改進(jìn)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及優(yōu)化的桿狀病毒構(gòu)建物，其可用于生產(chǎn)病毒（樣）粒子或病毒載體，特別是用于基因治療的病毒載體。【專利說(shuō)明】改進(jìn)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)[0001]本發(fā)明涉及優(yōu)化的桿狀病毒構(gòu)建物，其可用于生產(chǎn)病毒(樣)粒子或病毒載體，特別是用于基因治療的病毒載體?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEV)被用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)高水平的重組蛋白。它一般是基于桿狀病毒多角體蛋白基因(Polh)的缺失，所述基因被待表達(dá)的基因替換，所述待表達(dá)的基因在Polh啟動(dòng)子的控制下。將細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)、抗生素抗性基因和受體Tn7重組位點(diǎn)整合到桿狀病毒基因組中(即桿粒)極大地改進(jìn)了這種系統(tǒng)，使其能夠快得多地產(chǎn)生重組病毒(Luckow等，1993)。大多數(shù)可商購(gòu)的桿狀病毒載體缺少polh基因并除此之外具有完整的基因組，但是OxfordExpressionbTechnologies公司以商品名fIashBACGOLD發(fā)售幾丁質(zhì)酶基因和組織蛋白酶基因陰性的桿狀病毒載體。因此，預(yù)期這種表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)行改進(jìn)。已顯示，從AcMNPV基因組缺失幾丁質(zhì)酶基因和組織蛋白酶基因?qū)?xì)胞內(nèi)和分泌的重組蛋白的穩(wěn)定性具有積極的影響(Kaba等,2004)。還已顯示,幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶、p26、pl0和P74缺陷的BEV允許生產(chǎn)與使用非缺失病毒獲得的重組蛋白相比更高水平的重組蛋白(Hitchman等，2009)。然而，在這后一項(xiàng)研究中獲得的表達(dá)數(shù)據(jù)僅涉及單一重組蛋白。為了生產(chǎn)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)例如病毒載體和病毒樣粒子，必需生產(chǎn)一種或多種蛋白，并且在病毒載體的情況下，還必需生產(chǎn)病毒基因組。根據(jù)Hitchman等的結(jié)果，沒(méi)有證據(jù)表明當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因、組織蛋白酶基因、p26基因、plO基因和p74基因缺失時(shí)，可以在蛋白質(zhì)質(zhì)量方面改善這樣的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)。[0003]本研究的目的是提供用于生產(chǎn)病毒載體和/或病毒樣粒子的優(yōu)化的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。【
發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含p26和p74桿狀病毒基因的0RF，同時(shí)桿狀病毒的組織蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因和plO基因被破壞。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，PlO基因被破壞而沒(méi)有缺失plO啟動(dòng)子。在另一種實(shí)施方式中，重組桿狀病毒基因組包含一個(gè)或多個(gè)異源目的序列。[0005]本發(fā)明的另一方面涉及一種重組桿狀病毒基因組，其中桿狀病毒的組織蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、P26基因、p74基因和plO基因被破壞，并且其中所述重組桿狀病毒基因組包含編碼病毒載體或病毒樣粒子的一部分的異源序列。[0006]在另一方面，本發(fā)明提供了一種重組桿狀病毒，其包含如上所述的重組桿狀病毒基因組。[0007]在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，所述方法包括將含有本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組的原核細(xì)胞在允許生產(chǎn)桿狀病毒的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。[0008]在另一方面，提供了包含本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組的宿主細(xì)胞。[0009]另一方面提供了一種用于生產(chǎn)重組蛋白或核酸(例如RNA或DNA分子或重組基因組，所述重組基因組是例如RNA或DNA基因組)的方法，所述方法包括將帶有一種或數(shù)種本發(fā)明的重組桿狀病毒的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，其中異源目的序列編碼重組蛋白或核酸。[0010]在另一方面,本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)病毒載體或病毒樣粒子的方法,所述方法包括將帶有一種或數(shù)種重組桿狀病毒的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，每種所述重組桿狀病毒包含帶有可用于生產(chǎn)所述病毒載體或病毒樣粒子的異源目的序列的重組桿狀病毒基因組，其中所有重組桿狀病毒包含具有完整的P26和P74桿狀病毒基因的ORF的重組桿狀病毒基因組，其中桿狀病毒的組織蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因和PlO基因的ORF被破壞，并且其中plO基因的啟動(dòng)子未被破壞。[0011]在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)病毒載體或病毒樣粒子的方法，所述方法包括將帶有一種或數(shù)種重組桿狀病毒的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，每種所述重組桿狀病毒包含帶有可用于生產(chǎn)所述病毒載體或病毒樣粒子的異源目的序列的重組桿狀病毒基因組，[0012]其中所有重組桿狀病毒包含其中桿狀病毒的組織蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、p26基因、p74基因和plO基因被破壞的重組桿狀病毒基因組。