具有過氧化酶活性的多肽及編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有過氧化酶活性的分離的多肽以及編碼多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用多肽的方法。
【專利說明】具有過氧化酶活性的多肽及編碼該多肽的多核苷酸
[0001]對序列表的引用
[0002]本申請包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其并入本文以作參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及具有過氧化酶(peroxygenase )活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]WO 2008/119780公開了八種不同的來自茶樹^(Agrocybe aegerita)、灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea)、雙色臘蘑(Laccaria bicolor)和福毛鬼傘(Coprinus radians)的過氧化酶。
[0005]Ullrich 等人,Appl.Env.Microbiol.(2004) 70 (8): 4575-4581 公開了來自傘菌擔(dān)子菌菌株茶樹菇(菌株TM-Al)的過氧化酶，發(fā)現(xiàn)該酶氧化芳基醇類和醛類。
[0006]WO 2006/034702公開了使用茶樹菇TM Al的AaP過氧化酶對未活化的烴諸如萘、甲苯和環(huán)己燒進(jìn)行酶促輕化的方法。這也描述于Ullrich and Hofrichter, FEBSLetters (2005)579:6247-6250。
[0007]DE 10332065A1公開了通過使用茶樹菇TM Al的AaP過氧化酶經(jīng)由醛類的中間形成從醇類酶法制備酸的方法。
[0008]報(bào)道了迅速且選擇性分光光度法直接檢測經(jīng)AaP過氧化酶的芳族羥化的方法(Kluge 等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2007) 75:1473-1478)。
[0009]眾所周知，將氧官能團(tuán)直接區(qū)域選擇性引入有機(jī)分子(氧合)在化學(xué)合成中構(gòu)成問題。產(chǎn)物可在各種不同的合成中用作重要的中間體。
[0010]WO 2011/120938公開了使用各種過氧化酶在取代的或未取代的、直鏈的或支鏈的脂族烴的2位或3位進(jìn)行酶促羥化的方法。
[0011]本發(fā)明提供具有過氧化酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明涉及具有過氧化酶活性的分離的多肽，其選自:
[0013](a)與SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽；
[0014](b)由在中等嚴(yán)格條件下與(i) SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；(^)其00嫩序列；*(iii)，(i)或(ii)的全長互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼的多肽；
[0015](C)由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽；
[0016](d)在一個或多個(例如，若干個)位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體；以及[0017](e), (a)、(b)、(c)或(d)多肽的具有過氧化酶活性的片段。
[0018]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸；包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞；以及制備該多肽的方法。
[0019]本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的多肽的方法。
[0020]本發(fā)明還涉及編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1或由SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1組成的信號肽的多核苷酸，該多核苷酸與編碼蛋白的基因可操作地連接；包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)蛋白的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0021]定義:
[0022]過氧化酶:術(shù)語“過氧化酶”根據(jù)ECl.11.2.1意指“非特異性過氧化酶”活性，其催化氧原子從H2O2插入廣泛種類的底物，如4-硝基苯并二氧雜環(huán)戍烯(4-nitrobenzodioxole)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)實(shí)施例3中描述的步驟或 M.Poraj-Kobielska, M.Kinne, R.Ullrich, K.Scheibner, M.Hofrichter, “Aspectrophotometric assay for the detection of fungal peroxygenases，，(用于真菌過氧化酶檢測的分光光度測定),Analytical Biochemistry (2012), vol.421, issuel, pp.327 - 329中的步驟來確定過氧化酶活性。
[0023]一方面，本發(fā)明的多肽(過氧化酶)具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的過氧化酶活性的至少20%，如，至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少 100%ο
`[0024]等位變體(allelic variant):術(shù)語“等位變體”是指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變化天然地通過突變產(chǎn)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽無變化)，或者可以編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體所編碼的多肽。
[0025]cDNA:術(shù)語“cDNA”是指可以通過逆轉(zhuǎn)錄由從真核或原核細(xì)胞得到的成熟的、已剪接的mRNA分子制備而來的DNA分子。cDNA缺少可存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。最初的初級RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的、已剪接的mRNA之前，通過一系列包括剪接在內(nèi)的步驟進(jìn)行加工。
[0026]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”是指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，開放閱讀框以起始密碼子如ATG、GTG或TTG開始并以終止密碼子如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其組合。
[0027]控制序列:術(shù)語“控制序列”是指對于編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸的表達(dá)為必需的核酸序列。各個控制序列對于編碼多肽的多核苷酸可以是內(nèi)生的(native) (B卩，來自相同基因)或外來的(foreign)(即，來自不同基因)，或者對于彼此是內(nèi)生或外來的。這些控制序列包括但不限于，前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最小程度地，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入特定的限制性酶切位點(diǎn)以促進(jìn)控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的目的，控制序列可設(shè)有接頭(linker)。
[0028]表達(dá):術(shù)語“表達(dá)”包括多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括但不限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
[0029]表達(dá)載體:術(shù)語“表達(dá)載體”是指包括編碼多肽的多核苷酸、并與用于其表達(dá)的控制序列可操作地連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
[0030]片段:術(shù)語“片段”是指有一個或多個(例如，若干個)氨基酸從成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基端和/或羧基端缺失的多肽或催化結(jié)構(gòu)域；其中該片段具有過氧化酶活性。一方面，片段包含至少220個氨基酸殘基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至220)、至少230個氨基酸殘基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至230)、或至少240個氨基酸殘基(如，SEQ ID NO:2的氨基酸I至240)。
[0031]高等嚴(yán)格條件:術(shù)語“高等嚴(yán)格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程進(jìn)行12~24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在65 °C下清洗三次，每次15分鐘。 [0032]宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指對于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)任何細(xì)胞類型。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括由于在復(fù)制過程中發(fā)生突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0033]分離的:術(shù)語“分離的”是指處于非天然出現(xiàn)的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括:(1)任何非天然出現(xiàn)的物質(zhì)；(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔助因子的任何物質(zhì)，其至少部分地從與其天然相關(guān)的一種或多種或所有天然出現(xiàn)的成分中移出；(3)相對于天然出現(xiàn)的物質(zhì)有人工修飾的任何物質(zhì)；或者(4)通過增加物質(zhì)相對于與其天然相關(guān)的其他組分的含量(例如，多個拷貝的物質(zhì)編碼基因；使用比與編碼物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動子更強(qiáng)的啟動子)而修飾的任意物質(zhì)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣本中。
[0034]低等嚴(yán)格條件:術(shù)語“低等嚴(yán)格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程進(jìn)行12~24個小時。載體材料最終使用2XSSC、
0.2%SDS在50°C下清洗三次，每次15分鐘。
[0035]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”是指在翻譯和任何翻譯后修飾(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的多肽。一方面，成熟多肽是SEQ ID N0:2的氨基酸I~259，基于SignalP3.0程序，預(yù)測SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1是信號肽。領(lǐng)域內(nèi)公知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
[0036]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”是指編碼具有過氧化酶活性的成熟多肽的多核苷酸。一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID N0:1的核苷酸52~613、701~878和965~1001 ;或其cDNA序列，基于SignalP3.0程序，預(yù)測SEQ ID NO:1的核苷酸I至51編碼信號肽。
[0037]中等嚴(yán)格條件:術(shù)語“中等嚴(yán)格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程進(jìn)行12~24個小時。載體材料最終使用2XSSC、
0.2%SDS在55 °C下清洗三次，每次15分鐘。[0038]中-高等嚴(yán)格條件:術(shù)語“中-高等嚴(yán)格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程進(jìn)行12~24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在60°C下清洗三次，每次15分鐘。
[0039]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會另外出現(xiàn)的方式被修飾成包含核酸片段的、或合成的單鏈或雙鏈的核酸分子，其包含一個或多個控制序列。
[0040]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”是指如下的構(gòu)造，其中控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在合適位置處，從而控制序列引導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
[0041]序列同一性:兩個氨基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性通過參數(shù)“序列同一'I"生”來描述。
[0042]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件包),Rice 等人,2000, TrendsGenet.16:276-277)(優(yōu)選 5.0.0 版本或更新)的 Needle 程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來確定兩個氛基酸序列之間的序列同一性。使用的可選參數(shù):空位開放罰分為10，空位擴(kuò)展罰分為0.5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)替代矩陣。標(biāo)記為“最長同一性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的Needle輸出用作百分比同一'丨生,計(jì)算如下:
[0043](相同殘基X100) / (比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0044]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件包)，Rice等人，2000,同上)(優(yōu)選5.0.0版本或更新)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch, 1970，同上)來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性。使用的可選參數(shù):空位開放罰分為10，空位擴(kuò)展罰分為0.5，以及EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩陣。標(biāo)記為“最長同一性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的Needle輸出用作百分比同一性，計(jì)算如下:
[0045](相同脫氧核苷酸X100) / (比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0046]子序列:術(shù)語“子序列”是指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(例如，若干個)核苷酸的多核苷酸；其中子序列編碼具有過氧化酶活性的片段。一方面，子序列包含至少660個核苷酸、至少690個核苷酸、或至少720個核苷酸。
[0047]變體:術(shù)語“變體”是指在一個或多個(例如，若干個)位置上包含改變(即替換、插入和/或缺失)的具有過氧化酶活性的多肽。替換是指用不同的氨基酸取代占據(jù)某位置的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入是指將氨基酸添加至并緊鄰占據(jù)某位置的氨基酸。
[0048]極高等嚴(yán)格條件:術(shù)語“極高等嚴(yán)格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程進(jìn)行12~24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在70°C下清洗三次，每次15分鐘。
[0049]極低等嚴(yán)格條件:術(shù)語“極低等嚴(yán)格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程進(jìn)行12~24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在45°C下清洗三次，每次15分鐘。
[0050]具有過氧化酶活性的多肽
[0051]在實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如下的具有過氧化酶活性的分離多肽，該分離多肽與SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%的序列同一性，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。一方面，該多肽與SEQ ID NO: 2的成熟多肽相差不超過10個氨基酸，如1、2、3、4、5、6、7、8或9個。
[0052]本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位變體，或者由SEQ IDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或者是它的具有過氧化酶活性的片段。另一方面，該多肽包括SEQ ID NO: 2的成熟多肽，或者由SEQ ID N0:2的成熟多肽組成。另一方面，該多肽包括SEQ ID NO: 2的氨基酸I~259，或者由SEQ ID NO: 2的氨基酸I~259組成。
[0053]本發(fā)明的多肽可包括如下的氨基酸序列:
[0054]Glu-His-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Arg(SEQ ID N0:3),或
[0055] Glu-His-Asp-Ala-Ser-Leu-Ser-Arg(SEQ ID NO:4)
[0056]-其與相鄰于血紅素基的Mn原子配位結(jié)合(coordinate)。
[0057]在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及由以下多核苷酸編碼的具有過氧化酶活性的分離多肽，該多核苷酸在極低等嚴(yán)格條件、低等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中-高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件、或極高等嚴(yán)格條件下與(i) SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；(ii)其cDNA 序列 j(iii), (i)或(ii)的全長互補(bǔ)物雜交(Sambrook 等人.,1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York)。
[0058]根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO: 2的多肽或其片段可用來設(shè)計(jì)核酸探針，以便從不同屬或種的株系鑒定和克隆編碼具有過氧化酶活性的多肽的DNA。特別地，為了鑒定和分離其中相應(yīng)的基因，可遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，使用這種探針與目標(biāo)細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交。這種探針的長度可大大短于整個序列，但應(yīng)為至少15個，如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個核苷酸，如至少200個核苷酸，至少300個核苷酸，至少400個核苷酸，至少500個核苷酸，至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，至少800個核苷酸，或至少900個核苷酸?？墒褂肈NA和RNA探針。通常對探針進(jìn)行標(biāo)記，用以檢測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。本發(fā)明涵蓋這些探針。
[0059]可以對由這樣的其它株系制備的基因組DNA或cDNA文庫進(jìn)行篩選，以篩選出與上述探針雜交且編碼具有過氧化酶活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或者其它分離技術(shù)從這些其它株系中分離基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定化在硝化纖維或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO:1或其子序列雜交的克隆或DNA,在Southern印跡中使用載體材料。
[0060]出于本發(fā)明的目的，雜交表示多核苷酸在極低等至極高等的嚴(yán)格條件下與如下的標(biāo)記核酸探針雜交，其中標(biāo)記核酸探針對應(yīng)于(i) SEQ ID NO:1 ；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全長互補(bǔ)物；或(0其子序列?？墒褂美鏧光片或任何其它本領(lǐng)域已知的檢測方法來檢測核酸探針在這些條件下所雜交的分子。
[0061]一方面，核酸探針是SEQ ID NO:1的核苷酸316~339。另一方面，核酸探針是編碼SEQ ID N0:2的多肽、其成熟多肽、或其片段的多核苷酸。另一方面，核酸探針是SEQ IDNO:1或其cDNA序列。
[0062]在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及由以下多核苷酸編碼的具有過氧化酶活性的分離多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%序列同一性，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性。
[0063]在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在一個或多個(例如，若干個)位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體。在實(shí)施方式中，引入SEQ ID N0:2的成熟多肽中的氨基酸替換、缺失和/或插入的數(shù)量不超過10個，如1、2、3、4、5、6、7、8或9個。氨基酸變化可以是性質(zhì)輕微的，即不顯著影響蛋白折疊和/或活性的保守的氨基酸替換或插入；小的缺失，通常為I~30個氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸，如氨基端的甲硫氨酸殘基；多至20~25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能而促進(jìn)純化的小的延伸，如多組氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0064]保守替換的實(shí)例在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。通常不改變特異活性的氨基酸替換是領(lǐng)域內(nèi)已知的，并在例如
H.Neurath and R.L.Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York 中記載。常見的替換為，Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala /Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0065]或者，氨基酸變化的性質(zhì)為多肽的物化性質(zhì)被改變。例如，氨基酸變化可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適PH等。
[0066]可根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)已知的步驟來鑒定多肽中的基本氨基酸，例如定點(diǎn)誘變或丙氛酸掃描誘變(Cunningham and Wells, 1989，Science244:1081-1085)。在后述的技術(shù)中，在分子的每個殘基中引入單個丙氨酸突變，并對所得的突變分子測試過氧化酶活性，以鑒定對于分子活性為關(guān)鍵性的氨基酸殘基。還參見，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其它生物學(xué)相互作用的活性部位也可以通過對結(jié)構(gòu)的物理分析來確定，如通過以下這些技術(shù):如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，結(jié)合對推定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來加以測定。參見例如de Vos等人，1992，Science255:306-312; Smith 等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904; Wlodaver 等人，1992，F(xiàn)EBS Lett.309:59-64。還可從與相關(guān)的多肽進(jìn)行比對來推斷基本氨基酸的身份(identity)。
[0067]可以使用已知的突變、重組和/或改組方法，接著進(jìn)行相關(guān)的篩選步驟(例如Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science241:53-57;Bowie and Sauer, 1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W095/17413 ;或冊95/22625 中所公開的)來做出并測試單個或多個氨基酸替換、缺失和/或插入。其它可用的方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman 等人，1991, Biochemistry30:10832-10837 ;美國專利第 5，223,409 號；W092/06204)以及定位誘變(Derbyshire 等人，1986，Gene46:145; Ner 等人，1988，DNA7:127)。
[0068]突變/改組方法可與高通量的自動化篩選方法結(jié)合來檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的突變多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnologyl7:893-896)?？墒褂妙I(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞中回收編碼活性多肽的突變DNA分子，并快速測序。這些方法使得可以快速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
[0069]多肽可以是雜合多肽，其中一個多肽的區(qū)域融合在另一多肽的區(qū)域的N端或C端。
[0070]多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一個多肽融合在本發(fā)明多肽的N端或C端。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸來制備融合多肽。制備融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域已知，且包括連接編碼多肽的編碼序列使得它們在閱讀框內(nèi)并且融合多肽的表達(dá)在同一啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)來構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等人，1993，EMBO J.12:2575-2583;Dawson等人，1994，Science266:776-779)。
[0071]融合多肽還可以包括在兩個多肽之間的切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌時，該位點(diǎn)被切割，釋出兩個多肽。切割位點(diǎn)的例子包括但不限于，在Martin等人，2003，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-576;Svetina 等人,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson 等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward 等人，1995, Biotechnologyl3:498-503 ;以及 Contreras 等人，1991, Biotechnology9:378-38I; Eaton 等人,1986, Biochemistry25:505-512; Collins-Racie 等人,1995, Biotechnology13:982-987; Carter 等人，1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics6:240-248;以及 Stevens, 2003，Drug Discovery World4:35_48 中公開的位點(diǎn)。
[0072]具有過氧化酶活性`的多肽的來源
[0073]本發(fā)明的具有過氧化酶活性的多肽可從任何屬的微生物獲得。出于本發(fā)明的目的，本文中與給定來源關(guān)聯(lián)使用的術(shù)語“獲自”應(yīng)指，由多核苷酸編碼的多肽是由該來源或其中插入有該來源的多核苷酸的株系產(chǎn)生的。一方面，獲自給定來源的多肽是分泌到細(xì)胞外的。
[0074]多肽可以是真菌多肽。例如，多肽可以是毛殼菌屬多肽,如變綠毛殼(Chaetomiumvirescens)或球毛殼菌(Chaetomium globosum)多月太。
