以下技術(shù)的一種或更多種:MS-SNuPE、MSP、MethyLight?、HeavyMethyl、COBRA和核酸測(cè)序。但是，按照本發(fā)明的試劑盒也可僅容納上述組分的一部分。
[0264]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含另外的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變?cè)噭?，其選自:DNA變性緩沖液、磺化緩沖液、DNA回收試劑或試劑盒(例如，沉淀、超濾、親和柱)、去磺化緩沖液和DNA回收組分。
[0265]在另一個(gè)替代實(shí)施方案中，所述試劑盒可容納包裝在單獨(dú)容器中的聚合酶和反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液針對(duì)由聚合酶介導(dǎo)的引物延伸例如PCR進(jìn)行了優(yōu)化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于得到和/或存儲(chǔ)對(duì)象生物樣品的工具。優(yōu)選的是這樣的試劑盒，其還包含容器，所述容器適合于容納用于確定對(duì)象生物樣品中在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列之甲基化的工具，并且最優(yōu)選地還包含使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:(a)重亞硫酸鹽試劑；(b)適合于容納所述重亞硫酸鹽試劑和對(duì)象生物樣品的容器；(c)至少一個(gè)引物寡核苷酸集合，其包含兩種寡核苷酸，在每種情況下所述寡核苷酸的序列與選自重亞硫酸鹽序列之序列的至少9個(gè)或更優(yōu)選18個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交；以及任選地(d)使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:(a)重亞硫酸鹽試劑；(b)適合于容納所述重亞硫酸鹽試劑和對(duì)象生物樣品的容器；(c)長(zhǎng)度為至少9或16個(gè)核苷酸的至少一種寡核苷酸和/或PNA-寡聚物，其與根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的預(yù)處理核酸序列相同或雜交；以及任選地(d)使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。
[0266]在一個(gè)替代實(shí)施方`案中，所述試劑盒包含:(a)重亞硫酸鹽試劑；(b)適合于容納所述重亞硫酸鹽試劑和對(duì)象生物樣品的容器；(C)至少一個(gè)引物寡核苷酸的集合，其包含兩種寡核苷酸，在每種情況下所述寡核苷酸的序列在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下與選自重亞硫酸鹽序列之序列的至少9個(gè)或更優(yōu)選18個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或雜交；(d)長(zhǎng)度為至少9或16個(gè)核苷酸的至少一種寡核苷酸和/或PNA-寡聚物，其與根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的預(yù)處理核酸序列相同或雜交；以及任選地(e)使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。
[0267]所述試劑盒還可包含包裝在單獨(dú)容器中的其他組分，例如適合于封閉、洗滌或包被的緩沖液或溶液。
[0268]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于確定患癌癥對(duì)象的預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含:用于測(cè)量在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列轉(zhuǎn)錄水平的工具，以及用于確定在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列甲基化的工具。
[0269]用于COBRA?分析的典型試劑(例如，如在典型的基于COBRA?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的PCR引物、限制酶和適當(dāng)?shù)木彌_液、基因雜交寡聚物、對(duì)照雜交寡聚物、用于寡核苷酸探針的激酶標(biāo)記試劑盒以及帶標(biāo)記核苷酸。用于MethyLight?分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于MethyLight?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變序列的PCR引物、重亞硫酸鹽特異性探針(例如，TaqMan?或LightCycIer?)、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸以及Taq聚合酶。
[0270]用于Ms-SNuPE?分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于Ms-SNuPE?的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于特異性基因(或經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA序列或CpG島)的PCR引物、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸、凝膠提取試劑盒、陽(yáng)性對(duì)照引物、用于在癌癥中是甲基化的而在非癌組織 中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變序列的Ms-SNuPE?引物、反應(yīng)緩沖液(用于Ms-SNuPE反應(yīng))以及帶標(biāo)記的核苷酸。
[0271]用于MSP分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于MSP的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變序列的甲基化和非甲基化引物、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸以及特異性探針。
