用于篩選肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于鑒定SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變的擴(kuò)增引物、測(cè)序引物、用于篩選的試劑盒和篩選方法。篩選方法包括用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增引物處理DNA樣品，所述擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增具有SLC6A8的DNA區(qū)域，以產(chǎn)生第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物，用測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物，以提供樣品中的SLC6A8的DNA序列，并且比較SLC6A8的DNA序列與SLC6A8的參考DNA序列。
【專利說(shuō)明】用于篩選肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的組合物和方法
[0001]本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§ 119要求于2011年5月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/490，192的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容在此通過(guò)引用全文并入。
[0002]本公開(kāi)內(nèi)容涉及引物、試劑盒和篩選方法，并且更具體而言，涉及擴(kuò)增和測(cè)序引物、用于篩選的試劑盒、和用于鑒定SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變的篩選方法。
[0003]近來(lái)已存在美國(guó)和全世界中的孤獨(dú)癥譜系障礙診斷的增加。這多少是由于更佳的診斷測(cè)試，更多公眾意識(shí)和用于該譜系中存在的一些疾病的有效治療的開(kāi)發(fā)。最近估計(jì)表明多達(dá)60/10，000個(gè)兒童顯示孤獨(dú)癥癥狀。X-連鎖智力低下(下文“XLMR”)限定一組這些障礙，其中問(wèn)題存在于X染色體內(nèi)；存在已知基因中的廣泛多樣突變，并且更多突變每年在全世界被發(fā)現(xiàn)。在西方國(guó)家，智力低下影響2-3%的一般人群。對(duì)于大多數(shù)這些病例，原因仍有待確定，但受累男性普遍超過(guò)女性(約70%男性)指示XLMR對(duì)這個(gè)患者人群的顯著貢獻(xiàn)。XLMR被認(rèn)為占5-12%的所有智力低下(下文“MR”)。約2.1%的XLMR可以追溯到編碼肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的SLC6A8基因中的突變。
[0004]肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷(例如“CTD”)是基于在Cincinnati Children’s HospitalMedical Center的一組患者,在2001年首次描述的肌酸代謝的X連鎖先天性障礙。這種疾病的臨床標(biāo)志包括智力低下、表達(dá)型語(yǔ)言障礙、局限性癲癇和孤獨(dú)癥特征。這些癥狀的嚴(yán)重性可以隨著早期實(shí)現(xiàn)的治療策略而減小，使得早期診斷成為必需。兒童在診斷前越年長(zhǎng)，用治療策略解決發(fā)育遲緩越難。
[0005]SLC6A8基因是負(fù)責(zé)神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的溶質(zhì)載體家族成員。位于Xq28上的SLC6A8基因跨越約8.4kb，并且由13個(gè)外顯子組成。編碼的蛋白質(zhì)是635個(gè)氨基酸，具有70kDa的預(yù)測(cè)mw。SLC6A8基因被認(rèn)為在腦、骨骼和平滑肌以及腎中表達(dá)。存在被認(rèn)為僅在睪丸中表達(dá)的另一種形式的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0006]SLC6A8基因中的眾`多突變已得到鑒定，所述突變影響肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)且導(dǎo)致肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷。因此，在基因內(nèi)引起肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的突變的鑒定要求分析SLC6A8基因的編碼區(qū)的整個(gè)DNA序列。SLC6A8基因與編碼溶質(zhì)載體家族的其他成員以及假定蛋白質(zhì)(例如XP_002343512)的基因高度同源，使得它難以選擇性擴(kuò)增且測(cè)序。例如，假定蛋白質(zhì)與肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共享約95%同源性。由于這個(gè)同源性，SLC6A8基因中的突變鑒定一般已要求使用針對(duì)SLC6A8基因的短非同源區(qū)段的引物，測(cè)序許多更小區(qū)段中的基因。以這種方式測(cè)序整個(gè)基因目前是耗時(shí)、費(fèi)力和低效的。因此，需要引物和方法以增加就突變分析SLC6A8基因的效率，以及減少就突變分析SLC6A8基因的時(shí)間，以增加篩選這種障礙的有效性。
[0007]目前，當(dāng)診斷呈現(xiàn)肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷中可見(jiàn)的癥狀譜的兒童時(shí)，首先在該兒童中檢查線粒體電子傳遞鏈功能障礙。如果沒(méi)有任何發(fā)現(xiàn)，則執(zhí)行皮膚活組織檢查(或漸增的抽血)，以采集足夠的組織用于功能和基因測(cè)試。獲得的皮膚量不足以用于遺傳、功能和生物化學(xué)分析，并且要求對(duì)受試者的疼痛操作。高度期望能夠以創(chuàng)傷少得多的方式收集樣品，并且能夠收集足夠的組織用于遺傳、功能和生物化學(xué)分析。
[0008]一旦獲得組織，就將它送到由CLIA批準(zhǔn)用于基因測(cè)試的經(jīng)認(rèn)證的診斷實(shí)驗(yàn)室。目前全世界僅存在執(zhí)行SLC6A8整個(gè)編碼區(qū)的基于DNA的序列分析的6個(gè)實(shí)驗(yàn)室，其中僅三個(gè)位于美國(guó)，并且其中無(wú)一執(zhí)行肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白動(dòng)力學(xué)測(cè)試，以測(cè)定肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能障礙的水平。這個(gè)過(guò)程是耗時(shí)的并且有時(shí)是創(chuàng)傷性的過(guò)程，其中可以用于實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)策略的寶貴時(shí)間喪失，所述早期干預(yù)策略已顯示改善接受早期診斷的受試者的結(jié)果。
