核酸擴(kuò)增的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增的方法，所述方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：將核酸和等溫試劑盒的擴(kuò)增混合物提供至pH傳感器或pH指示劑，采用等溫?cái)U(kuò)增對(duì)所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且使用所述pH傳感器或pH指示劑檢測(cè)由于擴(kuò)增引起的pH變化。所述試劑盒包括鎂鹽、季銨鹽和堿金屬堿。
【專利說(shuō)明】核酸擴(kuò)增
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對(duì)一定量的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法和試劑盒。本發(fā)明特別地涉及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。經(jīng)擴(kuò)增的核酸可以被傳感器檢測(cè)到。
【背景技術(shù)】
[0002]在進(jìn)行遺傳分析時(shí)，往往由于樣品中存在的拷貝數(shù)太少而無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，通常需要對(duì)樣品中的拷貝數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。
[0003]例如，可以采用熱循環(huán)擴(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增完成這個(gè)過(guò)程。
[0004]等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括SDA、LAMP、SMAP、ICAN、SMART。通過(guò)鏈置換反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行該反應(yīng)過(guò)程。通過(guò)在恒溫下孵育包含樣品、引物、具有鏈置換活性的DNA聚合酶以及底物的混合物，可以一步完成擴(kuò)增。
[0005]在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)中，采用4至6個(gè)被特別設(shè)計(jì)為分別識(shí)別靶基因中的6至8個(gè)特定區(qū)域的不同引物，來(lái)完成祀特異性擴(kuò)增。Eiken Chemical的專利EP2045337 “Process for synthesizing nucleic acid” 中進(jìn)一步描述了 LAMP 技術(shù)，在此通過(guò)引用的方式將其并入本文中。
[0006]這種方法通常能夠在15-60分鐘內(nèi)將核酸拷貝擴(kuò)增IO9-1Ow倍。
[0007]除了引物之外，鏈置換技術(shù)使用Tris和硫酸鹽化合物(例如MgSO4、NH4SO4)來(lái)保持酶的功能性。
[0008]Tris為具有式(HOCH2)3CNH2的有機(jī)化合物(正式名稱為三(羥甲基)氨基甲烷)。諸如LAMP之類的鏈置換技術(shù)使用Tris作為緩沖劑，使反應(yīng)維持在最佳pH值。
[0009]Tris和硫酸鹽的推薦濃度分別為大于等于20mM和12_20mM。
[0010]核酸擴(kuò)增后，核酸檢驗(yàn)需要二級(jí)檢測(cè)技術(shù)，例如分光光度法、濁度法、LFD (橫向流動(dòng)試紙條法)或熒光素酶法。然而，這些已知的技術(shù)存在缺陷。熒光試劑需要標(biāo)記以發(fā)出紫外熒光，因而耗費(fèi)昂貴。此外，諸如SYBR綠等試劑與DNA結(jié)合，使其本身具有致癌性；埃姆斯試驗(yàn)(Ames Test)表明其具有致突變性和細(xì)胞毒性。而且，SYBR綠是非特異性的，其可以附著在任意雙鏈DNA上，因此增強(qiáng)了背景信號(hào)。濁度測(cè)量需要昂貴的儀器以提供量化。最后，LFD中所用試劑需要二次偶聯(lián)，其對(duì)非特異性檢測(cè)敏感。
[0011]現(xiàn)有的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不適用于采用pH檢測(cè)的體系。因此，該領(lǐng)域存在這樣的需求:需要一種對(duì)核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增并且能夠利用安全廉價(jià)的設(shè)備有效地對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒和方法。令人驚訝的是，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所用的試劑可以提高擴(kuò)增的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種試劑盒，其中的試劑可組合形成用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的混合物，所述試劑盒包括:鎂鹽、季銨鹽和堿金屬堿。
