分離自茶樹葉的新型植物乳桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了新型植物乳桿菌菌株以及含有該新型植物乳桿菌菌株或其培養(yǎng)基的組合物。
KCCM 11179P
2011.03.28

KCCM 11180P
2011.03.28

KCCM 11181P
2011.03.28

KCCM 11182P
2011.03.28
【專利說明】分離自茶樹葉的新型植物乳桿菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種分離自茶樹)葉的新型植物乳桿菌 {Lac tobaci 11 us plan tarum ) 〇

【背景技術(shù)】
[0002] 用來飲用的茶是將茶科屬茶樹的嫩芽或葉子中存有的加氧酶失活并從中去除水 分而獲得的。它不僅含有維生素，而且還包含咖啡因、單寧、類黃酮、植物精油等，而且已被 廣泛地應(yīng)用于各種領(lǐng)域，如食品領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 技術(shù)問題 本發(fā)明涉及提供一種新型植物乳桿菌菌株。進一步，本發(fā)明涉及提供包含該新型植物 乳桿菌菌株或其培養(yǎng)液的組合物。
[0004] 技術(shù)方案 在一方面，本發(fā)明提供植物乳桿菌APsull〇c331261菌株。
[0005] 在一方面，本發(fā)明提供植物乳桿菌APsulloc331263菌株。
[0006] 在一方面，本發(fā)明提供植物乳桿菌APsulloc331266菌株。
[0007] 在一方面，本發(fā)明提供植物乳桿菌APsulloc331269菌株。
[0008] 在另一方面，本發(fā)明提供包含選自植物乳桿菌APsull〇c331261菌株、 APsulloc331263菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一種、或其培 養(yǎng)液的組合物。
[0009] 有益效果 本發(fā)明的新型植物乳桿菌菌株具有優(yōu)秀的耐酸性，因此，它被當(dāng)作食品攝取時還能在 胃中生存下來，進一步，它還可具有較高的腸道抵達(dá)率。本發(fā)明的植物乳桿菌菌株具有優(yōu)秀 的膽汁酸耐性，從而它能很好地固定于腸道內(nèi)。進一步，本發(fā)明的植物乳桿菌菌株具有優(yōu)秀 的抗菌活性，從而它具有優(yōu)秀的抑制有害細(xì)菌的作用。在生成的乳酸中，本發(fā)明的植物乳桿 菌菌株相比現(xiàn)有的植物乳桿菌菌株具有更低的D-乳酸比率。因此，甚至對乳酸敏感的成人 或嬰幼兒也可以自由攝取所述菌株。本發(fā)明的植物乳桿菌菌株能夠生成比現(xiàn)有植物乳桿菌 更少量的乳酸，從而用該植物乳桿菌菌株發(fā)酵食品時，該食品會具有溫和的口感。因此，本 發(fā)明的新型植物乳桿菌菌株可廣泛地應(yīng)用于各種領(lǐng)域，例如食品領(lǐng)域。

【具體實施方式】
[0010] 乳酸菌是通過降解糖，如葡萄糖，而產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌。由乳酸菌通過乳酸發(fā)酵而生 成的乳酸可抑制病原體和有害細(xì)菌的生長，而此特性被用來制作如乳制品、泡菜、釀造食品 等的食品。進一步，乳酸菌棲息于哺乳動物的腸道內(nèi)，并抑制由各種雜菌所引起的異常發(fā) 酵，從而這些是用作腸道疾病藥品的重要細(xì)菌。 toon] 植物乳桿菌是屬乳酸菌的一種菌株，已知主要在泡菜已發(fā)酵充足并有酸味時進行 生長。所生成的乳酸的光學(xué)異構(gòu)體為D型和L型。植物乳桿菌可廣泛用于各種需要發(fā)酵的 食品中。因此，如能開發(fā)出具有優(yōu)秀的耐酸性、膽汁酸耐性和抗菌活性的植物乳桿菌，可有 益地投入使用。