[0075]應(yīng)當(dāng)理解的是，就前文所述的物種而言，本發(fā)明涵蓋了完全和不完全的狀態(tài)，以及其它分類學(xué)上的等同物，例如無性型，不管它們已知的種名是什么。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地識別出合適的等同物的身份。
[0076]公眾可以在若干保藏機(jī)構(gòu)容易地獲取這些物種的株系，這樣的機(jī)構(gòu)諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures, CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection, Northern Regional Research Center, NRRLX
[0077]可以使用上述探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或者從天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接獲得的DNA樣本鑒定和獲得這些多肽。用于直接從天然生境(habitat)分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫或者混合的DNA樣品來獲得編碼多肽的多核苷酸。在用探針檢測到編碼多肽的多核苷酸后，就能夠通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)分離或克隆多核苷酸(參見，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
[0078]核酸構(gòu)建體
[0079]本發(fā)明還涉及包括與一個或多個控制序列可操作地連接的本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體，上述控制序列在與該控制序列相容的條件下引導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0080]可以通過多種方式操縱多核苷酸，以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入到載體之前對其進(jìn)行操縱可以是合意的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
[0081]控制序列可以是啟動子，其是由宿主細(xì)胞識別用于編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)的多核苷酸。啟動子含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是任何在宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從與宿主細(xì)胞同源或異源的編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。
[0082]用于引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是:從解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) α -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖鹿糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB 基因、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) cryIIIA 基因(Agaisse andLereclus, 1994, Molecular Microbiologyl3:97-107)、大腸桿菌 Iac 操縱子、大腸桿菌 trc啟動子(Egon 等人，1988，Gene69:301-315)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)和原核β -內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:3727-3731)以及 tac 啟動子(DeBoer 等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)中得到的啟動子。其它啟動子在Gilbert等人，1980，ScientificAmerican242:74-94 的〃Useful proteins from recombinant bacteria〃(重組細(xì)菌的有用蛋白)中記載；并在Sambrook等人(1989，同上)中記載。串聯(lián)啟動子的實(shí)例在W099/43835中公開。
[0083]用于引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從以下物質(zhì)的基因獲得的啟動子:從構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA 淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)胰酶樣蛋白酶(W0 96/00787)、Fusarium venenatum 淀粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、Fusariumvenenatum Daria (W0 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn (W000/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei) β -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β_木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(曲霉中性α-淀粉酶基因的修飾啟動子，其中非翻譯前導(dǎo)被曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的非翻譯前導(dǎo)替代；非限制性實(shí)例包括來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修飾啟動子，其中非翻譯前導(dǎo)被構(gòu)巢曲霉或米曲霉的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的非翻譯前導(dǎo)替代)；及其突變的、截短的和雜合的啟動子。
[0084]在酵母宿主中，可用的啟動子獲自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其它可用于酵母宿主細(xì)胞的啟動子由Romanos等人，1992，Yeast8:423-488 描述。 [0085]控制序列也可以是轉(zhuǎn)錄終止子，其被宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。終止子與編碼多肽的多核苷酸的3’端可操作地連接。在宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子均可用于本發(fā)明。
[0086]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲自克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)和大腸桿菌核糖體RNA (rrnB)的基因。
[0087]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲自構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢鐮孢胰酶樣蛋白酶的基因。
[0088]用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲自釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。其他可用于酵母宿主細(xì)胞的終止子在Romanos等,1992 (同上)中有過描述。
[0089]控制序列也可以是在啟動子下游和基因的編碼序列上游的增加基因表達(dá)的mRNA穩(wěn)定序列(mRNA stabilizer)區(qū)域。
[0090]合適的mRNA穩(wěn)定序列區(qū)域的實(shí)例獲自蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(W0 94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal ofBacteriologyI77:3465-3471)。
[0091]控制序列也可以是前導(dǎo)序列，即對由宿主細(xì)胞翻譯較為重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接到編碼多肽的多核苷酸的5’端。任何在宿主細(xì)胞中起作用的前導(dǎo)序列均可以使用。
[0092]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。
[0093]用于酵母宿主細(xì)胞的合適前導(dǎo)序列得自釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母
3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因。
[0094]控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即可操作地連接至多核苷酸的3’端的序列，在轉(zhuǎn)錄時其被宿主細(xì)胞識別為向轉(zhuǎn)錄mRNA添加多腺苷酸殘基的信號。在宿主細(xì)胞中起作用的任何多腺苷酸化序列均可以使用。
[0095]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列得自構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢鐮孢胰酶樣蛋白酶的基因。
[0096]用于酵母宿主細(xì)胞的有用多腺苷酸化序列記載于Guo and Sherman, 1995, Mol.Cellular Biol.15:5983-5990。[0097]控制序列也可以是編碼與多肽N端連接的信號肽并引導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌通路的信號肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列片段自然連接的信號肽編碼序列?；蛘?，編碼序列的5’端可以包含對于編碼序列為外來的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然包含信號肽編碼序列時，外來信號肽編碼序列可能是需要的?；蛘?，為增強(qiáng)多肽的分泌，外來信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列。然而，任何引導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路的信號肽編碼序列均可以使用。
[0098]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是得自芽孢桿菌NCIB11837麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因的信號肽編碼序列。其他信號肽記載于Simonen and Palva, 1993, MicrobiologicalReviews57:109-137。
[0099]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因的信號肽編碼序列。
[0100]用于酵母宿主細(xì)胞的可用信號肽得自釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其他可用的信號肽 編碼序列記載于Romanos等人，1992，同上。
[0101]控制序列也可以是編碼位于多肽N端的前肽的前肽編碼序列。得到的多肽稱為酶原或多肽原(或在一些情況下為酵素原)。多肽原一般是失活的且可以通過從多肽原到前肽的催化或自催化切割而轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可以得自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila)漆酶(W095/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子的基因。
[0102]在信號肽序列和前肽序列均存在時，前肽序列緊鄰多肽的N端且信號肽序列緊鄰前肽序列的N端。
[0103]也可能需要添加調(diào)控多肽相對于宿主細(xì)胞生長的表達(dá)的調(diào)控序列。調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激引起基因表達(dá)的開啟和關(guān)閉的那些，包括調(diào)控化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包含lac、tac、和trpf呆縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)控序列的其他實(shí)例是使得基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤的存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因、以及在重金屬的存在下擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將可操作地與調(diào)控序列連接。
[0104]表汰載體
[0105]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸、啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。各種核苷酸和控制序列可以連接在一起，以產(chǎn)生可以包含一個或多個便利限制性位點(diǎn)的重組表達(dá)載體，該限制性位點(diǎn)使得可以在位點(diǎn)插入或替換編碼多肽的多核苷酸?；蛘?，可以通過插入多核苷酸或包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體到合適的表達(dá)載體中來表達(dá)多核苷酸。在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，編碼序列位于載體中，從而編碼序列與合適的表達(dá)用控制序列可操作地連接。
[0106]重組表達(dá)載體可以是任何可以方便地進(jìn)行重組DNA程序并可引起多核苷酸表達(dá)的載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與載體將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0107]載體可以是自主復(fù)制型載體，即作為染色體外實(shí)體而存在且其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包含確保自我復(fù)制的任何元件(means)?；蛘?，載體可以是，在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單個載體或質(zhì)粒，或使用共同包含將要導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中的總DNA的兩個或更多個載體或質(zhì)粒，或使用轉(zhuǎn)座子。
[0108]載體優(yōu)選包含一個或多個允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物。選擇性標(biāo)記物是如下的基因，其產(chǎn)物提供對生物滅殺劑的抗性或病毒抗性、重金屬抗性、相對于營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。
