增加植物產(chǎn)量和脅迫耐性的方法
【專利摘要】本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并且關(guān)于可用于增加轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量的各種多核苷酸、多肽以及方法。具體來說，轉(zhuǎn)基因植物可展現(xiàn)由以下各項(xiàng)組成的任何一種性狀：增加的產(chǎn)量、增加的非生物脅迫耐性、增加的細(xì)胞生長、以及增加的養(yǎng)分利用效率。
【專利說明】增加植物產(chǎn)量和脅迫耐性的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并且關(guān)于可以用來增加轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量的各種多核苷酸、多肽以及使用它們的方法。包含在此描述的任何一種多核苷酸或多肽的轉(zhuǎn)基因植物可展現(xiàn)由增加的產(chǎn)量、增加的非生物脅迫耐性、增加的細(xì)胞生長、增加的水分利用效率以及增加的養(yǎng)分利用效率組成的性狀中的任何一個。
[0002]發(fā)明背景
[0003]增長的世界人口以及可用于農(nóng)業(yè)的可用耕地的萎縮供應(yīng)刺激了對于增加農(nóng)業(yè)效率領(lǐng)域研究的需要。常規(guī)的作物和園藝改良手段利用選擇育種技術(shù)來鑒定具有所希望的特征的植物。然而，這樣的選擇育種技術(shù)具有若干缺點(diǎn)，即這些技術(shù)經(jīng)常是勞動密集的并且產(chǎn)生的植物經(jīng)常含有異源性遺傳組分，它們可能并不總是導(dǎo)致從親本植物傳遞的所希望的性狀。分子生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)允許人類改良動物以及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得需要分離和操作遺傳物質(zhì)(通常呈DNA或RNA形式)并且隨后將該遺傳物質(zhì)引入植物的基因組中。這種技術(shù)具有賦予作物或植物具有各種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝學(xué)性狀的能力。
[0004]發(fā)明概述
[0005]以下概述列出本發(fā)明主題的若干實(shí)施例，并且在許多情況下列出這些實(shí)施例的變化和排列。本概述對于眾多的并且不同的實(shí)施例只是示例性的。給出的實(shí)施例的一個或多個代表性特征的提及同樣是示例性的。這樣一個實(shí)施例典型地可以具有或者不具有提到的這個或這些特征的存在；同樣，可以將那些特征應(yīng)用于本發(fā)明的其他實(shí)施例，不論是否在該概述中列出。為了避免過度重復(fù)，本概述沒有列出或提出這些特征的所有可能的組合。
[0006]本發(fā)明提供了編碼海藻糖途徑的多肽的核苷酸序列，當(dāng)這些核苷酸序列轉(zhuǎn)基因表達(dá)于植物中時增加產(chǎn)量。在此描述的T6PP多肽包含改變海藻糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)蛋白的活性的修飾，其中與未修飾T6PP相比，該活性降低。修飾T6PP可包含在SEQ ID NO:9中例示的共有序列并且具有至少一個修飾氨基酸。修飾T6PP可具有在保守氨基酸(包括在共有序列SEQ ID NO:9中描述的保守氨基酸)中進(jìn)行的修飾。修飾T6PP可引起野生型T6PP的體外活化。對于T6PP的修飾可在CAP、磷酸酶、A-磷酸酶或B-磷酸酶結(jié)構(gòu)域中的至少一個之內(nèi)。具有減少的針對海藻糖-6-磷酸(T6P)的底物結(jié)合的T6PP在轉(zhuǎn)基因表達(dá)于植物中時展示增加的產(chǎn)量以及增加的脅迫耐性并且具有增加的對于脅迫(包括干旱)的耐性。表達(dá)修飾T6PP的植物包括單子葉植物或雙子葉植物的植物，包括選自下組的植物，該組由以下各項(xiàng)組成:玉蜀黍、甘蔗、大豆、水稻、高粱或小麥。T6PP多肽的修飾可包括氨基酸置換、氨基酸缺失或氨基酸添加之一或組合。修飾T6PP可以是磷酸酶的鹵代酸脫鹵酶(HAD)超家族的成員。T6PP的酶活性可降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。
[0007]所描述的T6PP多肽中的任何一個可用于產(chǎn)生多核苷酸。可將編碼修飾T6PP多肽的多核苷酸引入宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞可包括植物細(xì)胞。多核苷酸可包含于表達(dá)盒中，這些表達(dá)盒確保多核苷酸在植物中的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)盒可包含啟動子，它用于在植物繁殖組織中表達(dá)多核苷酸。另外，繁殖組織可選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:小穗組織、穗節(jié)、苞片組織、小穗分生組織、花序梗組織以及未成熟的花組織。表達(dá)T6PP多核苷酸的啟動子可包括OsMADS啟動子或OsMADS6啟動子。包含多核苷酸或多肽的提取物可從任何宿主細(xì)胞、植物、植物部分或植物組織中產(chǎn)生。
[0008]在此披露的方法進(jìn)一步將例如在此披露的多核苷酸引入植物中。包含在此披露的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物可展示增加的細(xì)胞生長、增加的植物和/或幼苗勢(vigor)、增加的產(chǎn)量、增加的種子重量、增加的水分利用效率和/或增加的生物質(zhì)。通過在此方法產(chǎn)生的植物預(yù)期具有增加的非生物脅迫耐性。在此描述的轉(zhuǎn)基因植物可在植物的生物質(zhì)產(chǎn)量和籽粒(grain)產(chǎn)量方面產(chǎn)生較高產(chǎn)量。本發(fā)明的一個方面提供了人們可以在任何給定T6PP基因序列上進(jìn)行的各種修飾，這些修飾可用于轉(zhuǎn)基因植物中以便賦予增加的產(chǎn)量。可替代地，多種其他方法可用于增加T6P水平以便在植物中賦予增加的產(chǎn)量以及脅迫耐性。
[0009]用于增加產(chǎn)量、增加植物對于非生物脅迫的耐性或減少植物不結(jié)果實(shí)、增加水分虧缺條件下的每株植物穗數(shù)和/或每株植物的粒(kernel)數(shù)的方法可包括將包含修飾T6PP的表達(dá)盒引入植物細(xì)胞，并且然后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。植物可以是單子葉植物，例如可以是玉蜀黍、水稻、小麥、高粱、甘蔗或草坪草植物。可以是雙子葉植物，如大豆。對于增加植物對于非生物脅迫的耐性的方法，脅迫可選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:水分脅迫、熱脅迫或冷脅迫。水分脅迫可由干旱引起。
[0010]另外，包括通過以下步驟改變植物中的海藻糖-6-磷酸水平的方法:鑒定海藻糖途徑中的多肽；修飾多肽以便具有改變的酶活性；將包含編碼修飾多肽的多核苷酸的表達(dá)盒引入植物；并且產(chǎn)生具有改變水平的海藻糖-6-磷酸的植物。多肽可具有選自下組的活性，該組由以下各項(xiàng)組成:海藻糖-6-磷酸 合成酶；海藻糖-6-磷酸磷酸酶以及海藻糖酶。改變水平的海藻糖-6-磷酸可導(dǎo)致在植物穗節(jié)組織的干旱脅迫期間磷酸戊糖支路途徑中的基因表達(dá)的增加。另外或替代地，改變水平的海藻糖-6-磷酸可導(dǎo)致植物穗節(jié)組織中的碳酸酐酶水平增加。修飾多肽可表達(dá)于植物繁殖組織中，包括小穗組織、穗節(jié)、苞片組織、小穗分生組織、花序梗組織以及未成熟的花組織。修飾多肽(修飾海藻糖途徑酶)可具有降低的酶活性且/或引起野生型海藻糖-6-磷酸磷酸酶的體外活化。
[0011]根據(jù)以下描述，本發(fā)明的這些和其他特征、目的以及優(yōu)點(diǎn)將變得更好理解。在說明書中，參考所附的序列，這些序列形成本文的一部分并且通過說明而非限制性地展示了本發(fā)明的實(shí)施例。優(yōu)選實(shí)施例的描述并不旨在限制本發(fā)明，從而涵蓋所有修飾、等效物以及替代方案。因此，為了解釋本發(fā)明范圍，應(yīng)當(dāng)參考在此敘述的實(shí)施例。
[0012]在序列表中的序列的簡要說明
[0013]nt=核苷酸序列
[0014]Pt=蛋白質(zhì)序列
[0015]SEQ ID NO:1 海藻糖 _6_ 磷酸磷酸酶(nt)，0sT6PP-ffT
[0016]SEQ ID勵:2海藻糖-6-磷酸磷酸酶(？丨)，08了6---訂
[0017]SEQ ID NO:3 海藻糖 _6_ 磷酸磷酸酶-單一修飾(nt)，0sT6PP_H244D
[0018]SEQ ID NO:4 海藻糖-6-磷酸磷酸酶-單一修飾(pt)，0sT6PP_H244D
[0019]SEQ ID NO:5 海藻糖 _6_ 磷酸磷酸酶-雙重修飾 a (nt), 0sT6PP_I129F
[0020]SEQ ID NO:6 海藻糖-6-磷酸磷酸酶-雙重修飾 a (pt)，0sT6PP_I129F
[0021]SEQ ID NO:7海藻糖-6-磷酸磷酸酶-三重修飾b (nt)
[0022]SEQ ID NO:8海藻糖_6_磷酸磷酸酶-三重修飾b (pt)[0023]SEQ ID NO:9海藻糖_6_磷酸磷酸酶共有序列
[0024]SEQ ID NO: 10海藻糖_6_磷酸磷酸酶的磷酸酶結(jié)構(gòu)域
[0025]SEQ ID NO:11海藻糖_6_磷酸磷酸酶A-磷酸酶盒
[0026]SEQ ID NO: 12海藻糖_6_磷酸磷酸酶B-磷酸酶盒
[0027]SEQ ID NO: 130sMADS6 啟動子
[0028]SEQ ID NO: 14 海藻糖 _6_ 憐酸憐酸酶擬南芥(Arabidopsis thaliana) 19925
[0029]SEQ ID NO:15海藻糖_6_磷酸磷酸酶擬南芥19926
[0030]SEQ ID NO: 16 海藻糖 _6_ 憐酸憐酸酶水稻(Oryza sativa) 19924 [0031]SEQ ID NO:17海藻糖_6_磷酸磷酸酶如嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum) (Q9HIW7)
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1A 至 IC 顯示了來自擬南芥(19925 ;SEQ ID NO:14)、擬南芥(19926 ;SEQ ID NO:15)、水稻(19924 ;SEQ ID NO: 16)、水稻(15777 ;野生型 0sT6PP_WT ;SEQ ID NO:2)以及嗜酸熱原體(Q9HIW7 ;SEQ ID NO:17)的T6PP序列的初始比對。使用ClustalW方法來將這些序列與載體NTI進(jìn)行比對。
[0033]圖2顯示了源自多個T6PP蛋白的比對的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0034]圖3顯示了海藻糖途徑的描述。海藻糖途徑由兩種生物合成酶海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)、以及在降解中涉及的一種水解酶海藻糖酶組成。
[0035]圖4顯示了具有另外的下游產(chǎn)物的海藻糖途徑。UDPG經(jīng)由蔗糖合成酶直接產(chǎn)生；G6P由葡萄糖經(jīng)由轉(zhuǎn)化酶和己糖激酶產(chǎn)生，或經(jīng)由果糖和果糖6-磷酸(F6P)通過蔗糖合成酶、果糖激酶以及磷酸葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生。m)PG和G6P也是許多細(xì)胞功能可最終從其衍生的兩個中心活化前體。UDPG是主要細(xì)胞壁多糖和糖脂的前體。G6P是淀粉合成的前體、通過磷酸戊糖途徑的氧化部分得到NADPH，并且通過糖酵解、檸檬酸循環(huán)以及氧化磷酸化得到ATP。另外，G6P可轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸并且連同UDPG—起用于合成蔗糖-6-磷酸以及還有蔗糖。從M)PG和G6P制得的T6P駐留于植物中的主要碳通量的交叉中心(crossroad)。
[0036]圖5描述了 T6P結(jié)合至SnRKl的效應(yīng)。SnRKl是一種異源三聚體蛋白，并且是動物AMP激活的蛋白激酶以及酵母蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶(SnFl)的植物同源物。
[0037]圖6顯示了 SnRKl參與植物中的多個代謝途徑。
[0038]圖7顯示了水稻T6PP同源模型的帶圖。該酶含有兩個結(jié)構(gòu)域:α / β -水解酶結(jié)構(gòu)域和較小的“蓋子結(jié)構(gòu)域”?；钚圆课晃挥讦?β-水解酶結(jié)構(gòu)域頂部(小點(diǎn));底物結(jié)合裂隙處于兩個結(jié)構(gòu)域之間的界面中。這兩個結(jié)構(gòu)域通過柔性接頭來連接，從而允許蓋子結(jié)構(gòu)域在催化過程中打開和閉合。因?yàn)橥葱越５哪０寮?xì)菌Τ6ΡΡ相關(guān)蛋白(PDB代碼1U02)是具有空活性部位的脫輔基酶，蓋子結(jié)構(gòu)域和水解酶結(jié)構(gòu)域的相對定向在實(shí)際酶-底物復(fù)合物中可能稍微不同。
[0039]圖8顯示了 Τ6Ρ的6-磷酸基團(tuán)的布局。6_磷酸基團(tuán)的氧原子之一位于Mg2+配位層中的平伏位置。在催化過程中接受磷酸基團(tuán)以便形成共價(jià)中間物的Aspl21采取軸向位置。Lys289直接氫鍵鍵合至磷酸基團(tuán)并且HislSl處于緊鄰位置。兩個殘基理想地定位以便使催化過程中在磷酸部分上產(chǎn)生的負(fù)電荷穩(wěn)定。
[0040]圖9顯示了 T6P底物中的可旋轉(zhuǎn)鍵。雖然最接近于6-磷酸基團(tuán)的吡喃糖環(huán)的位置和定向充分地由所錨定的磷酸基團(tuán)來確定，由于存在兩個可旋轉(zhuǎn)糖苷鍵(箭頭)，在第一個環(huán)與第二個環(huán)之間存在相當(dāng)大的靈活性。第二個環(huán)的一系列可能位置通過旋轉(zhuǎn)這兩個鍵來獲得。其中第二個環(huán)與蛋白質(zhì)沖突的構(gòu)象被放棄。
[0041]圖10顯示了 T6PP (SEQ ID NO:9)的共有序列。粗體和加下劃線的殘基標(biāo)識高度保守區(qū)。共有序列中的“X”記號的位置指示變異區(qū)，其中任何其他單字母是指在本領(lǐng)域中通常使用的常見單字母氨基酸符號。加下劃線的氨基酸殘基所指示的區(qū)域可經(jīng)過修飾來構(gòu)建賦予轉(zhuǎn)基因植物中的增加的產(chǎn)量和/或增加的脅迫抗性的T6PP多肽。由DYDGTLSPIV所標(biāo)識的殘基編碼B-磷酸酶盒。
[0042]圖1lA 至 IlC 顯示了擬南芥(19925 ;SEQ ID NO: 14)、擬南芥(19926 ;SEQ ID NO:15)、水稻(19924 ;SEQ ID NO: 16)以及水稻(15777 ;野生型 0sT6PP_WT ;SEQ ID NO:2)的T6PP序列與來自嗜酸熱原體(Q9HIW7 ；SEQ ID NO:7)的T6PP相關(guān)蛋白的最終比對。
[0043]詳細(xì)說明
[0044]除非另外說明，本發(fā)明的實(shí)踐使用本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)的植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、植物數(shù)量遺傳學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)以及重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分解釋。參見例如Langenheim&Thimann (1982)植物學(xué):植物生物學(xué)及其與人類事務(wù)的關(guān)系(Botany:Plant Biology and Its Relationto Human Affairs), John Wiley ;細(xì)胞培養(yǎng)以及植物的體細(xì)胞遺傳學(xué)(Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants),第 I 卷，Vasil 編著(1984);Stanier 等人(1986)微生物界(The Microbial Wo rld),第 5 版，Prentice-Hall ;Dhringra&Sinclair (1985)基本植物病理學(xué)方法(Basic Plant Pathology Methods), CRC 出版社；Maniatis 等人(1982)分子克隆:實(shí)驗(yàn)指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual) ;DNA 克隆(DNA Cloning),第I 卷以及第 II 卷，Glover 編著(1985);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis), Gait編著(1984);核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization), Hames&Higgins 編著(1984)；以及叢書酶學(xué)方法(Methods in Enzymology), Colowick&Kaplan 編著,學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress, Inc.),圣地亞哥(San Diego),加利福尼亞州(Calif)。
[0045]單位、前綴以及符號可以其SI公認(rèn)的形式來表示。除非另外說明，分別以5'至3'的方向從左至右來書寫核酸；以氨基至羧基的方向從左至右來書寫氨基酸序列。數(shù)字范圍包括界定范圍的數(shù)字。氨基酸可在此由其通常已知的三字母符號或由IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號來提及。同樣地，核苷酸可由其普遍接受的單字母代碼來提及。以下定義的術(shù)語總體上參照說明書而更完整地定義。
[0046]除非另外定義，在此所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與屬于本發(fā)明的領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。
[0047]應(yīng)當(dāng)了解的是，本發(fā)明不局限于如此描述的具體方法、實(shí)驗(yàn)方案、細(xì)胞系、植物種類或?qū)兕悺?gòu)建體以及試劑。還應(yīng)當(dāng)理解的是在此使用的術(shù)語是為了描述具體實(shí)施例的目的，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。
[0048]如在此使用的，單數(shù)形式“一個(種)”以及“該”包括多個指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。因此，例如，提及“載體”是提及一個或多個載體并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物。
[0049]術(shù)語“約”在此用于表示近似、大致、約或在……左右。當(dāng)術(shù)語“約”結(jié)合數(shù)值范圍來使用時，它通過將邊界延伸至高于以及低于所闡明的數(shù)值來限定這個范圍。通常，術(shù)語“約”在此用于將數(shù)值限定至以20%的變化高于以及低于規(guī)定值。
[0050]如在此使用的，詞語“或”意指具體清單的任何一個成員并且還包括這個清單上的成員的任何組合。
[0051]術(shù)語“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、"包括(includes)”、“包括(including)”^具有(having)”以及其詞形變化意指“包括但不局限于”。術(shù)語“由……組成”意指“包括并且局限于”。