[0012] 下面，將詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0013] 本發(fā)明一方面提供植物乳桿菌APsulloc331261(保藏編號：KCCM11179P)菌株。本 發(fā)明一方面提供植物乳桿菌APsull 〇c331263 (保藏編號：KCCM11180P)菌株。本發(fā)明一方 面提供植物乳桿菌APsull〇c331266 (保藏編號：KCCM11181P)菌株。本發(fā)明一方面提供植 物乳桿菌APsulloc331269 (保藏編號：KCCM11182P)菌株。
[0014] 本發(fā)明的植物乳桿菌 APsulloc331261、APsulloc331263、APsulloc331266 和 APsulloc331269中的至少一種植物乳桿菌是一種分離自茶樹葉的 菌株，并屬于植物乳桿菌。具體地，本發(fā)明的植物乳桿菌可用以下方法進行分離，該方法包 括：在基于茶樹葉重量5~15 wt%的鹽中腌制茶樹葉的步驟；將所述腌制過的茶樹葉與糖溶 液如0. 1~3%低聚果糖進行混合后在25?35°C下培養(yǎng)1?5天的步驟；以及，取所述被培 養(yǎng)至pH值小于5的溶液后在25?35°C厭氧條件下培養(yǎng)1?5天的步驟。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明一方面的植物乳桿菌APsulloc331261、APsulloc331263、 APsulloc331266和APsulloc331269中的至少一種具有優(yōu)秀的耐酸性。當(dāng)攝入作為益生菌 的乳酸菌如植物乳桿菌時，為能發(fā)揮乳酸菌所特有的效果，優(yōu)選具有更高腸道抵達(dá)率的乳 酸菌。為了提高腸道抵達(dá)率，在因胃酸分泌而pH值低的胃中的生存率應(yīng)當(dāng)要高。已知，胃 處于空腹時的pH值為約1. 2?2,然而進食后pH值可為約2?3。本發(fā)明的植物乳桿菌菌 株可在pH值高于2至4,具體高于2至3. 5或高于2. 5至4,更具體高于2. 5至3. 5,進一步 具體高于2. 5至3時具有優(yōu)秀的耐酸性。另一方面，當(dāng)攝入食物時，已知食物的平均停留時 間可以為約1?3小時。本發(fā)明的植物乳桿菌菌株可以在0. 5?5小時內(nèi)，具體在1?4 小時內(nèi)，并在pH值高于2至4,具體高于2至3. 5或高于2. 5至4,更具體高于2. 5至3. 5， 進一步具體高于2. 5至3時具有優(yōu)秀的耐酸性。本發(fā)明的植物乳桿菌菌株在胃中停留時甚 至在低pH的胃中還能夠生存，因此當(dāng)作食物被攝取時其可具有高的腸道抵達(dá)率。
[0016] 在本發(fā)明的一方面，所述植物乳桿菌菌株具有優(yōu)秀的膽汁酸耐性。經(jīng)過胃的食物 會被送至小腸內(nèi)，此時，所分泌的膽汁酸會幫助食物消化。已知，高膽汁酸耐性的菌株會具 有良好的腸道固定能力。在本發(fā)明的一方面，所述具有優(yōu)秀的膽汁酸耐性的植物乳桿菌菌 株具有卓越的腸道固定能力。
[0017] 在本發(fā)明的一方面，所述植物乳桿菌菌株具有乳酸產(chǎn)生能力。通常，由乳酸菌產(chǎn)生 的乳酸可以為L型和D型。其中，D-乳酸的體內(nèi)代謝率不及L-乳酸。因此，高的血液D-乳 酸濃度可引起乳酸中毒。從而，如有可能，對乳酸敏感的成人或嬰幼兒最好不要攝取能夠大 量產(chǎn)生D-乳酸的乳酸菌。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，所述植物乳桿菌菌株可生成含有D型的乳酸，該D型乳酸的 含量為75%或以下，具體為70%或以下，更具體為65%或以下。
[0019] 在本發(fā)明的進一步另一方面，所述植物乳桿菌菌株可以生成乳酸，該乳酸的含量 為17. 5g/L或以下,具體為17g/L或以下，更具體為16. 5g/L或以下,進一步具體為15g/L 或以下，進一步更具體為14. 5g/L或以下，進一步更具體為14g/L或以下，進一步更具體為 13. 5g/L或以下。
[0020] 如此以來，由于本發(fā)明的植物乳桿菌菌株能夠產(chǎn)生比現(xiàn)有植物乳桿菌含有更少D 型的乳酸，對乳酸敏感的成人或嬰幼兒可以自由食用。進一步，由于它的乳酸產(chǎn)量低于現(xiàn)有 的植物乳桿菌，當(dāng)用其發(fā)酵食品時，可使食品具有更溫和的口感。