[0272]而且，本發(fā)明的另一個(gè)方面是替代性試劑盒，其包含用于確定在癌癥中是甲基化的而在非癌組織中是非甲基化的至少一種基因或基因組序列的工具，其中所述工具優(yōu)選地包括至少一種甲基化特異性限制酶；一種或多種引物寡核苷酸(優(yōu)選一種或多種引物對(duì))，其適合于擴(kuò)增包含選自所述基因組序列之序列的至少一個(gè)CpG島的序列；以及任選地用于進(jìn)行并評(píng)價(jià)所述甲基化分析方法的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的堿基序列與選自所述基因組序列之序列的至少18個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交。
[0273]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含一種或更多種寡核苷酸探針用于分析消化片段，優(yōu)選地所述寡核苷酸與選自基因組序列之序列的至少16個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交。
[0274]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含選自以下的另外的試劑:緩沖液(例如，限制酶緩沖液、PCR緩沖液、存儲(chǔ)緩沖液或洗滌緩沖液)、DNA回收試劑或試劑盒(例如，沉淀、超濾、親和柱)和DNA回收組分。
[0275]在另一個(gè)替代實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含包裝在單獨(dú)容器中的聚合酶和反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液針對(duì)通過(guò)聚合酶介導(dǎo)引物延伸例如PCR進(jìn)行了優(yōu)化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于得到和/或存儲(chǔ)對(duì)象生物樣品的裝置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:(a)甲基化敏感性限制酶試劑；(b)適合于容納所述試劑和對(duì)象生物樣品的容器；(C) 一種或多種核酸或肽核酸的寡核苷酸的至少一個(gè)集合，所述寡核苷酸的序列與選自所述基因組序列之序列的至少9個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交；以及任選地(d)使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:(a)甲基化敏感性限制酶試劑；(b)適合于容納所述試劑和對(duì)象生物樣品的容器；(c)引物寡核苷酸的至少一個(gè)集合，所述引物寡核苷酸適合于擴(kuò)增包含選自所述基因組序列之序列的至少一個(gè)CpG 二核苷酸的序列；以及任選地(d)使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。[0276]在一個(gè)替代實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:(a)甲基化敏感性限制酶試劑；(b)適合于容納所述試劑和對(duì)象生物樣品的容器；(C)引物寡核苷酸的至少一個(gè)集合，所述引物寡核苷酸適合于擴(kuò)增包含選自所述基因組序列之序列的至少一個(gè)CpG 二核苷酸的序列；(d) 一種或多種核酸或肽核酸的寡核苷酸的至少一個(gè)集合，其序列與選自所述基因組序列之序列的至少9個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交；以及任選地(e)使用說(shuō)明書(shū)和試劑盒結(jié)果的解釋說(shuō)明書(shū)。
[0277]所述試劑盒還可容納包裝在單獨(dú)容器中的其他組分，例如適合于封閉、洗滌或包被的緩沖液或溶液。
[0278]本發(fā)明還涉及用于通過(guò)甲基化敏感性限制酶分析在對(duì)象中確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含容器和DNA微陣列組分。所述DNA微陣列組分是在其上指定位置固定了多種寡核苷酸的表面并且其中所述寡核苷酸包含至少一個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)。所述寡核苷酸中的至少一個(gè)對(duì)選自所述基因的至少一種基因或基因組序列具有特異性，并且包含根據(jù)基因組序列之一的序列長(zhǎng)度為至少15個(gè)堿基對(duì)但不多于200bp的序列。優(yōu)選地，所述序列為根據(jù)所述基因組序列之一的序列長(zhǎng)度為至少15個(gè)堿基對(duì)但不多于SObp的序列。更優(yōu)選的是，所述序列為根據(jù)所述基因組序列之一的序列長(zhǎng)度為至少20個(gè)堿基對(duì)但不多于30bp的序列。所示測(cè)試試劑盒優(yōu)選地還包含限制酶組分，其包括一種或多種甲基化敏感性限制酶。
[0279]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)試試劑盒的特征還在于，其包含至少一種甲基化特異性限制酶，并且其中寡核苷酸包含所述至少一種甲基化特異性限制酶的限制位點(diǎn)。
[0280]所述試劑盒還可包含本領(lǐng)域已知的以下組分的一種或幾種以用于DNA富集:蛋白質(zhì)組分，所述蛋白質(zhì)選擇性結(jié)合甲基化DNA;三鏈體形成核酸組分，任選地在合適溶液中的一個(gè)或多個(gè)接頭；用于 進(jìn)行連接的物質(zhì)或溶液，例如連接酶、緩沖液；用于進(jìn)行柱色譜的物質(zhì)或溶液；用于進(jìn)行基于免疫的富集(例如，免疫沉淀)的物質(zhì)或溶液；用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增(例如PCR)的物質(zhì)或溶液；一種或幾種染料，如果可以與偶聯(lián)試劑一起使用的話，如果可以在溶液中使用的話；用于進(jìn)行雜交的物質(zhì)或溶液和/或用于進(jìn)行洗滌步驟的物質(zhì)和溶液。