[0013]在一種實(shí)施方式中,執(zhí)行上述方法來(lái)生產(chǎn)重組AAV載體。[0014]本發(fā)明涉及優(yōu)化的重組桿狀病毒基因組及其使用方法。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因和plO基因的破壞不提聞昆蟲(chóng)細(xì)胞中廣生的重組AAVCrAAV)粒子的水平，但允許產(chǎn)生對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有提高的感染性的rAAV粒子。這一結(jié)果是非常出人意料的，因?yàn)镠itchman等(同上)報(bào)道了從組織蛋白酶_、幾丁質(zhì)酶-、p26_、pl0_和p74_缺失的桿狀病毒產(chǎn)生的單個(gè)重組蛋白具有更高的表達(dá)水平，盡管這一研究沒(méi)有報(bào)道病毒載體的產(chǎn)生。本文所示的結(jié)果具體表明，使用上述桿狀病毒基因被破壞的桿狀病毒，沒(méi)有提高編碼VP1、VP2和VP3的AAVcap基因的表達(dá)水`平(該結(jié)果不同于從Hitchman等的公開(kāi)內(nèi)容所預(yù)期的結(jié)果)。相反，VPl和VP2的降解水平降低，并且使用這種缺失桿狀病毒產(chǎn)生的rAAV粒子與從野生型桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)桿粒(即沒(méi)有對(duì)幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶、p26、plO和/或P74基因座進(jìn)行修飾)產(chǎn)生的rAAV粒子相比，顯示出感染性提高4倍。[0015]本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組優(yōu)先能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞中和原核細(xì)胞例如大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行復(fù)制。具體來(lái)說(shuō)，可以使用含有BAC復(fù)制子的任何病毒桿狀病毒基因組。在特定實(shí)施方式中，重組桿狀病毒基因組是桿粒。適合的桿狀病毒序列包括苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)(Ac)MNPV桿粒。[0016]桿狀病毒常用于感染昆蟲(chóng)細(xì)胞以表達(dá)重組蛋白。具體來(lái)說(shuō)，可以按例如下述文獻(xiàn)中所描述的來(lái)實(shí)現(xiàn)異源基因在昆蟲(chóng)中的表達(dá):u.S.4，745，051；Friesen等，1986；EP127,839；EP155,476；Vlak等，1988;Miller等，1988;Carbonell等，1988;Maeda等，1985；Lebacq-Verheyden等，1988；Smith等，1985；Miyajima等，1987;和Martin等，1988。Luckow等，1988；Miller等，1986；Maeda等，1985；McKenna,1989；vanOers,2011和Lynn,2007中描述了可用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的多種桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的許可性昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞。[0017]根據(jù)本發(fā)明，可以使用源自于常用于蛋白質(zhì)和生物藥品的重組表達(dá)的桿狀病毒的任何桿狀病毒基因組。例如，桿狀病毒基因組可以源自于例如AcMNPV、家蠶(Bombyxmori)(Bm)NPV、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)(Hear)NPV或甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)(Se)MNPV,優(yōu)選源自于AcMNPV。具體來(lái)說(shuō)，桿狀病毒基因組可以源自于AcMNPV克隆C6(基因組序列:Genbank登記號(hào)NC_001623.1)或E2(Smith和Summers,1979)。[0018]本發(fā)明實(shí)施了桿狀病毒基因的破壞。為此目的可以實(shí)施數(shù)種策略，特別是突變，例如通過(guò)從(重組)桿狀病毒基因組缺失所選基因。用于研究基因功能的公知和已建立的方法是通過(guò)同源重組在細(xì)菌中操縱桿狀病毒基因組，所述同源重組使用針對(duì)單一基因或一段側(cè)翼基因的基于ET(大腸桿菌RecE和RecT蛋白)或λred的重組，所述單一基因或一段側(cè)翼基因隨后被抗生素選擇標(biāo)志物替換(Datsenko和Wanner,2000；ffesternberg等,2010)。為了在同一基因組中制備多個(gè)缺失，需要使用數(shù)種不同的選擇標(biāo)志物，或者選擇標(biāo)志物需要在側(cè)翼帶有獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，允許在每次基因缺失后通過(guò)消化和重新連接來(lái)移除。源自于在細(xì)菌基因組中制造連續(xù)缺失/插入的方法(Suzuki等,2007；Suzuki等,2005)的一種策略已被改造成用于桿粒技術(shù)(Marek等，2011)，并且已被有效地用在本研究中。它利用改良的cre-lox重組酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用修飾的1xP位點(diǎn)來(lái)做出連續(xù)突變。在通過(guò)同源重組用選擇標(biāo)志物例如氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶抗生素標(biāo)志物替換第一基因后，由于在標(biāo)志物兩端處存在1xP位點(diǎn)，可以將所述標(biāo)志物移除。在所使用的設(shè)置中，使用兩個(gè)修飾的1xP位點(diǎn)(1x66和1x71),每個(gè)位點(diǎn)具有不同的突變。在通過(guò)ere-重組酶重組后，1οχ72位點(diǎn)被留下(Lambert等,2007),該位點(diǎn)于是具有兩個(gè)突變而不是一個(gè),并且不再能夠被ere-重組酶識(shí)別。