自多潛能干細(xì)胞有效誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使多潛能干細(xì)胞分化為原條細(xì)胞群的方法，以逐步方式用于進(jìn)一步成熟為定形內(nèi)胚層。
【專利說明】自多潛能干細(xì)胞有效誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及使多潛能干細(xì)胞分化為原條細(xì)胞群的方法，以逐步方式用于進(jìn)一步成熟為定形內(nèi)胚層。
[0002]發(fā)明背景
胰島的移植對改進(jìn)I型糖尿病的治療有著巨大前景，但是缺乏可利用的供體胰島是需要解決的一個障礙。多潛能干細(xì)胞原則上可以產(chǎn)生無限數(shù)量的移植用β細(xì)胞，但迄今沒有找到產(chǎn)生全功能β細(xì)胞的可靠方案。前腸衍生器官:胰、肺、甲狀腺、肝、食道和胃起源于定形內(nèi)胚層(DE)，其為原腸胚形成期間形成的三個胚層之一。DE的誘導(dǎo)是自內(nèi)胚層衍生組織向分化細(xì)胞類型(例如產(chǎn)生胰島素的胰β細(xì)胞)形成的第一個關(guān)鍵步驟。已針對小鼠和人這二者報告了由多潛能胚胎干(ES)細(xì)胞形成DE細(xì)胞，載于例如W02005/116073、W02005/063971和US 2006/0148081。由DE細(xì)胞產(chǎn)生胰內(nèi)胚層(PE)細(xì)胞對于產(chǎn)生用于治療糖尿病的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞而言是必要的。
[0003]已知胚胎中的DE形成經(jīng)過原條(PS)形成(中內(nèi)胚層中間體)的中間步驟，所述原條具有形成中胚層或者DE的潛力。在細(xì)胞水平上，所有發(fā)育過程最終都由不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的協(xié)同作用來控制。這其中，fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于協(xié)調(diào)整個發(fā)育過程中發(fā)生的復(fù)雜細(xì)胞行為而言是必不可少。fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制細(xì)胞增殖、干細(xì)胞維護(hù)和細(xì)胞命運(yùn)的決定以及有組織的細(xì)胞運(yùn)動和組織極性的建立。它還在人類癌癥中被頻繁地解除控制并且涉及退行性疾病。作為治療干預(yù)的潛在靶標(biāo)，它因此給干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來新的希望。
[0004]通過與或不與Wnt組合使用激活素A/Nodal，已經(jīng)描述了 DE的誘導(dǎo)。具體地講，先前已經(jīng)報道了 Wnt受體配體Wnt3a當(dāng)在5天AA-介導(dǎo)的DE誘導(dǎo)的第I天期間(24 h)與激活素A (AA)孵育時，即，使用常規(guī)D’Amour方案(Kroon等人2008，Nat Biotech, 2006),促進(jìn)有效的DE形成。
[0005]將各Wnt蛋白按其可指定的特定活性分類的試圖，已經(jīng)形成了將Wnt分為“標(biāo)準(zhǔn)的(canonical)”或“非標(biāo)準(zhǔn)的(non-canonical) ”的細(xì)分類，其根據(jù)前者(而非后者)的誘導(dǎo)β_連環(huán)蛋白/TCF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。
[0006]CHIR是一種糖原合酶激酶3 β (Gsk3b)抑制劑和使小鼠胚胎干細(xì)胞維持在多潛能狀態(tài)的限定組織培養(yǎng)基的一種已知成分(Ying等人Nature 453，519-523)。Gsk3b具有多個靶標(biāo)，但主要是已知能調(diào)節(jié)β_連環(huán)蛋白的降解和/或核轉(zhuǎn)移。使用其它糖原合酶激酶3 β (Gsk3b)抑制劑例如BIO和Wnt3a,已經(jīng)描述了穩(wěn)定的β -連環(huán)蛋白在自人胚胎干細(xì)胞(hESC)向PS形成中的作用。然而CHIR是迄今為止所報道的最具選擇性的Gsk3b-抑制劑。
[0007]AA和CHIR的共孵育降低了 DE形成的穩(wěn)定性，導(dǎo)致有效性較差和穩(wěn)健性較差的方案。本發(fā)明涉及與用常規(guī)誘導(dǎo)方案獲取DE (D’Amour方案，描述于Kroon等人，2008)相t匕，在AA-介導(dǎo)的定形內(nèi)胚層誘導(dǎo)之前利用限定濃度范圍的CHIR而無AA來處理多潛能干細(xì)胞。這種先暴露給CHIR、再暴露給AA的序貫暴露是必不可少的并且反映了依次的PS形成(由CHIR誘導(dǎo))，然后是通過AA的更有效和快速的DE形成。本發(fā)明涉及首先對PS、然后對DE的不連續(xù)的和依次的誘導(dǎo)控制，導(dǎo)致總體更有效，具有較早的S0X17表達(dá)峰和穩(wěn)健的DE方案。用Wnt3a處理不能重現(xiàn)CHIR的這些效應(yīng)。
[0008]附圖描述
D0:在任何處理之前的未分化細(xì)胞
Ctrl:無Chir處理Dl。細(xì)胞在起始期間留在RPMI中，然后經(jīng)過AA D2替換和從D3開始的AA +血清替換(B27)。
[0009]’Am:無Chir處理，按照Kroon等人，Nat.Biotech., 2008的方案(I天激活素A 100 ng/ml + Wnt 25ng/ml，2 天激活素 AlOO ng/ml + 0.2% FBS)
Dl: Chir添加之后I天
D2-4: AA添加之后1-3天
所有基因表達(dá)圖都以LoglO值表不。
[0010]圖1顯示CHIR DE方案的命名法和概述。在下列7種不同的多潛能干細(xì)胞系中已經(jīng)證實了該方案:SA121、SA181、SA461、SA167 (人 ESC)和 chIPS2、chIPS3、chIPS4 (人iPSC)。
[0011]圖2顯示，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在hES SA121 (圖2A)和chIPS4 (圖2B)中在CHIR 處理之后 24 小時(Dl)的 PS 標(biāo)記 Brachyury (T)、MIXLl、EOMES 和 Goosecoid (GSC)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。還用ICC證實了 T蛋白水平(圖2C)。與未分化的細(xì)胞相比，24小時CHIR處理之后，T fold誘導(dǎo)跨越500-100000 (η > 60)。柱條顯示相對于未分化的細(xì)胞DO的LoglO值。
[0012]圖3顯示與未用CHIR預(yù)處理的細(xì)胞相比，用激活素A (AA)替代CHIR之后I天的DE 標(biāo)記(S0X17、CXCR4、F0XA2、CER)的基因表達(dá)。在 hESC SA121 (圖 3A)和 iPSC chIPS4(圖3B)兩者中都顯示出表達(dá)。柱條顯示相對于未分化的細(xì)胞DO的LoglO值。
[0013]圖 4 顯示單用 CHIR (3μΜ)、ΒΙ0 (0.5uM)、Wnt3a (200ng/ml)或者 AA (lOOng/ml)處理 24 小時(Dl)、然后是 2 天 AA 處理(D3)的 hESC SA121 (4A-B)和 iPSC chIPS4 (4C)細(xì)胞。另外，分析了 D’Amour (方案描述于Kroon等人,2008)。分析了 Brachyury和S0X17的表達(dá)。前24小時用AA或BIO處理的hES細(xì)胞直到第3天無存活。
