具有蛋白酶活性的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽和編碼這些多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)這些多肽及在例如動物飼料和洗滌劑中使用這些多肽的方法。
【專利說明】具有蛋白酶活性的多肽
[0001 ] 對序列表的引用
[0002]本申請含有處于計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽和編碼這些蛋白酶的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包括這些核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞(包括植物和動物細(xì)胞)，以及用于生產(chǎn)及使用這些 蛋白酶的方法，特別是這些蛋白酶在動物飼料和洗滌劑中的用途。
[0005]發(fā)明背景
[0006]在蛋白酶于動物飼料中的用途(體內(nèi))和/或此類蛋白酶用于處理植物蛋白的用途(體外)中，應(yīng)指出的是蛋白質(zhì)對于動物和人類而言是必需營養(yǎng)因子。大多數(shù)牲畜和人類從植物蛋白質(zhì)來源獲得必要的蛋白質(zhì)。重要的植物蛋白質(zhì)來源是例如油籽作物、豆類以及谷類。
[0007]當(dāng)例如大豆被包括在單胃動物如豬和家禽的飼料中時，相當(dāng)比例的大豆粉固體不能被有效地消化(在小豬、生長中的豬以及家禽如肉雞、蛋雞和公雞中表觀回腸蛋白質(zhì)消化率僅為大約80%)。
[0008]動物胃腸道由一系列的區(qū)段組成，每個區(qū)段代表不同的pH環(huán)境。在單胃動物例如豬和家禽以及許多魚類中，胃展現(xiàn)出低到PH1-2的強酸性pH，而腸展現(xiàn)出在pH6-7區(qū)中的更加中性的pH。除了胃和腸外，家禽還在胃之前具有嗉囊，在嗉囊中的pH主要由消化的飼料決定并且因此典型地處于PH4-6的范圍內(nèi)。由蛋白酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)消化可以沿著整個消化道進(jìn)行，其前提是該蛋白酶是有活性的，并且可在消化道中的條件下存在。因此，對于存在于胃環(huán)境中是高度酸穩(wěn)定的并且同時在目標(biāo)動物的寬生理PH下具有有效活性的蛋白酶是尤其希望的。
[0009]并且，動物飼料常常被配制為顆粒形式，其中蒸汽應(yīng)用于造粒過程中。因此，還希望的是用于動物飼料中的蛋白酶能夠在暴露于蒸汽處理時依然有活性。
[0010]具有蛋白酶活性的多肽
[0011]具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有時也稱為肽酶、蛋白酶、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽鏈內(nèi)部發(fā)揮作用的內(nèi)切型蛋白酶(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶對N-和C-末端封閉的肽底物顯示出活性，這些底物與所討論蛋白酶的特異性有關(guān)。
[0012]在此術(shù)語“蛋白酶”被定義為水解肽鍵的酶。蛋白酶的定義還適用于如在此使用的術(shù)語“親本蛋白酶”和“蛋白酶變體”的蛋白酶部分。術(shù)語“蛋白酶”包括任何屬于EC3.4組的酶(包括其13個亞類中的每一個)。EC編號參照來自NC-1UBMB，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),圣地亞哥，加利福尼亞州的《酶命名法》1992，包括分別發(fā)表于《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Bio-chem.) 1994, 223, 1-5 ;《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)1995，232，1-6 ;《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.) 1996，237，1-5 ;《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.) 1997, 250, 1-6 ；以及《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)1999, 264,610-650中的增補版1_5。命名法定期被增補并且更新，參見例如萬維網(wǎng)(WWW)http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index, html。
[0013]本發(fā)明的和根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白酶選自下組，該組由以下各項組成:
[0014]Ca)屬于EC3.4.21.酶組的蛋白酶；和/或
[0015](b)肽酶家族SI的絲氨酸蛋白酶，或更確切地為SlA ；
[0016]如在《生物化學(xué)雜志》(Biochem.J.) 290:205-218 (1993)和在MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫，發(fā)表版(release)，9.4 (2011年I月31日)(www.merops.ac.uk)中所描述的。該數(shù)據(jù)庫描述于羅林斯(Rawlings) , N.D.,巴雷特(Barrett) , A.J.&貝特曼(Bateman) , A.(2010) MEROPS:妝酶數(shù)據(jù)庫(MEROPS: the peptidase database),《核酸研究》(NucleicAcids Res) 38，D227-D233 中。.[0017]更確切地，本發(fā)明的蛋白酶是偏愛Pl位置上為疏水性芳香族aa殘基的那些。