[0009]關(guān)于這個(gè)缺陷的實(shí)際診斷數(shù)目是增長(zhǎng)中的，超過(guò)能夠執(zhí)行該測(cè)試的少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的能力，并且目前采用的診斷方法不能有效按比例增加以處理大量新生兒的篩選。這個(gè)需要是特別明顯的，因?yàn)橛捎隍?yàn)證篩選的缺乏，American College of Medical Genetics決定不推薦在新生兒中篩選該障礙。因此，需要用于在大量受試者中篩選肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的方法和組合物。
[0010]即使在具有診斷能力的實(shí)驗(yàn)室，也不存在基于診斷發(fā)現(xiàn)調(diào)整治療策略的嘗試。簡(jiǎn)明地，目前在美國(guó)沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室具有能夠廣泛肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷篩選和/或功能概況、基于診斷發(fā)現(xiàn)對(duì)治療作出后續(xù)調(diào)整的科學(xué)和專家鑒定能力和肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白患者人群。
[0011]本公開(kāi)內(nèi)容基于新擴(kuò)增引物的發(fā)現(xiàn)，所述新擴(kuò)增引物選擇性擴(kuò)增人中的SLC6A8基因的第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域，以形成第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物。本公開(kāi)內(nèi)容還基于新測(cè)序引物對(duì)的發(fā)現(xiàn)，所述新測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了用于鑒定受試者中的SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變的篩選方法。該方法包括:(a)在擴(kuò)增條件下用多個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物對(duì)處理來(lái)自人的基因組DNA樣品，所述擴(kuò)增引物對(duì)用于擴(kuò)增多個(gè)包含SLC6A8的人基因組DNA區(qū)域，所述處理產(chǎn)生含有SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域的第一種擴(kuò)增產(chǎn)物，含有SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域的第二種擴(kuò)增產(chǎn)物，和含有SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域的第三種擴(kuò)增產(chǎn)物；(b)用第一組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第一種擴(kuò)增產(chǎn)物，用第二組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第二種擴(kuò)增產(chǎn)物，和用第三組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第三種擴(kuò)增產(chǎn)物，其中比對(duì)來(lái)自第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，以提供樣品中的SLC6A8的D NA序列；和(c)比較SLC6A8的DNA序列與SLC6A8的參考DNA序列，從而鑒定所述突變。第一對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域。第二對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域。第三對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域。
[0012]在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了用于選擇性擴(kuò)增SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域的一組擴(kuò)增引物對(duì)。該組擴(kuò)增引物包括用于選擇性擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域的第一對(duì)擴(kuò)增引物，所述第一對(duì)具有SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2;用于選擇性擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域的第二對(duì)擴(kuò)增引物，所述第二對(duì)具有SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4 ;和用于選擇性擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域的第三對(duì)擴(kuò)增引物，所述第三對(duì)具有SEQ IDNO:11 和 SEQ ID NO:12。
[0013]在另外一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了一組測(cè)序引物對(duì)。該組測(cè)序引物對(duì)包括具有SEQID N0:1 和 SEQ ID NO:2 的第一組測(cè)序引物對(duì)；具有 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7和SEQ ID N0:8、以及SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10的第二組測(cè)序引物對(duì)；和具有SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 和 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 20 和 SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28、以及 SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30 的第三組測(cè)序引物對(duì)。