[0052]術(shù)語“主要由……組成”意指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括另外的成分、步驟和/或部分，但條件是這些另外的成分、步驟和/或部分不實(shí)質(zhì)性地改變所要求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本特征和新穎特征。
[0053]每當(dāng)在此指示數(shù)值范圍時,意味著包括所指示范圍內(nèi)的任何引用數(shù)字(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語第一指示數(shù)字與第二指示數(shù)字“之間的變動范圍/范圍”以及第一指示數(shù)字“至”第二指示數(shù)字的“變動范圍/范圍”在此可互換地使用并且意味著包括第一和第二指示數(shù)字以及其間的所有分?jǐn)?shù)以及整數(shù)。如在此使用的，術(shù)語“方法”是指用于完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)以及程序，包括但不局限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者已知的或容易由已知方式、手段、技術(shù)以及程序來開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)以及程序。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，為了清楚起見，在單獨(dú)實(shí)施例的情況下描述的本發(fā)明的某些特征也可以組合地提供在單個實(shí)施例中。相反地，為簡便起見，在單個實(shí)施例的情況下描述的本發(fā)明的各種特征也可單獨(dú)地或以任何適合的子組合或在適當(dāng)情況下提供于本發(fā)明的任何其他描述實(shí)施例中。在各種實(shí)施例的情況下描述的某些特征不認(rèn)為是那些實(shí)施例的必需特征，除非實(shí)施例在沒有那些要素的情況下是無效的。
[0054]“微生物(microbe)”是指任何微生物(microorganism)(包括真核和原核微生物)，如真菌、酵母、細(xì)菌、放線菌類、海藻類以及原生動物，以及其他單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
[0055]“擴(kuò)增”是指使用至少一個核酸序列作為模板來構(gòu)建核酸序列的多個拷貝或與核酸序列互補(bǔ)的多個拷貝。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA，Cangene公司，密西索加(Mississauga)，安大略省(Ontario))、Q-0復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)以及鏈置換擴(kuò)增(SDA)。參見例如診斷分子微生物學(xué):原理與應(yīng)用(Diagnostic Molecular Microbiology !Principlesand Applications), Persing 等人編著，美國微生物學(xué)會(American Society forMicrobiology),華盛頓哥倫比亞特區(qū)(Washington, D.C.) (1993)。擴(kuò)增產(chǎn)物被稱為擴(kuò)增子。
[0056]術(shù)語“保守修飾變異體”適用于氨基酸和核酸序列兩者。關(guān)于具體核酸序列，保守修飾變異體是指編碼相同氨基酸序列或氨基酸序列的保守修飾變異體的那些核酸。由于遺傳密碼的簡并性，很多功能相同核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG以及G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由一個密碼子來指定的每個位置處，該密碼子可改變成所描述的任何相應(yīng)密碼子而不改變所編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默變異”并且代表一種保守修飾變異。在此編碼多肽的每個核酸序列也描述該核酸的每個可能沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識到核酸中的每個密碼子(除了 AUG以外，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；一個例外是紅色微球菌(Micrococcus rubens),對于它來說，GTG是甲硫氨酸密碼子(Ishizuka等人(1993)普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.) 139:425-32)可加以修飾以便產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的每個沉默變異隱含于每個所描述的多肽序列中并且通過引用結(jié)合在此。
[0057]如在此使用的“對照植物”或“對照”可以是用于產(chǎn)生在此的轉(zhuǎn)基因植物的親本品系的非轉(zhuǎn)基因植物。在一些情況下，對照植物可以是轉(zhuǎn)基因植物品系，它包含空載體或標(biāo)記基因，但是不含有在所評估的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的本發(fā)明的重組多核苷酸。在其他情況下，對照植物是通過組成性啟動子來表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因植物。一般來說，對照植物是與所測試的轉(zhuǎn)基因植物相同品系或品種的植物，它沒有表征轉(zhuǎn)基因植物的賦予特定性狀的重組DNA。沒有這個賦予特定性狀的重組DNA的這種祖代植物可以是天然的野生型植物、原種的(elite)非轉(zhuǎn)基因植物、或沒有表征轉(zhuǎn)基因植物的賦予特定性狀的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物。沒有特定的賦予性狀的重組DNA的祖代植物可以是具有特定的賦予性狀的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物的姊妹種(sibling)。這種祖代姊妹種植物可包括其他重組DNA。
[0058]關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到當(dāng)改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)相似氨基酸來置換時，改變、添加或缺失所編碼序列中的單一氨基酸或較小比例氨基酸的對于核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的個別置換、缺失或添加是“保守修飾變異體”。因此，選自由從I至15組成的整數(shù)組的任何數(shù)目的氨基酸殘基可以這種方式來改變。因此，例如，可進(jìn)行1、2、
3、4、5、7或10個改變。保守修飾變異體通常提供與其所來源的未修飾多肽序列相似的生物活性。例如，底物特異性、酶活 性或配體/受體結(jié)合通常為天然蛋白質(zhì)對于其天然底物的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，優(yōu)選地60%_90%。提供功能上相似的氨基酸的保守性置換表在本領(lǐng)域中是所熟知的。
[0059]以下六個組各自含有彼此為保守置換的氨基酸:
[0060]I)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；
[0061]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0062]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0063]4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
[0064]5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)以及
[0065]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0066]7)還參見克瑞頓(Creighton),蛋白質(zhì)(Proteins), W.H.弗里曼出版公司(W.H.Freeman and C0.) (1984)。
[0067]如在此使用術(shù)語“修飾(modified)”或“修飾(modification)”可互換地指代改變、添加或缺失給定多肽內(nèi)的至少一個氨基酸殘基的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的有意或隨機(jī)置換、缺失或添加。如在此使用的“修飾T6PP”是指編碼T6PP或具有T6PP活性的肽、多肽或蛋白質(zhì)的任何核酸，其任何一個已經(jīng)被修飾使得所得T6PP賦予改變的T6PP活性和/或改變的與T6P的結(jié)合，從而導(dǎo)致當(dāng)與未修飾T6PP相比時，植物中的產(chǎn)量和/或非生物脅迫耐性得以改進(jìn)。
[0068]如在此使用“同源位置”是指多肽中的一個或多個氨基酸的位置或多核苷酸序列中的一個或多個堿基對的位置，這些氨基酸或堿基對處于作為原始序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的第二種多肽或多核苷酸中的類似或等同位置中。這些氨基酸的位置可處于兩種蛋白質(zhì)的相同功能區(qū)中，但是可能并非處于兩種多肽序列之間的氨基酸的精確數(shù)字位置處。兩種蛋白質(zhì)上的氨基酸的同源位置可通過本領(lǐng)域中熟知的多種方法來確定，這些方法包括例如序列比對(例如BLAST)、三維蛋白質(zhì)建模(參見例如Sander C.以及Scheider R.(1991)蛋白質(zhì):結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)(PROTEINS: Structure, Function andGenetics) 9:56-68)等等。
[0069]關(guān)于指定核酸的“編碼(encoding)”或“編碼(encoded)”是指包含用于翻譯成指定蛋白質(zhì)的信息。一種編碼蛋白質(zhì)的核酸在該核酸的翻譯區(qū)之內(nèi)可以包括非翻譯序列(例如內(nèi)含子)或可以缺乏此類插入的非翻譯序列(例如在cDNA中)。用來編碼一種蛋白質(zhì)的信息通過使用密碼子而詳細(xì)說明。典型地，通過核酸使用“通用”遺傳密碼來編碼氨基酸序列。然而，可使用通用密碼的變異體，如存在于一些植物、動物以及真菌線粒體、細(xì)菌山羊支原體(Mycoplasma capricolum) (Yamao 等人(1985)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 82:2306-9)或纖毛蟲大核(ciliate Macronucleus)中的通用密碼，此時核酸是使用這些生物來表達(dá)的。
[0070]當(dāng)核酸以合成方式來制備或改變時，可利用核酸將要表達(dá)于其中的預(yù)定宿主的已知密碼子偏好。例如，雖然本發(fā)明的核酸序列在單子葉和雙子葉植物種類中都可表達(dá)，但是可對序列進(jìn)行修飾以便考慮單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好以及GC含量偏好，因?yàn)檫@些偏好已被證明是不同的(Murray等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)17:477-98并且通過引用結(jié)合在此)。因此，具體氨基酸的玉蜀黍偏好密碼子可能由來自玉蜀黍中的已知基因序列推導(dǎo)出。關(guān)于來自玉蜀黍植物的28種基因的玉蜀黍密碼子使用在上述Murray等人的表4 中列出。
[0071]如在此使用的，提及一種核酸的“異源的”意為源自一種外來物種的核酸，或者如果源自相同物種，則是通過有意的人為干預(yù)實(shí)質(zhì)上從其天然形式在構(gòu)成和/或基因座方面進(jìn)行了修飾的核酸。例如，可操作地連接至異源結(jié)構(gòu)基因的啟動子是來自與結(jié)構(gòu)基因衍生至其中的物種不同的物種，或者如果來自相同物種，則一者或兩者實(shí)質(zhì)上是從它們的原始形式修飾的。異源蛋白可源自外來物種，或者如果來自相同物種，則是通過有意的人為干預(yù)實(shí)質(zhì)上從其原始形式修飾的。
[0072]“宿主細(xì)胞”是指包含本發(fā)明的異源核酸序列的細(xì)胞，它含有載體并且支持表達(dá)載體的復(fù)制和/或表達(dá)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是單子葉或雙子葉植物細(xì)胞，包括但不局限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大S.、小麥、苜猜、水稻、棉花、卡諾拉油菜(canola)、大麥、粟(millet)以及番茄。尤其優(yōu)選的單子葉植物宿主細(xì)胞是玉蜀黍宿主細(xì)胞。
[0073]術(shù)語“雜交復(fù)合物”包括指通過兩條彼此選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。
[0074]在將核酸插入細(xì)胞中的情形下的術(shù)語“引入”是通過任何手段，如“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”并且包括指將核酸結(jié)合到真核或原核細(xì)胞中，其中核酸可結(jié)合到細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成作為微型染色體的一部分的或被瞬時表達(dá)的自主復(fù)制子(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0075]如在此使用的，“基因疊加”是指將兩個或更多個基因引入一種生物的基因組中。在本發(fā)明的某些方面，可能令人希望的是將任何非生物脅迫基因(例如冷休克蛋白質(zhì)、與ABA反應(yīng)相關(guān)的基因)與如在此描述的T6PP疊加。同樣地，還可能令人希望的是將如在此描述的海藻糖途徑的基因與賦予抗昆蟲性、抗病性、增加產(chǎn)量或在本領(lǐng)域中已知的任何其他有利性狀(例如增加植物高度等)的基因疊加。或者，可以將包含修飾海藻糖途徑基因的轉(zhuǎn)基因植物與賦予另外的性狀，如改進(jìn)的水分利用、增加抗病性等等的天然性狀等位基因疊加。在一個實(shí)施例中，表達(dá)修飾海藻糖途徑基因的植物與W02011/079277中描述的等位基因疊加?？赏ㄟ^引入具有多個基因的表達(dá)盒或?qū)⒕哂幸粋€或多個性狀的植物與含有一個或多個另外的性狀的其他植物一起育種/雜交而將性狀疊加。
[0076]術(shù)語“分離的”是指如核酸或蛋白質(zhì)的物質(zhì)，它實(shí)質(zhì)上或基本上不具有如在其天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與其伴隨或與其相互作用的組分。分離的物質(zhì)任選地包含在其自然環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)與其一起的物質(zhì)。在此定義的“分離的”核酸也稱為“異源”核酸。除非另外說明，術(shù)語“NUE核酸”是指包含編碼全長或部分長度NUE多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
[0077]如在此使用的，“核酸”包括指處于單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物:其以與天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式雜交至單鏈核酸。
[0078]“核酸文庫”是指分離DNA或RNA分子的集合，在一種情況下，這些分子包括指定生物的基因組的整個轉(zhuǎn)錄部分的實(shí)質(zhì)性表示。示例性的核酸文庫如基因組文庫以及cDNA文庫的構(gòu)建在標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)參考文獻(xiàn)中傳授，如Berger以及Kimmel (1987)分子克隆技術(shù)指南(Guide To Molecular Cloning Techniques),來自叢書酶學(xué)方法(Methods inEnzymology),第152卷,學(xué)術(shù)出版社,圣地亞哥,加利福尼亞州；Sambrook等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第 2 版,第 1-3 卷；以及現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology), Ausubel 等人編著的現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols),Greene Publishing Associates, Inc.與約翰威利父子出版公司(John ffiley&Sons, Inc.)的合資公司(1994增刊)。在另一個實(shí)例中，在此定義的“核酸文庫”還可理解為代表包含指定生物的規(guī)定部分或者實(shí)際上是不實(shí)質(zhì)上代表指定生物的整個基因組的文庫。例如，`小RNA、mRNA以及甲基化DNA。如在此定義的核酸文庫還可能涵蓋具體分子的變異體(例如，具體蛋白質(zhì)的變異體的集合)。
[0079]如在此使用“可操作地連接”包括指第一序列如啟動子與第二序列之間的功能連接，其中該啟動子序列起始并且介導(dǎo)對應(yīng)于該第二序列的DNA的轉(zhuǎn)錄。一般來說，可操作地連接是指所連接的核酸序列是連續(xù)的，并且當(dāng)需要接合兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，是連續(xù)的并且處于同一閱讀框中。
[0080]如在此使用的，術(shù)語“植物”包括指整株植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子以及植物細(xì)胞和其子代。如在此使用的植物細(xì)胞包括但不局限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉以及小孢子中的細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明方法中的植物類別通常與適合于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物類別一樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物，包括來自以下屬類的種:南瓜屬(Cucurbita)、玫瑰屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、胡桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜猜屬(Medicago)、驢食草屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、豆工豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鶴草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓笞屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(SinapiS)、顛爺屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番爺屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、碧冬爺屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬約拉納屬(Majorana)、菊苣屬(Ciahorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、萱草屬(Heterocallis)、致命魚風(fēng)屬(Nemesis)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍?qū)?Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛莨屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、蛾蝶花屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、布洛華麗屬(Browaalia)、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale )、蔥屬(Al I ium)以及小麥屬(Triticum)。尤其優(yōu)選的植物是玉蜀黍(Zea mays)。