[0013]所述混合物的緩沖容量可以被設(shè)置為小于用擴(kuò)增時(shí)釋放的質(zhì)子的期望濃度除以PH變化閾值得到的值，所述pH變化是通過(guò)暴露于所述混合物的傳感器檢測(cè)得到的。[0014]所述混合物的緩沖容量可以被設(shè)置為小于用擴(kuò)增時(shí)釋放的質(zhì)子的期望濃度除以PH變化閾值所得值的一半，所述pH變化閥值是通過(guò)暴露于所述混合物的傳感器檢測(cè)得到的。
[0015]所述待檢測(cè)的pH變化閾值可以為所述感受器的檢測(cè)限值。
[0016]在用于所述擴(kuò)增的操作條件下，所述混合物的緩沖容量可以小于10mM，優(yōu)選地小于5mM，更優(yōu)選地小于ImM。
[0017]所述混合物中的緩沖劑的濃度可以小于5禮，更優(yōu)選地小于3mM、小于2mM或小于ImM0
[0018]如果存在硫酸鹽化合物的話，其濃度可以小于15mM，優(yōu)選地小于10mM、小于8mM、小于5mM或小于ImM。
[0019]所述季銨鹽的濃度為介于2mM和15mM之間，所述季銨鹽優(yōu)選為氯化銨。
[0020]所述堿金屬堿的濃度使得所述混合物的pH介于6和9之間，優(yōu)選地介于7和8.8之間，更優(yōu)選地介于8.3和8.6之間。
[0021]所述堿金屬堿為NaOH、KOH或LiOH之一。
[0022]在核酸擴(kuò)增過(guò)程中還可以使用一種或多種引物，所述引物為等位基因特異性的，從而使得擴(kuò)增能夠顯示目標(biāo)核酸的存在。
[0023]所述等溫?cái)U(kuò)增可以為鏈置換擴(kuò)增，優(yōu)選為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。
[0024]所述混合物的緩沖容量可以基本上屏蔽(mask)非擴(kuò)增時(shí)所釋放的質(zhì)子的預(yù)期量。
[0025]所述試劑盒還可以具有鏈置換酶、核苷酸和引物，其中優(yōu)選地這些試劑中的至少一種與其余試劑分開(kāi)存放。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種方法:使用用于等溫?cái)U(kuò)增的試劑盒、pH傳感器或PH指示劑；采用等溫?cái)U(kuò)增對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增；以及使用所述pH傳感器或pH指示劑檢測(cè)由于所述擴(kuò)增引起的PH變化。
[0027]所述pH指示劑可以為比色染料或熒光染料，所述pH傳感器可以為離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFET)。
[0028]所述方法可以確定使混合物的pH變化大于預(yù)定的變化量所需要的反應(yīng)時(shí)間；以及基于所述反應(yīng)時(shí)間對(duì)核酸的初始濃度進(jìn)行定量。
[0029]所述混合物可以與參比電極流體連通，所述參比電極優(yōu)選為銀-氯化銀電極。
[0030]所述混合物可以包含一種或多種等位基因特異性引物，所述引物具有至少一個(gè)與所述核酸的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)性(SNP)互補(bǔ)的堿基，所述方法還包括根據(jù)是否進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)鑒定所述核酸的所述至少一個(gè)堿基，所述擴(kuò)增是否進(jìn)行由PH傳感器或pH指示劑檢測(cè)。
[0031]所述擴(kuò)增可以改變所述混合物的質(zhì)子濃度使其變化量大于所述混合物的緩沖容量的10%。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種方法，其包括使用所述新的試劑盒對(duì)核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】 [0033]下文將結(jié)合附圖，通過(guò)例子對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行描述，其中:
[0034]圖1為鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(如LAMP)的一系列化學(xué)反應(yīng)；[0035]圖2為暴露于樣品的ISFET的剖面圖；