[0014]在另外一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了用于就SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變篩選受試者的試劑盒。該試劑盒包括一組擴(kuò)增引物對(duì)和一組測(cè)序引物對(duì)。擴(kuò)增引物對(duì)包括具有SEQID NO:1和SEQ ID NO: 2的第一對(duì)擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第一種擴(kuò)增產(chǎn)物；具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的第二對(duì)擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第二種擴(kuò)增產(chǎn)物；和具有SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12的第三對(duì)擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第三種擴(kuò)增產(chǎn)物。該組測(cè)序引物對(duì)用于測(cè)序第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物。該組測(cè)序引物對(duì)包括具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的第一組測(cè)序引物對(duì)；具有 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8、以及SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10的第二組測(cè)序引物對(duì)；和具有SEQ ID NO: 13和SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 和SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:20 和 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO: 27和 SEQ ID NO: 28、以及 SEQ ID NO: 29和 SEQ ID NO: 30 的第三組測(cè)序引物對(duì)。
[0015]本文描述的實(shí)施方案的另外特征和優(yōu)點(diǎn)將在下述詳述中闡述，并且部分根據(jù)該描述或通過(guò)實(shí)踐本文描述的實(shí)施方案認(rèn)識(shí)到的對(duì)于技術(shù)人員將是容易地顯而易見(jiàn)的，包括下述詳述、權(quán)利要求以及附圖。
[0016]應(yīng)當(dāng)理解前述一般描述和下述詳述描述多個(gè)實(shí)施方案，并且預(yù)期提供用于理解請(qǐng)求保護(hù)的主題的性質(zhì)和特征的概述或框架。包括附圖以提供多個(gè)實(shí)施方案的進(jìn)一步理解，并且摻入本說(shuō)明書(shū)內(nèi)且構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的部分。附圖舉例說(shuō)明本文描述的多個(gè)實(shí)施方案，并且連同說(shuō)明書(shū)一起用來(lái)解釋請(qǐng)求保護(hù)的主題的原理和操作。
[0017]圖1是依照本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案，SLC6A8基因擴(kuò)增和測(cè)序策略的圖示；
[0018]圖2包括依照本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案，SLC6A8基因的圖示和基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物的代表性顯微照片；和
[0019]圖3是依照本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案，與參考DNA序列相比較的SLC6A8基因的測(cè)序部分的屏幕截圖。
`[0020]技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在圖中的元素為了簡(jiǎn)單和清楚起見(jiàn)而舉例說(shuō)明，并不一定按比例繪制。例如，圖中的一些元素的尺寸可以相對(duì)于其他元素放大，以及去除常規(guī)部分，以幫助改善本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案的理解。
[0021]下述術(shù)語(yǔ)用于本申請(qǐng)中:
[0022]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“篩選”指通過(guò)其測(cè)定SLC6A8基因(即SLC6A8)中的突變存在的程序。在一個(gè)特定例子中，篩選指通過(guò)其測(cè)定人基因組DNA中的SLC6A8中的突變存在的程序。
[0023]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“突變”指DNA序列或染色體結(jié)構(gòu)中的變異，由其正?；蛞吧托蛄谢蛉旧w視為沒(méi)有缺陷。在DNA序列的背景下，突變的例子包括點(diǎn)突變、插入和缺失。此類突變可以具有功能效應(yīng)，例如基因產(chǎn)物的功能減少、基因產(chǎn)物中的功能消除、和/或基因產(chǎn)物中的新功能。
[0024]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“處理”指對(duì)樣品實(shí)施化學(xué)和/或生物過(guò)程。在一個(gè)特定例子中，處理指對(duì)基因組DNA樣品實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)。
[0025]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增條件”指在其下可以經(jīng)由變性、退火和DNA合成的循環(huán)擴(kuò)增DNA的一個(gè)和/或多個(gè)區(qū)域的條件。在一個(gè)特定例子中，術(shù)語(yǔ)擴(kuò)增條件指這樣的條件下，在所述條件下:1)使具有SLC6A8的雙鏈DNA樣品變性，形成單鏈DNA ；2)使第一對(duì)、第二對(duì)和/或第三對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)單鏈DNA退火，并且特別對(duì)SLC6A8的第一個(gè)、第二個(gè)和/或第三個(gè)區(qū)域退火；和3)經(jīng)由DNA合成延伸引物，形成與單鏈DNA互補(bǔ)的新DNA鏈。在擴(kuò)增條件下執(zhí)行的此類方法擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)、第二個(gè)和/或第三個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第一種、第
二種和/或第三種擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“基因組DNA”指保存物種的完全遺傳組分的DNA群體。在一個(gè)特定例子中，基因組DNA指保存人的完全遺傳組分的DNA群體。
[0027]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“區(qū)域”指DNA中的連續(xù)核苷酸序列。就SLC6A8而言，術(shù)語(yǔ)區(qū)域指SLC6A8中的連續(xù)核苷酸序列。在一個(gè)特定例子中，SLC6A8包括第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域。
[0028]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增產(chǎn)物”指經(jīng)由在擴(kuò)增條件下執(zhí)行的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的DNA區(qū)域。例如，在擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)、第二個(gè)和/或第三個(gè)區(qū)域的背景下，擴(kuò)增產(chǎn)物指經(jīng)由變性，對(duì)第一對(duì)、第二對(duì)和/或第三對(duì)引物退火和DNA合成的反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增的DNA區(qū)域。