[0081]如在此使用的，“產(chǎn)量”可包括指在收獲時每英畝谷類作物的蒲式耳數(shù)(針對籽粒水分進(jìn)行了調(diào)整，例如玉蜀黍的水分通常為15%)，以及所產(chǎn)生的生物質(zhì)的體積(對于飼料作物如苜蓿以及多種作物的植物根大小)。籽粒中的籽粒水分在收獲時進(jìn)行測量。調(diào)整后的籽粒容重確定為以磅/蒲式耳為單位的重量(對收獲時籽粒水分的水平進(jìn)行了調(diào)整)。生物質(zhì)測量為所產(chǎn)生的可收獲的植物材料的重量。產(chǎn)量可受到許多特性影響，包括不局限于植物高度、莢果數(shù)目、莢果在植物上的位置、節(jié)間數(shù)目、莢果破碎的發(fā)生率、籽粒大小、結(jié)瘤以及固氮的效率、養(yǎng)分同化的效率、碳同化、植物結(jié)構(gòu)、種子發(fā)芽百分比、幼苗勢以及幼年性狀。產(chǎn)量還可受以下因素影響:發(fā)芽效率(包括在脅迫條件下的發(fā)芽)、生長速率(包括在脅迫條件下的生長速率)、穗數(shù)目、每個穗的種子數(shù)目、種子大小、種子的組成(淀粉、油、蛋白質(zhì))以及種子充填的特征。植物產(chǎn)量可用許多方法測量，包括容重、每株植物的種子數(shù)目、種子重量、每單位面積的種子數(shù)目( 即每英畝的種子，或種子重量)、蒲式耳/英畝、噸/英畝或公斤/公頃。例如，玉米產(chǎn)量可測量為每單位生產(chǎn)面積的去殼玉米粒的產(chǎn)量，例如以蒲式耳/英畝或公噸/公頃為單位，經(jīng)?；谒终{(diào)整來報(bào)告，例如15.5%的水分。此外，玉米蒲式耳在愛荷華州由法律定義為按重量計(jì)56磅，玉米產(chǎn)量的一個有用換算系數(shù)是:100蒲式耳/英畝等于6.272公噸/公頃。產(chǎn)量的其他測量在本領(lǐng)域中是普遍的。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，產(chǎn)量可在脅迫和/或非脅迫條件下增加。
[0082]如在此使用的，“多核苷酸”包括指具有天然核苷酸的必要性質(zhì)的脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，它們具有該必要性質(zhì)是因?yàn)樗鼈冊趪?yán)格雜交條件下雜交至與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列實(shí)質(zhì)上相同的核苷酸序列，且/或允許翻譯成與天然存在的核苷酸所翻譯成的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因的全長序列或子序列。除非另外指示，否則該術(shù)語包括指指定的序列以及其互補(bǔ)序列。因此，出于穩(wěn)定性或其他原因而對主鏈進(jìn)行了修飾的DNA或RNA是如該術(shù)語在此所意指的“多核苷酸”。此外，僅舉兩個例子，包含稀有堿基(如肌苷)或修飾堿基(如三苯甲基化的堿基)的DNA或RNA是如該術(shù)語在此使用的多核苷酸。應(yīng)認(rèn)識到，已對DNA和RNA進(jìn)行了很多種修飾，這些修飾起到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的。如在此使用的術(shù)語多核苷酸涵蓋多核苷酸的這些化學(xué)修飾、酶修飾或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞(尤其包括簡單細(xì)胞以及復(fù)雜細(xì)胞)所特有的DNA和RNA的化學(xué)形式。[0083]術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白質(zhì)”在此可互換使用，以指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0084]如在此使用的，“啟動子”包括指DNA的在轉(zhuǎn)錄開始的上游并涉及RNA聚合酶以及其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域?！爸参飭幼印笔悄軌蚱鹗贾参锛?xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。示例性植物啟動子包括但不局限于從植物、植物病毒以及包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的細(xì)菌(如農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或根瘤菌屬(Rhizobium))獲得的那些啟動子。實(shí)例是優(yōu)先起始某些組織如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這些啟動子被稱為“組織優(yōu)選的”?！凹?xì)胞類型”特異性啟動子主要驅(qū)動在一個或多個器官中的某些細(xì)胞類型(例如，根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)。“可誘導(dǎo)”或“可調(diào)節(jié)”啟動子是處于環(huán)境控制下的啟動子?？捎绊懹烧T導(dǎo)型啟動子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件實(shí)例包括厭氧條件或光的存在。另一種類型啟動子是發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子，例如，在花粉發(fā)育期間驅(qū)動表達(dá)的啟動子。組織優(yōu)選啟動子、細(xì)胞類型特異性啟動子、發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子以及誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成“非組成性”啟動子類別?！敖M成性”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下在大多數(shù)細(xì)胞中起作用的啟動子。
[0085]任何合適啟動子序列可由本發(fā)明的核酸構(gòu)建體使用。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，啟動子是組成性啟動子、組織特異性啟動子或非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動子。
[0086]適合的組成性啟動子包括例如CaMV35S啟動子(SEQ ID NO:1546 ；0dell等人，自然(Nature) 313:810-812，1985);擬南芥 At6669 啟動子(SEQ ID NO:1652 ;參見 PCT 公布號 W004081173A2);玉蜀黍 Ubil (Christensen 等人,植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)18:675-689,1992);水稻肌動蛋白(McElroy 等人，植物細(xì)胞(Plant Cell) 2:163-171，1990) ；pEMU (Last 等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.) 81:581-588，1991)；CaMV19S (Nilsson 等人，植物生理學(xué)(Physiol.Plant)100:456-462，1997)；G0S2 (de Pater等人，植物雜志(Plant J) 11月；2 (6):837-44,1992);泛素(Christensen等人，植物分子生物學(xué)18:675-689,1992);水稻親環(huán)蛋白(Bucholz等人，植物分子生物學(xué)25(5):837-43,1994);玉蜀黍H3組蛋白(Lepetit等人，分子基因組學(xué)和遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)231:276-285，1992);肌纖蛋白 2(An 等人，植物雜志 10(1) ;107_121，1996)、組成性根尖 CT2啟動子(SEQ ID NO:1535 ;還參見 PCT 申請?zhí)?IL/2005/000627)以及 Synthetic Super MAS(Ni等人，植物雜志(The Plant Journal) 7:661-76，1995)。其他組成性啟動子包括美國專利號 5，659，026,5, 608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680、5，268，463、以及 5，608，142 中的那些。
[0087]適合的組織特異性啟動子包括但不局限于葉子特異性啟動子[如描述于例如Yamamoto 等人，植物雜志 12:255-265，1997 ；Kwon 等人，植物生理學(xué) 105:357-67，1994 ；Yamamoto 等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.) 35:773-778,1994 ；Gotor 等人，植物雜志3:509-18,1993 ；Orozco等人，植物分子生物學(xué)23:1129-1138，1993 ;以及Matsuoka等人，美國國家科學(xué)院院刊90:9586-9590，1993]、種子優(yōu)選啟動子[例如來自種子特異性基因(Simon等人，植物分子生物學(xué)5.191，1985 ；Scofield等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262:12202，1987 ；Baszczynski 等人，植物分子生物學(xué) 14:633，1990)、巴西堅(jiān)果白蛋白(Pearson’等人，植物分子生物學(xué)18:235-245，1992)、豆球蛋白(Ellis等人，植物分子生物學(xué)10:203-214，1988)、谷蛋白(水稻)(Takaiwa等人，分子基因組學(xué)和遺傳學(xué) 208:15-22，1986 ；Takaiwa 等人，歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(bào)(FEBS Letts.) 221:43-47，1987)、玉米蛋白(Matzke 等人，植物分子生物學(xué),143:323-321990)、napA (Stalberg等人，植物(Planta) 199:515-519,1996)、小麥 SPA (Albanietal,植物細(xì)胞(PlantCell), 9:171-184,1997)、向日葵油體蛋白(oleosin) (Cummins等人，植物分子生物學(xué)19:873-876，1992)]、胚乳特異性啟動子[例如小麥LMW以及HMW、麥谷蛋白_1(分子基因組學(xué)和遺傳學(xué) 216:81-90，1989 ;NAR17:461_2)、小麥 a、b 以及 g麥醇溶蛋白(EMB03:1409-15，1984)、大麥Itrl啟動子、大麥B1、C、D大麥醇溶蛋白(理論與應(yīng)用遺傳學(xué)98:1253-62，1999 ；植物雜志4: 343-55，1993 ;分子基因組學(xué)和遺傳學(xué)250:750-60，1996)、大麥D0F(Mena等人，植物雜志，116(1):53-62，1998)、Biz2 (EP99106056.7)、合成啟動子(Vicente-Carbajosa等人，植物雜志13:629-640，1998)、水稻谷醇溶蛋白NRP33、水稻-球蛋白Glb-1 (Wu等人，植物細(xì)胞生理學(xué)39(8)885-889，1998)、水稻α -球蛋白REB/0HP_1(Nakase等人，植物分子生物學(xué) 33:513-S22, 1997)、水稻 ADP-葡萄糖 PPCTrans Res6:157-68，1997)、玉蜀黍 ESR 基因家族(植物雜志12:235-46，1997)、高粱、-高粱醇溶蛋白(植物分子生物學(xué)32:1029-35，1996)]、胚特異性啟動子[例如水稻OSHKSato等人，美國國家科學(xué)院院刊93:8117-8122)、KN0X(Postma-Haarsma等人,植物分子生物學(xué)39:257-71,1999)、水稻油體蛋白(Wu等人,生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)，123:386,1998)]、以及花特異性啟動子[例如AtPRP4，查爾酮合成酶(chalene synthase ；chsA) (Van der Meer 等人,植物分子生物學(xué) 15,95-109,1990)、LAT52 (Twell等人，分子基因組學(xué)和遺傳學(xué)217:240-245 ;1989)、apetala-3 ;植物繁殖組織[例如OsMADS啟動子(美國專利申請2007/0006344)]。
[0088]適合的非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動子包括但不局限于鹽誘導(dǎo)型啟動子如RD29A(Yamaguch1-Shinozalei等人，分子基因組學(xué)和遺傳學(xué)236:331-340,1993);干旱誘導(dǎo)型啟動子如玉蜀黍rabl7基因啟動子(Pla等人，植物分子生物學(xué)21:259-266，1993)、玉蜀黍rab28基因啟動子(Busk等人，植物雜志11:1285-1295，1997)以及玉蜀黍Ivr2基因啟動子(Pelleschi等人，植物分子生物學(xué)39:373-380，1999);熱誘導(dǎo)型啟動子如來自番茄的熱番茄hsp80啟動子(美國專利號5，187，267)。
[0089]術(shù)語“酶活性”意欲包括脫甲基化、羥基化、環(huán)氧化、N-氧化、硫氧化(sulfooxidation)、N-、S-以及O-脫烷基化、脫硫化、脫氨基化、以及偶氮基、硝基和N-氧化物基團(tuán)的還原。術(shù)語“核酸”是指呈單鏈或雙鏈形式，或有義或反義的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋以與天然存在的核苷酸類似的方式雜交至核酸的天然核苷酸的已知類似物。除非另外指示，否則具體核酸序列包括其互補(bǔ)序列。
[0090]“結(jié)構(gòu)基因”是基因的一部分，它包含編碼蛋白質(zhì)、多肽或其一部分的DNA區(qū)段，并且不包括驅(qū)動轉(zhuǎn)錄起始的5'序列。結(jié)構(gòu)基因可替代地編碼不可翻譯的產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)基因可以是細(xì)胞中通常存在的基因，或是其所引入的細(xì)胞或細(xì)胞位置中通常不存在的基因，在后者情況下它被稱為“異源基因”。異源基因可全部或部分地來自本領(lǐng)域已知的任何來源，包括細(xì)菌基因組或附加體、真核生物、細(xì)胞核或質(zhì)粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可含有能影響生物活性或其特征、表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)速率或表達(dá)控制方式的一個或多個修飾。這些修飾包括但不局限于一個或多個核苷酸的突變、插入、缺失以及置換。結(jié)構(gòu)基因可構(gòu)成一個不間斷的編碼序列，或者它可包括通過適當(dāng)剪接位點(diǎn)相接的一個或多個內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)基因可以是可翻譯的或不可翻譯的，包括呈反義定向。結(jié)構(gòu)基因可以是來自多個來源以及來自多個基因序列(天然存在或合成的，其中合成是指化學(xué)合成的DNA)的區(qū)段的復(fù)合物。
[0091]“源自”用于指從一個來源(化學(xué)和/或生物)取得、獲得、接收、追溯、復(fù)制或起源。衍生物可通過對原始來源的化學(xué)或生物操作(包括但不局限于置換、添加、插入、缺失、提取、分離、突變以及復(fù)制)而產(chǎn)生。
[0092]如與DNA序列相關(guān)的“化學(xué)合成”是指組分核苷酸的一部分是在體外組裝的。DNA的人工化學(xué)合成可使用沿用已久的程序來完成(Caruthers，DNA和RNA測序的方法(Methodology of DNA and RNA Sequencing), (1983), Weissman (編著)，普雷格出版社(Praeger Publishers),紐約(New York),第I章);可使用許多可購得機(jī)器之一來執(zhí)行自動的化學(xué)合成。
[0093]如在此使用的，“重組”包括指已經(jīng)通過引入異源核酸來修飾的細(xì)胞或載體，或該細(xì)胞源自以這種方式修飾的細(xì)胞。因此，例如，作為有意人為干預(yù)的結(jié)果，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的不同形式的基因，或表達(dá)在其他情況下異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因，或可具有天然基因的減少或消除表達(dá)。如在此使用的術(shù)語“重組”不包括通過天然發(fā)生的事件(例如，自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)，例如不需要有意人為干預(yù)就發(fā)生的事件而造成的細(xì)胞或載體的改變。
[0094]如在此使用的，“表達(dá)盒”是具有一系列指定核酸元件的重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，這些核酸元件允許具體核酸在IE細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。表達(dá)盒可并入質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。典型地，除了其他序列以外，表達(dá)載體的表達(dá)盒部分包括有待轉(zhuǎn)錄的核酸以及啟動子。
[0095]術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在此可互換使用，以指并入蛋白質(zhì)、多肽或肽(共同稱為“蛋白質(zhì)”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸并且，除非另外限制，否則可包括可以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的天然氨基酸的已知類似物。
`[0096]術(shù)語“選擇性雜交”包括指在嚴(yán)格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交的程度比其與非靶核酸序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。選擇性雜交序列通常彼此間具有約至少40%序列一致性、優(yōu)選地60%-90%序列一致性并且最優(yōu)選地100%序列一致性(即，互補(bǔ))。
[0097]術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”包括指探針與其靶序列雜交的程度將比它與其他序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的情形下將會不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格度，能夠鑒定與該探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測)?？商娲兀烧{(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯配，這樣使得檢測到較低程度的相似性(異源探測)。優(yōu)選地，探針為大約500個核苷酸長度，但是長度可變化很大，從小于500個核苷酸至等于靶序列的整個長度。