[0109]細(xì)菌選擇性標(biāo)記物的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因、或賦予抗生素耐性(如氨節(jié)青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壯觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記物。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物包括但不限于amdS (乙酰胺酶)、argB (鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar (膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD (硝酸還原酶)、PyrG (乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC (鄰氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。 [0110]優(yōu)選載體包含有使得載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或使載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組而自主復(fù)制的元件。
[0111]對于整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可以依賴于編碼多肽的多核苷酸序列或經(jīng)同源重組或非同源重組整合入基因組的載體的任何其他元件。或者，載體可以含有用于引導(dǎo)經(jīng)由同源重組在染色體的精確位置整合入宿主細(xì)胞基因組的其他多核苷酸。為增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)包含足量的核酸，例如100~10,000個堿基對、400~10，000個堿基對、以及800~10，000個堿基對，其與相應(yīng)的靶序列具有高度的序列同一性，以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼的多核苷酸或編碼的多核苷酸。另一方面，載體可以通過非同源重組而整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0112]對于自主復(fù)制，載體還可以包含使載體能在被考慮的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”是指使質(zhì)粒或載體能在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0113]細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是使得在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)以及使得在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ I的復(fù)制起點(diǎn)。
[0114]用在酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)ARS1，ARS4，ARSl與CEN3的組合，以及ARS4與CEN6的組合。
[0115]可用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI (Gems等人，1991，Gene98:61-67;Cullen 等人，1987，Nucleic Acids Res.15:9163-9175;WO00/24883)。AMAl基因的分離以及包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)WO 00/24883中公開的方法實(shí)現(xiàn)。
[0116]多于一個拷貝的本發(fā)明多核苷酸可以插入到宿主細(xì)胞中，以增加多肽產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可以通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組中而得到；或者通過包含可擴(kuò)增選擇標(biāo)記物基因與多核苷酸而獲得，這樣，可以通過在合適選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記物基因的細(xì)胞，由此選擇含有額外拷貝的多核苷酸的細(xì)胞。
[0117]用來連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如，Sambrook等人，1989,同上)。
[0118]宿豐細(xì)朐
[0119]本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含與一個或多個引導(dǎo)本發(fā)明多肽生產(chǎn)的控制序列可操作地連接的本發(fā)明多核苷酸。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，從而使構(gòu)建體或載體保持為染色體整合子或作為前述的自我復(fù)制染色體外載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括因復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。對于宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
[0120]宿主細(xì)胞可以是任何可用于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)的細(xì)胞，例如，原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0121]原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、乳桿 菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽抱桿屬(OceanobaciIIus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、和鏈霉菌屬(Streptomyces)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于彎曲菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(IIyobacter)、奈瑟菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(SalmoneI la)、和服原體屬(UreapIasma)。
[0122]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus Iautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
[0123]細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈球菌細(xì)胞，包括但不限于似馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、化月農(nóng)性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)和似馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)細(xì)胞。
[0124]細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈霉菌(Streptomyces)細(xì)胞，包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)和變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)細(xì)胞。
[0125]將DNA導(dǎo)入芽孢桿菌細(xì)胞可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang andCohenj 1979，Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見，例如，Young andSpizizenj 1961，J.Bacteriol.81:823-829 或Dubnau and Davidoff-Abelsonj 1971，J.Mol.Biol.56:209-221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa and Dowerj 1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler and Thorne，1987，J.Bacteriol.169:5271-5278)來實(shí)現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahanj 1983, J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower 等人，1988，Nucleic AcidsRes.16:6127-6145)而實(shí)現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入鏈霉菌細(xì)胞可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見，例如，Gong等人，2004，F(xiàn)olia Microbiol.(Praha) 49:399-405)、接合(參見，例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke 等人，2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)來實(shí)現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入假單胞菌細(xì)胞可以通過電穿孔(參見，例如，Choi 等人，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedoand Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)而實(shí)現(xiàn)。將DNA 導(dǎo)入鏈球菌細(xì)胞可以通過自然感受態(tài)(參見，例如，Perry and Kuramitsuj 1981，Infect.1mmun.32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt and Jollick，1991，Microbios68:189-207)、電穿孔(參見，例如，Buckley 等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewellj 1981，Microbiol.Rev.45:409-436)來實(shí)現(xiàn)。然而，可以使用任何領(lǐng)域內(nèi)已知的將DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的方法。
[0126]宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。
[0127]宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和接合菌門以及卵菌門和所有有絲分裂真菌(如Hawksworth等人，In, Ainsworth andBisby^ s Dictionary of The Fungi，8thedition， 1995，CAB International,UniversityPress, Cambridge, UK 所定義)。
[0128]真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。本文所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母和屬于半知菌的酵母`(芽孢綱)。由于酵母的分類在未來可能會變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)如 Biologyand Activities of Yeast (Skinner, Passmore, andDavenport, editors, Soc.App.Bacteriol.Symposium Series N0.9, 1980)中記載般進(jìn)行定義。
[0129]酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces )、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母屬(Yarrowia)細(xì)胞，例如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、 Saccharomyces douglasi1、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces norbensis、Saccharomyces oviformis 或角軍脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)細(xì)胞。
[0130]真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門和卵菌門亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人，1995，同上所定義)。絲狀真菌通常的特征在于，由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)合多糖組成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長，碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽，碳分解可以是發(fā)酵性的。
[0131]絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管菌屬(Bjerkandera)、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、德抱霉屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、稻痕菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)λ毀絲霉屬(Myceliophthora)、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)Λ 白腐菌屬(Phlebia)、Piromyces、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、籃狀菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(ThieIavia)、彎頸霉屬(TolypocIadium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。