[0029]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“測(cè)序”指用于測(cè)定核苷酸以其在DNA序列中出現(xiàn)的次序的程序。例如，就SLC6A8而言，術(shù)語(yǔ)測(cè)序指用于測(cè)定核苷酸以其在SLC6A8和/或SLC6A8的區(qū)域中出現(xiàn)的次序的測(cè)序。測(cè)序技術(shù)的例子包括但不限于鏈終止法例如桑格法。
[0030]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“比對(duì)”指其中核苷酸以其在一條或多條DNA鏈中排列的次序。例如，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)比對(duì)指在由SLC6A8的第一個(gè)、第二個(gè)和/或第三個(gè)區(qū)域擴(kuò)增的第一種、第二種和/或第三種擴(kuò)增產(chǎn)物中排列核苷酸次序。在一個(gè)實(shí)施方案中，SLC6A8的第一個(gè)、第二個(gè)和/或第三個(gè)區(qū)域重疊,從而使得第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列在5’和/或3’末端上重疊。在這個(gè)實(shí)施方案中，因此可比對(duì)第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物的序列， 以便提供SLC6A8基因的DNA序列。
[0031 ] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“比較”指通過(guò)其DNA序列中的核苷酸次序可以針對(duì)參考DNA序列中的核苷酸次序進(jìn)行檢查以鑒定突變的程序。用于執(zhí)行此類程序的工具的例子包括但不限于生物信息學(xué)工具例如基本局部比對(duì)搜索工具(即BLAST)，其可從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health)獲得。
[0032]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“DNA序列”指DNA分子由其組成的核苷酸排序。
[0033]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“參考DNA序列”指不含突變的DNA序列和/或含有一種或多種已知突變的DNA序列。
[0034]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“評(píng)估”指通過(guò)其測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)功能的程序。在一個(gè)特定例子中，術(shù)語(yǔ)評(píng)估指通過(guò)其測(cè)定受試者中的肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)功能的程序。
[0035]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白測(cè)定法”指通過(guò)其測(cè)定肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的催化效應(yīng)的程序。
[0036]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷”指肌酸代謝的X連鎖先天性障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷由SLC6A8基因中的突變引起。
[0037]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“關(guān)聯(lián)”指通過(guò)其測(cè)定肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的功能和肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的突變之間的關(guān)系的程序。
[0038]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“選擇性”指僅對(duì)SLC6A8的區(qū)域和/或SLC6A8的擴(kuò)增產(chǎn)物退火的擴(kuò)增引物和/或測(cè)序引物。換句話說(shuō)，術(shù)語(yǔ)選擇性指基本上不對(duì)其他已知基因和/或擴(kuò)增產(chǎn)物退火的擴(kuò)增和/或測(cè)序引物。
[0039]如本文使用的，“高流通量篩選”指通過(guò)其測(cè)定相對(duì)大量樣品中的SLC6A8基因(SPSLC6A8)中的突變存在的篩選方法。在一個(gè)特定例子中，術(shù)語(yǔ)高流通量篩選指通過(guò)其在相對(duì)大量樣品中測(cè)定人基因組DNA中的SLC6A8中的突變存在的程序。
[0040]本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案涉及用于鑒定SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變的篩選方法、一組擴(kuò)增引物對(duì)、一組測(cè)序引物對(duì)、和用于就SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變而篩選受試者的試劑盒。現(xiàn)在將詳細(xì)參考篩選方法的實(shí)施方案。
[0041]1.篩詵方法
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于鑒定受試者中的SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變的篩選方法。篩選方法包括:(a)在擴(kuò)增條件下用多個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物對(duì)處理來(lái)自人的基因組DNA樣品，所述擴(kuò)增引物對(duì)用于擴(kuò)增多個(gè)包含SLC6A8的人基因組DNA區(qū)域，所述處理產(chǎn)生含有SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域的第一種擴(kuò)增產(chǎn)物，含有SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域的第二種擴(kuò)增產(chǎn)物，和含有SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域的第三種擴(kuò)增產(chǎn)物；(b)用第一組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第一種擴(kuò)增產(chǎn)物，用第二組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第二種擴(kuò)增產(chǎn)物，和用第三組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序第三種擴(kuò)增產(chǎn)物，其中比對(duì)來(lái)自第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，以提供樣品中的SLC6A8的DNA序列；和(c)比較SLC6A8的DNA序列與SLC6A8的參考DNA序列，從而鑒定所述突變。