[0021] 本發(fā)明的一方面提供植物乳桿菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌 株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一種的提取物或培養(yǎng)液。本 發(fā)明的另一方面提供含有植物乳桿菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌株、 APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一種、其提取物或其培養(yǎng)液的組合 物。
[0022] 本發(fā)明的一方面提供含有植物乳桿菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌 株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一種、其提取物或其培養(yǎng)液的食 品組合物。
[0023] 所述食品組合物可以為保健食品組合物，還可以為發(fā)酵食品組合物，即需要發(fā)酵 的食品，如茶、乳制產(chǎn)品、泡菜、釀制食品。
[0024] 所述食品組合物的劑型不會受到特別限制，例如，可被制成片劑、丸劑、硬或軟膠 囊劑、顆粒劑、飲劑、焦糖、減肥棒、茶包等。除活性成分外，所述保健食品組合物可進一步 包含常用的其他成分，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所述組合物的劑型或目的可適當(dāng)選取其他成 分。其他成分的加入可能會帶來協(xié)同效果。
[0025] 所述活性成分劑量的確定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如，其每日劑量 可以為約1〇5?1〇13 CFU/天的植物乳桿菌，更具體為106?101(ICFU/天，但不限于此，并且 可根據(jù)受試者的年齡、身體狀況、并發(fā)癥等各種因素而有所變化。
[0026] 本發(fā)明的一方面提供含有植物乳桿菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263菌 株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一種、其提取物或其培養(yǎng)液的化 妝品組合物。該化妝品組合物可被制成適于局部應(yīng)用的任一劑型?？杀恢瞥梢韵聞┬?，如 水包油乳劑、油包水乳劑、懸浮液、固體、凝膠、粉劑、漿糊、泡沫劑或氣溶膠組合物?？赏ㄟ^ 使用本領(lǐng)域的傳統(tǒng)方法來制備所述劑型的組合物。
[0027] 所述化妝品組合物可進一步包含其他成分，其不會對主要效果產(chǎn)生不利影響，相 反會給主要效果帶來協(xié)同效果。本發(fā)明的化妝品組合物可包含選自維生素、聚合肽、多糖和 鞘脂類中的物質(zhì)。進一步，本發(fā)明的化妝品組合物可包含保濕劑、潤膚劑、表面活性劑、UV吸 收劑、防腐劑、消毒劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、有機和無機染料、芳香劑，冷卻劑或止汗劑。所 述成分的含量可以在對本發(fā)明的目的及效果不會產(chǎn)生不利影響的范圍內(nèi)進行適當(dāng)選取，該 含量可以為基于所述組合物總重量的〇. 01?5wt%，具體為0. 01?3wt%。
[0028] 本發(fā)明的一方面提供含有選自植物乳桿菌APsulloc331261菌株、APsulloc331263 菌株、APsulloc331266菌株和APsulloc331269菌株中的至少一種、其提取物或其培養(yǎng)液的 藥物組合物。該藥物組合物可以被用來預(yù)防或治療腸道疾病，如腸易激綜合征、便秘和腹 瀉。