這允許隨后缺失第二靶基因。[0019]在特定實(shí)施方式中，chi/v-cath(根據(jù)AcMNPV遺傳圖譜(Ayres等，1994),第105282-107954位核苷酸)和plO(第118839-119121位核苷酸)基因被破壞。[0020]在特定實(shí)施方式中，在破壞p26和/或p74基因、優(yōu)選地p26和p74基因(第118044-121072位核苷酸)的編碼序列的全部或一部分的同時(shí)，進(jìn)行plO基因的破壞。[0021]在另一種特定實(shí)施方式中，對(duì)plO進(jìn)行破壞而不破壞相鄰的p26和p74基因的0RF。在這種實(shí)施方式的一種優(yōu)選變化形式中，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組仍包含plO啟動(dòng)子(因此，plO編碼序列被破壞而不缺失其啟動(dòng)子,根據(jù)AcMNPV遺傳圖譜,所述啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)于第118739-118836位核苷酸)。在另一種實(shí)施方式中，plO啟動(dòng)子也被缺失。下面顯示，破壞PlO基因的ORF同時(shí)保留其完整的啟動(dòng)子并且不破壞p26和p74基因的0RF，與重組桿狀病毒基因組中這三個(gè)基因都被破壞時(shí)相比，允許產(chǎn)生更有效的rAAV病毒粒子。[0022]本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組可用于按照基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)領(lǐng)域中公知的方法生產(chǎn)重組蛋白或核酸。因此，重組桿狀病毒基因組還可以帶有可用于生產(chǎn)重組蛋白、核酸或用于生產(chǎn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)例如病毒載體和病毒樣粒子的異源核苷酸序列。[0023]根據(jù)本發(fā)明，異源核苷酸序列是可用于生產(chǎn)目的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)、核酸例如mRNA、siRNA、反義核苷酸序列、發(fā)夾序列、病毒基因組例如用于基因治療的重組病毒基因組)的序列。[0024]因此，本發(fā)明還涉及如上定義的包含異源序列的重組桿狀病毒基因組(以及包含所述重組桿狀病毒基因組的重組桿狀病毒和宿主細(xì)胞)。[0025]可以將異源序列插入到桿狀病毒中已知的位點(diǎn)或基因座中，以允許表達(dá)插入序列。例如，經(jīng)典地，多角體蛋白基因座被用作異源核苷酸序列的插入位點(diǎn)(尤其是經(jīng)由桿粒的Tn7重組位點(diǎn))。[0026]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組的重組桿狀病毒和宿主細(xì)胞。[0027]本發(fā)明的重組桿狀病毒非常適用于生產(chǎn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)例如病毒載體或病毒樣粒子。在后一種情況下，可以從數(shù)種重組桿狀病毒基因組表達(dá)所述復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組分，每種所述基因組攜帶所述復(fù)雜結(jié)構(gòu)的至少一種組分，并且每種所述組分由被包含在本發(fā)明的不同重組桿狀病毒中的異源核苷酸序列編碼。當(dāng)使用這樣的一組重組桿狀病毒來(lái)生產(chǎn)數(shù)種重組組分時(shí)，優(yōu)選地所有桿狀病毒載體應(yīng)該在幾丁質(zhì)酶基因、組織蛋白酶基因、P26基因、p74基因和PlO基因中具有相同的修飾。[0028]例如，為了生產(chǎn)重組AAV，可以使用包含三種桿狀病毒的系統(tǒng):編碼AAVRep蛋白的桿狀病毒，編碼AAVCap蛋白的桿狀病毒和編碼在兩個(gè)AAVITR之間包含目的基因(例如治療性基因)的AAV-1TR基因組的桿狀病毒(Manno等，2006；Mendell等，2010；Simonelli等，2010)。包含兩種桿狀病毒的系統(tǒng)(雙重感染系統(tǒng))現(xiàn)在也是可用的，其中編碼AAVRep蛋白和AAVCap蛋白的DNA序列由一種桿狀病毒提供。在實(shí)施例中使用后一種雙重感染系統(tǒng)。[0029]因此，本發(fā)明還涉及如上定義的重組桿狀病毒基因組(以及包含所述重組桿狀病毒基因組的重組桿狀病毒和宿主細(xì)胞)，所述重組桿狀病毒基因組包含編碼病毒載體或病毒樣粒子的一部分的異源序列。[0030]在特定實(shí)施方式中，桿狀病毒載體編碼:[0031]-rAAV基因組，或[0032]-AAVR印蛋白，或[0033]-AAVCap蛋白，或[0034]-AAV組裝活化蛋白(AAP)。[0035]在特定實(shí)施方式中，所述重組桿狀病毒基因組包含優(yōu)選地以相反取向包含AAVrep和cap基因的表達(dá)盒。[0036]宿主細(xì)胞可以是用于生產(chǎn)重組蛋白、核酸、病毒或病毒樣粒子的生產(chǎn)細(xì)胞，所述生產(chǎn)細(xì)胞已被一種或多種本發(fā)明的桿狀病毒感染。當(dāng)然，控制重組桿狀病毒基因組中存在的異源核苷酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子以及5’和3’非翻譯區(qū)例如多腺苷酸化信號(hào)或miCToRNA靶區(qū)域最終取決于用于表達(dá)所述異源序列的產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。如果宿主細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，則需要使用在昆蟲(chóng)細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子(例如PlO和多角體蛋白極晚期桿狀病毒啟動(dòng)子或其組合)。在哺乳動(dòng)物生產(chǎn)宿主細(xì)胞的情況下，啟動(dòng)子可以是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，例如人類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。[0037]本發(fā)明的細(xì)胞可以選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、優(yōu)選為人類細(xì)胞，秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)細(xì)胞，酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞。[0038]用于實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選的酵母細(xì)胞是釀酒酵母(S.cervisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、白假絲酵母(C.albicans)和巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)。[0039]用于實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選的大腸桿菌細(xì)胞是ToplO、DH5a、DHlOβ、TG1、BW23473、BW23474.MW003和MW005細(xì)胞(Westernberg等，2010)。[0040]用于實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選的昆蟲(chóng)細(xì)胞是草地貪夜蛾(S.frugiperda)細(xì)胞，優(yōu)選為Sf9、Sf21、ExpressSf+,或粉紋夜蛾(Trichoplusiani)HighFive細(xì)胞和黑腹果蜆(D.melanogaster)、優(yōu)選為S2Schneider細(xì)胞。[0041]用于實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選的人類細(xì)胞選自HeLa、Huh7、HEK293、H印G2、KATO-1II,MR32、MT-2、胰腺β-細(xì)胞、角化細(xì)胞、骨髓成纖維細(xì)胞、CHP212、原代神經(jīng)細(xì)胞、W12、SK-N-MC,Saos-2、WI38、原代肝細(xì)胞、FLC4、143TK_、DLD-1、胚胎肺成纖維細(xì)胞、原代包皮成纖維細(xì)胞、Saos-2骨肉瘤、MRC5和MG63細(xì)胞。[0042]現(xiàn)在將結(jié)合下面的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述?！緦＠綀D】【附圖說(shuō)明】[0043]圖1.缺失幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plOORF而留下完整的plO啟動(dòng)子(ΛCCAplO)或與p26、plO和ρ74基因缺失相組合(ACCAp26pl0p74)的AcMNPV桿粒的示意性圖譜。[0044]AcMNPV桿粒的幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO或p26、plO、p74基因已被失活。將AAVrep2/cap8表達(dá)盒插入到所述桿粒的Tn7位點(diǎn)處。在同一桿粒骨架上，將rAAV基因(在本實(shí)施例中為mSeAP)轉(zhuǎn)移到Tn7位點(diǎn)處。[0045]圖2.總樣品和純化樣品中的rAAV病毒基因組測(cè)定。[0046]在源自于使用野生型、ACCAplO-、ΛCCΛρ26ρ10ρ74_桿狀病毒骨架進(jìn)行的生產(chǎn)的總樣品或純化產(chǎn)物樣品中，評(píng)估rAAV生產(chǎn)率。通過(guò)QPCR來(lái)定量rAAV滴度并將其表示為病毒基因組/mL(vg/mL)/mL(藍(lán)色條),通過(guò)QPCR來(lái)定量污染的桿狀病毒滴度,單位為vg/ml(紅色點(diǎn))。(a)rAAV總樣品(b)免疫親和純化的rAAV。[0047]圖3.純化的rAAV載體的表征。[0048]通過(guò)SDS-PAGE，然后進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色(a)或AAVVP蛋白的Western印跡(b)，來(lái)分析免疫親和純化的rAAV載體。[0049]1:使用野生型桿狀病毒生產(chǎn)的AAV-mSeAP(5xl010vg)`[0050]2:使用桿狀病毒Λ(ΧΛρ26ρ10ρ74生產(chǎn)的AAV8_mSeAP(5xl010vg)[0051]3:使用桿狀病毒ACCAplO生產(chǎn)的AAV8_mSeAP(5xl010vg)[0052]圖4.rAAV載體的體內(nèi)評(píng)估。[0053]將使用野生型或ΛCCΛρ26ρ10ρ74或ΛCCΛρ10桿狀病毒生產(chǎn)的rAAV8_mSeAP以IO9Vg的量肌內(nèi)注射到小鼠中(n=4)。(a)測(cè)定血清mSeAP隨時(shí)間過(guò)程的表達(dá)。(b)mSeAP表達(dá)的組織學(xué)分析。制備肌肉切片(8μM)并分析mSeAP的定位。(C)轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌肉中rAAV基因組的定量。實(shí)施例[0054]材料和方法:[0055]桿狀病毒基因組的缺失[0056]在含有AcMNPV桿粒(Luckow等，I"3)并用質(zhì)粒pKD46(Datsenko和Wanner,2000)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DHlOBac菌株中進(jìn)行從野生型AcMNPV桿粒缺失組織蛋白酶和幾丁質(zhì)酶。使用pCRTopo-lox-CAT-lox作為模板(Marek等，2011)，利用引物CC-K0-F和CC-KO-R(表I)來(lái)產(chǎn)生組織蛋白酶/幾丁質(zhì)酶基因失活所必需的PCR產(chǎn)物?；蚴Щ畎凑誐arek等，2011來(lái)進(jìn)行，并使用引物幾丁質(zhì)酶-105625F和組織蛋白酶-107849R(表1)來(lái)評(píng)估。按照以前所描述的(Marek等,2011)來(lái)進(jìn)行從組織蛋白酶/幾丁質(zhì)酶缺失的桿粒(AcbacΔCCAcat)移除CAT基因標(biāo)志物，并使用前面描述的引物通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。以相同的方式，使用利用引物對(duì)plO-KO-F/plO-KO-R(表1)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，來(lái)進(jìn)行第二基因的失活以從AcbacΛCCΛcat移除plO編碼序列。利用引物對(duì)pl0-118725-F/pl0_119259-R(表1)，使用PCR和測(cè)序來(lái)進(jìn)行正確基因失活的驗(yàn)證。該第二基因失活產(chǎn)生具有完整plO啟動(dòng)子的組織蛋白酶/幾丁質(zhì)酶/PlO缺失的桿粒(AcbacACCAplO)?