[0036]圖3為pH檢測(cè)系統(tǒng)的剖面圖；
[0037]圖4為監(jiān)測(cè)DNA樣品擴(kuò)增以鑒定DNA (選項(xiàng)A)或計(jì)算DNA的量(選項(xiàng)B )的方法的流程圖；
[0038]圖5為示出常規(guī)LAMP配方中試劑的緩沖容量的圖；
[0039]圖6為示出不同濃度的NH4Cl的緩沖容量的圖；以及
[0040]圖7為用于定量樣品中的DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0041]常規(guī)LAMP擴(kuò)增方法使用具有置換活性的DNA聚合酶在標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)條件下進(jìn)行，例如:20mM Tris-HCl(pH8.8)UOmM KCl、IOmM(NH)4SO4'2.5mM MgS04、0.l%Triton Χ_100、0.8M甜菜堿、DNA/RNA、dNTP和Bst聚合酶。
[0042]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些常規(guī)試劑使得無(wú)法使用pH傳感器進(jìn)行檢測(cè)，這主要是因?yàn)樗鼈兡軌蚱帘螖U(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的質(zhì)子。
[0043]事實(shí)上，所有這些組分具有不同的pKa，這意味著它們對(duì)所述混合物的緩沖容量具有不同的影響。
[0044]上述提到的試劑中，TrisHCl具有吸收抗衡離子(H+和0H_)的能力，從而幫助溶液保持在聚合酶起作用的最佳PH范圍內(nèi)的穩(wěn)定pH水平。
[0045]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用NaOH替代TrisHCl可以將pH設(shè)定在聚合酶(例如Bst)可以起作用的范圍內(nèi)，同時(shí)降低了緩沖容量。此外，NaOH使雙鏈DNA中的兩條鏈不那么緊密地結(jié)合，使得置換聚合酶更容易將它們分開(kāi)，從而加速反應(yīng)并提高鏈置換酶的效率。
[0046]此外，電子傳感器(例如`ISFET)使用參比電極,例如鉬、Ag/AgCl、氯化亞萊等。這些材料中的一些材料，特別是Ag/AgCl電極與所述標(biāo)準(zhǔn)試劑反應(yīng)。例如，通過(guò)Ag/AgCl電極,Tris在該電極上形成Tris-Ag絡(luò)合物,其使Ag/AgCl的性能劣化,并且含硫酸鹽的試劑會(huì)使Ag/AgCl電極中毒。
[0047]發(fā)明詳述
[0048]使用本發(fā)明方法的優(yōu)選的體系包括pH傳感器或指示劑、微流體結(jié)構(gòu)、核酸樣品、試劑、以及在需要時(shí)設(shè)定樣品的電壓電勢(shì)的參比電極。將試劑和樣品合并成一種流體以進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)釋放質(zhì)子，并用PH傳感器或指示劑測(cè)量pH的變化。
[0049]優(yōu)選地,所述pH傳感器或指示劑為ISFET (離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管)。圖3中示出該傳感器，其中pH傳感器3可以為一個(gè)或多個(gè)位于CMOS微芯片7上的離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFET)，CMOS微芯片7上具有由基片2中的空隙形成的微流體腔8。試劑和核酸樣品可以在被加入到一個(gè)或多個(gè)暴露于ISFET的腔之前或之后混合。每個(gè)ISFET輸出電信號(hào)，該電信號(hào)由信號(hào)處理器監(jiān)測(cè)。ISFET的鈍化層可被官能化從而使其對(duì)質(zhì)子(氫離子)敏感。隨著核酸的擴(kuò)增，釋放出質(zhì)子，并且作為ISFET電輸出的變化而被信號(hào)處理器監(jiān)測(cè)到。
[0050]在可選的實(shí)施方案中，pH指示劑可用于檢測(cè)擴(kuò)增時(shí)釋放的質(zhì)子。例如，所述pH指示劑可以為比色染料或熒光染料，其隨著接觸流體PH的變化而改變光學(xué)性質(zhì)，例如染料的發(fā)射波長(zhǎng)。pH指示劑的例子包括Fluorescein、Pyranine和pHrodo染料(可購(gòu)自LifeTechnology 公司)。