[0018]為了確定給定蛋白酶是否是絲氨酸蛋白酶以及SlA蛋白酶家族，參考了以上手冊和其中指示的原則?？蓪λ械鞍酌割愋瓦M(jìn)行這種確定，而不論其是天然存在的或野生型的蛋白酶，或經(jīng)基因工程改造的或合成的蛋白酶。
[0019]SI家族的肽酶包含以下順序的催化三聯(lián)體His、Asp和Ser。催化三聯(lián)體的任何氨基酸的突變將導(dǎo)致酶活性的損失。來自立枯韓國生工菌(Kribbella solani) (SEQ IDN0:2)和明礬韓國生工菌(Kribbella aluminosa) (SEQ ID N0:4)的SI蛋白酶I的催化三聯(lián)體的氨基酸可能是位置His-138、Asp-168和Ser-250。
[0020]可使用任何測定法測量蛋白酶活性，在`所述方法中使用底物，該底物包括與所討論蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。使測定-PH和測定-溫度同樣地適配于所討論蛋白酶。測定-pH值的實例為pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12。測定-溫度的實例是5、10、15、20、
25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90、或95°C。蛋白酶底物的實例為酪蛋白，如天青精-交聯(lián)的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)，或suc-AAPF-pNA。適合的蛋白酶測定的實例描述于實驗部分中。
[0021]相關(guān)技術(shù)說明
[0022]分離自韓國生工菌屬(Kribbella)和鏈霉菌屬的蛋白酶在本領(lǐng)域中是已知的。來自黃色韓國生工菌(Kribbella flavida)的蛋白酶披露于盧卡斯(Lucas)，S.等人，“黃色韓國生工菌 DSM17836 的全基因組(The complete genome of Kribbella flavidaDSM17836)” 中；提交至(SEP-2009) EMBL/GenBank/DDBJ 數(shù)據(jù)庫(SWISSPROT:C1WJ16 ;在此的SEQ ID N0:6)。該序列具有與成熟蛋白酶的SEQ ID NO:2的序列80.23%的一致性以及與SEQ ID N0:4的序列80.81%的一致性。參照的DNA序列(在此為SEQ ID N0:5)具有與在此的SEQ ID NO:1的序列81.6%的一致性以及與SEQ ID NO: 3的序列85.51%的一致性。
[0023]—種蛋白酶一鏈霉菌蛋白酶B披露于亨德森(Henderson)，G.克瑞斯曼(Krygsman) , P.劉(Liu)，C.J.戴維(Davey)，C.C.馬萊克(Malek)，L.Τ., “來自灰色鏈霉菌的蛋白酶A和B的基因的表征和結(jié)構(gòu)(Characterization and structureof genes for proteases A and B from Streptomyces griseus)，，，〈〈細(xì)菌學(xué)雜志〉〉(J.Bacteriol).169:3778-3784 (1987)中。對于此蛋白酶的序列一致性低于以上指示的那些:
[0024]本發(fā)明提供了具有蛋白酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的蛋白酶是肽酶家族SlA的絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶展現(xiàn)出令人驚訝的pH特性，尤其是pH穩(wěn)定性和PH-活性特性，這使得它們成為令人感興趣的用于在動物飼料中使用的候選者。因此本發(fā)明的蛋白酶在從PH4-11的寬范圍內(nèi)對Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA是有活性的并且在PH6-11的范圍內(nèi)展現(xiàn)特別高的活性，在從pH3-7的寬生理pH范圍內(nèi)對飼料相關(guān)大豆粉-玉米粉底物是有活性的，并且在經(jīng)受低到2的pH持續(xù)2小時之后保持大于80%的活性。
[0025]在動物飼料中使用蛋白酶以改進(jìn)飼料中的蛋白質(zhì)的消化是已知的。W095/28850披露了改進(jìn)植物蛋白溶解性的植酸酶與一種或多種微生物蛋白水解酶的組合。W001/58275披露了枯草桿菌蛋白酶家族的酸穩(wěn)定蛋白酶在動物飼料中的用途。W001/58276披露了與衍生自擬諾卡氏屬(Nocardiopsis sp.) NRRL18262 (IOR蛋白酶)的蛋白酶和衍生自白擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alba) DSM14010的蛋白酶相關(guān)的酸穩(wěn)定蛋白酶在動物飼料中的用途。W004/07222U W004/111220、W004/111223、TO05/035747、和 W005/123911 披露了與 IOR 蛋白酶相關(guān)的蛋白酶以及它們在動物飼料中的用途。并且，W004/072279披露了其他蛋白酶的用途。
[0026]W004/034776披露了來自地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)的枯草桿菌蛋白酶/角蛋白酶PWD-1在家禽飼料中的用途。W004/077960披露了通過施用細(xì)菌或真菌蛋白酶增加反芻動物對草料或谷物的消化率的方法。
[0027]包括蛋白酶并且 上市用于動物飼料中的商品包括RONOZYME? ProAct(DSM NP/ 諾維信公司(Novozymes))、Axtra⑩(丹尼斯克公司(Danisco))、Avizyme?(丹尼斯克公司)、Porzyme^ (丹尼斯克公司)、Allzyme?(阿爾泰克公司(Alltech))、Vcrsa/ymciv:(國際生物資源公司(BioResources, Int.))、Pou I try grow? (杰夫公司(Jef0))以及Cibenza? dpioo (諾偉司公司(Novus))。