；蛘?，以類似的方式，利用使用引物對(duì)p26-K0-F/p74-K0_R(表1)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，來(lái)進(jìn)行AcbacΛCCΛcat中鄰近基因p26-、pl0和p74的第二基因失活。利用引物對(duì)p26-117989-F/p74-121176-R(表1)，使用PCR和測(cè)序來(lái)進(jìn)行正確基因失活的驗(yàn)證。后一種基因失活產(chǎn)生組織蛋白酶/幾丁質(zhì)酶/p26/pl0/p74缺失的桿粒(AcbacΛCCΛρ26ρ10ρ74)。[0057]通過(guò)轉(zhuǎn)座將AAVrep/cap基因和重組AAV基因組插入到桿粒中[0058]用質(zhì)粒pM0N7124(Luckow等，1993)轉(zhuǎn)化含有野生型桿粒的大腸桿菌DHlOBac細(xì)胞和含有AcbacΛCCΛplO或AcbacACCAρ26ρ10ρ74的大腸桿菌DHlOP細(xì)胞。然后按照Bac-to-Bac系統(tǒng)手冊(cè)(Invitrogen),使用質(zhì)粒pFBD-mSeAP對(duì)所有這三種桿粒進(jìn)行轉(zhuǎn)座，所述質(zhì)粒編碼受CMV啟動(dòng)子控制并在側(cè)翼帶有AAV2的反向末端重復(fù)序列(ITR)的鼠類分泌型堿性磷酸酶報(bào)告基因(mSeAP)。還使用質(zhì)粒pSR660進(jìn)行轉(zhuǎn)座，所述質(zhì)粒編碼受多角體蛋白極晚期啟動(dòng)子控制的AAV2r印78/52基因和受plO極晚期啟動(dòng)子控制的AAV8cap基因(Smith等，2009)。在桿?；蚪M中的有效重組按照Bac-to-Bac方案來(lái)驗(yàn)證。這產(chǎn)生了用于生產(chǎn)攜帶ITR-mSeAPDNA的rAAV粒子的三組雙桿粒，每組具有不同的桿狀病毒基因組骨架(野生型，AcbacΔCCΔplO或AcbacΔCCΔρ26ρ10ρ74)。[0059]細(xì)胞系、桿狀病毒和rAAV生產(chǎn)[0060]在ILBellco轉(zhuǎn)瓶中，將懸浮培養(yǎng)物中的Sf9細(xì)胞在SF900II培養(yǎng)基(Invitrogen)中在27°C下進(jìn)行生長(zhǎng)。按照Bac-to-Bac方案的指導(dǎo),從上面描述的缺失桿粒和重組桿粒產(chǎn)生桿狀病毒，并將所述桿狀病毒在IOOmLBellco轉(zhuǎn)瓶中在Sf9細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中進(jìn)行擴(kuò)增。rAAV的生產(chǎn)通過(guò)以下方式來(lái)進(jìn)行:在IOOmLBellco轉(zhuǎn)瓶中，在以IO6個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種的70mLSf9細(xì)胞培養(yǎng)物中，用帶有重組AAV基因組(ITR-mSeAP)和AAVrep2/cap8基因的桿狀病毒以各自1.6的MOI對(duì)Sf9細(xì)胞進(jìn)行雙重感染。在感染后72h，回收ImL總培養(yǎng)物，用于在純化前對(duì)rAAV生產(chǎn)進(jìn)行直接定量，然后儲(chǔ)存在_80°C。[0061]rAAV的純化和表征[0062]按照(Smith等，2009)，在免疫親和AVB瓊脂糖介質(zhì)(GEHealthcare)上從總樣品純化rAAV。將純化的rAAV載體的5xl01Q病毒基因組(vg)在SDS-PAGEBis-Tris4_12%(Nu-PAGE，Invitrogen)上運(yùn)行，并直接進(jìn)行考馬斯染色或轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(iBlot凝膠轉(zhuǎn)移硝酸纖維素堆疊體(iBlotgeltransferstacknitrocellulose),Invitrogen),然后進(jìn)行免疫檢測(cè)(參見(jiàn)下面Western印跡)。[0063]rAAV基因組滴度的測(cè)定[0064]直接在總培養(yǎng)物樣品或純化的rAAV樣品上進(jìn)行定量PCR測(cè)定法，以測(cè)定rAAV滴度(每mL產(chǎn)物的病毒基因組)。使用MagNAPureDNA和病毒RNA小量試劑盒(MagNAPure96，Roche),從總樣品或純化的樣品直接提取病毒DNA。用作參比的質(zhì)粒含有AAV2的兩個(gè)ITR和桿狀病毒DNA聚合酶基因。進(jìn)行連續(xù)稀釋以計(jì)算所分析的樣品的最終拷貝數(shù)，并使用陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)估有效的滴定。由獨(dú)立的操作人員在同一塊板上同時(shí)進(jìn)行滴定。[0065]Western印跡[0066]通過(guò)Western印跡分析桿狀病毒總樣品或純化的rAAV8樣品的AAVVP和Rep蛋白。[0067]抗VP第一抗體是以1/250稀釋度使用的小鼠IgGl克隆BI(Progen)?？筊印第一抗體是以1/100稀釋度使用的小鼠IgGl克隆303.9(Progen)。第二抗體是以1/5000稀釋度使用的山羊抗小鼠Dye680(L1-C0R)。在紅外成像系統(tǒng)阻斷緩沖液(L1-COR)中進(jìn)行溫育，在Odyssey系統(tǒng)(L1-COR)上進(jìn)行結(jié)果顯示。使用0dySSey2.1軟件來(lái)定量熒光強(qiáng)度。[0068]體內(nèi)注射、樣品收集和mSeAP定量[0069]將25μL磷酸鹽緩沖鹽水中IO9Vg的rAAV載體肌內(nèi)注射到6周齡C57black6小鼠的左脛骨前(TA)肌中(每種載體n=4)。在注射后第3、7、14、21、28、35天，從注射的小鼠收集血樣，用于mSeAP血清定量。在第35天，將動(dòng)物處死，收集左側(cè)和右側(cè)TA肌并冷凍，然后進(jìn)行組織學(xué)測(cè)定和酶法測(cè)定。[0070]按照關(guān)于科學(xué)目的用動(dòng)物的保護(hù)的指令2010/63/EU來(lái)對(duì)待所有小鼠。使用12.5μL小鼠血清來(lái)進(jìn)行mSeAP劑量測(cè)定。使用Phospha-LightSystem試劑盒(AppliedBiosytems)來(lái)實(shí)現(xiàn)mSeAP定量。在VictorII照度計(jì)儀器上對(duì)樣品進(jìn)行讀數(shù)。使用純化的人類胎盤堿性磷酸酶(AppliedBiosystems)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,將表達(dá)水平表示成每mL血清中mSeAP的ng數(shù)。