[0051]所述微流體結(jié)構(gòu)可為孔、腔或通道，以接收靠近傳感器或指示劑的樣品，并且可以包括將樣品輸送至傳感器或指示劑的裝置。所述微流體結(jié)構(gòu)還有助于降低質(zhì)子遠(yuǎn)離傳感器或指示劑的擴(kuò)散。在以下實(shí)施方案中，ISFET用于舉例說(shuō)明pH檢測(cè)方案，但是也可以使用其他PH傳感器。所述腔可由材料(如SU-8)中的空穴形成，所述材料位于微芯片頂部，并且可被選擇性地侵蝕，以留下所述空穴。
[0052]圖2示出了由氮化硅制成的、具有浮柵和傳感層的ISFET，其暴露于流體電解質(zhì)中。在專利US2004134798(A1)中進(jìn)一步描述了 ISFET，通過(guò)引用的方式將其內(nèi)容并入本文。
[0053]優(yōu)選地，每個(gè)ISFET產(chǎn)生經(jīng)ISFET和參比信號(hào)之間的差值校準(zhǔn)的輸出信號(hào)。參比信號(hào)可來(lái)自另一個(gè)暴露于陰性對(duì)照反應(yīng)的ISFET，或來(lái)自位于芯片上但不暴露于波動(dòng)pH的FET0因此，芯片上任何通常的漂移和噪音將由這些信號(hào)之間的差異消除。
[0054]優(yōu)選的擴(kuò)增反應(yīng)為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，優(yōu)選為鏈置換反應(yīng)。如本文所用，鏈置換反應(yīng)是通過(guò)具有鏈置換活性的聚合酶在可進(jìn)行鏈置換的反應(yīng)條件下進(jìn)行的。鏈置換反應(yīng)的例子包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。
[0055]作為例子，在圖1中示出LAMP方法中化學(xué)反應(yīng)的步驟。在步驟I中，雙鏈DNA模板在升高的溫度下處于動(dòng)態(tài)平衡。引物F2可以在互補(bǔ)位置上退火至單鏈。在步驟2中，具有鏈置換活性的聚合酶使核苷酸從F2的3’端沿著模板延伸。引入核苷酸是以氫離子(質(zhì)子)作為一種副產(chǎn)物的反應(yīng)。在步驟3中，F(xiàn)3引物退火至模板上的F3c區(qū)域，并開(kāi)始鏈置換。在步驟4中合成上游鏈，進(jìn)一步釋放質(zhì)子。下游鏈變?yōu)閱捂?步驟5)，其在步驟6中隨著Flc在5’端退火至Fl而形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，BIP引物退火至所述鏈的另一端并且核苷酸從B2延伸，釋放更多的質(zhì)子。引物B3置換所述鏈并促進(jìn)延伸以形成步驟7所示的雙鏈。步驟8中的結(jié)構(gòu)具有雙端莖環(huán)，由其進(jìn)行連續(xù)的置換和延伸以擴(kuò)增模板。如前所述，延伸涉及質(zhì)子的釋放。
[0056] 本文所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中所使用的鏈置換聚合酶可選自由以下聚合酶構(gòu)成的組:phi29_DNA_聚合酶、Klenow DNA-聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、9oNm(TM)DNA聚合酶、以及它們的突變體和變體。
[0057]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解，試劑的最佳濃度將取決于聚合酶的選擇；并且，基于聚合酶的知識(shí)和實(shí)驗(yàn)，下述對(duì)優(yōu)選試劑的一些改變是常規(guī)的方法。有關(guān)適宜條件的指導(dǎo)可以從酶制造商獲得。
[0058]優(yōu)選的試劑濃度
[0059]本發(fā)明的方法不需要任何緩沖劑，并且優(yōu)選地存在最小量的緩沖劑。緩沖劑為用于將溶液的酸度(PH)保持在接近指定操作點(diǎn)的弱酸及其共軛堿，從而使得在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時(shí)，或者在本發(fā)明中在摻入核苷酸時(shí)釋放少量質(zhì)子的情況下，pH不會(huì)發(fā)生顯著的變化。緩沖劑是加入到混合物中的化合物，主要目的是提供對(duì)抗PH變化的緩沖作用。如本文所用，當(dāng)化合物的主要目的不是緩沖或其緩沖效果遠(yuǎn)小于混合物中其他化合物時(shí)，該化合物不是緩沖劑。用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖劑通常具有介于6和8.5之間的pKa值，并且具有介于6和9之間的緩沖范圍。例如，銨(NH4+)具有一定的緩沖能力，但是其主要目的不是用于緩沖混合物，并且在PH8的混合物中具有9.24的pKa，相比于Tris而言，其不是很強(qiáng)的緩沖劑。