[0098]典型地，嚴(yán)格條件將是這些:其中鹽濃度小于約1.5M Na離子、典型地為約0.01至1.0M Na離子濃度(或其他鹽)，pH為7.0至8.3，并且對于短探針(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少30°C而對于長探針(例如，大于50個核苷酸)至少約60°C。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺或登哈特氏試劑(Denhardt’ s)來實(shí)現(xiàn)。示例性低嚴(yán)格性條件包括在37°C下使用30%至35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液進(jìn)行雜交，并且在50°C至55°C下在IX至2XSSC (20XSSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性中等嚴(yán)格條件包括在37°C下在40%至45%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS中雜交，并且在55°C至60°C下在0.5X至IXSSC中洗滌。示例性高嚴(yán)格條件包括在37°C下在50%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中雜交，并且在60°C至65°C下在0.1XSSC中洗滌。特異性通常取決于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度以及溫度。對于DNA-DNA雜交體，可從Meinkoth以及Wahl (1984)分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)，138:267-84的方程粗略估if Tm:Tm=81.5°C.+16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) -0.61 (%form) -500/L ;其中 M是一價(jià)陽離子的摩爾濃度，%GC是DNA中的鳥苷以及胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是雜交體的長度(單位為堿基對)。Tffl是50%的互補(bǔ)靶序列與完美匹配的探針雜交時的溫度(在限定的離子強(qiáng)度及PH下)。對于每1%錯配，Tffl降低約1°C ;因此，可調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件以便雜交至所希望的一致性的序列。例如，如果尋找具有>90% —致性的序列，則可將Tm降低10°C。一般來說，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其補(bǔ)體在限定的離子強(qiáng)度以及PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而，極嚴(yán)格條件可利用低于熱熔點(diǎn)(Tm)1°〇、21:、31:或41:的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可利用低于熱熔點(diǎn)(Tm)6°C、7°C、8°C、9°C或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可利用低于熱熔點(diǎn)(Tm) 11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C的雜交 和/或洗滌。使用該方程、雜交和洗滌組成以及所希望的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解，雜交和/或洗滌溶液嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所希望的錯配程度導(dǎo)致^小于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度以使得可使用較高溫度。有關(guān)核酸雜交的詳盡指南見于以下文獻(xiàn)=Tijssen,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-與核酸探針雜交(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes),第 I 部分,第 2 章,“雜交原理概述和核酸探針測定策略(Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays)” Elsevier, New York (1993);以及現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology),第 2 章，Ausubel 等人編著，GreenePublishing與Wiley-1nterscience,紐約(1995)。除非另外說明，否則在本申請中高嚴(yán)格性定義為在65°C下在4XSSC、5X登哈特氏試劑(500ml水中的5g聚蔗糖(Ficoll)、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸鮭魚精子DNA，以及25mM Na磷酸鹽中雜交，并且在65°C下在0.1 X SSC,0.1%SDS中洗滌。
[0099]如在此使用的，“轉(zhuǎn)基因植物”包括指在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般來說，異源多核苷酸穩(wěn)定整合于基因組內(nèi)以使得多核苷酸得以傳遞至連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨(dú)或作為重組表達(dá)盒的一部分來整合至基因組中。在此使用轉(zhuǎn)基因來包括:任何其基因型已因異源核酸的存在而改變的細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括最初被這樣改變的那些轉(zhuǎn)基因以及那些通過從最初轉(zhuǎn)基因進(jìn)行有性雜交或無性繁殖所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因。如在此使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過天然發(fā)生的事件如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變所造成的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)的改變。
[0100]如在此使用的，“載體”包括指用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并且可在其中插入多核苷酸的核酸。載體常常是復(fù)制子。表達(dá)載體允許插入其中的核酸的轉(zhuǎn)錄。
[0101 ] “過表達(dá)”是指轉(zhuǎn)基因生物中的表達(dá)水平超過正?；蛭崔D(zhuǎn)化生物中的表達(dá)水平。[0102]“植物組織”包括已分化的和未分化的組織或植物，包括但不局限于根、莖、枝條、葉、花粉、種子、腫瘤組織、以及細(xì)胞和培養(yǎng)物的多種形式如單一細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚、以及愈傷組織。該植物組織可以在植物中或在器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。
[0103]“優(yōu)選表達(dá)”、“優(yōu)先轉(zhuǎn)錄”或“優(yōu)選轉(zhuǎn)錄”可互換地指代基因產(chǎn)物的如下表達(dá)，這些基因產(chǎn)物優(yōu)選地在一個或幾個植物組織中(空間限制)和/或在一個或幾個植物發(fā)育階段(時間限制)以較高水平來表達(dá)，而在其他組織/發(fā)育階段，存在相對較低水平的表達(dá)。
[0104]“初級轉(zhuǎn)化體”以及“T0世代”是指與最初轉(zhuǎn)化(即，自從轉(zhuǎn)化起未經(jīng)歷減數(shù)分裂以及受精)的組織具有相同遺傳世代的轉(zhuǎn)基因植物?！按渭夀D(zhuǎn)化體”以及“Tl、T2、T3等世代”是指經(jīng)由一個或多個減數(shù)分裂以及受精循環(huán)而源自初級轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因植物。它們可通過初級或次級轉(zhuǎn)化體的自體受精或初級或次級轉(zhuǎn)化體與其他轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化植物的雜交來獲得。
[0105]“選擇性標(biāo)記基因”是指一種基因，該基因在一種植物細(xì)胞中的表達(dá)給予該細(xì)胞一種選擇優(yōu)勢。用該選擇性標(biāo)記基因所轉(zhuǎn)化的這些細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢可以是由于它們與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長相比具有在一種陰性選擇劑(如，一種抗菌素或一種除草劑)的存在下生長的能力。與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，由這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢還可以是由于它們將一種添加的化合物用作一種養(yǎng)分、生長因子、或能源的增強(qiáng)的能力。轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢還可以是由于在所謂“陰性選擇”中失去以前具有的基因。在這種情況下，所添加的化合物只對未失去親本細(xì)胞(通常是轉(zhuǎn)基因)中存在的特異性基因(陰性選擇標(biāo)記基因)的細(xì)胞具有毒性。
[0106]術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的基因組中，導(dǎo)致基因上穩(wěn)定的遺傳?！八矔r轉(zhuǎn)化的”是指轉(zhuǎn)基因 以及外來DNA已經(jīng)引入其中(例如通過如土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊的方法)，但是未針對穩(wěn)定維持加以選擇的細(xì)胞?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化的”是指轉(zhuǎn)化之后在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇和再生的細(xì)胞。
[0107]“轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)基因的/重組的”是指異源核酸分子已經(jīng)引入其中的宿主生物如細(xì)菌或植物。該核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到宿主的基因組中，或者該核酸分子還可以作為一種染色體外分子存在。這樣一種染色體外分子能夠自主復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或者植物應(yīng)當(dāng)理解為不僅包含轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物，而且包含其轉(zhuǎn)基因子代?！胺寝D(zhuǎn)化”、“非轉(zhuǎn)基因”或“非重組”宿主是指不含有異源核酸分子的野生型生物，例如細(xì)菌或植物。
[0108]術(shù)語“翻譯增強(qiáng)子序列”是指一個基因的處于啟動子與編碼序列之間的DNA序列部分，它被轉(zhuǎn)錄至RNA中并且存在于翻譯起始密碼子上游(5’ )的完全加工mRNA中。翻譯增強(qiáng)子序列可影響初級轉(zhuǎn)錄物至mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率?！翱梢姌?biāo)記”是指其表達(dá)未賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞優(yōu)勢但是能成為可檢測或可見的基因。可見標(biāo)記的實(shí)例包括但不局限于葡糖醛酸酶(⑶S)、熒光素酶(LUC)以及綠色熒光蛋白(GFP)。
[0109]“野生型”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的沒有進(jìn)行任何突變或修飾的正常基因、病毒或生物。
[0110]如在此使用的，“植物材料”、“植物部分”或“植物組織”是指植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、植物可由其再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織(plant calIi)、植物叢(plantclump )、以及在植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，這些植物部分例如是胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、粒、穗、穗軸、外殼、莖、根、根尖、花藥、塊莖、根莖等。[0111]如在此使用的，“蛋白質(zhì)提取物”是指從植物部分提取的部分或總蛋白質(zhì)。植物蛋白質(zhì)提取方法在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0112]如在此使用的，“植物樣品”是指完整或不完整(例如研磨的種子或植物組織、切碎的植物組織、凍干的組織)的植物組織。它還可以是包含完整或不完整種子或植物組織的提取物。
[0113]以下術(shù)語用于描述兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系:(a) “參考序列”、(b) “比較窗口”、(c) “序列一致性”、(d) “序列一致性百分比”、以及(e) “實(shí)質(zhì)一
致性”。
[0114]如在此使用的，“參考序列”是用作序列比較基礎(chǔ)的定義序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，全長cDNA或基因序列的區(qū)段或該完整cDNA或基因序列。
[0115]如在此使用的，“比較窗口 ”表示括指多核苷酸序列的連續(xù)且指定的區(qū)段，其中可將該多核苷酸序列與參考序列比較，并且其中為了兩個序列的最佳比對，該多核苷酸序列的在比較窗口中的部分相比于該參考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，空位)。一般來說，比較窗口為至少20個連續(xù)核苷酸的長度，并且任選地可以是30個、40個、50個以及100個或更多個核苷酸的長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，為了避免由于在多核苷酸序列中包含空位而導(dǎo)致與參考序列的高相似性，通常引入空位罰分并將其從匹配數(shù)目中扣除。
[0116]將核苷酸和氨 基酸序列進(jìn)行比對以供比較的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。Smith&ffaterman (1981)高等應(yīng)用數(shù)學(xué)(Adv.Appl.Math) 2:482的局部同源性算法(BESTFIT)可對序列進(jìn)行最佳比對用于比較；Needleman&Wunsc (1970)分子生物學(xué)雜志48:443-53的同源性比對算法(GAP) ；Pearson&Lipman (1988)美國國家科學(xué)院院刊85:2444的相似性搜索方法(Tfasta&Fasta);這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施,包括但不局限于:加利福尼亞州山景城(Mountain View) Intelligenetics公司的PC/Gene程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics 軟件包，第 8 版(可得自 Genetics Computer Group(GCG?:程序(Accelrys公司，圣地亞哥，加利福尼亞州))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA。如下文獻(xiàn)詳細(xì)描述了 CLUSTAL程序:Higgins&Sharp (1988)基因(Gene) 73:237-44 ；Higgins&Sharp (1989) CAB10S5:151-3 ；Corpet 等人(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 16:10881-90 ;Huang等人(1992)計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用(Computer Applications in the Biosciences) 8:155-65 以及 Pearson 等人(1994)分子生物學(xué)方法(Meth.Mol.Biol.) 24:307-31。用于多個序列的最佳全局比對的優(yōu)選程序是 PileUp (Feng&Doolittle (1987)分子進(jìn)化雜志(J.Mol.Evol.)，25:351-60，它類似于由Higgins&Sharp (1989) CAB10S5:151-53描述的方法，并且通過引用結(jié)合在此)?？捎糜跀?shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST程序家族包括:用于核苷酸查詢序列對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的BLASTN ;用于核苷酸查詢序列對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的BLASTX ;用于蛋白質(zhì)查詢序列對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的BLASTP ;用于蛋白質(zhì)查詢序列對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的TBLASTN ;以及用于核苷酸查詢序列對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的TBLASTX。參見現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(CurrentProtocols in Molecular Biology),第 19 章,Ausubel 等人編著,Greene Publishing 與ffiley-1nterscience,紐約(1995)。