[0029] 在本發(fā)明一方面，所述藥物組合物可口服或腸胃外給藥，例如直腸給藥、局部給 藥、經(jīng)皮給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、皮下給藥等?？诜o藥劑型的例子包括 片劑、丸劑、軟或硬膠囊劑、顆粒劑、粉劑、微顆粒劑、溶液、乳劑、微丸劑等，但不限于此。腸 胃外給藥劑型的例子包括溶液、懸浮液、洗劑、凝膠、注射溶液、滴劑、栓劑、貼劑或噴霧劑， 但不限于此。所述劑型可根據(jù)傳統(tǒng)方法容易制得，而且可對所述劑型適當(dāng)?shù)厥褂帽砻婊钚?齊U、賦形齊?、潤濕齊?、乳化劑、助懸劑、用于控制滲透壓的鹽或緩沖液、著色齊?、增味齊?、穩(wěn)定 齊u、防腐劑、腌制劑或其他常用添加劑。
[0030] 在本發(fā)明一方面，所述藥物組合物的活性成分會根據(jù)受試者的年齡、性別和體重、 待治療的病理狀況、該病理狀態(tài)的嚴(yán)重程度、給藥途徑及醫(yī)生診斷而不同?？紤]到這些因 素，其劑量的判斷可在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如，每日劑量可以為0. l~5000mg/ kg/天，具體為5(T500mg/kg/天，但不限于此。
[0031] 在 2011 年 3 月 28 日將植物乳桿菌 APsulloc331261、APsulloc331263、 APsulloc331266和APsulloc331269存放到韓國微生物培養(yǎng)中心（KCCM，地址：韓國首 爾市西大門區(qū)弘濟一洞361-221儒林大廈，120-091)，保藏編號分別為KCCM11179P、 KCCM11180P、KCCM11181P 和 KCCM11182P。
[0032] (1)植物乳桿菌 APsulloc 331261 保藏機構(gòu)名稱：韓國微生物培養(yǎng)中心 保藏編號：KCCM11179P 保藏日期：2011年3月28日 (2) 植物乳桿菌 APsulloc 331263 保藏機構(gòu)名稱：韓國微生物培養(yǎng)中心 保藏編號：KCCM11180P 保藏日期：2011年3月28日 (3) 植物乳桿菌 APsulloc 331266 保藏機構(gòu)名稱：韓國微生物培養(yǎng)中心 保藏編號：KCCM11181P 保藏日期：2011年3月28日 (4) 植物乳桿菌 APsulloc 331269 保藏機構(gòu)名稱：韓國微生物培養(yǎng)中心 保藏編號：KCCM11182P 保藏日期：2011年3月28日 下面，將結(jié)合實施例（以及實驗）詳細(xì)說明本發(fā)明的新型植物乳桿菌的分離方法、鑒定 方法和特性。然而，以下實施例（以及實驗）僅用于說明為目的，不會限制本發(fā)明的范圍。
[0033] 【實施例1】植物乳桿菌的分離 用蒸餾水清洗200g茶樹葉兩次，以清除雜質(zhì)。去除所清洗的茶樹葉上的水分。然后， 將所述茶樹葉與基于該茶樹葉總重量8wt%的食鹽混合，之后在室溫下保存3小時。將用鹽 腌制的茶樹葉與l〇〇〇mL的1%低聚果糖溶液混合，之后在32°C的培養(yǎng)器中培養(yǎng)三天。三天 后，檢查所培養(yǎng)的溶液的pH值是否降到低于5,如果pH值低于5,收集所培養(yǎng)的溶液并在 Difco Lactobacilli MRS Agar?培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。此時，該培養(yǎng)在32°C厭氧室內(nèi)進行兩 天，然后收集白色菌落。
[0034] 通過上述方法，從茶樹葉中分別分離出植物乳桿菌APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266 和 APsulloc 331269。
[0035] 【實施例2】植物乳桿菌的鑒定 (1)菌株培養(yǎng) 用實施例1中所分離出的APsulloc 331261在MRS瓊脂板上進行劃線，之后在37°C下 培養(yǎng)兩天。將所得的單菌落接種在10mL MRS肉湯中，然后在37°C下培養(yǎng)一夜來制備植物乳 桿菌菌株培養(yǎng)液。分別對所述的 APsulloc 331263、APsulloc 331266 和 APsulloc 331269 實施上述方法，而制備出植物乳桿菌菌株培養(yǎng)液。