[0281]所述的本發(fā)明還提供了可用于確定患癌癥對(duì)象之預(yù)后的物質(zhì)的組合物。所述組合物包含重亞硫酸鹽序列中所公開(kāi)之核酸序列的至少一種長(zhǎng)度為18個(gè)堿基對(duì)的核酸區(qū)段，以及選自以下的一種或更多種底物:1至5mM氯化鎂、100至500μΜ dNTP、0.5至5單位的taq聚合酶、牛血清白蛋白、寡聚物特別是寡核苷酸或肽核酸(PM)-寡聚物，所述寡聚物在每種情況下均包含長(zhǎng)度為至少9個(gè)核苷酸的至少一種堿基序列，其與根據(jù)重亞硫酸鹽序列及其互補(bǔ)序列之一的預(yù)處理基因組DNA互補(bǔ)或在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下雜交。優(yōu)選的是，所述物質(zhì)的組合物包含緩沖溶液，其適合于在水溶液中穩(wěn)定所述核酸并且使得能夠在所述溶液中進(jìn)行基于聚合酶的反應(yīng)。合適的緩沖液在本領(lǐng)域中是已知的并且是可商購(gòu)的。
[0282]本發(fā)明還涉及如前定義的試劑盒或寡核苷酸用于以下的用途:確定癌癥對(duì)象預(yù)后，確定癌癥對(duì)象的藥物治療，確定來(lái)自癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛力或者是否指示對(duì)象的存活時(shí)間減少，檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥，為癌癥治療選擇癌癥對(duì)象，或者確定包括癌癥對(duì)象在內(nèi)的對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)荷。
[0283]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種核酸是重亞硫酸鹽序列中公開(kāi)的核酸序列的長(zhǎng)度為至少50、100、150、200、250或500個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段。[0284]表1根據(jù)本發(fā)明的基因組序列及其經(jīng)處理變體
[0285]
【權(quán)利要求】
1.用于確定癌癥對(duì)象之預(yù)后的方法，其包括以下步驟:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與所述治療前樣品相比所述治療后樣品中所述甲基化基因組DNA或片段的量增加指示所述癌癥是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或所述對(duì)象的存活時(shí)間減少。
3.用于確定癌癥對(duì)象之醫(yī)學(xué)治療的方法，其包括以下步驟:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。
4.用于確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少的方法，其包括:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述甲基化基因組DNA或片段的量增加或相當(dāng)指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少。
5.用于檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式癌癥的方法，其包括:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述甲基化基因組DNA或片段的量增加指示所述腫瘤為侵襲性形式。
6.選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象的方法，其包括:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述基因之甲基化基因組DNA的量增加指示進(jìn)行額外的癌癥治療。
7.用于確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)的方法，其包括:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平；和b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述基因之甲基化基因組DNA的量增加指示所述對(duì)象具有增加的或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，或者所述腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。
8.用于確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)的方法，其包括:將獲自所述對(duì)象的生物樣品中基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療后水平與所述基因之甲基化基因組DNA或其片段的治療前水平進(jìn)行比較，由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中所述基因之甲基化基因組DNA的量增加指示所述對(duì)象具有增加或相當(dāng)?shù)哪[瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，或者所述腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)未因所述治療而減少。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因是SEPTIN9(SEQID NO:1)或 RASSF2a(SEQ ID NO:2)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中在選自SEQID NO:32的21、28、30、37以及39位和SEQ ID NO:34的25、29、46、52、58、70、74、79以及89位的至少一個(gè)胞嘧啶處測(cè)量所述基因組DNA的甲基化。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所 述的方法，其中所述基因是SEPTIN9(SEQID NO:1)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥選自:a.結(jié)腸癌；和b.結(jié)直腸癌。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述癌癥的分期為I期結(jié)直腸癌。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述癌癥的分期為II期結(jié)直腸癌。