[0117]GAP使用上述Needleman&Wunsch的算法來發(fā)現(xiàn)兩個完整序列的比對,這種比對使匹配數(shù)目最大化并且使空位數(shù)目最小化。GAP考慮所有可能的比對以及空位位置并且產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基以及最少空位的比對。它允許以匹配堿基為單位來提供空位產(chǎn)生罰分以及空位延伸罰分。GAP必須為它插入的每個空位得到空位產(chǎn)生罰分匹配數(shù)目的收益。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP必須另外地為乘以空位延伸罰分的空位長度的每個所插入空位產(chǎn)生收益。Wisconsin Genetics軟件包第10版中的默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值以及空位延伸罰分值分別為8和2?？瘴划a(chǎn)生罰分以及空位延伸罰分可表示為選自由O至100組成的整數(shù)組中的整數(shù)。因此，例如，空位產(chǎn)生罰分以及空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、15、20、30、40 以及 50 或更大。 [0118]GAP代表最佳比對家族的一個成員。可存在此家族的許多成員，但是其他成員不具有較好的質(zhì)量。GAP顯示用于比對的四個優(yōu)點(diǎn)特征:質(zhì)量、比率、一致性以及相似性。質(zhì)量是為了比對序列而被最大化的度量。比率是質(zhì)量除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)目。一致性百分比是實(shí)際上匹配的符號的百分比。相似性百分比是相似的符號的百分比。在空位對面的符號予以忽略。當(dāng)一對符號的打分矩陣值大于或等于相似性閾值0.50時，對相似性打分。Wisconsin Genetics軟件包第10版中使用的打分矩陣是BL0SUM62 (參見Henikoff&Henikoff (1989)美國國家科學(xué)院院刊 89:10915)。
[0119]除非另外說明，否則在此提供的序列一致性/相似性值是指用BLAST2.0程序包、采用默認(rèn)參數(shù)所獲得的值(Altschul等人(1997)核酸研究25:3389-402)。
[0120]如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解，BLAST搜索假設(shè)蛋白質(zhì)可被建模為隨機(jī)序列。然而，許多實(shí)際蛋白質(zhì)包括非隨機(jī)序列區(qū)，它們可以是同聚序列段(homopolymeric tracts)、短周期重復(fù)序列或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這些低復(fù)雜性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白質(zhì)之間比對，即使蛋白質(zhì)的其他區(qū)域完全不同。許多低復(fù)雜性過濾程序可用來減少這些低復(fù)雜性比對。例如，可單獨(dú)或組合使用SEG (ffooten&Federhen (1993)計(jì)算化學(xué)(Comput.Chem.) 17:149-63)以及(Claverie&States (1993)計(jì)算化學(xué) 17:191-201)低復(fù)雜性過濾。
[0121]在兩個核酸或多肽序列情形下，如在此使用的“序列一致性”或“一致性”包括指當(dāng)在指定的比較窗口上進(jìn)行比對以獲得最大對應(yīng)時兩個序列中相同的殘基。當(dāng)參考蛋白質(zhì)使用序列一致性百分比時，認(rèn)為不一致的殘基位置通常由保守的氨基酸置換造成不同，其中氨基酸殘基被其它有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷和疏水性)的氨基酸殘基所置換，因此并不改變分子的功能特性。當(dāng)序列在保守置換方面不同時，可以向上調(diào)整序列一致性百分比以校正該置換的保守性質(zhì)。因這樣的保守置換而不同的序列被說成具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行此調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。典型地，這涉及將保守置換打分為部分錯配而不是完全錯配，從而提高序列一致性百分比。因此，例如，如果給予相同氨基酸I分并且給予非保守置換零分，則給予保守置換零與I之間的分?jǐn)?shù)。例如根據(jù)Meyers&Miller(1988)計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用(Computer Applic.Biol.Sc1.)4:11-17的算法來計(jì)算保守置換的分?jǐn)?shù)，例如在程序PC/GENE (Intelligenetics，山景城，加利福尼亞州，USA)中所實(shí)施的。
[0122]如在此使用的，“序列一致性百分比”表示通過對一個比較窗比較兩條最佳比對的序列確定的值，其中與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，該比較窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，空位)，以最佳比對這兩個序列。通過如下方法計(jì)算該百分比:確定兩個序列中的相同核酸堿基或氨基酸殘基所在的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗中的總位置數(shù)并且將結(jié)果乘以100而產(chǎn)生序列一致性百分比。
[0123]術(shù)語多核苷酸序列的“實(shí)質(zhì)一致性”是指使用所描述的比對程序中的一種并采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，多核苷酸包含的序列與參考序列相比具有50%-100%之間的序列一致性、優(yōu)選地至少50%序列一致性、優(yōu)選地至少60%序列一致性,優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且最優(yōu)選地至少95%。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，可通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些值，以便確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)一致性。出于這些目的，氨基酸序列的實(shí)質(zhì)一致性通常表示55%-100%之間、優(yōu)選地至少55%、優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70%、80%、90%并且最優(yōu)選地至少95%的序列一致性。
[0124]核苷酸序列實(shí)質(zhì)上一致的另一個指示是兩個分子在嚴(yán)格條件下是否彼此雜交。遺傳密碼的簡并性允許許多氨基酸置換，從而導(dǎo)致編碼相同氨基酸的核苷酸序列的變樣化，因而有可能DNA序列可編碼相同多肽但是并不在嚴(yán)格條件下彼此雜交。例如，當(dāng)使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性而生成核酸的拷貝時，發(fā)生這種情況。兩個核酸序列實(shí)質(zhì)上一致的一個指示是，第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。
[0125]如在此使用的短語“非生物脅迫”是指任何由非生物因素(即水可用性、熱、冷等)對植物的代謝、生長、繁殖和/或生存力所造成的不利影響。因此，非生物脅迫可通過次優(yōu)環(huán)境生長條件而誘導(dǎo)，這些條件例如像鹽度、水分剝奪、水分虧缺、干旱、洪澇、冰凍、低溫或高溫(例如寒冷或過熱)、有毒化學(xué)品污染、重金屬毒性、厭氧生活、養(yǎng)分缺乏、養(yǎng)分過量、大氣污染或UV照射。
[0126]如在此使用的短語“非生物脅迫耐性”是指植物忍受非生物脅迫而不遭受代謝、生長、生產(chǎn)力和/或生存力的實(shí)質(zhì)性改變的能力。
[0127]如在此使用“水分虧缺”表示當(dāng)植物可獲得的水不能補(bǔ)充植物的消耗速率的時期。長期水分虧缺俗稱干旱。如果有可獲得的地下水貯備來支持植物生長速率，那么雨水或灌溉缺乏可以不立即產(chǎn)生水分脅迫。在具有充足地下水的土壤中生長的植物可在無雨水或灌溉的情況下存活數(shù)天，而不對產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。在干土中生長的植物可能在最短水分虧缺時期內(nèi)遭受不利影響。嚴(yán)重水分虧缺脅迫可導(dǎo)致枯萎以及植物死亡；中度干旱可減少產(chǎn)量、阻礙生長或延遲發(fā)育。植物可從某些時期的水分虧缺脅迫中恢復(fù)而不對產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響。然而，授粉時的水分虧缺可降低或減少產(chǎn)量。因此，例如用于觀察對于水分虧缺的反應(yīng)或耐性的玉米生命周期中的有用時期是在抽穗或過渡至繁殖發(fā)育之前的營養(yǎng)生長階段晚期。通過與對照植物比較來確定水分虧缺耐性。例如，當(dāng)暴露于水分虧缺時，本發(fā)明的植物與對照植物相比可產(chǎn)生更高產(chǎn)量?？稍趯?shí)驗(yàn)室中以及在田間試驗(yàn)中模擬干旱，方法是通過與給予充分施水的對照植物相比，給予本發(fā)明的植物以及對照植物較少的水，并且測量性狀差異。例如，產(chǎn)量可分解成若干分量，如每英畝的植物數(shù)、每個穗的粒行數(shù)、每株植物的穗數(shù)、每株植物的粒數(shù)以及每粒的重量。在水分脅迫情況下，不結(jié)果實(shí)或結(jié)籽減少也會加重。本發(fā)明的一個方面提供過表達(dá)如在此披露的賦予較高水分虧缺耐性的基因的植物。
[0128]如在此使用的，短語“水優(yōu)化”是指植物、其部分或其結(jié)構(gòu)的任何度量，它可被測量且/或量化以便評定在不同的水可用性條件下植物生長和發(fā)育的程度或速率。因此，“水優(yōu)化性狀”是可被證明為在與水可用性相關(guān)的若干組不同生長條件下影響植物的產(chǎn)量的任何性狀。水優(yōu)化的示例性度量是在標(biāo)準(zhǔn)水分百分率下的籽粒產(chǎn)量(YGSMN)、收獲時的籽粒水分(GMSTP)、每塊地的籽粒重量(GffTPN)以及產(chǎn)量恢復(fù)百分比(PYREC)。
[0129]如在此使用的，短語“耐旱性”以及“耐旱”是指植物在水可用性為次優(yōu)的條件下忍受且/或茁壯成長的能力。一般來說，如果植物顯示“增強(qiáng)的耐旱性”，則將它標(biāo)記為“耐旱的”。如在此使用的，短語“增強(qiáng)的耐旱性”是指如與一個或多個對照植物相比，一個或多個水優(yōu)化表型的可測量的改善、增強(qiáng)或增加。
[0130]水分利用效率(WUE)是常常用于評估水消耗量與CO2吸收/生長之間的權(quán)衡的參數(shù)(Kramer, 1983,植物的水關(guān)系(Water Relations of Plants),學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)第405頁)。WUE已經(jīng)用多種方法來定義并且測量。一種方法是計(jì)算整株植物的干重與植物在其整個壽命期間所消耗的水重量的比率(Chu等人，1992，生態(tài)學(xué)(Oecologia)89:580)。另一個變化是當(dāng)測量生物質(zhì)積累以及水分利用時使用較短時間間隔(Mian等人，1998，作物科學(xué)(Crop Sc1.) 38:390)。另一種方法是利用來自植物的限制部分的測量結(jié)果，例如，只測量地上部分生長以及水分利用(Nienhuis等人1994美國植物學(xué)雜志(Amer JBot) 81:943)。WUE還被定義為CO2吸收與從葉子或葉子一部分中損失的水蒸氣的比率，經(jīng)常在很短時段(例如數(shù)秒/數(shù)分鐘)內(nèi)測量(Kramer，1983，第406頁)。在植物組織中固定并且用同位素比值質(zhì)譜儀測量的13C/12C比率也用于估計(jì)在植物中使用C-3光合作用的WUE(Martin等人，1999，作物科學(xué)1775)。如在此使用的，術(shù)語“水分利用效率”是指由植物產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)的量除以植物產(chǎn)生它所使用的水的量，即，相對于植物的用水量的植物干重。如在此使用的，術(shù)語“干重”是指植物中除了水以外的任何物質(zhì)，并且包括例如碳水化合物、蛋白質(zhì)、油以及礦質(zhì)營養(yǎng)素。預(yù)期由在此描述的方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物將賦予水分利用效率的增加。
[0131]如在此使用的短語“生物脅迫”是指任何由生物因素(即昆蟲壓力、疾病等)對植物的代謝、生長、繁殖和/或生存力所造成的不利影響。
[0132]如在此使用的短語“生物脅迫耐性”是指植物忍受生物脅迫而不遭受代謝、生長、繁殖和/或生存力的實(shí)質(zhì)性改變的能力。
[0133]如在此使用的，短語“植物生物質(zhì)”是指由植物在生長季節(jié)中產(chǎn)生的組織的量(以風(fēng)干或干燥組織的克數(shù)來測量)，它也可決定或影響植物產(chǎn)量或每種植面積的產(chǎn)量。
[0134]如在此使用的，短語“植物活力”是指由植物在給定時間中產(chǎn)生的組織的量(按重量來測量)。因此，增加的活力可決定或影響植物產(chǎn)量或每單位種植時間或種植面積的產(chǎn)量。
[0135]術(shù)語“早期生長勢”是指尤其是在植物生長早期期間的活躍、健康、充分平衡的生長，并且可以因提高的植物適應(yīng)性所致，提高的植物適應(yīng)性的原因是例如這些植物更好地適應(yīng)它們的環(huán)境(優(yōu)化能量資源的用途并且在苗與根之間的分配)。具有早期生長勢的植物也顯示提高的籽苗存活和更佳的作物建立，這常常導(dǎo)致高度均勻的田塊(即，作物以均勻方式生長，例如作物在基本上相同的時間達(dá)到各個發(fā)育期)、和常常更高的產(chǎn)量。因此，早期生長勢可以通過測量多種因素如千粒核重(thousand kernel weight)、萌發(fā)百分比、出苗百分比、籽苗生長、籽苗高度、根長度、根和苗生物量和許多其他因素等確定。
[0136]如在此使用的，“幼苗勢”是指如下植物特征:在相似條件下與野生型或?qū)φ障啾龋参飶耐寥乐懈斐雒?、具有增加的發(fā)芽速率(即，更快發(fā)芽)、具有更快以及更大的幼苗生長且/或在寒冷條件下發(fā)芽更快。幼苗勢經(jīng)常定義為包括以下種子特性，這些特性決定“正常幼苗在廣泛范圍的田間條件下快速、均勻的出苗以及發(fā)育的潛力”。
[0137]開花植物的生命周期一般可劃分為三個生長期:營養(yǎng)期、花序期以及花期(晚期花序期)。在營養(yǎng)期內(nèi)，枝條頂端分生組織(SAM)產(chǎn)生葉，隨后這些葉將確保為了產(chǎn)生可育后代所必需的資源。在收到適當(dāng)?shù)沫h(huán)境信號以及發(fā)育信號時，植物轉(zhuǎn)換至花生長或繁殖生長并且SAM進(jìn)入花序期(I)并且產(chǎn)生具有花原基的花序。在此期過程中，SAM以及出現(xiàn)于葉腋的次生枝條的命運(yùn)由一組分生組織身份基因所決定，這些分生組織身份基因中的一些阻止花分生組織發(fā)育，而一些促進(jìn)花分生組織發(fā)育。一旦建立，植物就進(jìn)入產(chǎn)生花器官的晚期花序期。如果存在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境信號以及發(fā)育信號，則植物轉(zhuǎn)換至花生長或繁殖生長。如果這些信號被破壞，植物將不能夠進(jìn)入繁殖生長，由此維持營養(yǎng)生長。
[0138]“種質(zhì)”是指屬于或來自個體(例如，植物)、個體群體(例如，植物品系、品種或家族)、或源自品系、品種、物種或培養(yǎng)物的克隆的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)可以是一個生物或細(xì)胞的部分，或可以從該生物或細(xì)胞中分離。通常，種質(zhì)提供了具有特定分子構(gòu)成的遺傳物質(zhì)，該分子構(gòu)成提供了對于一個生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的一些或所有遺傳品質(zhì)而言的物理基礎(chǔ)。如在此使用的，種質(zhì)包括可從其生長新植物的細(xì)胞、種子或組織，或可培養(yǎng)成整株植物的植物部分，如葉、莖、花粉或細(xì)胞。
[0139]本發(fā)明抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體及其混合物，它們可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD中的任何一個，以及其任何同種型(isotype),例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在單克隆抗體的情況下，一個示例性類別的抗體是IgG。IgG的子類包括例如IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4?？贵w包括具有兩個全長重鏈和兩個全長輕鏈(例如，重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的成熟部分)的完整以及嵌合免疫球蛋白分子，以及保持特異性結(jié)合T6PP并且尤其是結(jié)合修飾T6PP的親本完整抗體 的至少一部分功能(例如T6PP結(jié)合特異性或T6PP結(jié)合親和力)的重鏈或輕鏈子序列/片段。子序列可具有與親本完整抗體以及嵌合抗體相同或大致上相同的結(jié)合特異性、結(jié)合親和力。
[0140]單克隆抗體或多克隆抗體的產(chǎn)生可通過本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)?！岸嗫寺　笨贵w是從不同B細(xì)胞資源獲得的抗體。它們是各自識別不同表位的針對特異性抗原的免疫球蛋白分子的組合。通常通過接種至適合的哺乳動物，如小鼠、兔或山羊中而產(chǎn)生多克隆抗體。例如，將含有能夠產(chǎn)生抗原的T6PP蛋白的組合物注入哺乳動物體內(nèi)。新蛋白質(zhì)的存在誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對T6PP抗原特異的IgG免疫球蛋白。然后，從哺乳動物的血清中純化多克隆IgG免疫球蛋白。
[0141]如在此使用的，術(shù)語“單克隆抗體”是指具有單一分子構(gòu)成的抗體分子的制劑。單克隆抗體顯示對于具體表位的單一結(jié)合特異性和親和力。單克隆抗體產(chǎn)生方法涉及:獲得具有抗體產(chǎn)生潛力的免疫體細(xì)胞，尤其B淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞以前用所感興趣的抗原在體內(nèi)或體外進(jìn)行了免疫并且適合于與B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系融合。
[0142]哺乳動物淋巴細(xì)胞的免疫典型地通過將動物(例如，小鼠)用所希望的蛋白質(zhì)或多肽，例如，用本發(fā)明T6PP來進(jìn)行體內(nèi)免疫。必要時以多達(dá)幾周的時間間隔來重復(fù)這樣的免疫，以便獲得抗體的足夠滴度。一旦經(jīng)免疫，將動物用作抗體產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的來源。在最后一次抗原加強(qiáng)之后，將動物處死并且將脾細(xì)胞移出。小鼠淋巴細(xì)胞得到與在此描述的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系的較高百分比的穩(wěn)定融合。其中，BALB/c小鼠是優(yōu)選的。然而，其他小鼠品系、兔、倉鼠、綿羊以及青蛙也可用作用于制備抗體產(chǎn)生細(xì)胞的宿主。參見Goding (單克隆抗體:原理與實(shí)踐(Monoclonal Antibodies !Principles and Practice),第 2 版,第 60-61頁，奧蘭多(Orlando),佛羅里達(dá)州(Fla.),學(xué)術(shù)出版社(Academic Press), 1986)。