[0071]mSeAP表達(dá)的組織學(xué)分析[0072]制備肌肉切片(8μΜ)，并且使用如前所述(Riviere等，2006)的硝基藍(lán)四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽方法來(lái)分析mSeAP的定位。用核固紅復(fù)染肌肉切片，并通過(guò)蘇木精-伊紅染色和光學(xué)顯微鏡分析來(lái)評(píng)估炎癥和肌肉完整性。[0073]rAAV基因組的體內(nèi)檢測(cè)[0074]使用FastDNA試劑盒(QBIOgene),在FastPrep裝置(QBIOgene)上，從小鼠肌肉提取總DNA樣品。如前面部分中所述，使用QPCR進(jìn)行rAAV基因組的滴定。使用titin基因的定量來(lái)進(jìn)行歸一化。[0075]統(tǒng)計(jì)分析[0076]對(duì)rAAV注射后35天時(shí)血清mSeAP表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性進(jìn)行評(píng)估。進(jìn)行組群比較。通過(guò)Fischer檢驗(yàn)(α=0.05),然后使用Excel程序通過(guò)Student檢驗(yàn)(α=0.05)來(lái)進(jìn)行方差分析。[0077]結(jié)果[0078]幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶與plO或p26、plO和ρ74基因一起缺失的桿狀病毒的產(chǎn)生[0079]為了移除多個(gè)基因，需要將連續(xù)缺失引入到AcMNPV桿粒中。用于研究基因功能的公知和已建立的方法是通過(guò)同源重組在細(xì)菌中操縱桿狀病毒基因組，所述同源重組使用針對(duì)單一基因的基于ET(大腸桿菌RecE和RecT蛋白)或λred的重組，所述單一基因隨后被抗生素選擇標(biāo)志物替換(Datsenko和Wanner,2000)。為了在同一基因組中制備多個(gè)缺失，需要使用數(shù)種不同的選擇標(biāo)志物，或者選擇標(biāo)志物需要在側(cè)翼帶有獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，允許在每次基因缺失后通過(guò)消化和重新連接來(lái)移除。源自于在細(xì)菌基因組中制造缺失/插入的方法(Suzuki等,2007；Suzuki等,2005)的一種策略已被改造成用于桿粒技術(shù)(Marek等，2011)。在通過(guò)同源重組用氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶抗生素標(biāo)志物替換第一基因后，由于在標(biāo)志物兩端處存在1xP位點(diǎn)，可以將所述標(biāo)志物移除。在所使用的設(shè)置中，使用兩個(gè)修飾的1xP位點(diǎn)(1οχ66和1οχ71),每個(gè)位點(diǎn)具有不同的突變。在通過(guò)ere-重組酶重組后，1οχ72位點(diǎn)被留下(Lambert等,2007),該位點(diǎn)于是具有兩個(gè)突變而不是一個(gè),并且不再能夠被ere-重組酶識(shí)別。這允許隨后缺失第二靶基因。在桿粒設(shè)置中測(cè)試了這種方法，以分兩步連續(xù)移除chi/v-cath(按照AcMNPV遺傳圖譜(Ayres等，1994)，缺失第105282-107954位核苷酸)和ρ10(缺失第118839-119121位核苷酸)或p26/pl0/p74(缺失第118044-121072位核苷酸)基因。通過(guò)PCR和測(cè)序來(lái)評(píng)估這些缺失。用每種缺失桿粒DNA成功地轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。感染后96h，觀察到桿狀病毒感染的可見(jiàn)征兆(細(xì)胞層的破壞，更大的Sf9細(xì)胞直徑和死亡率)，表明AcΛCCΛplO和AcΛCCΛρ26ρ10ρ74桿狀病毒兩者的感染性。[0080]在將受polh啟動(dòng)子控制的AAV2rep基因和受plO啟動(dòng)子控制的AAV8cap基因以及AAV-mSeAP序列轉(zhuǎn)座到AcΛCCAplO中之前，將含有不同的桿粒構(gòu)建物的大腸桿菌DHlOβ細(xì)胞用質(zhì)粒ΡΜ0Ν7124(Luckow等，1993)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以介導(dǎo)從含有目的構(gòu)建物的轉(zhuǎn)移載體有效重組到桿粒的Τη7位點(diǎn)中(圖1)。[0081]在重組后并在桿粒DNA轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中之前，驗(yàn)證不存在非重組桿粒。[0082]對(duì)桿狀病毒進(jìn)行噬斑純化并擴(kuò)增兩代。在重組的野生型、ACCAplO和ΛCCΛρ26ρ10ρ74桿狀病毒之間，在桿狀病毒滴度(pfu/ml)或AAVVP和Rep蛋白水平方面沒(méi)有觀察到差異。然后使用所述桿狀病毒來(lái)進(jìn)行rAAV生產(chǎn)。[0083]幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因的缺失不提高Sf9細(xì)胞中的rAAV生產(chǎn)率[0084]在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的rAAV載體生產(chǎn)，清楚地表明，野生型或ACCAplO型或ACCAp26pl0p74型重組桿狀病毒的生產(chǎn)是相當(dāng)?shù)?，分別產(chǎn)生2.09χ10η、1.30χ10η和2.llxlOnvg/mL的滴度。同樣地，當(dāng)使用兩種桿狀病毒時(shí)，AAV的生產(chǎn)(模型轉(zhuǎn)基因:mSeAP)事實(shí)上也相似，分別產(chǎn)生1.27x10'1.32xl010和1.40xl010vg/mL的滴度(圖2A)。使用AVB層析法純化AAV，導(dǎo)致滴度分別增加至Ij4.25χ1012、2.47χ1012和3.52xl012vg/mL(圖2B)。[0085]這些結(jié)果表明，從桿狀病毒骨架移除一些非必需桿狀病毒基因，對(duì)AAV載體的生產(chǎn)和純化沒(méi)有影響。[0086]幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO或p26、plO、p74基因缺失的桿狀病毒的使用減少rAAV粒子降解。[0087]幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶的不存在，與plOORF缺失或者p26、plO和p74基因的缺失相組合，對(duì)AAV載體的完整性具有有益影響。