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述癌癥的分期為III期結(jié)直腸癌。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療選自:a.手術(shù)或切除；b.免疫治療；c.化學(xué)治療；d.放射治療；e.靶向?qū)嶓w腫瘤的治療；f.靶向軟組織腫瘤的治療；以及g.靶向血液癌癥的治療。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療局限于所述對(duì)象中的癌癥區(qū)域。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療不局限于所述對(duì)象中的癌癥區(qū)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品選自:a.組織；b.尿；C.糞便；d.灌洗流體；以及e.血液。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是血清或血漿。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中定量地、或部分定量地、定性地和/或部分定性地測(cè)量甲基化基因組DNA或片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中部分定量地且部分定性地或者半定量地測(cè)量甲基化基因組DNA或片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)量所述甲基化基因組DNA或片段包括使來(lái)自所述生物樣品的基因組DNA與在所述基因組DNA的至少一個(gè)靶區(qū)域中區(qū)分甲基化CpG 二核苷酸與非甲基化CpG 二核苷酸的至少一種試劑或一系列試劑相接觸，其中所述靶區(qū)域包含SEQ ID ΝΟ:1的至少9個(gè)、至少16個(gè)或至少25個(gè)連續(xù)核苷酸的序列或者在嚴(yán)格條件下與之雜交，其中所述連續(xù)核苷酸包含至少一個(gè)CpG 二核苷酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中在b)中所述的接觸基因組DNA或其片段包括使用選自包括以下的組的試劑:重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、焦亞硫酸鹽及其組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其包括:、 a.從所述生物樣品中提取或以其他方式分離所述基因組DNA或其片段；b.用一種或更多種試劑處理所提取或分離的基因組DNA或其片段，以將其5’位非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛘咴陔s交性質(zhì)方面可檢測(cè)地不同于胞嘧啶的另一堿基；c.使所述經(jīng)處理的基因組DNA或經(jīng)處理的片段與擴(kuò)增酶及至少一種包含至少9個(gè)核苷酸連續(xù)序列的引物相接觸，所述核苷酸連續(xù)序列與所述經(jīng)處理的序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)或者在中等嚴(yán)格條件或嚴(yán)格條件下與之雜交，其中所述經(jīng)處理的基因組DNA或其片段擴(kuò)增以產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物或者不擴(kuò)增；以及d.基于所述擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或量或性質(zhì)確定所述基因之至少一個(gè)CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)或水平，或者反映所述基因之多個(gè)CpG 二核苷酸的平均甲基化狀態(tài)或水平的平均值或值。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其包括:a.從所述生物樣品中提取或以其他方式分離所述基因組DNA或其片段；b.用一種或更多種甲基化敏感性限制酶消化所提取或分離的基因組DNA或其片段；c.使b)中的DNA限制酶消化產(chǎn)物與擴(kuò)增酶及至少兩種引物相接觸，所述引物適于擴(kuò)增包含所述基因的至少一個(gè)CpG 二核苷酸的序列；以及d.基于擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、不存在或類(lèi)別確定所述基因之至少一個(gè)CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)或水平。
27.甲基化基因組SEPTIN9核酸或包含所述核酸的至少9個(gè)、至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段及其互補(bǔ)序列，其用于確定癌癥對(duì)象的預(yù)后。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的甲基化基因組SEPTIN9核酸，其中所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌。
29.甲基化基因組SEPTIN9核酸或包含所述核酸的至少9個(gè)、至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段及其互補(bǔ)序列用于下述項(xiàng)的用途:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定用于癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象或者確定對(duì)象包括癌癥對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其中所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌或結(jié)腸癌。
31.包含至少9個(gè)、至少16個(gè)、至少25個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的經(jīng)重亞硫酸鹽處理的基因組SEPTIN9DNA核酸及其互補(bǔ)序列，其用于:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定用于癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)。