第一對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域。第二對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域。第三對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在擴(kuò)增條件下用多個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(即PCR)擴(kuò)增引物對(duì)處理來(lái)自人的基因組DNA樣品，所述擴(kuò)增引物對(duì)用于擴(kuò)增多個(gè)具有SLC6A8的人基因組DNA區(qū)域。多個(gè)PCR擴(kuò)增引物對(duì)包括擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域的第一對(duì)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域的第二對(duì)·擴(kuò)增引物，和擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域的第三對(duì)擴(kuò)增引物。篩選方法用第一對(duì)、第二對(duì)和·第三對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增在三個(gè)區(qū)域中具有SLC6A8的人基因組DNA。
[0044]參考圖1，就第一對(duì)、第二對(duì)和第三對(duì)擴(kuò)增引物而言，第一對(duì)擴(kuò)增引物可以用于由短鏈聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域。第一對(duì)擴(kuò)增引物包括如下表1中所示的有義引物(SEQ ID N0:1)和反義引物(SEQID N0:2)。
[0045]表1
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒定受試者中的SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變的篩選方法，所述方法包括: Ca)在擴(kuò)增條件下用多個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物對(duì)處理來(lái)自人的基因組DNA樣品，所述擴(kuò)增引物對(duì)用于擴(kuò)增多個(gè)包含SLC6A8的人基因組DNA區(qū)域，其中: 第一對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域， 第二對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域， 第三對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域， 所述處理產(chǎn)生含有SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域的第一種擴(kuò)增產(chǎn)物，含有SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域的第二種擴(kuò)增產(chǎn)物，和含有SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域的第三種擴(kuò)增產(chǎn)物， (b)用第一組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序所述第一種擴(kuò)增產(chǎn)物，用第二組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序所述第二種擴(kuò)增產(chǎn)物，和用第三組測(cè)序引物對(duì)測(cè)序所述第三種擴(kuò)增產(chǎn)物，其中比對(duì)來(lái)自所述第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，以提供樣品中的SLC6A8的DNA序列，和 (c)比較SLC6A8的DNA序列與SLC6A8的參考DNA序列，從而鑒定所述突變。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一對(duì)擴(kuò)增引物包含SEQID NO:1和SEQ ID N0:2。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二對(duì)擴(kuò)增引物包含SEQID N0:3和SEQ ID N0:4。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述第三對(duì)擴(kuò)增引物包含SEQID NO: 11和SEQ ID NO: 12。
5.權(quán)利要求1的方法·，其中所述SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域包含外顯子1，所述SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域包含外顯子2-4，并且所述SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域包含外顯子4_13。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一個(gè)區(qū)域含有SLC6A8的核苷酸位置1-25至c.262+25，所述第二個(gè)區(qū)域含有SLC6A8的核苷酸位置c.263-25至c.777+25，并且所述第三個(gè)區(qū)域含有SLC6A8的核苷酸位置c.645-25至c.1908+25。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一組測(cè)序引物對(duì)包含SEQID NO:1和SEQ ID NO:2。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組測(cè)序引物對(duì)包含SEQID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8、以及 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述第三組測(cè)序引物對(duì)包含SEQID NO:13和SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 和SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:20 和 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28、以及 SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品得自所述受試者的血液。