最可能的是，源自于桿狀病毒的蛋白酶活性(組織蛋白酶)的不存在，導(dǎo)致載體粒子降解的減少，如SDS-PAGE和Western印跡(WB)分析所示(圖3)。這些分析方法清楚地表明至少三條VP特異性“污染降解帶”的消失。三條帶中主要的污染降解帶位于VP3附近(圖3)。因此，使用八0^?10或八0^?26?10?74桿狀病毒代替野生型桿狀病毒，導(dǎo)致rAAV載體降解的減少和數(shù)種VP降解產(chǎn)物的消失。[0088]使用幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO或p26、plO、p74基因缺失的桿狀病毒生產(chǎn)的rAAV粒子表現(xiàn)出更高的體內(nèi)感染性。[0089]當(dāng)使用ACCAplO或ACCAp26pl0p74桿狀病毒時(shí)，WB中某些小尺寸蛋白帶的消失表明rAAV載體粒子的降解減少并可能具有更好的完整性，提示體內(nèi)感染性/效能可能提高。事實(shí)上，當(dāng)將使用三種不同的桿狀病毒骨架(野生型、ΛCCΛρ10和ACCAp26pl0p74)生產(chǎn)的純化的rAAV-mSeAP粒子肌內(nèi)注射到小鼠(C57Black6)中時(shí)，在注射后約I周在血清中觀察到mSeAP活性。當(dāng)使用野生型骨架、ΛCCΛρ10_和ΛCCΛρ26ρ10ρ74_骨架進(jìn)行AAV生產(chǎn)時(shí)，在注射后3周，活性分別增加到約5.8ng/mL、23.2ng/mL和9.3ng/mL的平臺(tái)水平(圖4A)。當(dāng)使用ACCAplO-桿狀病毒骨架進(jìn)行rAAV生產(chǎn)時(shí)，與野生型桿狀病毒骨架相比，差異在4倍的量級(jí)上(p=0.01)。當(dāng)使用ACCAp26pl0p74-骨架代替野生型骨架時(shí)，差異在2倍的量級(jí)上(ρ=0.05)。[0090]在注射后35天，將小鼠處死并對(duì)注射的肌肉進(jìn)行組織學(xué)分析。對(duì)于mSeAP活性的血清水平的增加來(lái)說(shuō)，與用使用野生型桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV注射的小鼠相比，用使用ΛCCAplO桿狀病毒生產(chǎn)的rAAV注射的小鼠顯示出轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌肉組織中mSeAP活性明顯提高。已發(fā)現(xiàn)，與使用兩種其他桿狀病毒骨架生產(chǎn)的rAAV相比，用使用ACCAp26pl0p74生產(chǎn)的rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌肉組織中的mSeAP活性在中間范圍內(nèi)(圖4B)。如定量PCR(圖4C)所示，用使用ΛCCΛρ10桿狀病毒生產(chǎn)的rAAV觀察到的mSeAP活性的增加，與被遞送至TA肌肉細(xì)胞的rAAV基因組拷貝數(shù)的增加相關(guān)，表明與野生型生產(chǎn)系統(tǒng)相比，遞送了超過(guò)3.25個(gè)基因組拷貝。類似地，與使用用野生型桿狀病毒骨架生產(chǎn)的rAAV相比，在使用ACCAp26pl0p74桿狀病毒生產(chǎn)后對(duì)被遞送到TA肌肉細(xì)胞的rAAV基因組拷貝數(shù)進(jìn)行的評(píng)估產(chǎn)生2倍的增加(圖4C)。這些值與使用各種桿狀病毒載體獲得的mSeAP活性水平非常一致。[0091]參考文獻(xiàn)[0092]AyresMD,HowardSC,KuzioJ,Lopez-FerberM,PosseeRD(1994).苜猜銀紋夜蛾核多角體病毒的完整DNA序列(ThecompleteDNAsequenceofAutographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus),Virology202(2):586-605.[0093]CarbonellLF,HodgeMR,TomalskiMD,MillerLK(1988).編碼昆蟲(chóng)特異性蝎神經(jīng)毒素的基因的合成以及使用桿狀病毒載體表達(dá)它的嘗試(Synthesisofagenecodingforaninsect-specificscorpionneurotoxinandattemptstoexpressitusingbaculovirusvectors),Gene73,409-18.[0094]DatsenkoKA,WannerBL(2000).使用PCR產(chǎn)物在大腸桿菌K-12中一步法失活染色體基因(One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts)，PNAS97(12):6640-6645.[0095]FriesenF1D和MillerLK(1986).桿狀病毒基因表達(dá)的調(diào)控(Theregulationofbaculovirusgeneexpression)`,在《桿狀病毒的分子生物學(xué)》(TheMolecularBiologyofbaculoviruses)中(ff.Doerfler和P.Boehm主編)，Springer-Verlag,Berlin,pp.31-49.[0096]HitchmanRB,PosseeRD,CrombieAT,ChambersA,HoK,SiaterliE,Lissina0,SternardH,NovyR,LoomisK,BirdLE,OwensRJ,KingLA(Epub2009Aug5)用于提高昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)的桿狀病毒載體遺傳修飾(Geneticmodificationofabaculovirusvectorforincreasedexpressionininsectcells),CellBiolToxicol.[0097]KabaSA,SalcedoAM,WafulaPO,VlakJM,vanOersMM(2004).用于提高分泌型重組蛋白的完整性的幾丁質(zhì)酶和v-組織蛋白酶陰性桿粒的開(kāi)發(fā)(Developmentofachitinaseandv—cathepsinnegativebacmidforimprovedintegrityofsecretedrecombinantproteins),JVirolMethodsl22(I):113-118.[0098]LambertJM,BongersRS,KleerebezemM(2007).