32.根據(jù)權(quán)利要求27、28或31中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述連續(xù)堿基序列包含至少一個(gè)CpG、TpG或CpA 二核苷酸序列。
33.用于以下的試劑盒:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定用于癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，所述試劑盒包含:a.多個(gè)能夠在嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下與所述基因或甲基化基因組DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的寡核苷酸或多核苷酸；和b.用于檢測(cè)所述雜交的工具。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述基因或甲基化基因組DNA是SEPTIN9。
35.用于以下的試劑盒:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定用于癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，所述試劑盒包含:`(a)重亞硫酸鹽試劑；(b)至少一組寡核苷酸，其含有兩種寡核苷酸，在每種情況下其序列與SEPTIN9序列的至少9個(gè)或至少18個(gè)堿基長(zhǎng)的區(qū)段相同、互補(bǔ)或者在嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下雜交。
36.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求27、28或31中任一項(xiàng)所述的核酸和/或根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的試劑盒用于以下的用途:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定用于癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)。
37.用于以下的方法:確定癌癥對(duì)象之預(yù)后；確定用于癌癥對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療；確定癌癥對(duì)象的腫瘤是否指示所述腫瘤是侵襲性的或具有轉(zhuǎn)移潛能或者指示所述對(duì)象的存活時(shí)間減少；檢測(cè)對(duì)象中侵襲性形式的癌癥；選擇用于癌癥治療的癌癥對(duì)象或者確定對(duì)象中的腫瘤負(fù)荷或癌癥負(fù)擔(dān)，所述方法包括以下步驟:a.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中Septin9基因表達(dá)和/或其啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件或其片段、或者RASSF2A基因和/或其啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件或其片段的治療前水平；b.測(cè)量獲自所述對(duì)象的生物樣品中Septin9基因表達(dá)和/或其啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件或其片段、或者RASSF2A基因和/或其啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件或其片段的治療后水平；由此與所述治療前樣品相比，所述治療后樣品中Septin9或RASSF2A基因表達(dá)的量減少或相當(dāng)指示對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行額外癌癥治療。
38.用于確定權(quán)利要求37所述方法的試劑盒，其包含:a.多個(gè)能夠在嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下與S印tin9基因和/或其啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件(包括其所有轉(zhuǎn)錄變體)或RASSF2A基因和/或其啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件(包括其所有轉(zhuǎn)錄變體)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的寡核苷酸或多核苷酸；和b.用于檢測(cè)所述雜交的工具。
39.根據(jù)權(quán)利要求37中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)由所述基因或其序列編碼的多肽的存在、不存在或水平來(lái)確定所述表達(dá)水平。
40.用于確定權(quán)利要求36所述方法的試劑盒，其包含:a.用于檢測(cè)S印tin9或RASSF2A之多肽的工具；和b.用于檢測(cè)a)的復(fù)合物的工具。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑盒，其中通過(guò)一種或更多種選自包括以下之組的方法來(lái)檢測(cè)所述多肽western印跡分析、色譜法、免疫測(cè)定、ELISA免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、抗體及其組合。
42.在癌癥對(duì)象或來(lái)自所述癌癥對(duì)象的組織中檢測(cè)轉(zhuǎn)移的方法，其包括在從所述對(duì)象中移除原發(fā)性腫瘤之后檢測(cè)來(lái)自所述對(duì)象的甲基化基因組DNA。
43.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中在來(lái)自所述對(duì)象的血液或血漿中檢測(cè)所述甲基化基因組DNA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103732759SQ201280033813
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月8日
【發(fā)明者】約恩·萊溫, 曼紐爾·克里斯平 申請(qǐng)人:表觀基因組股份有限公司