[0060]對(duì)緩沖劑、酶和體系的初始pH的選擇是相互依賴的。例如，雖然緩沖劑可為如下常見(jiàn)緩沖劑之一:TAPS、Bicine, Tris, Tricine, TAPSO, HEPES, TES、MOPS、PIPES、Cacodylate、SSC和MES，但在一個(gè)實(shí)施方案中，TRIS在pH為8.5時(shí)與BST酶一起使用。[0061]優(yōu)選地，緩沖劑的濃度小于10mM，優(yōu)選地小于8mM、小于5mM或小于ImM。優(yōu)選地，所述緩沖劑為Tris或Hepes。
[0062]為了降低對(duì)參比電極的毒害作用，在合并的流體中的硫酸鹽化合物的濃度小于15mM，優(yōu)選地小于10mM、小于8mM、小于5mM或小于ImM。
[0063]氯化銨可用于替代硫酸銨，同時(shí)還使得可獲得良好的擴(kuò)增產(chǎn)量。更通常地，其他季鹽可用于替代氯化銨。季銨鹽是具有NR4+結(jié)構(gòu)的帶正電的多原子離子，其中R為烷基或芳基。鹽酸胍和氯化銨為季銨鹽的例子。
[0064]優(yōu)選地，在合并的流體中，季銨鹽的濃度范圍為大于2mM、5mM或8mM。但是，銨(NH4+)具有一定的緩沖容量，因此在保持最佳擴(kuò)增產(chǎn)量的同時(shí)，需要使合并的流體中的銨化合物(如氯化銨)的最終濃度最小化。為了降低緩沖容量，合并的流體中的銨化合物的濃度小于15mM、優(yōu)選地小于10mM。
[0065]鎂有利于促進(jìn)模板中核苷酸的摻入。合并的流體中的鎂化合物(例如硫酸鎂)的濃度優(yōu)選地大于0.5mM、大于ImM、大于2mM、或大于4mM。合并的流體中的鎂離子的濃度取決于dNTP、模板和引物的濃度。通常，合并的流體中的dNTP與硫酸鎂的比例優(yōu)選地小于1:2、小于1:3、小于1:4或小于1:5。
[0066]由于高氯濃度有助于Ag/AgCl電極，因此加入如氯化鈉或氯化鉀等一價(jià)鹽，氯離子濃度優(yōu)選地大于10mM、大于20mM、大于30mM、大于40mM或大于50mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流體中的氯離子濃度為介于40mM和60mM之間。
[0067]為了設(shè)定所述流體的初始pH，向流體中加入堿金屬堿，例如NaOH、LiOH或K0H。設(shè)定所述堿金屬堿的濃度使得所述合并溶液的PH介于6和9之間，更優(yōu)選地介于7和8.8之間，最優(yōu)選地介于8和8.6之間，這些pH范圍適于某些酶起作用。對(duì)于Bst聚合酶，優(yōu)選地初始PH大于7，更優(yōu)選地大于8.2且小于8.8，更優(yōu)選地小于8.6。
[0068]其他試劑的濃度可以保持在常規(guī)用量。參見(jiàn)Notomi T等人的文章(Nucleic AcidsRes.2000Junl5 ;28(12):E63)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，Bst聚合酶的量為至少0.3單位每微升合并的流體；甜菜堿的濃度為0-1.5M，優(yōu)選為0.8M-1M ;并且引物的總濃度介于2m和6.2uM之間。
[0069]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，上述試劑濃度能夠提供良好的擴(kuò)增產(chǎn)量，同時(shí)也能提供低的緩沖容量，從而使PH傳感器能夠用于檢測(cè)核酸擴(kuò)增時(shí)釋放的質(zhì)子。
[0070]所述過(guò)程可以在固定溫度下進(jìn)行，以降低由熱循環(huán)引起的傳感器信號(hào)漂移，從而使傳感器信號(hào)更穩(wěn)定。另外，該過(guò)程與半導(dǎo)體平臺(tái)高度相容。例如，最佳酶作用溫度可由芯片上的加熱元件和溫度傳感器實(shí)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)；可以較少地?fù)?dān)心與熱循環(huán)有關(guān)的熱膨脹和熱疲勞；以及可以選擇試劑以使其不影響微芯片上的電極。
[0071]通常，等溫法需要固定的溫度，該溫度由所用的試劑決定。例如，在LAMP中，酶功能在60°C至65°C之間最佳。有利的是，本文所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的試劑/緩沖劑允許更寬的操作溫度。
[0072]與熱循環(huán)不同，由于等溫?cái)U(kuò)增不涉及不連續(xù)的步驟，在每個(gè)步驟中DNA加倍，因此難以估計(jì)指定時(shí)間內(nèi)發(fā)生了多少次擴(kuò)增。結(jié)果，這種等溫?cái)U(kuò)增法通常有助于過(guò)量擴(kuò)增，其負(fù)作用是背景(即非特異性)擴(kuò)增或熒光背景水平過(guò)高。本發(fā)明的方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程，從而在獲得足夠產(chǎn)量時(shí)可以停止該過(guò)程。在微芯片上進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，所述流體由pH傳感器監(jiān)測(cè)并且由芯片表面上的元件加熱，可以使溫度降低或升高至擴(kuò)增暫停的溫度。這保證了在背景DNA之外有足夠的所需DNA，并且不需要為了確定發(fā)生足夠的擴(kuò)增而進(jìn)行不必要的等待。