[0132]例如，絲狀真 菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、淺黃擬錯孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、 熱帶金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛云芝菌(Coriolus hirsutus)、Fusarium bactridioides、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、黃色德抱菌(Fusarium culmorum)、禾谷德抱菌(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusarium negundi)、尖抱德抱菌(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬枝抱德抱菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、擬絲抱德抱(Fusarium trichothecioides)、Fusarium venenatum、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、脈射側(cè)菌(Phlebia radiata)、白腐菌(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢殼霉(Thielaviaterrestris)、長域毛栓菌(Trametes viI1sa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii )、長梗木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞。
[0133]真菌細(xì)胞可以通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本質(zhì)上已知的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。合適的用于曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的方法記載在 EP238023、Yelton 等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474 以及Christensen等人，1988，Bio/Technology6:1419-1422中。用于轉(zhuǎn)化鐮孢菌屬物種的適當(dāng)方法記載于Malardier等人，1989，Gene78:147-156和W096/00787。酵母可以使用由 Becker andGuarente，In Abelsonj J.N.and Simon, Μ.1., editors, Guide to YeastGeneticsand Molecular Biology,Methods in EnzymologyjVolumel94, ppl82_187，Academic Press, Inc.，New York ；Ito 等人，1983，J.Bacteriol.153:163 ；以及 Hinnen 等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920 記載的方法來轉(zhuǎn)化。
[0134]生產(chǎn)方法
[0135]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中野生型的該細(xì)胞產(chǎn)生多肽；和6)回收多肽。在優(yōu)選的方面，該細(xì)胞為毛殼菌屬細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，該細(xì)胞為變綠毛殼細(xì)胞。
[0136]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞jP(b)回收多肽。
[0137]使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，可通過在合適的介質(zhì)中并在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的步驟在包含碳源和氮源以及無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的介質(zhì)可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成來制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽被分泌到營養(yǎng)介質(zhì)中，則可以直接從介質(zhì)回收多肽。如果多肽未被分泌出去，則可以從細(xì)胞裂解物中進(jìn)行回收。
[0138] 可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的特定用于多肽的方法來檢測多肽。這些檢測方法包括但不局限于特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成、或酶底物的消失。例如，酶的測定可用來判定多肽的活性。
[0139]可使用本領(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，可通過常規(guī)的步驟從營養(yǎng)介質(zhì)回收多肽，該步驟包括但不局限于收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
[0140]可通過本領(lǐng)域已知的多種方法提純多肽來獲得基本純的多肽，該方法包括但不局限于層析法(例如，離子交換、親和性、疏水性、層析聚焦、和尺寸排阻)、電泳法(例如，制備式等電聚焦)、差別溶解法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(參見例如，ProteinPurification, Janson 和 Ryden,編者，VCH Publishers, New York, 1989)。
[0141]在可替代的方面，不回收多肽，而是使用表達(dá)多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞作為多肽的來源。
[0142]植盤
[0143]本發(fā)明還涉及分離的植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、或植物細(xì)胞，其包括本發(fā)明的多核苷酸以便表達(dá)和產(chǎn)生可回收量的多肽或結(jié)構(gòu)域?？蓮闹参锘蛑参锊糠只厥斩嚯幕蚪Y(jié)構(gòu)域?；蛘撸墒褂冒嚯幕蚪Y(jié)構(gòu)域的植物或植物部分來提高食物或飼料的質(zhì)量，例如，提高營養(yǎng)價(jià)值、適口性、和流變特性，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0144]轉(zhuǎn)基因植物可為雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例為草，如草地早熟禾(meadow grass)(藍(lán)草,早熟禾屬),飼用牧草,如羊茅屬、黑麥草屬，溫帶草(temperate grass),如剪股穎屬(Agrostis),和谷物,例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻米、高粱、和玉蜀黍(maize)(玉米)。
[0145]雙子葉植物的實(shí)例為煙草、豆類，如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆(bean)和黃豆，和十字花科植物(十字花科)，如花椰菜、油菜籽，和密切相關(guān)的模式生物擬南芥。
[0146]植物部分的實(shí)例為莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、和塊莖以及包括以下部分的獨(dú)立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。具體的植物細(xì)胞室，如葉綠體、質(zhì)外體(apoplast )、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。此外,任何植物細(xì)胞，無論組織的來源，都認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如，胚芽、胚乳、糊粉和種皮。
[0147]同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是此類植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。
[0148]表達(dá)多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可按照本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建。簡單來說，通過將一個或多個編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到植物宿主基因組或葉綠體基因組中并使所得的修飾的植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，從而構(gòu)建植物或植物細(xì)胞。 [0149]表達(dá)構(gòu)建體便利地為核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與適合的調(diào)控序列可操作地連接的編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，該調(diào)控序列對于在所選的植物或植物部分中進(jìn)行多核苷酸的表達(dá)是必需的。此外，表達(dá)構(gòu)建體可包含可用來鑒定已整合有表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物，以及對于將構(gòu)建體導(dǎo)入所考慮植物中所必需的DNA序列(后者取決于所使用的DNA導(dǎo)入方法)。
[0150]調(diào)控序列的選擇，如啟動子和終止子序列以及任選的信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，是基于例如期望何時、何處以及如何表達(dá)多肽或結(jié)構(gòu)域而加以確定的。比如，編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的基因的表達(dá)可以是組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)，或者可以是發(fā)育性表達(dá)、階段表達(dá)或組織特異性表達(dá)，且基因產(chǎn)物可靶向特定的組織或植物部分，如種子或葉。調(diào)控序列記載于例如 Tague 等人,1988, Plant Physiology86:506 中。
[0151]對于組成型表達(dá)，可使用35S_CaMV、玉蜀黍泛素1、或稻肌動蛋白I啟動子(Franck 等人，1980，Cell21:285-294;Christensen 等人，1992，Plant Mol.Biol.18:675-689;Zhang 等人，1991，Plant Cell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是，例如來自忙藏庫組織如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動子(Edwards andCoruzzi, 1990, Ann.Rev.Genet.24:275-303),或來自代謝庫組織如分生組織的啟動子(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子如來自稻的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等人，1998，Plant Cell Physiol.39:885-889)，來自豆球蛋白B4的蠶豆(Vicia faba)啟動子和來自蠶豆的未知種子蛋白基因(Conrad等人,1998, J.Plant Physiol.152:708-711)、來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等人，1998，Plant Cell Physiol.39:935-941 )、來自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的忙藏蛋白napA啟動子，或本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異性啟動子，例如WO 91/14772中描述的。此外，啟動子可以為葉特異性啟動子，如來自稻或番爺?shù)膔bcs啟動子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiol.102:991-1000),小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol.Biol.26:85-93)，來自稻的 aldP 基因啟動子(Kagaya等人，1995, Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)型啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人，1993，Plant Mol.Biol.22:573-588)。同樣地，啟動子可經(jīng)由非生物處理誘導(dǎo)，如溫度、干旱、或鹽度的改變，或經(jīng)由外部施加的激活啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如，乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脫落酸、和赤霉酸)，以及重金屬。
[0152]也可使用啟動子增強(qiáng)元件來實(shí)現(xiàn)植物中多肽或結(jié)構(gòu)域的更高表達(dá)。比如，啟動子增強(qiáng)元件可以是位于啟動子與編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸之間的內(nèi)含子。比如，Xu等人(1993，同上)公開了使用稻肌動蛋白I基因的第一內(nèi)含子來加強(qiáng)表達(dá)。
[0153]選擇性標(biāo)記物基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可從本領(lǐng)域中可得的那些中選擇。
[0154]核酸構(gòu)建體按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入到植物基因組中，這些技術(shù)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)和電穿孔(Gasser 等人,1990, Science244:1293;Potrykus, 1990, Bio/Technology8:535; Shimamoto 等人,1989, Nature338:274)。
[0155]根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物(對于綜述，參見 Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol.Biol.19:15-38)和用來轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，雖然對于這些植物也可使用其他轉(zhuǎn)化方法。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是對胚愈傷組織或發(fā)育中的胚進(jìn)行粒子轟擊(涂有轉(zhuǎn)化DNA的微觀的金或鶴顆粒)(Christou, 1992, Plant J.2:275-281; Shimamoto, 1994, Curr.0pin.Biotechnol.5:158-162; Vasil 等人,1992, Bio/Techno logy 10:667-674 )? 可替代的用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法是基于Omirulleh等人，1993，Plant Mol.Biol.21:415-428描述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。額外的轉(zhuǎn)化方法包括在美國專利第6，395，966號和第7，151，204號(二者均全部并入本文以供參考)中描述的那些。