[0014]圖5顯示與D’ Amour相比，在CHIR誘導(dǎo)之后DE標(biāo)記S0X17、F0XA2和CXCR4 (圖`5A-C)和0CT4 (圖5E)的基因表達(dá)水平，以及在chIPS4細(xì)胞中定量測定的S0X17/0CT4的ICC蛋白水平(圖F)。對0CT4和S0X17呈陽性染色的細(xì)胞的相應(yīng)的％ (D1-3)也示于表2中。使用這兩個方案任一個，使用先前已公布的PE分化方案(Ameri等人2010)，使chIPS/SA121 DE細(xì)胞進(jìn)一步分化為胰內(nèi)胚層(PE)。使用對于I3DXl蛋白水平的ICC，在PE誘導(dǎo)7天后分析細(xì)胞。平行地，對于chIPS4細(xì)胞(圖5G)和SA121細(xì)胞(圖5H)兩者，從細(xì)胞中采集mRNA并通過實時PCR分析I3DXl表達(dá)。在這兩種細(xì)胞系中重復(fù)2次實驗(圖5G，H)。
[0015]圖6顯示僅用RPM1、AA和Wnt3a或者CHIR Dl處理、接著用AA或者用AA和Wnt3aD2和AA D3的組合(圖6A)處理的hES SA121 (圖6A)或chIPS4 (圖6C)中的S0X17 D3的基因表達(dá)。細(xì)胞還用CHIR Dl和AA D2 ( “CHIR”)、D’ Amour或者CHIR加上DjAmour處理，并分析S0X17表達(dá)(圖6B)和形態(tài)學(xué)(圖6C)。
[0016]圖7顯示在24小時(Dl)之后和在隨后的AA處理2天(D3)之后在濃度為l_7uM之間滴定CHIR并分析。CHIR 0.5-luM和CHIR 7uM D3無存活。在SA121 (圖7A)和chIPS細(xì)胞(圖7C)中，在24小時處理之后分析Brachyury表達(dá)。在SA121 (圖7B)和chIPS細(xì)胞(圖7D)中D3分析S0X17表達(dá)。
[0017]圖8顯示在CHIR預(yù)處理之后或在D’Amour方案之后，在mTeSR系統(tǒng)中的S0X17 D3基因表達(dá)(圖8)。
[0018]圖9顯示當(dāng)在MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)時，標(biāo)記fcachyury和S0X17在D0、D2和D3的基因表達(dá)水平。
[0019]發(fā)明概述
本發(fā)明還涉及用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
a.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
b.在包含激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第二后續(xù)步驟。
[0020]本發(fā)明涉及更快和更明顯的S0X17表達(dá)峰和分化人類多潛能干細(xì)胞以獲得定形內(nèi)胚層的更穩(wěn)健的方法。
[0021]發(fā)明描述
本發(fā)明涉及用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:在包含至少2 μΜCHIR的培養(yǎng)基中孵育多潛能干細(xì)胞，和隨后在包含激活素A (AA)的培養(yǎng)基中孵育這些細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單用CHIR 24小時然后再添加ΑΑ，在這24小時期間誘導(dǎo)PS標(biāo)記(例如Brachyury、Mixl1、Eomes和Goosecoid (GSC))的顯著和劑量依賴性的上調(diào)。
[0023]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與無CHIR預(yù)孵育的培養(yǎng)相比或當(dāng)與常規(guī)D’ Amour方案(Novocell, Nature Biotec 2006, 2008)相比時，在用AA的后續(xù)孵育以誘導(dǎo)DE期間，經(jīng)S0X17表達(dá)測定的DE誘導(dǎo)在更早時間點達(dá)到峰值并具有更高倍數(shù)的變化。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法更有效并顯示出比其它已知的DE誘導(dǎo)方案更快的Soxl7 mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0024]CHIR-介導(dǎo)的效應(yīng)在其他培養(yǎng)系統(tǒng)(在小鼠胚胎飼養(yǎng)(MEF)細(xì)胞上的mTeSR培養(yǎng)基和常規(guī)ES培養(yǎng)基)和跨越不同的細(xì)胞系(SA121、SA181、SA461、SA167、chIPS2、chIPS3、chIPS4)兩者中都已重現(xiàn)，證明所述效應(yīng)不依賴于細(xì)胞系或DEF培養(yǎng)基培養(yǎng)系統(tǒng)。人胚胎干細(xì)胞可源自單個卵裂球而不破壞胚胎(Klimanskaya等人2006 ；Chung等人2008 ；Geens等人 2009)。細(xì)胞系 chIPS2、chIPS3、chIPS4 是 iPS 細(xì)胞系。
[0025]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加AA之后，CHIR促進(jìn)高的細(xì)胞密度。在PS誘導(dǎo)中CHIR的劑量依賴性將會允許當(dāng)啟動AA處理時未來可能的前-圖式發(fā)育(pre-patterning)影響的優(yōu)化。隨后所添加因子的順序減少了被平行激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的數(shù)量。使可能影響效率的因子數(shù)量最小化將會提高穩(wěn)健性和重現(xiàn)性。
[0026]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，就S0X17表達(dá)的有效峰和穩(wěn)健性而言，當(dāng)與BIO或Wnt3a相比時，CHIR-起始步驟對于DE誘導(dǎo)而言是獨特的和優(yōu)越的。
[0027]在簡單的RPM1-1640培養(yǎng)基中，使來自可擴(kuò)展的多潛能培養(yǎng)物的人胚胎干細(xì)胞(hESC)和人誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(iPSC)經(jīng)歷24小時CHIR (2-7 μΜ)處理。然后將培養(yǎng)基更換為含有AA的RPM1-1640培養(yǎng) 基，DE誘導(dǎo)開始，其中2天之后S0X17 mRNA表達(dá)達(dá)到峰值，3-4天之后S0X17蛋白表達(dá)達(dá)到峰值。低于2 μΜ濃度的CHIR導(dǎo)致Brachyury的延遲誘導(dǎo)至明顯較低的水平，隨后AA刺激，在72小時之后DE不被誘導(dǎo)。在CHIR濃度低于1.5μΜ時PS的形成被延遲，因此當(dāng)添加AA時不能進(jìn)一步發(fā)展為DE。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，濃度范圍大于或等于2 μΜ的CHIR達(dá)24小時，對于隨后通過AA的DE誘導(dǎo)而言是重要的。
[0028]本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)CHIR-起始步驟導(dǎo)致AA對S0X17的明顯快速的誘導(dǎo)，I天之后就已達(dá)到峰值，相比之下，僅用AA則在3-4天之后才見峰值。用CHIR接著用AA的序貫孵育對于DE形成達(dá)到有利水平而言是必不可少的。
[0029]本發(fā)明的實施方案:
1.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
c.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
d.在包含激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第二后續(xù)步驟。