[0143]處于分裂漿母細(xì)胞階段的那些抗體產(chǎn)生細(xì)胞優(yōu)先融合。體細(xì)胞可從已接觸抗原的動物的淋巴結(jié)、脾以及外周血來獲得，并且所選的淋巴細(xì)胞在較大程度上取決于其在具體融合系統(tǒng)中的經(jīng)驗(yàn)有用性。然后，抗體分泌淋巴細(xì)胞與(小鼠)B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞融合，這些細(xì)胞能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中無限地復(fù)制，從而產(chǎn)生永生的免疫球蛋白分泌細(xì)胞系。對所得融合細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并且針對所希望的單克隆抗體的產(chǎn)生來篩選所得集落。將產(chǎn)生這些抗體的集落克隆，并且使其在體內(nèi)或體外生長以便產(chǎn)生大量抗體。融合這些細(xì)胞的理論基礎(chǔ)以及實(shí)際方法的描述闡明于Kohler&Milstein，自然256:495 (1975)中，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在此。
[0144]增加的作物產(chǎn)量是在世界各地具有可觀經(jīng)濟(jì)利益的性狀。產(chǎn)量通常定義為來自作物的具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測量產(chǎn)物。這可在數(shù)量和/或質(zhì)量方面來定義。產(chǎn)量直接取決于多種因素，例如，器官的數(shù)目和大小、植物結(jié)構(gòu)(例如，枝條數(shù))、種子生產(chǎn)、葉子老化以及其他因素。根發(fā)育、養(yǎng)分吸收、脅迫耐性以及早期生長勢也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。另外，在農(nóng)業(yè)中非常希望開發(fā)可在最佳生長條件以及非最佳生長條件下(例如干旱、在非生物脅迫條件下)顯示出增加產(chǎn)量的作物。因此，優(yōu)化上述因素可有助于增加作物產(chǎn)量。
[0145]種子產(chǎn)量是尤其重要的性狀，因?yàn)樵S多植物的種子對于人類和動物營養(yǎng)是至關(guān)重要的。如玉米、水稻、小麥、卡諾拉油菜以及大豆等作物占人類總熱量攝取的一半以上，不論是經(jīng)由直接消費(fèi)種子本身，或是經(jīng)由消費(fèi)用經(jīng)過加工的種子飼養(yǎng)的家畜。植物種子也是糖、油以及用于各種工業(yè)過程中的許多種類代謝物的來源。種子由胚(新枝條以及根的來源)以及胚乳(發(fā)芽期間以及早期幼苗生長期間的胚生長的養(yǎng)分來源)組成。種子的發(fā)育涉及許多基因，并且需要將來自根、葉以及莖的代謝物傳送至正發(fā)育的種子中。胚乳同化碳水化合物、油以及蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它`們合成為儲存大分子以便使籽粒飽滿起來。
[0146]早期生長勢是產(chǎn)量的另一個重要方面。改進(jìn)早期生長勢是溫帶以及熱帶水稻栽培種的現(xiàn)代水稻育種計(jì)劃的重要目的。長根對于水播水稻的適當(dāng)土壤錨固是至關(guān)重要的。水播水稻直接播種至淹水田地中，其中植物必須穿過水快速出苗，因此更長枝條允許增加幼苗的存活。在實(shí)施條播時，更長的中胚軸以及胚芽鞘對于良好出苗是至關(guān)重要的。將早期生長勢工程化至植物中的能力在農(nóng)業(yè)中是極其重要的。例如，不良的早期生長勢已經(jīng)對將基于玉米帶種質(zhì)的玉蜀黍(玉蜀黍L.(Zea mays L.))雜種引入歐洲大西洋造成限制。在另一方面，早期生長勢還可在一些作物中允許較早收獲時間，從而可在許多農(nóng)業(yè)應(yīng)用中充當(dāng)優(yōu)勢。
[0147]為了在各種生物以及非生物脅迫下改進(jìn)產(chǎn)量而工程化的植物在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中是特別感興趣的。例如，非生物脅迫是全世界的作物損失的主要原因，使大多數(shù)主要作物植物的平均產(chǎn)量減少超過50% (Wang等人，植物(2003) 218:1-14)。非生物脅迫可由干旱、洪水、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性以及氧化脅迫引起。改進(jìn)植物非生物脅迫耐性的能力對于全世界的農(nóng)民具有極大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢并且將會在不利條件期間以及在作物的栽培以其他方式不可實(shí)現(xiàn)的地區(qū)允許栽培作物。
[0148]在一些情況下，植物產(chǎn)量是對于具體植物可產(chǎn)生的植物生物質(zhì)的量而言。與較小植物相比，具有更大葉面積的較大植物可通常吸收更多光、養(yǎng)分以及二氧化碳，并且因此可能會在相同時期期間增加更大重量(Fasoula&Tollenaar2005Maydica50:39)。在例如將生物質(zhì)(例如玉米、草、高粱、甘蔗)轉(zhuǎn)化成燃料如乙醇或丁醇的過程中，增加的植物生物質(zhì)也可以是非常令人希望的。
[0149]增加植物產(chǎn)量的能力在如下領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用，如裝飾性植物的生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、園藝、生物燃料生產(chǎn)、藥品、使用植物作為這些分子的制造場所的酶工業(yè)、以及林業(yè)。增加產(chǎn)量還可在生產(chǎn)供用于生物反應(yīng)器(用于以生物技術(shù)生產(chǎn)物質(zhì)如藥品、抗體、疫苗、燃料，或用于有機(jī)廢料的生物轉(zhuǎn)化)的微生物或海藻以及其他這樣的領(lǐng)域中得到應(yīng)用。
[0150]植物育種者往往對改進(jìn)產(chǎn)量的特定方面感興趣，這取決于所討論的作物或植物，以及該植物或作物的具有相對經(jīng)濟(jì)價(jià)值的部分。例如，植物育種者可尤其期待植物的一個或多個部分的植物生物質(zhì)(重量)的改進(jìn)，這些部分可包括地上(可收獲)部分和/或地下的可收獲部分。如果植物的地上部分或地下部分是用于消費(fèi)，則這是尤其相關(guān)的。對于許多作物，尤其谷物(cereal )，種子產(chǎn)量的改進(jìn)是非常令人希望的。增加的種子產(chǎn)量可在許多方面體現(xiàn)出來，其中取決于所討論的作物或植物及其最終用途，種子產(chǎn)量的每個單獨(dú)的方面對于植物育種者具有不同的重要性。
[0151]對于植物育種者來說，能夠挑選和選擇有待改變的產(chǎn)量方面是極大的優(yōu)勢。能夠挑選適合于改變產(chǎn)量的特定方面(例如種子產(chǎn)量、生物質(zhì)重量、水分利用效率、脅迫條件下的產(chǎn)量)的基因也可以是非常令人希望的。例如，填充率的增加并結(jié)合增加的千粒重，對于如玉米的作物來說是非常令人希望的。對于水稻和小麥，增加填充率、收獲指數(shù)以及增加千粒重的組合是非常令人希望的。
[0152]海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的非常穩(wěn)定的二糖。當(dāng)在廣泛pH范圍下加熱至100°C持續(xù)24小時時，它不降解。它的低反應(yīng)性、生理化學(xué)特性以及穩(wěn)定性使其成為優(yōu)越的滲透保護(hù)劑。沒有水的情況下，它通過經(jīng)由與極性殘基的氫鍵來代替水而使蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜以及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在干燥時，海藻糖形成類似玻璃的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而限制分子運(yùn)動，防止蛋白質(zhì)聚集以及自由基擴(kuò)散(Br umfield G (2004)自然428:14-15，Paul MJ (2004)植物生物技術(shù)雜志(Plant Biotechnol J)，2，第71-82頁)。
[0153]以前認(rèn)為只有某些植物，如干燥耐受性物種如復(fù)蘇植物才積累海藻糖，因?yàn)樗鼈円宰銐蛉菀诇y量的數(shù)量來制造海藻糖。然而，最近的遺傳以及基因組證據(jù)證明迄今為止所檢測的所有植物都具有合成海藻糖的能力，但是通常以極低量來合成(Paul MJ等人(2008)植物生物學(xué)年評(Annu Rev Plant Biol)59:417-441 )。此外，海藻糖代謝似乎是必不可少的，因?yàn)槔缃?jīng)由突變來移除植物產(chǎn)生海藻糖的能力是致死性的(Eastmond PJ等人(2002)植物雜志(Plant J) 29:225-235)。大多數(shù)作物物種含有微量海藻糖(在低微摩爾、或甚至納摩爾水平下測量到)，但是對于玉蜀黍來說，典型積累是未知的。
[0154]如在此使用的“海藻糖途徑”由兩個生物合成酶海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)，以及在降解中所涉及的一個水解酶海藻糖酶組成，請參見圖
3。我們目前不知道玉蜀黍中存在多少(TPS)或(T6PP)同工型(isoform)。在模型植物擬南芥中，有總共11個TPS基因(Paul等人(2008)植物生物學(xué)年評59:417-441)，然而，只證明了 AtTPSl 的催化活性(Vandesteene L 等人(2010)分子植物(Mol Plant) 3:406-419)。其他10個擬南芥TPS同系物的功能仍然是神秘的。在擬南芥中有10個T6PP基因，并且雖然大多數(shù)未充分表征，但它們似乎都具有T6PP活性(Schluepmann H等人(2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志(J Exp Bot):1-12 ;Paul等人(2008)植物生物學(xué)年評59:417-441)。相比之下，擬南芥僅含有一個編碼海藻糖酶的基因(MUller J等人(2001)植物生理學(xué)(PlantPhysiol) 125:1086-1093 ；Frison M 等人(2007) FEBS Letters581:4010-4016 ；Paul 等人2008)。水稻中的情況是類似的(Shima S等人(2007) FEBS J274:1192-1201 ;Zang等人(2011)植物分子生物學(xué)76:507-522)。表達(dá)譜數(shù)據(jù)表明，基因家族成員在植物發(fā)育整個過程中是差異表達(dá)的(Scheulpmann等人(2004)植物生理學(xué)135:879-890 ;Zang等人(2011)植物分子生物學(xué)76:507-522)。T6PP以及TPS基因家族中的一些成員之間的組織特異性表達(dá)以及翻譯的多樣性提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明這些酶在植物中執(zhí)行重要并且或許不同的功能(Satoh-Nagasawa 等人(2006)自然 441:227-230 ；Mustroph 等人(2009)美國國家科學(xué)院院刊 106:18843-18848 ;Ramon 等人(2009)植物、細(xì)胞與環(huán)境(Plant Cell Environ)32:1015-1032)。
[0155]海藻糖途徑酶還在翻譯后水平上得到調(diào)控。TPS蛋白質(zhì)是蔗糖非發(fā)酵(SNFl)相關(guān)蛋白激酶(SnRKl)的底物(Zhang等人(2009)植物生理學(xué)149:1860-1871)。一些TPS(AtTPS5、6&7)磷蛋白結(jié)合 14-3-3 蛋白(Harthill 等人(2006)植物雜志 47:211-223)。14-3-3蛋白對磷酸化部位的同等的磷酸化以及封端可能是用來調(diào)控TPS活性的可能機(jī)制。通過基于光/暗轉(zhuǎn)換的相似機(jī)制來調(diào)控硝酸還原酶(Huber等人(2002)植物分子生物學(xué)50:1053-1063)。Harthill等人提出，硝酸還原酶、6-磷酸果糖_2_激酶/果糖-2，6- 二磷酸酶(F2KP)以及TPS都由相同激酶(可能是SnRKl)來修飾、結(jié)合14_3_3蛋白、并且以某種方式可通過光/暗循環(huán)來調(diào)控(Harthil I等人(2006 )植物雜志47:211-223 )。
[0156]表達(dá)以及調(diào)控中的復(fù)雜性有力地表明，在海藻糖代謝途徑中的蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)與對于植物代謝至關(guān)重要的提供催化作用和調(diào)控作用兩者的酶一起分組。它們的確切作用未完全了解，但是出現(xiàn)的模型可 與三個核心功能相關(guān):糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物發(fā)育以及脅迫保護(hù)。
[0157]基于微生物系統(tǒng)中的公開報(bào)告(Wiemken, A.(1990)普通微生物學(xué)雜志(J GenMicrobiol) 58:209-217)中膜穩(wěn)定化以及其他益處與高海藻糖水平(1%_10%干重，g/g)相關(guān)，早期轉(zhuǎn)基因研究集中于利用海藻糖作為滲透保護(hù)劑。一些公開的研究暗示海藻糖保護(hù)植物抗御干旱以及其他滲透脅迫(Garg等人(2002) PNAS99:15898-15903 ；Paul等人(2008)植物生物學(xué)年評59:417-441 ;Ge等人2008 ;Li等人2011)。然而當(dāng)在被設(shè)計(jì)成過度積累海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物中測量海藻糖水平時，發(fā)現(xiàn)其很低，處于每克鮮重?cái)?shù)微克的數(shù)量級。系統(tǒng)發(fā)育信息也證明盡管植物海藻糖途徑基因發(fā)生增殖，但僅少量植物將海藻糖代謝物積累至可充當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的滲透保護(hù)劑或穩(wěn)定劑的直接效應(yīng)所需要的水平。
[0158]二十世紀(jì)九十年代中期在植物中產(chǎn)生海藻糖的研究(用于食品工業(yè))不同于在植物中產(chǎn)生其他“外來”糖分子的研究(Eastmand&Graham (2003 )植物生物學(xué)新見(Current Opin Plant Biol) 6:231-235 ;Pellny 等人(2004)植物生物技術(shù)雜志，2,第71-82頁；Paul M.J.(2007)植物生物學(xué)新見，第10卷，第3期，6月，第303-309頁)。改變轉(zhuǎn)基因植物中的海藻糖代謝常常導(dǎo)致意外的多效生長缺陷(pleotroptic growthdefect) (Lordachescu&Imai (2008)綜合植物生物學(xué)雜志(J Integrative Plant Biol)50:1223-1229)。
[0159]P.J.Eastmond等人首先證明了胚發(fā)育對于活性植物TPS基因擬南芥TPSl的絕對需求(Eastmond P.J.等人(2002)植物雜志29:225-235)。純合tpsl突變體不產(chǎn)生成熟種子。Schluepmann等人證明tpsl突變體可通過表達(dá)編碼海藻糖6-磷酸合成酶的大腸桿菌OtsA基因來營救，提示調(diào)控植物代謝的海藻糖途徑的有效組分是T6P。植物細(xì)胞中的T6P濃度很低，提示它充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。(Scheulpmann等人(2004)植物生理學(xué)135:879-890)。其濃度的較小改變可以對于調(diào)控植物代謝過程具有顯著“激素樣”作用(Rolland等人(2002)植物細(xì)胞:S185-S205)。
[0160]現(xiàn)在越來越多的證據(jù)支持海藻糖途徑牽涉于所有生物必需的糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中。它使得能夠在飽與餓的極端之間調(diào)控糖水平(Eveland&Jackson, (2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1-11)。例如，在哺乳動物中，血糖水平的胰島素調(diào)控對于維持最佳健康狀況是必需的。
[0161]糖海藻糖牽涉到感測糖以及能量狀態(tài)的概念在微生物，尤其酵母中得到確立，并且現(xiàn)在在植物中予以證實(shí)(Schluepmann等人(2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1_12)。在植物中，從蔗糖分解的下游產(chǎn)物G6P和UDPG來合成T6P。UDPG經(jīng)由蔗糖合成酶來直接產(chǎn)生；G6P由葡萄糖通過轉(zhuǎn)化酶以及己糖激酶產(chǎn)生，或由果糖以及果糖6-磷酸(F6P)通過蔗糖合成酶、果糖激酶以及磷酸葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生。M)PG以及G6P也是兩個核心活化前體，許多細(xì)胞功能可最終從其得到(圖4)。UDPG是主要細(xì)胞壁多糖以及糖脂的前體。G6P是淀粉合成的前體、經(jīng)由磷酸戊糖途徑的氧化部分得到NADPH (Masakapalli S.K.等人(2010)植物生理學(xué)152:602-619)，并且經(jīng)由糖酵解、檸檬酸循環(huán)以及氧化磷酸化得到ATP。另外，G6P可轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸并且連同UDPG —起用于合成蔗糖-6-磷酸，然后獲得蔗糖。從UDPG以及G6P制得T6P處于植物中的主要碳通量的活動中心。因此,植物細(xì)胞中的T6P水平可反映己糖磷酸、UDPG以及蔗糖的可用性。[0162]一個重要發(fā)現(xiàn)證明T6P結(jié)合至SnRKl來抑制其活性(Zhang等人(2009)植物生理學(xué)149:1860-1871)，請參見圖5。SnRKl是異源三聚體蛋白，并且是動物AMP激活的蛋白激酶以及酵母蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶(SnFl)的植物同源物(Paul等人(2008)植物生物學(xué)年評59:417-441 ;Schlu印mann 等人(2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1-12 ；Polge&Thomas (2007)植物科學(xué)趨勢(Trends in Plant Science),第12卷,第I期,2007年I月，第20 - 28頁)。過表達(dá)SnRKl亞基基因的植物中的全局基因表達(dá)類似于植物對于長時間黑暗、光合作用抑制或浸沒所引起的碳養(yǎng)分或能量脅迫的反應(yīng)(Baena-GonzciIez等人(2007)自然448:938-942)。因此，增加的SnRKl介導(dǎo)低能量脅迫反應(yīng)。而SnRKl的鈍化促進(jìn)碳利用以及合成代謝所需要的過程(圖6)。
[0163]在擬南芥中，T6P與NADPH依賴性過程間接地相關(guān)(Kolbe等人(2005)PNASIO 2:11118-1112 3 )。擬南芥中的T6P水平傾向于與G6P水平負(fù)相關(guān)(Sch I eupmann等人(2003)美國國家科學(xué)院院刊100:6849-6854)，并且與蔗糖水平直接相關(guān)(Martinez-Barajas等人,2011)。在擬南芥中，供給鹿糖或海藻糖增加T6P水平并且啟動將碳并入淀粉中，這將碳用于儲存。T6P涉及異養(yǎng)組織中的AGP酶的氧化還原活化(Schleupmann等人(2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1_12)。另外，當(dāng)T6P水平通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)而增加時,AGP酶通過硫氧還蛋白介導(dǎo)的還原來顯著地活化。NAPDH硫氧還蛋白還原酶C(NTRC)酶使用NADPH用于AGP酶的氧化還原活化。NTRC中的突變體對海藻糖供給無反應(yīng)，提示T6P作用于AGP酶的氧化還原活化的途徑中的NTRC酶或上游。總之，植物中的T6P功能影響NADPH的能量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；T6P是必需的，因?yàn)樗刂七€原生物合成的底物NADPH的可用性。然而Τ6Ρ對NADPH依賴性氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)施加其作用的機(jī)制在植物中是未知的。在此情況下，SnRKl的參與性質(zhì)是未知的(Schleupmann等人(2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1-12)。SnRKl 為 AGP 酶活化所需要(Kolbe 等人(2005) PNAS102:11118-11123)并且在異養(yǎng)組織中AGP酶的氧化還原活化中T6P的上游以及下游似乎均具有活性。