[0156]轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域已熟知的方法選擇已導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化株并再生成整個植物。通常，轉(zhuǎn)化過程設(shè)計(jì)為通過以下方法在再生過程中或在后續(xù)世代中選擇性地消除選擇基因:通過使用例如兩個單獨(dú) 的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶對選擇基因的位點(diǎn)特異性切除。
[0157]除使用本發(fā)明的構(gòu)建體進(jìn)行的特定植物基因型的直接轉(zhuǎn)化之外，還可通過將具有該構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的另一植物進(jìn)行雜交(cross)獲得轉(zhuǎn)基因植物。例如，可通過雜交將編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體導(dǎo)入特定植物種類，而不需要直接轉(zhuǎn)化給定類型的植物。因此，本發(fā)明不僅包含直接從按照本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生的植物，還包含此類植物的后代。如本文所使用的，后代可表示按照本發(fā)明制備的親本植物的任一代的后裔。此類后代可包含按照本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交使得轉(zhuǎn)基因通過起始株系與供體植物系的異花授粉而導(dǎo)入植物系。此類步驟的非限制性實(shí)例在美國專利第7，151，204號中描述。
[0158]植物可通過回交轉(zhuǎn)換的過程產(chǎn)生。例如，植物包括被稱為回交轉(zhuǎn)換基因型、系、近交種的或雜交種的植物。
[0159]遺傳標(biāo)記物可用于協(xié)助發(fā)明的一個或多個轉(zhuǎn)基因從一個遺傳背景到另一個遺傳背景的漸滲作用(introgression)。標(biāo)記物協(xié)助的選擇相對于傳統(tǒng)育種所提供的優(yōu)勢在于，它可用來避免表型變異導(dǎo)致的錯誤。另外，遺傳標(biāo)記物可提供關(guān)于特定雜交的個體后代中的優(yōu)良種質(zhì)相對程度的數(shù)據(jù)。例如，當(dāng)具有期望性狀的另外具有非農(nóng)藝學(xué)所期望的遺傳背景的植物與優(yōu)良親本雜交時，遺傳標(biāo)記物可用來選擇不僅具有目標(biāo)性狀、還具有較大比例的期望種質(zhì)的后代。這樣，將一個或多個性狀基因滲入到特定遺傳背景所需的世代數(shù)目被最大程度地降低。
[0160]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，其包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)包括編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；(b)回收多肽或結(jié)構(gòu)域。
[0161]過氧化酶活性的去除或降低
[0162]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)親本細(xì)胞的突變體的方法，其包括破壞編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸或其部分或者使其缺失，得到與親本細(xì)胞相比當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時產(chǎn)生更少的多肽的突變細(xì)胞。
[0163]可通過使用本領(lǐng)域熟知的方法(例如插入、破壞、取代或缺失)減少或消除多核苷酸的表達(dá)來構(gòu)建突變細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，多核苷酸是失活的。所要修飾或失活的多核苷酸可以是，例如編碼區(qū)或?qū)τ诨钚远员匦璧牟糠郑蛘呤蔷幋a區(qū)表達(dá)所需的調(diào)控元件。這樣的調(diào)控序列或控制序列的實(shí)例可以是啟動子序列或其功能性部分，即，足以影響多核苷酸的表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它控制序列包括但不局限于，前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活因子。
[0164]可以通過對親本細(xì)胞進(jìn)行誘變，并且選擇其中多核苷酸的表達(dá)已降低或消除的突變細(xì)胞來進(jìn)行多核苷酸的修飾或失活。誘變可以是特異性的或隨機(jī)的，其可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過對DNA序列施以PCR產(chǎn)生的誘變而進(jìn)行。此外,可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。
[0165]適合于本發(fā)明目的的物理 或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、鄰甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate) (EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
[0166]當(dāng)使用這些試劑時，通常通過如下過程來進(jìn)行誘變:在合適條件下，并在存在所選的誘變劑時，培育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇表現(xiàn)出減少的基因表達(dá)或無基因表達(dá)的突變細(xì)胞。
[0167]可以通過基因中一個或多個核苷酸或者其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件的插入、替換或缺失來實(shí)現(xiàn)多核苷酸的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致終止密碼子的引入，起始密碼子的去除，或開放閱讀框的改變?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上可以在體內(nèi)進(jìn)行修飾，即，直接在表達(dá)待修飾多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行修飾。
[0168]消除或降低多核苷酸表達(dá)的便利方式的實(shí)例是基于基因取代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將對應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生有缺陷的核酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷性基因。通過同源重組，缺陷性核酸序列取代內(nèi)源多核苷酸。理想的是缺陷性多核苷酸還編碼可用于選擇其中多核苷酸已被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記物。在一個方面，使用選擇性標(biāo)記物(如本文所述的那些)來破壞多核苷酸。
[0169]本發(fā)明還涉及抑制具有過氧化酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對細(xì)胞施用雙鏈RNA (dsRNA)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA (dsRNA)分子，其中dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的子序列。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或更多個雙鏈體核苷酸。[0170]dsRNA優(yōu)選地是小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)。在優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA。在另一優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微小RNA。
[0171]本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中多肽表達(dá)的包含SEQ ID NO:1成熟多肽編碼序列的部分的這樣的雙鏈RNA (dsRNA)分子。本發(fā)明不受任何特定作用機(jī)制的限制，但是dsRNA能進(jìn)入細(xì)胞并引起相似或等同序列的單鏈RNA (ssRNA)包括內(nèi)源mRNA的降解。當(dāng)細(xì)胞暴露于dsRNA時，來自同源基因的mRNA經(jīng)由稱為RNA干擾(RNAi)的過程被選擇性地降解。
[0172]本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默。在一個方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性降解RNA的方法。該過程可以在體外、先體外后體內(nèi)或在體內(nèi)進(jìn)行。在一個方面，dsRNA分子能夠用于產(chǎn)生細(xì)胞、器官或動物中的功能喪失突變。制備和使用用于選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領(lǐng)域中公知；參見，例如美國專利第6，489，127號；第6，506，559 號?’第 6，511，824 號；和第 6，515，109 號。
[0173]本發(fā)明還涉及親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，其包含編碼多肽的多核苷酸或其控制序列的破壞或缺失或者包含編碼多肽的沉默基因，這樣得到與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽的突變細(xì)胞。
[0174]多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)內(nèi)生和異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)內(nèi)生或異源多肽的方法，包括:(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和化)回收多肽。術(shù)語“異源多肽”意為對宿主細(xì)胞不是內(nèi)生的多肽，例如，內(nèi)生蛋白的變體。宿主細(xì)胞可包含多于一個拷貝的編碼內(nèi)生或異源多肽的多核苷酸。
[0175]用于培養(yǎng)和純化目標(biāo)產(chǎn)物的方法可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
[0176]本發(fā)明的用于產(chǎn)生基本上無過氧化酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽(特別是真菌蛋白比如酶)的生產(chǎn)中具有特別的意義。過氧化酶缺陷型細(xì)胞也可用于表達(dá)具有藥用價(jià)值的異源蛋白，如激素、生長因子、受體等。術(shù)語“真核多肽”不僅包括內(nèi)生的多肽，而且還包括例如酶的已經(jīng)經(jīng)由氨基酸替換、缺失或增`加或其它這樣的修飾所修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性和pH耐受性等的那些多肽。
[0177]在另一個方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的基本上無過氧化酶活性的蛋白產(chǎn)物。
[0178]鉬合物
[0179]在又一個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的具有過氧化酶活性(過氧化酶)的多肽的組合物。
[0180]該組合物可包含本發(fā)明的過氧化酶作為主要的多肽組分，例如，單組分組合物?；蛘?，該組合物可包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
[0181]可按照本領(lǐng)域已知的方法制備組合物，并且組合物可以是液體或干燥組合物的形式。例如，多肽組合物可以是顆粒或微粒的形式?？砂凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法將包含于組合物中的多肽穩(wěn)定化。
[0182]下面給出本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實(shí)例?？梢曰诒绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法來確定本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件。
[0183]可以加入本發(fā)明的過氧化酶多肽并由此使其成為洗滌劑組合物的組分。
[0184]本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制成例如手洗或機(jī)洗洗滌劑組合物，其包括適合于預(yù)處理玷污織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物；或者可以配制成用于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物；或者配制用于手洗或機(jī)洗洗碗操作。
[0185]在具體的方面，本發(fā)明提供一種包含如本文所述的本發(fā)明多肽的洗滌劑添加劑。
[0186]該洗滌劑組合物可包含一種或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兩性離子的表面活性劑或其混合物。在具體的實(shí)施方式中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子表面活性劑與一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。表面活性劑的典型存在水平是約0.l-60wt%,例如，約1%至約40%，或約3%至約20%，或約3%至約10%。表面活性劑的選擇取決于所需的清潔應(yīng)用，并且包括本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)的表面活性劑。
[0187]洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可包含一種或多種其它酶，如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或過氧化物酶。
[0188]本發(fā)明的多肽可以以與每升洗滌液0.0Ol-1OOmg蛋白對應(yīng)的量添加到洗滌劑組合物中，例如0.01-1OOmg的蛋白，優(yōu)選0.005-50mg蛋白，更優(yōu)選0.01_25mg的蛋白，甚至更優(yōu)選0.05-10mg的蛋白，最優(yōu)選0.05-5mg的蛋白，并且甚至最最優(yōu)選0.01-1mg的蛋白。
[0189]具有過氧化酶活性的多肽(過氧化酶)以及任選額外的過氧化氫源可以配制成液體(例如，水性的)、固體、凝膠、糊劑或干燥產(chǎn)品制劑。隨后可將干燥產(chǎn)品制劑再水化以形成可用于本發(fā)明的方法中的活 性液體或半液體制劑。