[0028]發(fā)明概述
[0029]本發(fā)明涉及選自下組的具有蛋白酶活性的分離的多肽，該組由以下各項組成:
[0030](a)具有與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的一種多肽；
[0031](b)由一種具有與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列至少86%的序列一致性的多核苷酸編碼的一種多肽；
[0032](C)一種變體，該變體包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的一個或多個(若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
[0033](d) (a)、(b)、或(C)的多肽的片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0034]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸，包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、以及重組宿主細(xì)胞，并且涉及生產(chǎn)這些多肽的方法。
[0035]本發(fā)明還涉及用于制備供動物飼料使用的組合物、用于改進(jìn)動物飼料的營養(yǎng)價值的方法，以及處理有待用于動物飼料組合物中的蛋白質(zhì)的方法。
[0036]此外，本發(fā)明還涉及蛋白酶在洗滌劑組合物和此類洗滌劑組合物中的用途。
[0037]序列表綜述[0038]SEQ ID NO:1是如從立枯韓國生工菌(Kribbella solani)分離的DNA序列。
[0039]SEQ ID NO: 2是如從SEQ ID NO:1推導(dǎo)出的氨基酸序列
[0040]SEQ ID NO: 3是如從明帆韓國生工菌(Kribbella aluminosa)分離的DNA序列。
[0041]SEQ ID NO:4是如從SEQ ID NO:3推導(dǎo)出的氨基酸序列
[0042]SEQ ID NO: 5是來自黃色韓國生工菌(Kribbella flavida)的DNA序列(EMBL:CPOOI736)
[0043]SEQ ID N0:6是來自黃色韓國生工菌(Kribbella flavida)的氨基酸序列(盧卡斯(Lucas)，S.等人“黃色韓國生工菌DSM17836的全基因組(The complete genome ofKribbella flavida DSM17836.)”UNIPR0T:D2Q1F6)
[0044]SEQ ID N0:7 是 10R 蛋白酶的 DNA 序列(W005/035747, SEQID NO:1)
[0045]SEQ ID N0:8 是 10R 蛋白酶的氨基酸序列(W005/035747，SEQID N0:2)
[0046]SEQ ID N0:9是立枯韓國生工菌(Kribbella solani) SI肽酶特異性正向引物。
[0047]SEQ ID NO: 10是立枯韓國生工菌(Kribbella solani) SI肽酶特異性反向引物。
[0048]SEQ ID NO: 11是明礬韓國生工菌(Kribbella aluminosa) SI肽酶特異性正向引物。
[0049]SEQ ID NO: 12是明礬韓國生工菌(Kribbella aluminosa) SI肽酶特異性反向引物。`
[0050]SEQ ID NO: 13上游側(cè)翼片段特異性正向引物。
[0051]SEQ ID NO: 14上游側(cè)翼片段特異性反向引物。
[0052]SEQ ID NO: 15下游側(cè)翼片段特異性正向引物。
[0053]SEQ ID NO: 16下游側(cè)翼片段特異性反向引物。
[0054]SEQ ID: 17是遲緩芽孢桿菌分泌信號。
[0055]序列的一致性矩陣:
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種選自下組的具有蛋白酶活性的分離的多肽，該組由以下各項組成: (a)具有與SEQID N0:2和/或SEQ ID N0:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的一種多肽； (b)由一種在高嚴(yán)格條件下或非常高嚴(yán)格條件下與以下項雜交的多核苷酸編碼的一種多肽 (i)SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列，和/或 (ii)SEQID NO:3的成熟多肽編碼序列，或 (iii)(i)或(ii)的全長互補鏈； (c)由一種具有與SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列至少86%的序列一致性的多核苷酸編碼的一種多肽；和/或 (d)—種變體，該變體包括SEQID N0:2和/或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一個或多個(若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，該多肽由一種在高嚴(yán)格條件下或非常高嚴(yán)格條件下與以下項雜交的多核苷酸編碼 (i)SEQID N0:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列， (ii)(i)或(ii)的全長互補鏈。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的多肽，包括SEQID N0:2或由其組成。
4.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的多肽，包括SEQID N0:4或由其組成。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽，該多肽是SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的一種片段，其中該片段具有蛋白酶活性。