[0030]2.實施方案I的方法，其中所述培養(yǎng)基是RPM1-1640。
[0031]3.前述實施方案中任一個的方法，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0032]4.前述實施方案中任一個的方法，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
[0033]5.實施方案3的方法，其中所述干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
[0034]6.實施方案3的方法，其中所述干細(xì)胞是誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0035]7.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約2.5 μΜ,或至少3μΜ，例如范圍在大約2-20uM，例如范圍在大約3.1-15 μΜ，或例如范圍在大約3.5_7 μΜ，或例如范圍在大約3.5-6 μΜ，或例如范圍在大約3.5-5 μΜ。
[0036]8.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約2 μΜ。
[0037]9.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約2.5 μΜ。
[0038]10.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3 μΜ。
[0039]11.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.1 μΜ。
[0040]12.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.2 μΜ。
[0041]13.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.3 μΜ。
[0042]14.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.4 μΜ。
[0043]15.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.5 μΜ。
[0044]16.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約2_7 μΜ。
[0045]17.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3_7 μΜ。
[0046]18.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.1-7 μΜ。
[0047]19.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.2-7 μΜ。
[0048]20.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.3-7 μΜ。
[0049]21.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.4-7 μΜ。
[0050]22.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.5-7 μΜ。
[0051]23.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為2.5 μΜ。
[0052]24.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3 μΜ。
[0053]25.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.1 μΜ。[0054]26.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.2 μΜ。
[0055]27.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.3 μΜ。
[0056]28.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.4 μΜ。
[0057]29.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.5 μΜ。
[0058]30.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.6 μΜ。
[0059]31.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.7 μΜ。
[0060]32.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.8 μΜ。
[0061]33.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為3.9 μΜ。
[0062]34.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為大約4 μΜ。
[0063]35.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為大約4.5 μΜ。
[0064]36.實施方案7的方法，其中CHIR的濃度為大約5 μΜ。
[0065]37.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少12小時。
[0066]38.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少24小時。
[0067]39.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少48小時。
[0068]40.實施方案37的方法，其中所述與CHIR的孵育為介于24和48小時之間。
[0069]41.實施方案37的方法，其中所述與CHIR的孵育為24小時。
[0070]42.實施方案37的方法，其中所述與CHIR的孵育為48小時。
[0071]43.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度為至少大約100ng/ml，例如范圍為大約1-5000 ng/ml，例如范圍為大約1-1000 ng/ml，例如范圍為大約10-500ng/ml或例如范圍為大約1-200 ng/ml。
[0072]44.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度范圍為大約l_200ng/ml。
[0073]45.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度范圍為大約20_200ng/ml。
[0074]46.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度范圍為大約30_200ng/ml。
[0075]47.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為至少25ng/ml。
[0076]48.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為大約140ng/ml。
[0077]49.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為大約120ng/ml。
[0078]50.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為大約100ng/ml。