[0073]在合并時(shí)，提供具有上述濃度的所述試劑。有些試劑具有它們本身所需的保持穩(wěn)定性的條件，因此可以在混合前單獨(dú)儲(chǔ)存。例如，酶可以與其他試劑分開(kāi)，在合適的緩沖溶液中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，從而保證酶的穩(wěn)定性。在與其余試劑混合時(shí)，緩沖劑被充分稀釋從而不會(huì)顯著地屏蔽PH的變化。另外，針對(duì)特定目標(biāo)基因的引物可以以獨(dú)立的溶液或以凍干形式提供?？紤]到所用的試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解或可推知其條件和預(yù)混濃度。
[0074]應(yīng)用
[0075]如圖4的流程圖所示，可以制備DNA樣品并將其分到一個(gè)或多個(gè)腔或孔中。每個(gè)腔或孔暴露于微芯片上的ISFET。將DNA與試劑合并以用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。以下分別為優(yōu)選的試劑和濃度，其組合為最優(yōu)選的試劑盒:
[0076]?至少0.3單位每微升的Bst聚合酶；
[0077].濃度為IM的甜菜堿；
[0078].總濃度為5uM的引物；
[0079].濃度為5mM的硫酸鎂；
[0080].濃度為 ImM 的 Tris ;
[0081]?濃度為O的硫酸銨；
[0082].濃度為1.2mM的NaOH，其使得合并的流體的pH為8.5 ;
[0083].濃度為5mM的氯化銨；以及
[0084].濃度為50mM的氯化鉀。
[0085]ISFET信號(hào)的接收與參比FET不同，并且由信號(hào)處理器監(jiān)測(cè)。通過(guò)與微芯片整合的加熱器將腔和流體加熱至60°C。在預(yù)定反應(yīng)時(shí)間后，如果可能，應(yīng)使模板充分地?cái)U(kuò)增，從而通過(guò)ISFET信號(hào)的變化而被檢測(cè)到。還可以連續(xù)地監(jiān)測(cè)信號(hào)以確定擴(kuò)增和由此產(chǎn)生的信號(hào)變化何時(shí)達(dá)到閾值。
[0086]診斷
[0087]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如圖4的選項(xiàng)A所述，本方法可用于鑒定核酸鏈中的一個(gè)或多個(gè)堿基。該鑒定可以為單一堿基或單一序列。在鑒定單一序列的情況下，可以鑒定與醫(yī)學(xué)狀況有關(guān)的特定堿基，并且對(duì)該堿基的了解能夠?yàn)樵\斷提供方法。目標(biāo)堿基的例子包括單一序列、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、缺失、插入、短串聯(lián)重復(fù)(STP)以及遺傳或體細(xì)胞來(lái)源的突變。也可以進(jìn)行病原體檢測(cè)，由此，本方法可以檢測(cè)生物體或生物體株系的存在。
[0088]可以設(shè)計(jì)擴(kuò)增所用的引物，例如FIP寡聚物(上游內(nèi)部引物)和BIP (下游內(nèi)部引物)寡聚物，使其包括或排除這些序列:SNP或STP區(qū)域。這樣，這些序列的擴(kuò)增或缺失表明待鑒定的堿基/序列的存在或缺失。
[0089]在圖1所示的體系中，兩個(gè)或多個(gè)腔或孔可用來(lái)同時(shí)進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。每個(gè)孔中加入不同引物組，每組引物用于檢測(cè)樣品DNA中的不同堿基。因此，DNA將僅在存在互補(bǔ)引物組的情況下擴(kuò)增，產(chǎn)生質(zhì)子，而其他情況則不會(huì)發(fā)生擴(kuò)增。當(dāng)僅有一個(gè)腔中發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，可以認(rèn)為該DNA是純合的，即在兩個(gè)基因上具有相同的等位基因(突變型或野生型)。當(dāng)兩個(gè)腔中發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，可以認(rèn)為該DNA為雜合的，即在基因上具有不同的等位基因(突變型和野生型)。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)ISFET信號(hào)以檢測(cè)波動(dòng)，并結(jié)合相應(yīng)孔中的引物組情況，人們可以確定樣品DNA中堿基的一致性。為了降低信號(hào)處理的需要，可以對(duì)來(lái)自ISFET的信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)比較，從而輸出代表各孔中擴(kuò)增副產(chǎn)物之間的差異的信號(hào)。