[0164]T6P是必需代謝物，因?yàn)樗刂朴糜谏L的底物可用性。當(dāng)在具有海藻糖的培養(yǎng)基上生長時擬南芥幼苗生長受到抑制，并且當(dāng)供給蔗糖與海藻糖時該效應(yīng)被抑制。在海藻糖上的生長停滯被證明是由T6P的積累所引起；海藻糖抑制與T6P的10倍增加相關(guān)(Schluepmann等人(2004)植物生理學(xué)135:879-890)。擬南芥幼苗的生長抑制與子葉中的顯著淀粉積累相關(guān)。相比之下，根尖未顯示典型的淀粉積累。對幼苗的海藻糖供給擾亂碳分配，其中所有碳保留于來源子葉中，而在頂端碳饑餓明顯。然而，AGP酶的T6P活化以及淀粉中的碳固存不是生長抑制的原因。而實(shí)際上，SnRKl活性的T6P抑制被證明導(dǎo)致在海藻糖上的生長抑制，因?yàn)檫^表達(dá)SnRKl的催化亞基(KINlO)的幼苗在海藻糖上生長(Delatte等人(2011)植物生理學(xué)157:160-174)。因此，似乎幼苗在海藻糖上停止生長，因?yàn)門6P積累抑制了 SnRKl活性。
[0165]這可能看起來是矛盾的，因?yàn)樵趖psl突變體中太少的T6P以及在不存在外源供應(yīng)碳情況下的太多的T6P都使植物生長停止。T6P/SnRKl對植物代謝施加控制的機(jī)制遠(yuǎn)未被了解。然而，不受理論限制，在異養(yǎng)組織中，當(dāng)蔗糖可用時，T6P增加。T6P增加抑制了 SnRKl活性，這樣使得允許細(xì)胞開始對于生長所需要的合成代謝過程。當(dāng)蔗糖水平或碳可用性下降時，T6P水平下降，從而釋放SnRKl活性；合成代謝過程被抑制。還已知SnRKl活性在碳以及能量脅迫反應(yīng)期間被活化(圖6)。SnRKl感測低能量或碳信號并且介導(dǎo)使碳在庫細(xì)胞中可用于生長所需要的 過程。需要SnRKl活性直到碳再次在異養(yǎng)組織中變得可獲得為止。然后，合成蔗糖并且T6P水平增加至足以抑制SnRKl活性。
[0166]此T6P/SnRKl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?jīng)Q不是全局性的。在擬南芥中，T6P結(jié)合至SnRKl需要仍然隱蔽的可溶性蛋白質(zhì)分子，因子I (Zhang等人(2009)植物生理學(xué)149:1860-1871)，它在成熟葉子中可能檢測不到。另外，SnRKl復(fù)合物的亞基不均勻地分布于植物組織內(nèi)(Bitrian等人(2011)植物雜志65:829-842)。因此，在異養(yǎng)組織以及光自養(yǎng)組織中，在SnRKl的T6P抑制中，預(yù)期存在不均勻性(Bitrian等人(2011)植物雜志65:829-842)。另外T6P是帶電荷的代謝物并且因此不可能自由地輸出至其他細(xì)胞(Schleupmann等人(2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1_12)。
[0167]遺傳以及生物化學(xué)證據(jù)表明海藻糖途徑對于植物發(fā)育是必需的并且控制細(xì)胞形態(tài)發(fā)生。擬南芥中的TPSl酶活性損失是胚致死性的(Eastmond等人(2002)植物雜志29:225-235 ；Paul等人(2008)植物生物學(xué)年評59:417-441)。AtTPSl的表達(dá)與特定發(fā)育表型相關(guān)，如延遲的胚發(fā)育、改變的根和枝條生長、以及過渡至開花的改變。數(shù)據(jù)指示缺乏T6P會損害胚過渡至發(fā)育的細(xì)胞擴(kuò)增期的能力(Paul等人(2008)植物生物學(xué)年評59:417-441)。
[0168]在玉蜀黍中，對于花序分枝重要的RAM0SA3 (RA3)編碼單域T6PP蛋白(Satoh-Nagasawa等人(2006)自然441:227-230)。認(rèn)為環(huán)繞腋生分生組織的區(qū)域中的T6PP的表達(dá)可幫助轉(zhuǎn)導(dǎo)移動、短程信號，以便調(diào)控分生組織身份和確定性。RA3活性的損失導(dǎo)致嚴(yán)重穗異常，包括早期發(fā)育中的穗基座的長腋分枝(Eveland&Jackson (2012)實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志:1-11)。[0169]Chary等人描述細(xì)胞形狀表型-1 (csp_l)擬南芥突變體的鑒定。CSP-1在植物發(fā)育過程中展示許多缺陷，如植物株型、葉子形態(tài)、根發(fā)育、減少的枝條分枝以及延遲開花(Chary等人(2008)植物生理學(xué)146:97-107)。在AtTPS6基因中發(fā)現(xiàn)突變。這提供顯著證據(jù)表明TPS基因是細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及全植物發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。這些引人注目的發(fā)育效應(yīng)的潛在作用機(jī)制尚不明確?？赡芩鼈兪侵辽俨糠值赜蒚6P/SnRKl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來介導(dǎo)。
[0170]玉蜀黍T6P以<10μ g/GFW存在于大多數(shù)樣品中，使得難以精確地測量T6P。另外，玉蜀黍T6PP基因家族在尺寸上類似于水稻以及擬南芥，并且在大多數(shù)組織中，天然T6PP積累較高。這暗示玉蜀黍中的水稻T6PP的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能以空間以及時間方式來發(fā)揮其作用。
[0171]現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)植物中的若干種形式海藻糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)的表達(dá)賦予產(chǎn)量的顯著增加并且賦予對于各種類型脅迫(即非生物脅迫)的抗性。在分析以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)于植物中的各種T6PP變異體的過程中，發(fā)現(xiàn)顯示種子的最高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物也包含具有與底物結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基的修飾的T6PP。不受理論限制，當(dāng)與不含有這些修飾的T6PP直接比較時，這些蛋白質(zhì)可具有降低的酶活性。進(jìn)一步不受理論限制，似乎在植物中表達(dá)具有修飾酶活性的T6PP導(dǎo)致在脅迫(例如干旱)以及非脅迫田間條件下具有顯著增加產(chǎn)量的有利表型。再次不受理論限制，這可表明較小活性形式的T6PP充當(dāng)分子信號，由此賦予植物增加的淀粉、糖以及增加的種子產(chǎn)量。理論上，此分子信號可以是與海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而形成復(fù)合物，該復(fù)合物然后可向植物提供信號。理論上，此信號可以是改變水平的海藻糖-6-磷酸(T6P)。不受理論限制，但是一種可能性是修飾的T6PP在表達(dá)于植物中時與內(nèi)源性形式的TPS和/或T6PP形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。理論上此結(jié)合改變T6PP水解其底物T6P的能力并且活化或調(diào)節(jié)TPS來產(chǎn)生T6P。然后，此相互作用賦予改變水平的T6P，它然后向植物發(fā)信號以便將更多糖投入到種子和/或生物質(zhì)?；蛘?，不受理論限制，具有降低活性的修飾T6PP與仍未被鑒定的某種其他組分相互作用，導(dǎo)致啟動級聯(lián)，從而向植物發(fā)信號以便將更多糖投入到產(chǎn)量和/或生物質(zhì)?；谝陨侠碚摚S多方法可用于產(chǎn)生在任何條件下具有增加產(chǎn)量的植物。也預(yù)期可使用在此描述的方法來調(diào)節(jié)植物中的糖產(chǎn)生并且進(jìn)一步使用分子工程技術(shù)來將糖運(yùn)輸至植物的不同部分以便增加例如像植物生物質(zhì)、種子產(chǎn)量、地上植物材料(即如甘鹿)的糖含量這樣的事情，并且將糖運(yùn)輸至可消費(fèi)植物部分。另外，這些海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因可適用于賦予許多更令人希望的性狀如早期生長勢、脅迫耐性、耐旱性、增加的養(yǎng)分利用效率、增加的根群以及增加的水分利用效率。
[0172]海藻糖是由經(jīng)由α-1，I鍵連接的兩個葡萄糖分子組成的非還原二糖。糖海藻糖可發(fā)現(xiàn)于跨越多個界(例如植物、細(xì)菌、昆蟲等)的許多不同生物中。海藻糖已被證明涉及碳水化合物儲存功能并且進(jìn)一步與在細(xì)菌、真菌以及昆蟲中的脅迫耐性中起作用相關(guān)聯(lián)。在植物中，海藻糖最初被認(rèn)為限于極端微生物如復(fù)蘇植物復(fù)活草(SelaginellaI印idophylla)，然而現(xiàn)在廣泛地公認(rèn)海藻糖代謝普遍存在于植物界中。
[0173]海藻糖在兩個酶反應(yīng)中從UDP-葡萄糖以及葡萄糖-6-磷酸合成。首先UDP-葡萄糖以及葡萄糖-6-磷酸通過酶TPS (海藻糖磷酸合成酶)來轉(zhuǎn)化成UDP (尿苷二磷酸)以及α, α-海藻糖6-磷酸(Τ6Ρ)。在酶Τ6ΡΡ (海藻糖磷酸磷酸酶)催化的第二步中，Τ6Ρ被去磷酸化來產(chǎn)生海藻糖以及正磷酸鹽。(參見圖3)[0174]在酵母中，兩種酶活性(TPS以及T6PP活性)存在于較大蛋白質(zhì)復(fù)合物中，這種復(fù)合物含有活性亞基TPSl和TPS2，以及調(diào)控亞基，其中TPSl具有TPS活性并且TPS2具有T6PP活性。在大腸桿菌中，這兩種酶活性存在于單獨(dú)蛋白質(zhì)復(fù)合物中。在植物中，該蛋白質(zhì)復(fù)合物迄今為止尚未表征。
[0175]在擬南芥中，海藻糖生物合成酶已經(jīng)歸類成三個類別:
[0176]I類:含有與ScTPSl具有高相似性的四個基因，AtTPSl至AtTPS4 ；
[0177]II類:具有與ScTPS2具有高序列相似性的七個成員，AtTPS5至AtTPSll ;以及
[0178]III類:含有10個成員，AtT6PPA至AtT6PPJ，它們編碼與大腸桿菌TPS2以及ScTPS2蛋白質(zhì)的C末端具有相似性的蛋白質(zhì)。
[0179]這些類別中的編碼蛋白質(zhì)的基因也存在于其他植物物種中。
[0180]在I類以及II類中，只明確地確定了 AtTPSl的酶活性，它顯示TPS活性(Blazquez等人，植物雜志1998年3月；13(5):685_9)。意外地，迄今為止未報(bào)告其他II類TPS蛋白質(zhì)的任何一個的T6PP活性。相比之下，以前描述了 III類的兩個成員AtT6PPA以及AtT6PPB的T6PP活性(Vogel等人，植物雜志1998年3月；13 (5): 673-83)。植物III類T6PP含有發(fā)現(xiàn)于迄今為止所描述的所有T6PP酶中的兩個磷酸酶共有序列基序(Thaller等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sc1.) 1998 年 7 月；7 (7): 1647-52)。
[0181]據(jù)報(bào)告，海藻糖生物合成基因的遺傳操作導(dǎo)致植物中的脅迫耐性改進(jìn)，從而引起顯著的發(fā)育改變。據(jù)報(bào)告，大腸桿菌OtsA以及OtsB基因(T6PP以及TPS的等效物)在轉(zhuǎn)基因煙草以及馬鈴薯植物中 的過表達(dá)導(dǎo)致根和葉中的發(fā)育畸變以及矮化的植物生長。在OtsA轉(zhuǎn)基因煙草植物中產(chǎn)生較少種子并且OtsB轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物不產(chǎn)生塊莖(Goddijn等人，植物生理學(xué)1997年I月;113(1):181-90)。相似結(jié)果已經(jīng)由其他人描述(Holmstrom等人，自然，379，683-684 ；Romero 等人，植物，201，293-297 ；Pilont-Smits 等人，1998 ;植物生理學(xué)雜志(J Plant Physiol.) 152:525-532 ;Schlu印mann等人，美國國家科學(xué)院院刊2003 ;100(11):6849-54)。TPS以及T6PP基因缺陷的突變體也報(bào)告展示了發(fā)育缺陷。擬南芥中的TPSl敲除突變體展示削弱的胚發(fā)育(Eastmond等人，植物雜志2002年I月；29(2):225-35λΜο5?θθη 等人(植物細(xì)胞 2006 ；18 ;518_522)提及玉蜀黍基因 RAM0SA3(RA3)的分離和表征被報(bào)告為負(fù)責(zé)分生組織發(fā)育以及花序發(fā)育(包括分枝)。表明基因、基因產(chǎn)物以及調(diào)控區(qū)可用于操作分枝、分生組織生長、花序發(fā)育以及排列。與轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)的陰性表型可對于植物相對產(chǎn)量具有有害的影響。例如，在沒有種子形成、種子填充、植物能育性等的情況下，種子產(chǎn)量不會增加。專利申請U.S.2007/0006344是對本申請知悉的一種方法的首次報(bào)道，該方法描述T6PP在植物中的表達(dá)可賦予植物產(chǎn)量增加而不造成任何陰性表型和/或?qū)τ谥参锷锕δ艿挠泻τ绊?。美國專利申?007/0006344描述使用可操作地連接至OsMADS啟動子的海藻糖-6-磷酸磷酸酶，該啟動子將T6PP的優(yōu)先表達(dá)靶向于植物的母體繁殖組織，導(dǎo)致在水分虧缺以及較好施水條件下玉蜀黍的顯著產(chǎn)量增加。以下本發(fā)明總體上涉及鑒定具有賦予作物植物改進(jìn)產(chǎn)量以及田間藥效的修飾的T6PP并且進(jìn)一步描述可用于通過在植物中使用修飾的T6PP來增加植物的產(chǎn)量的方法。
[0182]本發(fā)明提供核苷酸序列，它們在以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)于植物中時增加脅迫或非脅迫條件下的植物活力、產(chǎn)量、氮利用和/或生物質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)，包含改變T6PP蛋白活性的修飾的T6PP蛋白(其中在直接與不具有修飾的相對T6PP相比時，活性降低)在這些修飾T6PP以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)于植物中時，賦予產(chǎn)量的顯著增加和/或增加的脅迫耐性。不受理論限制，這些修飾似乎在T6PP蛋白內(nèi)的影響T6PP與其底物T6P結(jié)合的關(guān)鍵位置處發(fā)生。理論上，如在此披露的具有降低活性的T6PP充當(dāng)植物的信號或在植物中起始某些代謝級聯(lián)或代謝途徑，從而賦予植物中向果實(shí)、籽粒、葉、根或其他部分的增加的糖運(yùn)輸，由此產(chǎn)生增加的種子產(chǎn)量、生物質(zhì)和/或根生長。
[0183]不受理論限制，針對降低的活性而修飾和/或經(jīng)修飾以便具有與內(nèi)源性TPS蛋白質(zhì)的增加結(jié)合潛力的T6PP的表達(dá)可用于起始T6PP/TPS復(fù)合物，然后所述T6PP/TPS復(fù)合物的存在賦予植物增加的產(chǎn)量和/或增加的脅迫耐性。在另一個實(shí)施例中，不受理論限制，T6PP/TPS復(fù)合物賦予植物改變水平的T6P，這然后賦予植物增加的產(chǎn)量和/或增加的脅迫耐性。在本發(fā)明的一方面，轉(zhuǎn)基因T6PP/TSPS復(fù)合物可以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)于植物中以便賦予植物增加的產(chǎn)量和/或增加的脅迫耐性。在另一個實(shí)施例中，預(yù)期各種化學(xué)結(jié)構(gòu)和或分子結(jié)構(gòu)可經(jīng)由相應(yīng)領(lǐng)域熟知的方法來構(gòu)建以便模擬如在此描述那些的T6PP/TSPS復(fù)合物的功能。在一個實(shí)施例中，不受理論限制，任何T6PP可經(jīng)過修飾以便具有降低的與T6P的底物結(jié)合，然后當(dāng)修飾的T6PP以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)于植物中時賦予增加的產(chǎn)量以及田間藥效。在一些情況下，核苷酸序列編碼涉及海藻糖生物合成途徑的蛋白質(zhì)，在一個實(shí)施例中，蛋白質(zhì)編碼T6PP。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，將T6PP從被子植物的基因組中分離，并且然后如在此描述來修飾。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，從單子葉植物中分離T6PP基因。在一方面，在此披露的T6PP基因是從水稻植物的基因組中分離。
[0184]在此描述的T6PP基因主要是HAD超家族磷酸酶的成員或包含如在SEQ ID NO:9中描繪的蛋白質(zhì)共有序列。也可被稱為DDDD磷酸酶超家族的HAD磷酸酶超家族包括保守α/β核心域以及其功能(即底物結(jié)合等)可變化的蓋子結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，修飾位于Τ6ΡΡ的蓋子結(jié)構(gòu)域、磷酸酶結(jié)構(gòu)域、A-磷酸酶盒結(jié)構(gòu)域或B-磷酸酶盒結(jié)構(gòu)域中的任何一個，其中所述修飾改變與其底物(例如Τ6Ρ)的結(jié)合。在另一個實(shí)施例中，修飾可包括如SEQ ID NO:9中描繪的相對Τ6ΡΡ蛋白共有序列的一個或多個氨基酸殘基的置換、缺失或添加中的一種或多種，其中一個或多個氨基酸殘基的置換、缺失或添加在Τ6ΡΡ以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)于植物中時賦予所述Τ6ΡΡ的改變活性和/或增加的Τ6Ρ水平。不受理論限制，認(rèn)為產(chǎn)生具有降低催化活性(即減少的Τ6Ρ水解)的Τ6ΡΡ蛋白變異體在植物內(nèi)產(chǎn)生信號，該信號賦予增加的產(chǎn)量和/或增加的脅迫(例`如干旱、熱、冷)耐性。理論上，具有降低活性的Τ6ΡΡ可與TPS相互作用，從而形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0185]理論上，經(jīng)過修飾以便具有降低酶活性的Τ6ΡΡ可充當(dāng)植物的代謝信號以便將糖投入到種子和/或糖的產(chǎn)生。另外，這些修飾Τ6ΡΡ還可充當(dāng)代謝信號來起始賦予植物增加的對于非生物和/或生物脅迫的耐性的過程。再次不受理論限制，認(rèn)為與對照植物相比或與過表達(dá)活性形式Τ6ΡΡ的轉(zhuǎn)基因植物相比時，表達(dá)具有降低活性的修飾Τ6ΡΡ的植物將具有改變水平的海藻糖。