[0079]51.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為大約80ng/ml。
[0080]52.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為大約60ng/ml。
[0081]53.實施方案43的方法，其中激活素A的濃度為大約40ng/ml。
[0082]54.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育范圍為12小時至5天，例如至少12小時，例如至少24小時或至少48小時，或例如3-4天。
[0083]55.實施方案54的方法，其中所述與激活素A的孵育為至少12小時。
[0084]56.實施方案54的方法，其中所述與激活素A的孵育為24小時。
[0085]57.實施方案54的方法，其中所述與激活素A的孵育為48小時。
[0086]58.實施方案54的方法，其中所述與激活素A的孵育為72小時。
[0087]59.實施方案54的方法，其中所述與激活素A的孵育為48至72小時。
[0088]60.實施方案54的方法，其中所述與激活素A的孵育為3_4天。
[0089]61.前述實施方案中任一個的方法，其中內(nèi)胚層細(xì)胞是得自所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0090]62.實施方案61的方法，其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞、腸內(nèi)胚層細(xì)胞和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0091]63.實施方案62的方法，其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0092]64.實施方案62的方法，其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0093]65.通過實施方案1-64的方法可獲取的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0094]66.通過實施方案1-64的方法可獲取的內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0095]67.實施方案66的肝內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞、腸內(nèi)胚層細(xì)胞和/肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0096]68.實施方案66的內(nèi)胚層細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0097]69.實施方案66的內(nèi)胚層細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0098]70.實施方案1-64的方法，其中β-連環(huán)蛋白被CHIR-誘導(dǎo)的Gsk3b抑制而活化。 [0099]71.CHIR的用途，其中在培養(yǎng)基中的CHIR的濃度為至少2μΜ CHIR，例如范圍為
3.1-15 μΜ，或例如3.1-7 μΜ，或例如3.5-15 uM，或例如
72.在培養(yǎng)基中濃度為至少3.1uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)原條細(xì)胞中的用途。
[0100]73.濃度范圍為3.1-7UM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0101]74.濃度范圍為3.5_7uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0102]75.濃度為3.5 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0103]76.濃度為4 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0104]77.濃度為4.5 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0105]78.濃度為5 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0106]79.實施方案71-78的用途,其中所述原條表達(dá)一種或多種以下標(biāo)記:Brachyury或 Mixll。
[0107]80.實施方案71-78的用途，其中所述定形內(nèi)胚層表達(dá)一種或多種以下標(biāo)記:Soxl7。
[0108]本發(fā)明的更多實施方案:
81.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
a.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
b.在包含至少25ng/ml激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第二后續(xù)步驟。
[0109]82.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
a.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的至少12小時的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
c.在包含至少25ng/ml激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的至少12小時的第二后續(xù)步驟。
[0110]83.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
b.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的至少24小時的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
d.在包含至少25ng/ml激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的至少24小時的第二后續(xù)步驟。
[0111]84.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
a.在包含至少3.1 μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
b.在包含至少25ng/ml激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第二后續(xù)步驟。
[0112]85.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
a.在包含至少3.5 μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和
b.在包含至少25ng/ml激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第二后續(xù)步驟。
[0113]86.前述實施方案中任一個的方法，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0114]87.實施方案86的方法，其中所述干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