[0036] (2)植物乳桿菌菌株的糖發(fā)酵類型的分析 將如（1)中所述而制備出的APsulloc 331261菌株培養(yǎng)液接種于10mL MRS肉湯中，濃 度為0. 5%，之后在37°C下培養(yǎng)一夜。在8, OOOrpm下離心分離所述培養(yǎng)液5分鐘，去除上清 液，而后只收集細(xì)菌。然后，在所述細(xì)菌中加入2mL的0. 85%生理鹽水緩沖液并進行懸浮。 通過使用API 50CHL裝置（Biomerieux)按照制造商的規(guī)定進行之后的步驟。具體步驟如 下。
[0037] 首先，慢慢地將所述菌株懸浮液加入于5mL API懸浮培養(yǎng)基中，來測定濁度約2麥 氏比池標(biāo)準(zhǔn)（Biomerieux)時所需的懸浮液量。將所測懸浮液量的2倍的懸浮液加入到10mL API 50CHL培養(yǎng)基中，然后搖晃混合。將上述混合物加入到裝有不同基底的小杯內(nèi)，其中 滴入一滴礦物油，然后在37°C下培養(yǎng)所述混合液2天，而分析出糖發(fā)酵類型。對APsulloc 331263、APsulloc 331266和APsulloc 331269菌株的各培養(yǎng)液重復(fù)上述方法，而分析糖發(fā) 酵類型。
[0038] 在以下表中展示了 APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266 和 APsulloc 331269與作為標(biāo)準(zhǔn)菌株的植物乳桿菌菌株（KCTC3108)相比之下的糖發(fā)酵類 型的結(jié)果、以及用上述結(jié)果對 APsulloc 331261、APsulloc 331263、APsulloc 331266 和 APsulloc 331269 作出的鑒定結(jié)果。表1 為 APsulloc 331261，表 2 為 APsulloc 331263,表 3 為 APsulloc 331266,以及表 4 APsulloc 331269。
[0039]【表1】

【權(quán)利要求】
1. 植物乳桿菌APsulloc 331261 (保藏編號：KCCM11179P)菌株。
2. 植物乳桿菌APsulloc 331263 (保藏編號：KCCM11180P)菌株。
3. 植物乳桿菌APsulloc 331266 (保藏編號：KCCM11181P)菌株。
4. 植物乳桿菌APsulloc 331269 (保藏編號：KCCM11182P)菌株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的菌株，其特征在于，所述菌株是從茶樹葉中分 離出來的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有耐酸性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株在pH2?4時具有05?5小時 的耐酸性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有膽汁酸耐性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有乳酸產(chǎn)生能力。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有乳酸產(chǎn)生能力，能生產(chǎn)占 所產(chǎn)生的乳酸的70%或以下量的D型乳酸。
11. 一種組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的菌株或其培養(yǎng)液。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述組合物是被發(fā)酵的食品組合 物。
【文檔編號】C12P7/56GK104245920SQ201280038929
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月10日
【發(fā)明者】郭一榮, 劉世真, 樸泰訓(xùn), 李汎真, 辛桂豪, 鄭鎮(zhèn)吾, 曺濬喆 申請人:株式會社愛茉莉太平洋