用于在植物乳桿菌中進(jìn)行多基因缺失和可選擇標(biāo)志物移除的基于Cre-lox的系統(tǒng)(Cre-lox-BasedSystemforMultipleGeneDeletionsandSelectable-MarkerRemovalinLactobacilluspiantarum),ApplEnvironMicrobioI73(4):1126-1135.[0099]Lebacq-VerheydenAM,KasprzykPG，RaumMG,VanWykeCoelinghK，LebacqJAjBatteyJF.(1988).內(nèi)源和桿狀病毒表達(dá)的人類胃泌素釋放肽前體的翻譯后加工(Posttranslationalprocessingofendogenousandofbaculovirus-expressedhumangastrin-releasingpeptideprecursor)，MolecularandCellBiology8,3129-35.[0100]LuckowVAjSummersMD(1988).桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展趨勢(shì)(Trendsinthedevelopmentofbaculovirusexpressionvectors),BioTechnology6,47-55.[0101]LuckowVAjLeeSC，BarryGFjOlinsP0(1993).通過(guò)將外來(lái)基因以位點(diǎn)特異性的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的方式插入到在大腸桿菌中繁殖的桿狀病毒基因組中可有效地產(chǎn)生感染性重組桿狀病毒(Efficientgenerationofinfectiousrecombinantbaculovirusesbysite-specifictransposon—mediatedinsertionofforeigngenesintoabaculovirusgenomepropagatedinEscherichiacoli),JVirol67(8):4566-4579.[0102]LynnDE(2007).可用的鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系(Availablelepidopteraninsectcelllines)，InMethodsMolBiol,pp.117-137.[0103]MaedaSjKawaiT，ObinataMjFujiwaraH，HoriuchiT，SaekiY，SatoYjFurusawaM.(1985).使用桿狀病毒載體在家蠶中生產(chǎn)人類α-干擾素(Productionofhumanalpha-1nterferoninsilkwormusingabaculovirusvector),Nature315,592-4.[0104]MannoCS,PierceGFjArrudaVRjGladerB，RagniM等(2006).通過(guò)AAV-因子IX在血友病患者中成功轉(zhuǎn)換肝臟以及由宿主免疫應(yīng)答施加的限制(SuccessfultransductionofliverinhemophiliabyAAV-FactorIXandlimitationsimposedbythehostimmuneresponse)，NatMedl2(3):342-347.[0105]MarekMjvanOersMM，DevarajFFjVlakJMjMertenOW(2011).用于制造無(wú)毒粒生物藥物的桿狀病毒載體的工程化改造(Engineeringofbaculovirusvectorsforthemanufactureofvirion-freebiopharmaceuticals)，BiotechnolBioengl08(5):1056-1067.[0106]MartinBM，TsujiSjLaMarcaME,MaysakK，EliasonWjGinnsEI(1988).使用桿狀病毒表達(dá)載體在無(wú)脊椎動(dòng)物中對(duì)高水平的活性人類葡萄糖腦苷脂酶進(jìn)行糖基化和加工(Glycosylationandprocessingofhighlevelsofactivehumanglucocerebrosidaseininvertebratecellsusingabaculovirusexpressionvector),DNA7,99-106.[0107]McKennaKAjHongH，vanNunenjGranadosRR(1989).在無(wú)血清培養(yǎng)基中建立用于桿狀病毒和重組蛋白生產(chǎn)的新的粉紋夜蛾細(xì)胞系(EstablishmentofnewTrichoplusianicelllinesinserum-freemediumforbaculovirusandrecombinantproteinproduction),JournalofInvertebratePathology71，82-90.[0108]MendellJRjRodino-KlapacLR,RosalesXQjColeyBDjGallowayG等(2010).在2D型肢節(jié)型肌營(yíng)養(yǎng)不良中基因轉(zhuǎn)移后α-肌膜蛋白聚糖基因的持續(xù)表達(dá)(Sustainedalpha-sarcoglycangeneexpressionaftergenetransferinlimb—girdlemusculardystrophy,type2D)，AnnNeurol68(5):629-638.[0109]MillerDWjSaferPjMillerLK(1986).在《遺傳工程:原理和方法》(GeneticEngineering!PrinciplesandMethods)Vol.8(SetlowjJ.和Hollaender，A.主編)中，PlenumPublishing,NewYork,pp.277-298.[0110]MillerLK(1988).作為基因表達(dá)載體的桿狀病毒(Baculovirusesasgeneexpressionvectors),AnnualReviewMicrobiology.42,177-99.[0111]MiyajimaA,SchreursJ，OtsuK，KondoA,AraiK，MaedaS(1987).使用家香Bombyxmori和昆蟲(chóng)桿狀病毒載體進(jìn)行生物活性小鼠白介素_3的高水平表達(dá)和分泌(Useofthesilkworm,Bombyxmori,andaninsectbaculovirusvectorforhigh-levelexpressionandsecretionofbiologicalIyactivemouseinterleukin-3),Gene58，273-81.[0112]SimonelliFjMaguireAM，TestaFjPierceEAjMingozziF等(2010).用于先天性利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