[0115]88.實施方案86的方法，其中所述干細(xì)胞是誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0116]89.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約2，至少大約2.5uM，至少大約3uM，至少大約3.1 μΜ，例如范圍為大約3.1-15 μΜ，或例如大約3.5-7 μΜ,或例如大約3.5-6 μΜ，或例如大約3.5-5 μΜ。
[0117]90.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.1 μΜ。
[0118]91.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.2 μΜ。
[0119]92.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.3 μΜ。
[0120]93.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.4 μΜ。
[0121]94.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.5 μΜ。
[0122]95.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.1-7 μΜ。
[0123]96.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.2-7 μΜ。
[0124]97.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.3-7 μΜ。
[0125]98.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.4-7 μΜ。
[0126]99.前述實施方案中任一個的方法，其中CHIR的濃度范圍為大約3.5-7 μΜ。
[0127]100.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少24小時。
[0128]101.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少48小時。
[0129]102.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為介于24和48小時之間。
[0130]103.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為24小時。
[0131]104.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為48小時。
[0132]105.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度范圍為大約25_200ng/ml ο
[0133]106.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度范圍為大約30_200ng/ml ο
[0134]107.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度為大約100ng/ml。
[0135]108.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度為大約80ng/ml。
[0136]109.前述實施方案中 任一個的方法，其中激活素A的濃度為大約60ng/ml。[0137]110.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度為大約40ng/ml。
[0138]111.前述實施方案中任一個的方法，其中激活素A的濃度為至少大約110ng/ml。
[0139]112.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育范圍為12小時至5天，例如至少12小時，例如至少24小時或至少48小時，或例如3-4天。
[0140]113.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育為至少大約24小時。
[0141]114.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育為大約24小時。
[0142]115.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育為大約48小時。
[0143]116.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育為大約72小時。
[0144]117.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育為大約48至約72小時。
[0145]118.前述實施方案中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育為大約3-4天。
[0146]119.前述實施方案中任一個的方法，其中內(nèi)胚層細(xì)胞得自所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0147]120.實施方案119的方法，其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞、腸內(nèi)胚層細(xì)胞和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0148]121.實施方案120的方法，其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0149]122.實施方案120的方法，其中`所述內(nèi)胚層細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0150]123.通過實施方案81-122的方法可獲取的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0151]124.通過實施方案81-122的方法可獲取的內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0152]125.實施方案124的肝內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞、腸內(nèi)胚層細(xì)胞和/肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0153]126.實施方案124的內(nèi)胚層細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0154]127.實施方案124的內(nèi)胚層細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0155]128.實施方案81-122的方法，其中β-連環(huán)蛋白被CHIR-誘導(dǎo)的Gsk3b抑制而活化。
[0156]129.特定濃度的CHIR在自干細(xì)胞誘導(dǎo)原條細(xì)胞中的用途。
[0157]130.特定濃度的CHIR在自干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0158]131.實施方案129-130的用途，其中培養(yǎng)基中的CHIR濃度為至少2 μΜ CHIR。
[0159]132.實施方案129-131的用途，其中培養(yǎng)基中的CHIR濃度為至少2μΜ CHIR，例如范圍為2-7 μΜ，例如3 μΜ或例如4 μΜ。