[0090]定量
[0091]如圖4選項(xiàng)B所示，本方法可以用于對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行定量。給定時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)子濃度與流體中DNA的量、以及之前產(chǎn)生的且未從傳感區(qū)域擴(kuò)散走的質(zhì)子的累積量成比例。通過(guò)得知在給定時(shí) 間點(diǎn)，信號(hào)與反應(yīng)開(kāi)始時(shí)相比的變化，并且將該變化與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，人們可以確定擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)樣品中DNA的量。因此，人們可由現(xiàn)在的量和時(shí)間來(lái)反向確定樣品中初始DNA的量。
[0092]所述標(biāo)準(zhǔn)可以得自模型、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、或者一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的、經(jīng)歷與所述檢驗(yàn)平行的擴(kuò)增反應(yīng)的內(nèi)對(duì)照反應(yīng)。所述標(biāo)準(zhǔn)可以作為儲(chǔ)存介質(zhì)上的查詢表或者作為計(jì)算機(jī)程序中的量化方程表示。圖7示出了 DNA的量相對(duì)于時(shí)間的示例性圖表,據(jù)此確定DNA的量。該圖表可以內(nèi)插或外推，或者可以通過(guò)數(shù)據(jù)提取最佳方程，從而在測(cè)量反應(yīng)時(shí)間后估計(jì)DNA的量。
[0093]反應(yīng)時(shí)間為從擴(kuò)增開(kāi)始(即，存在所有用于擴(kuò)增的試劑和條件的時(shí)刻)至pH變化大于閾值時(shí)的時(shí)間?？梢酝ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)PH傳感器信號(hào)或pH指示劑來(lái)檢測(cè)pH變化。
[0094]RNA
[0095]本發(fā)明方法也可以用于通過(guò)使用反轉(zhuǎn)錄酶(RTase)，例如禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV RTase),以及DNA聚合酶來(lái)檢測(cè)RNA模板。cDNA可由模板RNA合成并用本發(fā)明技術(shù)擴(kuò)增，然后使用PH傳感器或指示劑檢測(cè)。
[0096]緩沖容量?jī)?yōu)化
[0097]當(dāng)大多數(shù)化合物對(duì)混合物貢獻(xiàn)一定的緩沖容量時(shí)，理想的是，總的貢獻(xiàn)被最小化。然而，可能需要一些少量的緩沖來(lái)穩(wěn)定酶。應(yīng)當(dāng)考慮擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)期所產(chǎn)生的質(zhì)子來(lái)選擇緩沖劑(如果存在的話)、試劑總緩沖容量、和濃度。所產(chǎn)生的質(zhì)子的量取決于起始模板的量、擴(kuò)增條件和擴(kuò)增時(shí)間(假定有過(guò)量的核苷酸、酶和引物)。起始模板取決于供體、所取的生物樣品類型，擴(kuò)增時(shí)間可以由測(cè)試的操作者或制造商來(lái)選擇。然而，通過(guò)了解擴(kuò)增時(shí)間、生物樣品類型以及供體類型，人們能夠計(jì)算出所產(chǎn)生的質(zhì)子的預(yù)期量(或量的范圍)。
[0098]然后可以選擇混合物的緩沖容量，使得即使是在緩沖混合物的存在下，預(yù)期的(或最低預(yù)期的)由擴(kuò)增產(chǎn)生的質(zhì)子也會(huì)導(dǎo)致PH的變化大于閾值量。pH變化閾值可以為傳感器或相關(guān)電路的檢測(cè)限值?？晒┻x則的是，PH變化閾值可以為0.ΙρΗ，更優(yōu)選為0.2pH，最優(yōu)選為0.5pH。
[0099]緩沖容量由等式⑴定義:
[0100]β =dn/d (p [H.])