[0190]當(dāng)將過氧化酶與過氧化氫源配制成干燥制劑時，可將這些組分混合布置成不連續(xù)的層或單獨(dú)進(jìn)行包裝。
[0191]當(dāng)使用非干燥形式的制劑時，并且即使在這種情況下，優(yōu)選地使用過氧化酶與過氧化氫源分開的兩部分制劑系統(tǒng)。
[0192]本發(fā)明的組合物還可包含助劑，比如潤濕劑、增稠劑、用于PH控制的緩沖劑、穩(wěn)定劑、香料、著色劑、填充劑等。
[0193]有用的潤濕劑是表面活性劑，即非離子、陰離子、兩性或兩性離子表面活性劑。上文進(jìn)一步描述過表面活性劑。
_4] 方法和用途
[0195]本發(fā)明的過氧化酶多肽可以用于脂族烴的2位或3位的位點(diǎn)特異性羥化，如在W02011/120938中所描述的那樣。脂族烴必須包括至少3個碳的鏈，并且脂族烴的任(一個或多個)端可以用作起始點(diǎn)以確定哪個碳在2位或3位。脂族烴必須具有至少一個連接至2位或3位的碳(被羥化的)的氫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由過氧化酶羥化的2位或3位的碳是未取代的(在進(jìn)行羥化之前)。
[0196]因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于取代的或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的任一端(一個或多個端)的2位或3位羥化的方法，該脂族烴具有至少3個碳并具有連接至2位或3位碳的氫，該方法包含使脂族烴與過氧化氫和本發(fā)明的具有過氧化酶活性的多肽相接觸。[0197]本發(fā)明的方法可用于各種目的，例如批量化學(xué)合成(生物催化)，增加脂族烴的水溶解度、生物除污(bioremediation)和改進(jìn)食品特性。
[0198]本發(fā)明的方法也可用于許多工業(yè)工藝中，其中所述羥化反應(yīng)是有益的。這種應(yīng)用的一個實(shí)例是在紙漿和紙制品的制造中，其中存在于木材(樹脂)中的烷烴和其它相關(guān)的脂族烴可能導(dǎo)致紙漿和紙張制造過程中的沉積問題。這些疏水化合物是紙漿和紙張制造過程中所謂的樹脂沉積物(Pitch deposit)的前體。樹脂沉積導(dǎo)致低品質(zhì)的紙漿，并且可能引起紙漿廠運(yùn)營的停工。與具有高提取物含量的紙漿相關(guān)的特定問題包括運(yùn)轉(zhuǎn)能力問題、紙上的斑點(diǎn)和孔洞以及紙張斷裂。用過氧化酶進(jìn)行處理可以增加所述化合物的溶解度并因此緩解問題。
[0199]本發(fā)明方法的另一個用途是，即用于石油或煤精煉，其中過氧化酶催化的羥化可用于改變烴的溶解度、粘度和/或燃燒特性。具體地，該處理會引起所處理的烴的煙點(diǎn)、著火點(diǎn)(kindling point)、燃點(diǎn)(fire point)和沸點(diǎn)發(fā)生變化。
[0200]在散裝化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品(包括殺蟲劑)、專用化學(xué)品和藥品的合成中，本發(fā)明的方法顯然在將羥基選擇性地引入底物從而影響所修飾的化合物的溶解度方面是相關(guān)聯(lián)的。此外，選擇性羥化對于通過有機(jī)化學(xué)合成和化學(xué)酶促合成領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行進(jìn)一步修飾提供了位點(diǎn)。
[0201]將天然氣徹底加工以去除高級烷烴。此類高級烷烴的羥化可用于提高水溶解度，并且因此便于通過洗滌天然氣流而去除高級烷烴?？梢栽诰谢蛘咴诰珶掃^程中進(jìn)行去除。
[0202]油廢物的羥化將顯著地提高生物可降解性，并且可應(yīng)用于涉及來自精煉廠的廢水處理和被污染地面或水的生物除污的方面。
[0203]在第二方面，本發(fā)明提供用于在脂質(zhì)的酰基的末端的2位或3位進(jìn)行羥化的方法，其包括使脂質(zhì)與過氧化氫和本發(fā)明的具有過氧化酶活性的多肽相接觸。
[0204]脂質(zhì)的酰基的羥化通常提高脂質(zhì)的水溶解度。相應(yīng)地，通過使衣物與過氧化酶和過氧化氫源、以及任選的表面活性劑相接觸，本發(fā)明的方法可用于從衣物除去或減少包含油或脂質(zhì)的污潰，如巧克力。
[0205]在另一方面，通過將衣物與過氧化酶和過氧化氫源以及任選的表面活性劑相接觸，本發(fā)明的方法可以用來減少衣物中難聞的氣味。本發(fā)明的方法導(dǎo)致衣物中的丁酸(酪酸)量減少。丁酸在洗滌衣物期間某些動物脂肪和植物油例如通過洗滌劑脂肪酶被水解得到游離的脂肪酸(包括丁酸)時形成。丁酸具有極其難聞的氣味。過氧化酶將丁酸羥化成2-羥基丁酸(α -羥基丁酸)或3-羥基丁酸(β -羥基丁酸)。
[0206]本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的過氧化酶多肽和過氧化氫在脂族烴的至少兩端的第二或第三個碳處位點(diǎn)特異性引入羥基和/或氧代(酮)基的方法。
[0207]脂族烴必須包括至少5個碳的鏈。通過從脂族烴的任一端對碳原子計(jì)數(shù)來確定第二個碳和第三個碳。
[0208]脂族烴必須具有至少一個與經(jīng)由羥基的連接而被羥化的碳相連接的氫；以及至少兩個在引入氧代基時與碳連接的氫。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二或第三個碳在與過氧化酶接觸之前是未取代的。
[0209]根據(jù)本發(fā)明的方法，羥基和/或氧代基在脂族烴的(至少)兩端處彼此獨(dú)立地引入。因此，可以在一端引入羥基，同時在另一(其它)端引入氧代基，反之亦然。不能在脂族烴的相同端引入兩個羥基、或兩個氧代基、或一個羥基和一個氧代基。實(shí)施例1示出了一些組合的實(shí)例。
[0210]在本發(fā)明的上下文中，“氧化”指的是羥基和/或氧代基的引入。
[0211]相應(yīng)地，在第一方面，本發(fā)明提供在取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的(至少)兩個端部的第二或第三個碳處引入羥基和/或氧代(酮)基的方法，脂族烴具有至少5個碳并且具有至少一個連接到所述第二或第三個碳上的氫，該方法包括將脂族烴與過氧化氫和具有本發(fā)明的過氧化酶活性的多肽相接觸。
[0212]在實(shí)施方式中，脂族烴不是正己烷或正癸烷。
[0213]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂族烴通過引入兩個羥基被氧化成(轉(zhuǎn)換成)二醇。更優(yōu)選地，兩個羥基位于直鏈脂族烴的每個端部處。
[0214]本發(fā)明的方法可以用于各種目的，例如，批量化學(xué)合成(生物催化)，增加脂族烴的水溶解度、生物除污和改進(jìn)食品特性。
[0215]本發(fā)明的方法也可用于許多工業(yè)過程中，其中所述氧化反應(yīng)是有益的。這種應(yīng)用的一個實(shí)例是在紙漿和紙制品的制造中，其中存在于木材(樹脂)中的烷烴和其它相關(guān)的脂族烴可能導(dǎo)致紙漿和紙張制造過程中的沉積問題。這些疏水化合物是紙漿和紙張制造過程中所謂的樹脂沉積物的前體。樹脂沉積導(dǎo)致低品質(zhì)的紙漿，并且可能引起紙漿廠運(yùn)營的停工。與具有高提取物含量的紙漿相關(guān)的特定問題包括運(yùn)轉(zhuǎn)能力問題、紙上的斑點(diǎn)和孔洞以及紙張斷裂。用過氧化 酶進(jìn)行處理可以增加所述化合物的溶解度并因此緩解問題。
[0216]本發(fā)明方法的另一個用途是，例如用于油或煤精煉，其中過氧化酶催化的氧化可用于改善烴的溶解度、粘度和/或燃燒特性。具體地，該處理會引起所處理的烴的煙點(diǎn)、著火點(diǎn)、燃點(diǎn)和沸點(diǎn)發(fā)生變化。
[0217]在批量化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品(包括殺蟲劑)、專用化學(xué)品和藥品的合成中，本發(fā)明的方法顯然在將羥基選擇性地引入底物從而影響所修飾的化合物的溶解度方面是相關(guān)聯(lián)的。此外，選擇性氧化對于通過有機(jī)化學(xué)合成和化學(xué)酶促合成領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行進(jìn)一步修飾提供了位點(diǎn)。
[0218]將天然氣徹底加工以去除高級烷烴。此類高級烷烴的氧化可用于提高水溶解度，并且因此便于通過洗滌天然氣流而去除高級烷烴。可以在井中或者在精制過程中進(jìn)行去除。
[0219]根據(jù)本發(fā)明，油廢物的氧化將顯著地提高生物可降解性，并且可應(yīng)用于涉及來自精煉廠的廢水處理和被污染地面或水的生物除污的方面。
[0220]可以用本發(fā)明的固定化過氧化酶多肽來實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0221]本發(fā)明的方法可在水性溶劑(反應(yīng)介質(zhì))、多種醇、醚、其他極性或非極性溶劑、或其混合物中進(jìn)行。通過研究用于本發(fā)明方法的脂族烴的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地認(rèn)知溶劑的合適實(shí)例。通過提高或降低進(jìn)行羥化/氧化的壓力，溶劑(反應(yīng)介質(zhì))和脂族烴可以在反應(yīng)溫度保持液相。
[0222]根據(jù)本發(fā)明的方法可在O~90攝氏度，優(yōu)選5~80攝氏度，更優(yōu)選10~70攝氏度，甚至更優(yōu)選15~60攝氏度，最優(yōu)選20~50攝氏度，且特別是20~40攝氏度的溫度進(jìn)行。[0223]本發(fā)明的方法可采用10秒至(至少)24小時的處理時間，優(yōu)選I分鐘至(至少)12小時，更優(yōu)選5分鐘至(至少)6小時，最優(yōu)選5分鐘至(至少)3小時，且特別是5分鐘至(至少)I小時的處理時間。 [0224]通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的二醇(二羥基脂族烴)可用于制備聚氨酯。聚氨酯是由通過氨基甲酸酯(carbamate, urethane)鍵連接的有機(jī)單元的鏈組成的聚合物。通過在催化劑的存在下使單體(具有至少兩個異氰酸酯官能團(tuán))與另一單體(具有至少兩個羥基)反應(yīng)，經(jīng)逐步生長聚合來形成聚氨酯聚合物。
[0225]本發(fā)明還提供用于在取代的或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的第二或第三個碳處引入氧代(酮)基的方法，該脂族烴具有至少5個碳并具有至少兩個與所述第二或第三個碳連接的氫，該方法包括將脂族烴與過氧化氫和具有本發(fā)明的過氧化酶活性的多肽相接觸。
[0226]在實(shí)施方式中，脂族烴不是正己烷或正癸烷。
[0227]在另一方面，本發(fā)明還提供用于在直鏈或支鏈脂族烴的末端碳處引入羥基或氧代基的方法，該脂族烴具有至少五個用羧基取代的碳原子，該方法包括將脂族烴與過氧化氫和具有本發(fā)明的過氧化酶活性的多肽相接觸。
[0228]在實(shí)施方式中，被羧基取代的脂族烴是脂肪酸；優(yōu)選丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二酸(月桂酸)、十四酸(肉豆蘧酸)、十六酸(棕櫚酸)、十八酸(硬脂酸)、二十酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
[0229]在實(shí)施方式中，被羧基取代的脂族烴不是月桂酸或棕櫚酸。
[0230]在又一方面，本發(fā)明還提供用于將具有至少5個碳的直鏈或支鏈脂族烴的伯醇變成(氧化成)相應(yīng)的酸的方法，該方法包含將脂族烴的醇與過氧化氫和具有本發(fā)明的過氧化酶活性的多肽相接觸。
[0231]例如，戊醇可以變化(氧化)為戊酸(纈草酸)，己醇可以變化為己酸(羊油酸)，庚醇可以變化為庚酸(葡萄花酸)，辛醇可以變化為辛酸(羊脂酸)，壬醇可以變化為壬酸(天竺葵酸)，癸醇可以變化為癸酸(羊蠟酸)，十二醇可以變化為十二酸(月桂酸)，十四醇可以變化為十四酸(肉豆蘧酸)，十六醇可以變化為十六酸(棕櫚酸)，十八醇可以變化為十八酸(硬脂酸)，且二十醇可以變化為二十酸(花生酸)。
[0232]具有本發(fā)明的過氧化酶活性的多肽(過氧化酶多肽或過氧化酶)以0.005-50ppm(mg/1)、或 0.01-40,0.02-30,0.03-25,0.04-20,0.05-15,0.05-10,0.05-5,0.05-1,0.05-0.8,0.05-0.6或0.1-0.5ppm的量用于本發(fā)明的方法中。酶的量是指定義明確的酶制
劑的毫克值。
[0233]在本發(fā)明的方法中，過氧化酶可以單獨(dú)應(yīng)用或與額外的酶一起應(yīng)用。術(shù)語“額外的酶“是指至少一種額外的酶,例如,一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或甚至更多額外的酶。
[0234]術(shù)語“與…一起應(yīng)用“(或“與…一起使用”)是指額外的酶可以應(yīng)用于本發(fā)明方法的同一步驟或另一步驟中。與使用了過氧化酶的步驟相比，其它工序步驟可以是上游或下游的。
[0235]在特定的實(shí)施方式中，額外的酶是具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、留酯酶(steryl esterase)和/或膽甾醇酯酶活性的酶。氧化還原酶的實(shí)例是具有漆酶和/或過氧化酶活性的酶。
[0236]方法中的術(shù)語“步驟”是指至少一個步驟，并且其可以為一個、兩個、三個、四個、五個或者更多個方法步驟。換句話說，本發(fā)明的過氧化酶可以應(yīng)用于至少一個方法步驟中，且額外的酶也可應(yīng)用于至少一個方法步驟，該步驟與使用過氧化酶的步驟相比可以是相同或不同的方法步驟。
[0237]術(shù)語“酶制劑”是指含有至少一種過氧化酶的產(chǎn)品。酶制劑也可以包含具有其它酶活性的酶。除了酶活性，此類制劑優(yōu)選地含有至少一種佐劑。佐劑的實(shí)例是緩沖劑、聚合物、表面活性劑和穩(wěn)定劑。
[0238]過氧化氫
[0239]過氧化酶所需的過氧化氫可提供為過氧化氫的水溶液，或提供為用于原位產(chǎn)生過氧化氫的過氧化氫前體。任何在溶解時釋放可被過氧化酶利用的過氧化物的固體實(shí)體均可用作過氧化氫的來源。當(dāng)溶解于水或合適的水性介質(zhì)時產(chǎn)生過氧化氫的化合物包括但不限于，金屬過氧化物、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過氧酸、烷基過氧化物、?；^氧化物、過氧酯(peroxyester s )、尿素過氧化物、過硼酸鹽和過氧羧酸或它們的鹽。
[0240]過氧化氫的另一來源是生成過氧化氫的酶體系，諸如氧化酶和氧化酶的底物。氧化酶和底物的組合的實(shí)例包括但不限于:氨基酸氧化酶(參見例如US6，248，575)和合適的氨基酸；葡糖氧化酶(參見例如WO 95/29996)和葡萄糖；乳酸氧化酶和乳酸鹽；半乳糖氧化酶(參見例如WO 00/506 06)和半乳糖；以及醛糖氧化酶(參見例如W099/31990)和合適的醛糖。
[0241]通過研究ECl.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._ 和 ECl.5.3._ 或類似的類型(根據(jù)國際生物化學(xué)聯(lián)合會)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識別此類氧化酶和底物的組合的其他實(shí)例。
[0242]可在本發(fā)明的方法開始時或過程中添加過氧化氫或過氧化氫源，例如作為過氧化氫的一次或多次單獨(dú)添加；或連續(xù)地作為補(bǔ)料分批添加。過氧化氫的典型量相應(yīng)于0.001mM至25mM的水平，優(yōu)選0.005mM至5mM的水平，且特別是0.01至ImM的水平的過氧化氫。過氧化氫還可以以相應(yīng)于0.1mM至25mM的水平使用，優(yōu)選0.5mM至15mM的水平，更優(yōu)選ImM至IOmM的水平,且最優(yōu)選2mM至8mM的水平的過氧化氫量使用。
[0243]脂族烴