[0160]133.濃度范圍為2-7 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0161]134.濃度范圍為3-7 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0162]135.濃度范圍為3.5-7 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0163]在一個實施方案中，通過本發(fā)明的方法可獲取的胰內(nèi)分泌細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，任選與朝著產(chǎn)生胰高血糖素、生長抑素、胰多肽和/或生長素釋放肽的細(xì)胞分化的細(xì)胞在一起。如本文所用，“產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞”是指產(chǎn)生和貯存或分泌可檢測量的胰島素的細(xì)胞?！爱a(chǎn)生胰島素的細(xì)胞”可以是單一細(xì)胞或細(xì)胞集合。
[0164]在另一個實施方案中，包含胰細(xì)胞的細(xì)胞群得自體細(xì)胞群。在某些方面，所述體細(xì)胞群已經(jīng)誘導(dǎo)而去分化，成為胚胎-樣干(ES，例如多潛能)細(xì)胞。這樣的去分化細(xì)胞也稱為誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(IPS)。
[0165]在另一個實施方案中，包含胰細(xì)胞的細(xì)胞群得自胚胎干(ES，例如多潛能)細(xì)胞。在某些方面，包含胰細(xì)胞的細(xì)胞群是多潛能細(xì)胞，例如ES樣-細(xì)胞。
[0166]在另一個實施方案中，包含胰細(xì)胞的細(xì)胞群是胚胎分化的干(ES或多潛能的)細(xì)胞。分化發(fā)生在胚狀體中和/或在單層細(xì)胞培養(yǎng)中或其組合中。
[0167]在另一個實施方案中，所述細(xì)胞群是干細(xì)胞群。在某些方面，所述細(xì)胞群是分化為胰內(nèi)分泌譜系的干細(xì)胞群。
[0168]干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其定義為在單細(xì)胞水平上既能夠自我更新，又能夠分化以產(chǎn)生子代細(xì)胞，包括自我更新的祖細(xì)胞、非自我更新的祖細(xì)胞和終末分化的細(xì)胞。干細(xì)胞還可按以下能力來表征:在體外分化為來自多個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的多個細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞的能力，以及在移植之后產(chǎn)生多個胚層的組織的能力，和在注入胚泡中之后充分促進(jìn)大部分(如果不是所有的話)組織的能力。
[0169]按其發(fā)育潛力，將干細(xì)胞分為:(I)全能干細(xì)胞，是指能夠產(chǎn)生所有胚胎的和胚胎外的細(xì)胞類型；(2)多潛能(pluripotent)干細(xì)胞，是指能夠產(chǎn)生所有胚細(xì)胞類型；(3)多能(mult1-potent)干細(xì)胞，是指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系亞型，但都在特定的組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)(例如，造血干細(xì)胞(HSC)可產(chǎn)生子代，其包括HSC (自我更新的)、血細(xì)胞限制性寡能祖細(xì)胞和作為血液正常組分的所有細(xì)胞類型和要素(例如，血小板));(4)寡能干細(xì)胞，是指能夠產(chǎn)生比多能干細(xì)胞更受限制的細(xì)胞譜系亞型；和(5)單能干細(xì)胞，是指能夠產(chǎn)生單一的細(xì)胞譜系(例如生精干細(xì)胞)。
[0170]用于自干細(xì)胞獲取胰細(xì)胞的方案例如但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方案:D’Amour，K.Α.等人(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401 Jiang, J.等人(2007)，Stem Cells25，1940-53 ;和 Kroon, E.等人(20`08)，Nat Biotechnol 26，443 - 452。
[0171]自體細(xì)胞或經(jīng)誘導(dǎo)去分化為多潛能細(xì)胞例如ES樣-細(xì)胞的體細(xì)胞獲取胰細(xì)胞的方案例如但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方案:Aoi, T.等人(2008)，Science 321 (n0.5889)，699 - 702 ；D' Amour, Κ.A.等人(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401 Jiang,J.等人(2007)，干細(xì)胞 25，1940-53 ；Kroon, E.等人(2008)，Nat Biotechnol 26，443-452 ；Takahashi, K.等人(2007)，Cell 131，861-72 ；Takahashi, K.和 Yamanaka, S.(2006)，Cell 126，663-76 ;和 Wernig, M.等人(2007)，Nature 448，318-24。
[0172]如本文所用的“使分化”或“分化”是指細(xì)胞從未分化狀態(tài)向分化狀態(tài)、從未成熟狀態(tài)向較成熟狀態(tài)或從未成熟狀態(tài)向成熟狀態(tài)發(fā)展的過程。例如，早期未分化的胚胎胰細(xì)胞能夠增殖和表達(dá)特征性標(biāo)記，例如PdXl、NkX6.1和Ptfla。成熟或分化的胰細(xì)胞不增殖，但分泌高水平的胰內(nèi)分泌激素或消化酶。例如完全分化的β細(xì)胞在響應(yīng)葡萄糖時分泌高水平的胰島素。當(dāng)細(xì)胞失去未分化細(xì)胞標(biāo)記或獲得分化細(xì)胞標(biāo)記時，細(xì)胞相互作用和成熟的變化發(fā)生。失去或獲得單個標(biāo)記可表明細(xì)胞已“成熟或完全分化”。術(shù)語“分化因子”是指加入胰腺細(xì)胞以增強(qiáng)其向成熟內(nèi)分泌細(xì)胞(還包含產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞)分化的化合物。示例性的分化因子包括肝細(xì)胞生長因子、角化細(xì)胞生長因子、毒蜥外泌肽_4、基本成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子和胰高血糖素樣肽I。在某些方面，細(xì)胞的分化包括在含有一種或多種分化因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0173]如本文所用，“人多潛能干細(xì)胞”(hPS)是指可源自任何來源并且在合適條件下能夠產(chǎn)生作為所有3個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物的不同細(xì)胞類型的人的子代的細(xì)胞。hPS細(xì)胞可具有在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在組織培養(yǎng)中形成所有3胚層的可鑒定的細(xì)胞的能力。人多潛能干細(xì)胞的定義中包括不同類型的胚細(xì)胞，其包括人胚泡衍生的干(hBS)細(xì)胞(在30篇文獻(xiàn)中通常稱為人胚胎干(hES)細(xì)胞)，(參見例如Thomson等人(1998)，Heins等人.(2004),以及誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(參見例如 Yu等人，(2007) Science 318:5858) ;Takahashi 等人，(2007) Cell 131(5):861) ?本文所述的各種方法和其它實施方案可能需要或利用來自各種來源的hPS細(xì)胞。例如，適用的hPS細(xì)胞可得自發(fā)育中的胚胎。此外或備選地，合適的hPS細(xì)胞可得自已建立的細(xì)胞系和/或人誘導(dǎo)的多潛能干(hiPS)細(xì)胞。