11.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括評(píng)估受試者中的肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的功能。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述評(píng)估包括測(cè)定肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白動(dòng)力學(xué)包含Kn^PVmaxtl
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述評(píng)估包括對(duì)來(lái)自所述受試者的生物樣品執(zhí)行肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白測(cè)定法。
14.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)SLC6A8的DNA序列包含指示肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的診斷的至少一個(gè)突變，所述方法進(jìn)一步包括: 評(píng)估所述受試者中的肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的功能；和 使所述肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的功能與指示肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的診斷的至少一個(gè)突變關(guān)聯(lián)。
15.一組用于選擇性擴(kuò)增SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域的擴(kuò)增引物對(duì)，所述組包含: 用于選擇性擴(kuò)增所述SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域的第一對(duì)擴(kuò)增引物，所述第一對(duì)具有SEQ IDNO:1和 SEQ ID NO:2 ； 用于選擇性擴(kuò)增所述SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域的第二對(duì)擴(kuò)增引物，所述第二對(duì)具有SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4 ;和 用于選擇性擴(kuò)增所述SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域的第三對(duì)擴(kuò)增引物，所述第三對(duì)具有SEQ IDNO:11 和 SEQ ID NO:12。
16.一組測(cè)序引物對(duì)，其包括: 包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的第一組測(cè)序引物對(duì)；
包含 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8、以及 SEQ ID NO: 9 和SEQ ID NO: 10的第二組測(cè)序引物對(duì)；和
包含 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18 和 SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:20 和 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28、以及 SEQ ID NO: 29 和 SEQID NO:30的第三組測(cè)序引物對(duì)。
17.一種用于就SLC6A8肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變而篩選受試者的試劑盒，所述試劑盒包含: 一組擴(kuò)增引物對(duì)，其包括: 包含SEQ ID NO:UPSEQ ID NO: 2的第一對(duì)擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增SLC6A8的第一個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第一種擴(kuò)增產(chǎn)物； 包含SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4的第二對(duì)擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增SLC6A8的第二個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第二種擴(kuò)增產(chǎn)物；和 包含SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的第三對(duì)擴(kuò)增引物，用于擴(kuò)增SLC6A8的第三個(gè)區(qū)域，以產(chǎn)生第三種擴(kuò)增產(chǎn)物；和 一組測(cè)序引物對(duì)用于測(cè)序第一種、第二種和第三種擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述組測(cè)序引物對(duì)包括: 包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的第一組測(cè)序引物對(duì)；
包含 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7和 SEQ ID N0:8、以及 SEQ ID N0:9 和SEQ ID NO: 10的第二組測(cè)序引物對(duì)；和
包含 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18 和 SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20 和 SEQ ID N0:21、SEQ IDNO:20 和 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28、以及 SEQ ID NO: 29 和 SEQID NO:30的第三組測(cè)序引物對(duì)。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一對(duì)、第二對(duì)和第三對(duì)擴(kuò)增引物在所述擴(kuò)增條件下基本上不對(duì)其他已知基因退火。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述多個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)在基本上相似的擴(kuò)增條件下擴(kuò)增所述多個(gè)區(qū)域。
20.權(quán)利要求19 的方法，其中所述方法適合于多種樣品同時(shí)的高流通量篩選。
【文檔編號(hào)】C12P19/34GK103857800SQ201280034820
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月26日
【發(fā)明者】J·F·克拉克, G·派恩-蓋特曼, 黑澤裕子, K·張, W.張, M·凱迪達(dá)謝 申請(qǐng)人:辛辛那提大學(xué), 辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心技術(shù)商業(yè)化中心