[0244]在本發(fā)明的方法中被羥化的烴是具有至少3個碳的鏈且具有與2位或3位碳相連接的氫的脂族烴。優(yōu)選地，脂族烴是烷或烯；更優(yōu)選地，脂族烴是烷，諸如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷或其異構(gòu)體。
[0245]脂族烴是直鏈或支鏈的，但非環(huán)化的，因?yàn)槲稽c(diǎn)特異性羥化對環(huán)烴是不可行的。支鏈烴相應(yīng)于直鏈烴的異構(gòu)體。
[0246]脂族烴是取代或未取代的。優(yōu)選地，脂族烴是未取代的，諸如非活化的烴。
[0247]當(dāng)脂族烴是取代的時(連接有官能團(tuán))，優(yōu)選的取代基為鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、硫醇基、磺酰基、甲?；?、乙?；⒓籽趸?、乙氧基、苯基、芐基、二甲苯基、氨基甲?；桶被酋；?；更優(yōu)選的取代基為氯、羥基、羧基和磺酰基；最優(yōu)選的取代基為氯和羧基。
[0248]脂族烴可被多至10個取代基，多至8個取代基，多至6個取代基，多至4個取代基，多至2個取代或多至一個取代基取代。[0249]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂族烴是脂肪酸(取代基是羧基)。脂肪酸的實(shí)例包括，但不限于，丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二酸(月桂酸)、十四酸(肉豆蘧酸)、十六酸(棕櫚酸)、十八酸(硬脂酸)、二十酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
[0250]在第二方面，脂族烴是脂質(zhì)例如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂或鞘脂的酰基；且羥化發(fā)生在酰基末端的2位或3位。?；仨毦哂兄辽僖粋€與末端的2位或3位碳連接的氫。?；梢允秋柡突虿伙柡偷?，并且可以連接有任選的官能團(tuán)(取代基)。?；膶?shí)例包括但不限于，丁酸(酪酸)、戊酸(纈草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蠟酸)、十二酸(月桂酸)、十四酸(肉豆蘧酸)、十六酸(棕櫚酸)、十八酸(硬脂酸)、二十酸(花生酸)、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的?；问?。
[0251]信號肽
[0252]本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO: 2的氨基酸-17至-1或由其組成的信號肽。多核苷酸還可包括編碼與信號肽可操作地連接的蛋白的基因。蛋白優(yōu)選對于信號肽是外來的。在一個方面，編碼信號肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸I至51。
[0253] 本發(fā)明還涉及包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。
[0254]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)蛋白的方法，包括:(a)培養(yǎng)包含該多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收蛋白。
[0255]蛋白對于宿主細(xì)胞而言可以是內(nèi)生的或異源的。術(shù)語“蛋白”在本文中并非意指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此其涵蓋肽、寡肽和多肽。術(shù)語“蛋白”還包括組合形成編碼產(chǎn)物的兩個或更多個多肽。蛋白還包括雜合多肽和融合多肽。
[0256]優(yōu)選地，蛋白是激素、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報(bào)告子。例如，蛋白可以是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。
[0257]基因可以從任何原核生物、真核生物或其它來源獲得。
[0258]通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。
[0259]實(shí)施例
[0260]菌株
[0261]米曲霉ΜΤ3568是米曲霉JaL355 (W02002/40694)的amdS (乙酰胺酶)基因破壞的衍生物，其中通過用pyrG基因破壞米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因來修復(fù)pyrG營養(yǎng)缺陷型。
[0262]培養(yǎng)基和溶液
[0263]DAP-4C-1 培養(yǎng)某
[0264]Ilg MgSO4, 7H20
[0265]Ig KH2PO4[0266]2g C6H8O7, H2O
[0267]20g葡萄糖
[0268]IOg麥芽糖
[0269]5.2g K3PO4, H2O
[0270]0.5g酵母提取物
[0271]0.5ml KU6 微量金屬溶液(AMG)
[0272]混合直至完全溶解 [0273]添加Iml的Dowfax63N10 (直鏈Ε0/Ρ0嵌段共聚物、除泡劑/止泡劑)
[0274]用Mill1-Q水調(diào)節(jié)體積至1000ml
[0275]CaCO3 片劑 ?0.5g (每 200ml 添加 I 片)
[0276]接種前，150ml的各搖瓶添加3.5ml的50%磷酸氫二銨((NH4)2ΗΡ04)和5.0ml的20%乳酸。
[0277]KU6微量金屬溶液(AMG)
[0278]6.8g ZnCl2
[0279]2.5g CuSO4, 5H20
[0280]0.13g無水氯化鎳
[0281]13.9g FeSO4, 7H20
[0282]8.45g MnSO4, H2O
[0283]3g C6H8O7, H2O
[0284]離子交換水加至1000ml
[0285]實(shí)施例1
[0286]過氧化酶的表達(dá)和發(fā)酵
[0287]米曲霉菌株MT3568用于SEQ ID NO:1多核苷酸所編碼的成熟過氧化酶的異源表達(dá)。
[0288]SEQ ID NO:1是從在1975年保存且源自印度的變綠毛殼(Chaetomium virescens)CBS547.75 (從荷蘭菌種保藏中心獲得)分離的基因組核苷酸序列。
[0289]包含SEQ ID NO:1多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到米曲霉菌株MT3568中。于37°C孵育4-7天后，將四至八個轉(zhuǎn)化子的孢子接種到96深孔板中的0.5ml DAP-4C-01培養(yǎng)基中。
[0290]在30°C培養(yǎng)4天后，培養(yǎng)液通過SDS-PAGE分析以鑒定產(chǎn)生最大量的重組過氧化酶的轉(zhuǎn)化子，并且還在用于證實(shí)過氧化酶活性的測定中對培養(yǎng)液進(jìn)行分析。
[0291]如上構(gòu)建的米曲霉轉(zhuǎn)化子在以150RPM旋轉(zhuǎn)的振蕩搖床孵育箱中在于30°C孵育的500ml凹槽搖瓶中的150ml DAP-4C-01培養(yǎng)基中發(fā)酵5天，并進(jìn)一步用于下述的測定。
[0292]實(shí)施例2
[0293]2，2’ -聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的氧化
[0294]過氧化物酶和過氧化酶在過氧化氫的存在下氧化2，2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(也稱為ABTS)，且產(chǎn)生的綠色用分光光度法在405nm處定量(ε 405=36, βΟΟ?ν 1。!]!-1)。
[0295]反應(yīng)混合物(0.2ml)包含1.0mM ABTS、緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液pH7或50mMBritton-Robinson緩沖液ρΗ4)、20 μ I過氧化酶發(fā)酵上清液(參見實(shí)施例1)和0.5mM過氧化氫。
[0296]通過將過氧化酶上清液添加至測定中使用的其他組分而開始反應(yīng)。應(yīng)用Molecular Devices的SpectraMax酶標(biāo)儀,在室溫下監(jiān)測96孔微孔板在405nm處的吸光度變化。包括不添加酶而制備的空白。
[0297]記錄5分鐘的吸光度增加，且每分鐘吸光度(milli Abs)的變化的結(jié)果在表1中示出。
[0298]表1
[0299]
【權(quán)利要求】
1.一種具有過氧化酶活性的分離的多肽，其選自: (a)與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多肽； (b)由在中等嚴(yán)格條件、中-高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件、或極高等嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；(ii)其cDNA序列；或(iii )，( i )或(ii )的全長互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼的多肽； (c)由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%，如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽； Cd)在一個或多個位置包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體；以及 (e), (a)、(b)、(c)或(d)多肽的具有過氧化酶活性的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其包括SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。`
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽，其是由在低等嚴(yán)格條件、低-中等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中-高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件、或極高等嚴(yán)格條件下與(i ) SEQ IDNO:1的成熟多肽編碼序列；(^)其00嫩序列；*(iii)，(i)或(ii)的全長互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽，其是由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一'I"生的多核苷酸所編碼的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其包括SEQID NO:2或由SEQ ID NO:2組成，或者包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1-259。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其是在一個或多個位置包括替換、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其是SEQID NO: 2的片段，其中所述片段具有過氧化酶活性。
10.一種組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽。
11.一種分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽。
12.一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包括與一個或多個引導(dǎo)表達(dá)宿主中多肽產(chǎn)生的控制序列可操作地連接的根據(jù)權(quán)利要求11所述的多核苷酸。
13.—種重組宿主細(xì)胞，其包括與一個或多個引導(dǎo)多肽產(chǎn)生的控制序列可操作地連接的根據(jù)權(quán)利要求11所述的多核苷酸。
14.一種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，包括: (a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞在其野生型形式下產(chǎn)生所述多肽；以及 (b)回收所述多肽。
15.一種產(chǎn)生具有過氧化酶活性的多肽的方法，包括: Ca)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞；以及 (b)回收所述多肽。
16.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其被編碼根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
17.—種產(chǎn)生具有過氧化酶活性的多肽的方法，包括: Ca)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；以及 (b)回收所述多肽。
18.—種洗滌劑組合物，其包括表面活性劑和根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽。
19.一種用于在取 代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的任一端的2位或3位進(jìn)行羥化的方法，所述脂族烴具有至少3個碳且具有連接到2位或3位碳的氫，所述方法包括使所述脂族烴與過氧化氫和根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽接觸。
20.一種用于在脂質(zhì)?；哪┒说?位或3位進(jìn)行羥化的方法，包括使所述脂質(zhì)與過氧化氫和根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽接觸。
21.一種用于在取代或未取代的、直鏈或支鏈的脂族烴的至少兩端的第二個或第三個碳處引入羥基或酮基的方法，所述脂族烴具有至少5個碳且具有至少一個連接到所述第二個或第三個碳的氫，所述方法包括使所述脂族烴與過氧化氫和根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽接觸。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是烷烴。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述烷烴是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其異構(gòu)體。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是未取代的。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是直鏈的。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴通過兩個羥基的引入被轉(zhuǎn)化為二醇。
27.根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂族烴是脂肪酸。
28.一種產(chǎn)生聚氨酯的酶促方法，包括根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法將脂族烴轉(zhuǎn)化為二醇，以及使用所述二醇產(chǎn)生聚氨酯。
29.根據(jù)權(quán)利要求26產(chǎn)生的二醇用于生產(chǎn)聚氨酯的用途。
【文檔編號】C12N9/00GK103732740SQ201280039156
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月10日
【發(fā)明者】S·蘭德維克, L·H·厄斯特高, L·卡盧 申請人:諾維信公司