[0174]如本文所用的“hiPS細(xì)胞”是指人誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0175]如本文所用，術(shù)語“胚泡-衍生的干細(xì)胞”命名為BS細(xì)胞，人形式稱為“hBS細(xì)胞”。在文獻(xiàn)中，所述細(xì)胞通常稱為胚胎干細(xì)胞，更具體地講是人胚胎干細(xì)胞(hESC)。因此，用于本發(fā)明的多潛能干細(xì)胞可以是自胚泡制備的胚胎干細(xì)胞，如例如WO 03/055992和WO 2007/042225所述，或是市售的hBS細(xì)胞或細(xì)胞系。然而，進(jìn)一步設(shè)想的是任何人多潛能干細(xì)胞都可用于本發(fā)明，包括分化的成年細(xì)胞，這可通過例如用某些轉(zhuǎn)錄因子例如0CT4、S0X2、NAN0G 和 LIN28 (公開于 Yu 等人，2007，Takahashi 等人，2007 和 Yu 等人，2009)處理成年細(xì)胞，將其重新編程為多潛能細(xì)胞。
[0176]如本文所用“飼養(yǎng)細(xì)胞”意指單獨使用或組合使用的支持細(xì)胞類型。所述細(xì)胞類型還可以是人或其它物種來源。飼養(yǎng)細(xì)胞可來源的組織包括胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成人的組織，并且進(jìn)一步包括源自皮膚的組織，包括包皮、臍帶(umbilical chord)、肌肉、肺、上皮、胎盤、輸卵管、腺體、基質(zhì)或乳腺。飼養(yǎng)細(xì)胞可源自以下細(xì)胞類型:人成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞?？捎糜诘玫斤曫B(yǎng)細(xì)胞的具體細(xì)胞類型的實例包括胚胎成纖維細(xì)胞、胚胎 外內(nèi)胚層細(xì)胞、胚胎外中胚層細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞、胎兒肌肉細(xì)胞、胎兒皮膚細(xì)胞、胎兒肺細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)細(xì)胞、胎盤成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞、胎盤內(nèi)皮細(xì)胞。
[0177]如本文所用，術(shù)語“MEF細(xì)胞”意指小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。
[0178]如本文所用，“CHIR”、“Chir”或“Chir99021”是專利US6417185覆蓋下的已獲專利權(quán)的市售糖原合酶激酶3 β (Gsk3b)抑制劑，并由以下文獻(xiàn)描述:Goff，D.A.等人(2002)Inhibitors of glycogen synthase kinase 3?
[0179]本發(fā)明的實施方案:
136.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟:
a.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞；和
b.隨后在包含激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞。
[0180]137.實施方案136的方法，其中在所述與CHIR的孵育期間激活素A不存在。
[0181]138.實施方案136-137的方法，其中所述培養(yǎng)基是RPM1-1640。
[0182]139.實施方案136-138中任一個的方法，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
[0183]140.實施方案136- 139中任一個的方法，其中CHIR的濃度為至少2 μΜ，例如范圍為2-7 μΜ，或例如3 μΜ或例如4 μΜ。
[0184]141.實施方案136-140中任一個的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少12小時，例如24小時。
[0185]142.實施方案136-141中任一個的方法，其中所述與激活素A的孵育范圍為12小時至5天，例如至少12小時，例如至少24小時或至少48小時，或例如3-4天。
[0186]143.實施方案136-142中任一個的方法，其中特定的內(nèi)胚層細(xì)胞得自所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0187]144.實施方案143的方法，其中所述特定的內(nèi)胚層細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0188]145.通過實施方案136-144的方法可獲取的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0189]146.通過實施方案136-145的方法可獲取的特定內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0190]147.特定濃度的CHIR在自干細(xì)胞誘導(dǎo)原條細(xì)胞中的用途。
[0191]148.特定濃度的CHIR在自干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0192]149.實施方案147-148的用途，其中培養(yǎng)基中的CHIR濃度為至少2 μΜ CHIR。
[0193]150.實施方案147-148的用途，其中培養(yǎng)基中的CHIR濃度為至少2μΜ CHIR，例如范圍為2-7 μΜ，例如3 μΜ或例如4 μΜ。
[0194]151.濃度范圍為2-7 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0195]152.濃度范圍為3-7 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0196]153.濃度范圍為3.5-7 uM的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
[0197]本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請和專利，通過引用以其整體結(jié)合到本文中，并至如同每篇參考文獻(xiàn)各自和明確地指明通過引用予以結(jié)合和作為整體在本文中闡明(至法律所允許的最大程度)的相同程度。
[0198]所有標(biāo)題和小標(biāo)題在本文僅用于方便目的，不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明。
[0199]本文給出的任何和所有實施例或示例性語言(例如，“例如”)的使用，僅意指更好地說明本發(fā)明，不得視為對本發(fā)明范圍的限制，除非另有說明。本說明書中的語言不應(yīng)視為指示對本發(fā)明的實踐必不可少的任何非權(quán)利要求的要素。
[0200]盡管本文已經(jīng)說明和描述了本發(fā)明的某些特征，但是許多修改、替代、變動和等同方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是將會發(fā)生的。因此，可以理解，所附權(quán)利要求書意圖覆蓋所有這樣的修改和變動，如同落入本發(fā)明的真實精神之內(nèi)。
[0201]縮略語 AA:激活素A
D’ Am:D’ Amour 方案(Kroon 等人，2008)
DE:定形內(nèi)胚層
bFGF:基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF2)