[0186]預(yù)想的是，具有Τ6ΡΡ活性的任何Τ6ΡΡ或酶可經(jīng)過工程設(shè)計(jì)以便具有降低的活性并且因而被用于產(chǎn)生具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物或生物(例如海藻)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，包含如SEQ ID NO:9中描繪的共有序列的蛋白質(zhì)可用于如在此描述的方法中。如在此使用的，術(shù)語“減少的活性”是指Τ6ΡΡ活性的任何降低。例如經(jīng)過修飾以便相對于對照或天然 Τ6ΡΡ 基因具有 Τ6ΡΡ 活性的 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%降低的酶可適用于產(chǎn)生具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，T6PP多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO:9描述的共有序列具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%序列一致性。在另一個實(shí)施例中，T6PP包含如SEQ IDNO:9描述的共有序列，其中執(zhí)行至少一個修飾(包括氨基酸置換、氨基酸缺失、氨基酸添加)并且所述修飾減少所述T6PP的活性且/或增加所述T6PP與TPS形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的可能性。在另一個實(shí)施例中，與不表達(dá)不具有降低活性的T6PP變異體的對照相比，表達(dá)具有降低活性的T6PP變異體和/或具有與TPS形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的增加可能性的T6PP的植物具有改變水平的T6P，其中改變水平的T6P賦予植物增加的產(chǎn)量(例如種子產(chǎn)量、生物質(zhì)、生長勢)、細(xì)胞生長、糖含量、淀粉含量以及增加的脅迫(干旱、熱、冷、鹽度、洪水、非生物和/或生物脅迫)耐性。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，具有減少活性的T6PP變異體在植物中的表達(dá)是針對植物繁殖組織。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，基因表達(dá)模式可能在延長植物耐旱性的持續(xù)時間中是重要的。例如，可構(gòu)建表達(dá)盒以便在植物開花期間表達(dá)修飾的T6PP，因而賦予此發(fā)育階段的植物耐旱性。同樣地，還可構(gòu)建這樣的表達(dá)盒，它們在植物中組成性表達(dá)修飾的T6PP，因而在整個植物生命周期中賦予耐旱性。預(yù)期的是，T6PP可經(jīng)由如SEQ ID NO:9描繪的共有序列的保守氨基酸殘基以外的修飾來建模以便具有降低活性，其中該修飾減少T6PP與T6P的結(jié)合且/或所述修飾增加T6PP與TPS形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的可能性。
[0187]在一個實(shí)施例中，可降低T6PP活性，方法是照射DNA并且因而在表達(dá)于植物中時產(chǎn)生具有降低活性的變異體。同樣地，預(yù)期可使用常見技術(shù)如基因改組來產(chǎn)生具有降低活性的T6PP變異體。預(yù)想的是，人們可產(chǎn)生化學(xué)正交結(jié)構(gòu)，它們可在某種意義上模擬無活性T6PP蛋白結(jié)構(gòu)并且在一個實(shí)施例中與植物TPS形成復(fù)合物，因此賦予植物增加的產(chǎn)量。在另一個實(shí)施例中，可產(chǎn)生這樣一種化學(xué)正交結(jié)構(gòu)，它可模擬T6PP/TPS復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，這然后可應(yīng)用于植物(例如化學(xué)應(yīng)用)以便賦予增加的產(chǎn)量以及脅迫耐性(即耐旱性)。預(yù)想的是，可將化學(xué)正交結(jié)構(gòu)應(yīng) 用于植物以便在植物的給定繁殖或發(fā)育階段調(diào)節(jié)糖運(yùn)輸。
[0188]預(yù)期的是，來自任何類別或家族的T6PP基因可用于在此披露的本發(fā)明的任何方法和/或方面。進(jìn)一步預(yù)期的是，具有類似序列同源性(例如相對于SEQ ID NO:1的大于或等于50%、75%、80%或85%序列一致性)和/或所分離或合成的分子結(jié)構(gòu)的T6PP基因可用于如在此描述的實(shí)施例中。T6PP已被證明普遍存在于植物界成員之中并且許多實(shí)例已被證明在多個植物屬類以及物種間具有保守功能。因此，預(yù)期編碼賦予降低活性和/或降低的與T6P的結(jié)合和/或增加的與TPS的結(jié)合的T6PP蛋白的合成核酸可用于在此披露的方法中，以便賦予植物如在此描述的有利性狀(例如增加的產(chǎn)量、增加的生物質(zhì)、增加的植物活力)。
[0189]在此披露的方法進(jìn)一步描述以如在此披露的多核苷酸來轉(zhuǎn)化植物。包含在此披露的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物可展示增加的細(xì)胞生長、增加的植物和/或幼苗勢、增加的產(chǎn)量、增加的種子重量以及增加的生物質(zhì)。通過在此方法產(chǎn)生的植物預(yù)期具有增加的非生物脅迫耐性。預(yù)想的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物將會賦予增加的根生長，這可在以下方面具有許多積極意義:植物的水分利用效率以及養(yǎng)分利用效率，以及降低商業(yè)農(nóng)業(yè)用地的土壤侵蝕的發(fā)生率。還預(yù)期的是，包含如在此描述的多核苷酸的植物還可由于增加的生長而展示對于昆蟲取食的較高耐性。在一些情況下，本發(fā)明描述的植物具有增加的直立性和/或減少的作物倒伏風(fēng)險(xiǎn)，因此賦予轉(zhuǎn)基因植物能夠經(jīng)受住如強(qiáng)風(fēng)或冰雹的天氣條件。在此描述的轉(zhuǎn)基因植物可在植物的生物質(zhì)產(chǎn)量以及籽粒產(chǎn)量方面產(chǎn)生較高產(chǎn)量。本發(fā)明的一個方面提供可對于給定T6PP基因序列來執(zhí)行的各種修飾，這些修飾可用于轉(zhuǎn)基因植物中以便賦予增加的產(chǎn)量。在此的轉(zhuǎn)基因植物可在最佳和/或非最佳生長條件下賦予產(chǎn)量增加。
[0190]以下任何提及“適用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為是指在此定義的海藻糖途徑的多肽，包括但不局限于T6PP多肽。以下任何提及“適用于本發(fā)明方法的核酸”應(yīng)理解為是指能夠編碼海藻糖途徑多肽，如T6PP多肽的核酸。
[0191]用于調(diào)節(jié)編碼適用于本發(fā)明方法的T6PP蛋白的核酸的表達(dá)的優(yōu)選方法是通過在植物中引入并且表達(dá)編碼如以下定義的適用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的核酸。
[0192]有待引入植物(并且因此適用于執(zhí)行本發(fā)明方法)的核酸是編碼海藻糖途徑的酶的任何核酸。在此定義的“T6PP多肽”是指包含至少一個海藻糖-磷酸酶結(jié)構(gòu)域的具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性的任何多肽。海藻糖-磷酸酶結(jié)構(gòu)域通常為200與250個氨基酸之間的長度并且通常包括在迄今為止所描述的所有T6PP酶中發(fā)現(xiàn)的磷酸酶共有序列基序(Thaller等人，1998)。該海藻糖-磷酸酶結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列給出于SEQ ID N0:10中。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易能夠使用在本領(lǐng)域中已知的工具以及技術(shù)來鑒定海藻糖-磷酸酶結(jié)構(gòu)域的存在。此磷酸酶共有序列基序通常包含兩個磷酸酶盒，稱之為A-磷酸酶盒以及B-磷酸酶盒。SEQ ID NO: 11代表 磷酸酶盒A的共有序列并且SEQ ID NO: 12代表磷酸酶盒B的共有序列。
[0193]優(yōu)選地，有待引入植物中的核酸編碼與選自SEQ ID N01、3、5以及7的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的T6PP蛋白。最優(yōu)選地，種類T6PP核酸如SEQ ID NOl、3、5以及7中的任何一個所表示。
[0194]適用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)以及編碼它們的核酸的實(shí)例在此提供于實(shí)例5的表中。
[0195]實(shí)例5的表中給出的任何氨基酸序列的同源物也適用于本發(fā)明方法。蛋白質(zhì)的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)以及酶，它們相對于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸置換、缺失和/或插入，并且具有與其所來源的未修飾蛋白質(zhì)類似的生物活性以及功能活性。
[0196]缺失是指從蛋白質(zhì)中移除一個或多個氨基酸。
[0197]插入是指向蛋白質(zhì)中的預(yù)定部位中引入一個或多個氨基酸殘基。插入可包括N末端和/或C末端融合以及單一或多個氨基酸的序列內(nèi)插入。
[0198]一般來說，氨基酸序列內(nèi)的插入將比N或C末端融合少約I至10個殘基的數(shù)量級。N或C末端融合蛋白或肽的實(shí)例包括如以下所使用的轉(zhuǎn)錄活化劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或活化結(jié)構(gòu)域:酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6_標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白質(zhì)A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG? _表位、IacZ, CMP (鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白質(zhì)C表位以及VSV表位。
[0199]置換是指蛋白質(zhì)的氨基酸置換為具有類似特性(如類似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)或片層結(jié)構(gòu)的傾向)的其他氨基酸。氨基酸置換通常是單一殘基，但是取決于對于多肽的功能約束而可為成簇的；插入通常具有約I至10個氨基酸殘基的數(shù)量級。氨基酸置換優(yōu)選地是保守氨基酸置換。保守置換表在本領(lǐng)域中是熟知的(參見例如 Creighton (1984)蛋白質(zhì)(Proteins) W.H.Freeman and Company 以及下表)。[0200]表:保守氨基酸置換的實(shí)例
【權(quán)利要求】
1.一種具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性的分離多肽，其中該多肽被修飾為與未修飾的海藻糖-6-磷酸磷酸酶相比具有降低的酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中該多肽包含具有至少一個修飾氨基酸的SEQID NO:9。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中該修飾是在保守氨基酸中產(chǎn)生的。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中該修飾是在CAP結(jié)構(gòu)域、磷酸酶結(jié)構(gòu)域、A-磷酸酶結(jié)構(gòu)域、或B-磷酸酶結(jié)構(gòu)域中的至少一個內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中該多肽可引起野生型海藻糖-6-磷酸磷酸酶的體外活化。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的多肽，其中當(dāng)該多肽表達(dá)于植物中時在該植物中賦予增加的產(chǎn)量或脅迫耐性。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中該植物是單子葉植物或雙子葉植物。
8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中該植物是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:玉蜀黍、甘蔗、大豆、水稻、高粱或小麥。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予增加的干旱耐性。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述修飾包括(a)氨基酸置換、(b)氨基酸缺失、或(C)氨基酸添加中的任何一個或組合。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的多肽，其中該多肽是磷酸酶的鹵代酸脫鹵酶(HAD)超家族的成員。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的多肽，其中該多肽的酶活性降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99% 或 100%。
13.一種植物、植物細(xì)胞、植物部分或植物樣品，包含如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的海藻糖-6-磷酸磷酸酶多肽。
14.一種編碼如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的海藻糖-6-磷酸磷酸酶多肽的多核苷酸。
15.—種包含如權(quán)利要求15所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
16.—種包含如權(quán)利要求15所述的多核苷酸的提取物。
17.—種表達(dá)盒，包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸，該啟動子確保所述多核苷酸在植物中轉(zhuǎn)錄，其中所述多核苷酸編碼如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的多肽。
18.如權(quán)利要求18所述的表達(dá)盒，其中該啟動子在植物繁殖組織中表達(dá)所述多核苷酸。
19.如權(quán)利要求19所述的表達(dá)盒，其中該繁殖組織是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:小穗組織、穗節(jié)、苞片組織、小穗分生組織、花序梗組織、以及未成熟的花組織。
20.如權(quán)利要求18所述的表達(dá)盒，其中該啟動子是OsMADS啟動子。
21.如權(quán)利要求21所述 的表達(dá)盒，其中該啟動子是0sMADS6啟動子。
22.一種用于增加植物產(chǎn)量的方法，該方法包括: a)將如權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中； b)從a)的植物細(xì)胞再生植物；并且C)產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的植物。
23.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該植物是一種單子葉植物。
24.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該植物是玉蜀黍、水稻、小麥、高粱、甘蔗或草坪草。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其中該植物是一種雙子葉植物。
26.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該植物是大豆。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中產(chǎn)量增加是通過與對照植物相比的以下任何一項(xiàng)的增加來指示的:不結(jié)果實(shí)減少、每株植物的穗數(shù)增加、以及每株植物的粒數(shù)增加。
28.一種用于增加植物對于非生物脅迫的耐性的方法，該方法包括: a)將如權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中； b)從a)的植物細(xì)胞再生植物；并且 c)產(chǎn)生具有增加的非生物脅迫耐性的植物。
29.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該植物是一種單子葉植物。
30.如權(quán)利要求30所述的方法，其中該植物是玉蜀黍、水稻、小麥、高粱、甘蔗或草坪草?！?br> 31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該植物是一種雙子葉植物。
32.如權(quán)利要求32所述的方法，其中該植物是大豆。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述非生物脅迫包括選自下組的脅迫，該組由以下各項(xiàng)組成:水分脅迫、熱脅迫或冷脅迫。
34.如權(quán)利要求34所述的方法，其中水分脅迫是由干旱導(dǎo)致的。
35.一種在水分虧缺條件下減少植物不結(jié)果實(shí)、增加每株植物的穗數(shù)和/或每株植物的粒數(shù)的方法，該方法包括: a)將如權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中； b)從a)的植物細(xì)胞再生植物；并且 c)產(chǎn)生植物，當(dāng)與不包含所述表達(dá)盒的對照植物相比時，該植物不結(jié)果實(shí)減少、每株植物的穗數(shù)和/或每株植物的粒數(shù)增加。
36.一種改變植物的海藻糖-6-磷酸水平的方法，該方法包括: a.鑒定來自海藻糖途徑的一種或多種多肽； b.修飾該一種或多種多肽以便具有改變的酶活性； c.將至少包含編碼修飾多肽的多核苷酸的表達(dá)盒引入植物中；并且 d.產(chǎn)生具有改變水平的海藻糖-6-磷酸的植物。
37.如權(quán)利要求37所述的方法，其中該改變水平的海藻糖-6-磷酸導(dǎo)致在植物的穗節(jié)組織的干旱脅迫期間在磷酸戊糖支路途徑中的基因表達(dá)的增加。
38.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該改變水平的海藻糖-6-磷酸引起植物的穗節(jié)組織中碳酸酐酶水平的增加。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中該修飾多肽表達(dá)在植物繁殖組織中。
40.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該修飾多肽表達(dá)在選自下組的植物組織中，該組由以下各項(xiàng)組成:小穗組織、穗節(jié)、苞片組織、小穗分生組織、花序梗組織、以及未成熟的花組織。
41.如權(quán)利要求41所述的方法，其中該修飾多肽表達(dá)在穗節(jié)中。
42.如權(quán)利要求37所述的方法，其中該修飾多肽具有降低的酶活性。
43.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該修飾多肽可引起野生型海藻糖-6-磷酸磷酸酶的體外活化。
44.如權(quán)利要求37所述的方法，其中該修飾多肽具有選自下組的活性，該組由以下各項(xiàng)組成:海藻糖-6-磷酸合成酶；海`藻糖-6-磷酸磷酸酶、以及海藻糖酶。
【文檔編號】C12N9/16GK103717732SQ201280035018
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月15日
【發(fā)明者】S·巴蘇, J·科恩, M·努奇奧 申請人:先正達(dá)參股股份有限公司