6.一種具有蛋白酶活性并且具有與SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的變體多肽，該變體多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一個或多個(若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。
7.一種組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽。
8.—種分離的多核苷酸,編碼如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽。
9.一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體,該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括如權(quán)利要求8所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該多肽在一種表達(dá)宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的一個或多個(若干個)控制序列。
10.一種重組表達(dá)宿主細(xì)胞，包括如權(quán)利要求8所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該多肽的生產(chǎn)的一個或多個控制序列。
11.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽的方法,包括: (a)在有益于生產(chǎn)該多肽的條件下，培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞在處于其野生型形式下生產(chǎn)該多肽；并且 (b)回收該多肽。
12.—種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽的方法,包括: Ca)在有益于生產(chǎn)該多肽的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞；并且 (b)回收該多肽。
13.經(jīng)一種編碼如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
14.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多肽的方法,包括: Ca)在有益于生產(chǎn)該多肽的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；并且 (b)回收該多肽。
15.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的至少一種多肽在以下項中的用途 (i)動物飼料； (ii)動物飼料添加劑； (iii)用于在動物飼料中使用的一種組合物的制備； (iv)改進(jìn)一種動物飼料的營養(yǎng)價值； (ν)增加動物飼料中的可消化和/或可溶性蛋白質(zhì)； (vi)增加動物飲食中的蛋白質(zhì)的水解程度；和/或 (vii)蛋白質(zhì)的處理。
16.—種用于改進(jìn)一種動物飼料的營養(yǎng)價值的方法,其中將如權(quán)利要求1-6中任一項所述的至少一種多肽添加至該飼料。
17.一種動物飼料添加劑，包括 (i)如權(quán)利要求1-6中任一項所述的至少一種多肽；以及 (ii)至少一種脂溶性維生素，和/或 (iii)至少一種水溶性維生素,和/或 (iv)至少一種痕量礦物質(zhì)。
18.如權(quán)利要求17所述的動物飼料添加劑，進(jìn)一步包括一種或多種淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混合物。
19.一種動物飼料，具有50至800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量并且包括如權(quán)利要求1-6中任一項所述的至少一種多肽。
20.一種用于蛋白質(zhì)處理的方法，包 括將如權(quán)利要求1-6中任一項所述的至少一種多肽添加至至少一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源的步驟。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中大豆被包括在該至少一種蛋白質(zhì)來源之中。
22.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
23.一種洗滌劑組合物，包括如權(quán)利要求1至6中任一項所述的至少一種多肽。
24.如權(quán)利要求23所述的洗滌劑組合物，其中該組合物包括一種或多種另外的酶。
25.如權(quán)利要求24所述的洗滌劑組合物，其中這些另外的酶選自下組，該組包括:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶(xanthanases)、過氧化物酶、鹵代加過氧酶(haloperoxygenases)、過氧化氫酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。
【文檔編號】C12N9/52GK103764822SQ201280040416
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日
【發(fā)明者】C.斯喬霍爾姆, P.R.奧斯特加德, T.霍夫, K.龐托普皮丹, R.P.奧林斯基 申請人:諾維信公司