Gsk3b:糖原合酶激酶3 β hBSC:人胚泡-衍生的干細(xì)胞 hESC:人胚胎干細(xì)胞 hIPSC:人誘導(dǎo)的多潛能細(xì)胞 hPSC:人多潛能干細(xì)胞KO-SR:剔除血清替換 RNA:核糖核酸 PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PS:原條
SOXl7:SRY (性別決定區(qū) Y)_box 17 T:Brachyury。
實施例
[0202]實施例1 -人ES/iPS細(xì)胞的體外培養(yǎng)
在兩種不同的無飼養(yǎng)細(xì)胞(DEF，mTeSR)培養(yǎng)系統(tǒng)和一種飼養(yǎng)細(xì)胞依賴的(MEF-ES)培養(yǎng)系統(tǒng)中證實了 DE方案。
[0203]DEF hESC/iPS 培養(yǎng)系統(tǒng)
在 6-96 孔板中，在含有 30 ng/ml bFGF (Invitrogen)和 10 ng/ml Noggin(Peprotech)的 DEF 培養(yǎng)基(Cellartis)中，使人胚胎干(hES)細(xì)胞 SA121 和 chIPS4(Cellartis)生長在人纖連蛋白(Sigma)上。細(xì)胞是用Rock抑制劑Y-27632 (Calbiochem)傳代的單細(xì)胞并以40000細(xì)胞/cm2的密度接種，用于實驗。在傳代之后4天開始實驗。
`[0204]mTeSR培養(yǎng)系統(tǒng)
根據(jù)培養(yǎng)系統(tǒng)方案，使hES細(xì)胞(SA121)在mTeSRl培養(yǎng)基(Cell SignalingTechologies)中從飼養(yǎng)細(xì)胞(MEF)成族傳代至Matrigel (BD Biosciences),并進(jìn)一步用Dispase (BD Biosciences)傳代。一旦各簇開始彼此接觸,開始DE。
`[0205]MEF-ES
在 hES 培養(yǎng)基(KO-DMEM、PEST, Glutamax, NEAA、2_ 巰基乙醇、KO 血清替換、10ng/mlbFGF)中，將hES細(xì)胞(SA121)在包被明膠并預(yù)接種MEF的板上傳代。在80%匯合時開始
DE0
[0206]實施例2 - CHIR DE方案
將匯合的培養(yǎng)物在RPMI1640 (Invitrogen)中洗滌一次，然后在RPMI中用0.5_7μΜCHIR99021 (Stemgent) 24小時預(yù)處理。根據(jù)實驗設(shè)置，對照細(xì)胞置于RPMI中未經(jīng)處理，D’Amour 細(xì)胞置于 RPMI 中或者用 AA (Peprotech) + Wnt3a (R&D Systems)處理(不經(jīng)預(yù)處理)。
[0207]24小時之后，預(yù)處理的和對照細(xì)胞用RPMI洗滌一次，然后添加含100 ng/ml AA的RPMI。D’ Amour細(xì)胞也用100ng/ml AA處理，但用0.2% FBS替代B27。24小時之后，將2%B27 (Invitrogen)添加到AA培養(yǎng)基中2_3天。根據(jù)已公布的方案，對照細(xì)胞用B27處理以防細(xì)胞死亡，D’ Amour細(xì)胞用2% FBS處理。每天更換培養(yǎng)基。
[0208]當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步分化為PE時，在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中應(yīng)用DE方案，并在DE培養(yǎng)4天后以200K的密度在DE培養(yǎng)基中重接種。按照已公布方案(Ameri等人2010)，I天之后，將細(xì)胞洗滌一次，然后添加PE培養(yǎng)基(RPMI1640+12% K0SR+64ng/ml bFGF)。
[0209]CHIR定形內(nèi)胚層方案的概述可見圖1。已在下列7種不同的細(xì)胞系中證實了該方%:SA12U SA18U SA46U SA167 (hESC)和 chIPS2、chIPS3、chIPS4 (hiPSC)。
[0210]表1.CHIR DE細(xì)胞培養(yǎng)方案。
【權(quán)利要求】
1.用于使干細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層的方法，包括以下步驟: c.在包含至少2μΜ CHIR的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第一起始步驟，其中在所述起始步驟期間激活素A不存在；和 d.在包含激活素A的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞的第二后續(xù)步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基是RPM1-1640。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
4.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中CHIR的濃度為至少大約2.5 μΜ，或至少大約3.1 μΜ，例如范圍在大約2.5-15μΜ，例如范圍在大約3.1-15 μΜ，或例如范圍在大約3.1-7μΜ，或例如范圍在大約3.5-7 μΜ，或例如范圍在大約3.5-6 μΜ，或例如大約3.5_5 μΜ。
5.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中CHIR的濃度為至少大約3.1 μΜ。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中CHIR的濃度為至少大約3.5 μΜ。
7.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述與CHIR的孵育為至少24小時。
8.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述與激活素A的孵育為至少24小時。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述與激活素A的孵育為48至72小時。
10.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中內(nèi)胚層細(xì)胞得自所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法， 其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
12.通過權(quán)利要求1-11的方法可獲取的胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
13.在培養(yǎng)基中以下CHIR濃度的CHIR的用途:至少2μΜ，至少3 μΜ，例如范圍在大約2-15 μΜ，例如大約3-15 μΜ，例如大約3.1-15 μΜ，或例如大約3.1-7 μΜ，或例如大約3.5_15uM，或例如大約3.5-7 μΜ。
14.在培養(yǎng)基中濃度為至少2μΜ的CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)原條細(xì)胞中的用途。
15.濃度范圍為3.5-7 μΜ的 CHIR在自胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞中的用途。
【文檔編號】C12N5/0735GK103890167SQ201280040881
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月21日
【發(fā)明者】N.富納, K.赫斯, J.伊克伯格, H.塞姆布 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司, 塞拉蒂斯股份有限公司