[0101]其中η為所加入的OF或H+的量，d(p[H+])為所得氫離子濃度的余對(duì)數(shù)的無(wú)窮小(infinitesimal)變化。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，采用了具有0.5pH的較低檢測(cè)限的ISFET，其暴露于35ul擴(kuò)增反應(yīng)，其中，30分鐘后實(shí)驗(yàn)產(chǎn)量為50ug擴(kuò)增子。釋放自所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的總質(zhì)子大約為2.17mM (假定堿基對(duì)的分子量為650g/摩爾)；
[0103]β =2.17mM/>0.5[0104]β <4.34mM
[0105]因此，為了實(shí)現(xiàn)所需的>0.5的pH變化，混合物的緩沖容量應(yīng)當(dāng)被設(shè)定在小于
4.34mM0
[0106]下表1提供了在25°C下pKa介于6.15和8.43之間的常用緩沖劑的性質(zhì)。在反應(yīng)中，這些緩沖劑的濃度應(yīng)當(dāng)最小化，從而在較短的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)較大的pH變化。然而，可選地提供緩沖劑，以降低背景噪音、穩(wěn)定酶和/或穩(wěn)定初始反應(yīng)。表2提供了所計(jì)算出的通過(guò)改變緩沖劑的濃度對(duì)適合Bst酶的擴(kuò)增反應(yīng)緩沖容量的影響?？梢钥吹剑芏嗑彌_選擇將滿足上述需求，其緩沖容量小于4.34mM(4340uM)。表2中列出的滿足該條件的各種緩沖劑和濃度都各自是優(yōu)選的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0107]表1各種緩沖劑的性質(zhì)
【權(quán)利要求】
1.一種試劑盒，其中的試劑可組合形成用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的混合物，所述試劑盒包括:鎂鹽、季銨鹽和堿金屬堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中將所述混合物的緩沖容量設(shè)置為小于用擴(kuò)增時(shí)釋放的質(zhì)子的期望濃度除以PH變化閾值得到的值，所述pH變化閥值是通過(guò)暴露于所述混合物的傳感器檢測(cè)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中將所述混合物的緩沖容量設(shè)置為小于用擴(kuò)增時(shí)釋放的質(zhì)子的期望濃度除以PH變化閾值得到的值的一半，所述pH變化閥值是通過(guò)暴露于所述混合物的傳感器檢測(cè)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其中待檢測(cè)的所述pH變化閾值為所述傳感器的檢測(cè)限。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中在所述擴(kuò)增的操作條件下，所述混合物的緩沖容量小于IOmM,優(yōu)選地小于5mM，更優(yōu)選地小于ImM。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述混合物中的緩沖劑的濃度小于5mM，更優(yōu)選地小于3mM、小于2mM、或小于ImM。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中如果存在硫酸鹽化合物，其濃度小于15mM，優(yōu)選地小于10mM、小于8mM、小于5mM、或小于ImM。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述季銨鹽的濃度介于2mM和15mM之間，所述季銨鹽優(yōu)選為氯化銨。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述堿金屬堿的濃度使得所述混合物的PH介于6和9之間，優(yōu)選地介于7和8.8之間，更優(yōu)選地介于8和8.6之間。`
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述堿金屬堿為NaOH、KOH或LiOH中的一種。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括一種或多種用于所述核酸擴(kuò)增的引物，所述引物為等位基因特異性的，從而使得擴(kuò)增能夠指示目標(biāo)核酸的存在。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述等溫?cái)U(kuò)增為鏈置換擴(kuò)增，優(yōu)選為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述混合物的緩沖容量基本上能夠屏蔽非擴(kuò)增時(shí)所釋放的質(zhì)子的預(yù)期量。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括鏈置換酶、核苷酸和引物，其中優(yōu)選地，這些試劑中的至少一種與其余試劑分開(kāi)存放。
15.一種監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增的方法，包括以下步驟: 將核酸和根據(jù)權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)所述的試劑盒的擴(kuò)增混合物提供至pH傳感器或pH指示劑； 使用等溫?cái)U(kuò)增對(duì)所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增；以及 使用所述PH傳感器或pH指示劑檢測(cè)由于擴(kuò)增引起的pH的變化。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述pH指示劑為比色染料或熒光染料。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述pH傳感器為離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管(ISFET)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項(xiàng)所述的方法，還包括:確定使混合物的pH變化大于預(yù)定的變化量所需要的反應(yīng)時(shí)間；以及 基于所述反應(yīng)時(shí)間對(duì)所述核酸的初始濃度進(jìn)行定量。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述混合物與參比電極流體連通，所述參比電極優(yōu)選為銀-氯化銀電極。
20.根據(jù)權(quán)利要求15至19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述混合物包含一種或多種等位基因特異性引物，所述引物具有至少一個(gè)與所述核酸的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)性(SNP)互補(bǔ)的堿基，所述方法還包括根據(jù)是否進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)鑒定所述核酸的所述至少一個(gè)堿基，所述擴(kuò)增的進(jìn)行由PH傳感器或pH指示劑檢測(cè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求15至20中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增改變所述混合物的質(zhì)子濃度使其變化量大于所述混合物的緩沖容量的10%。
22.一種方法，包括使用權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)所述的試劑盒對(duì)核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103687962SQ201280034733
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月14日
【發(fā)明者】毛里奇奧·拉姆拉, 安吉爾·王, 阿爾佩什·帕特爾 申請(qǐng)人:Dna電子有限公司