Wap結(jié)構(gòu)域融合多肽及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含含有乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的多肽和第二多肽。另外，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽、第二多肽和第三多肽。本發(fā)明融合蛋白的第二和/或第三多肽是Fc多肽；白蛋白多肽；細(xì)胞因子靶向多肽；或絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽。本發(fā)明也涉及在各種治療性和診斷性適應(yīng)癥中使用所述分子的方法，以及產(chǎn)生所述分子的方法。
【專利說明】WAP結(jié)構(gòu)域融合多肽及其使用方法
[0001]相關(guān)申請
本申請要求2011年6月28日申請的美國臨時申請?zhí)?1/502052 ;2011年12月I日申請的美國臨時申請?zhí)?1/565625 ;和2012年4月25日申請的美國臨時申請?zhí)?1/638168 ；和2012年4月26日申請的美國臨時申請?zhí)?1/638516的權(quán)益。這些申請的每一個的內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及分子、尤其是多肽、更尤其是融合蛋白，其包含含有乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列、以及第二多肽。另外，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列、第二多肽、以及第三多肽。具體地講，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和第二多肽；或融合蛋白，其包括含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽、第二多肽、以及第三多肽，其中本發(fā)明融合蛋白的第二和第三多肽可以是以下的至少一個:Fc多肽或衍生自Fe多肽的氨基酸；白蛋白多肽、或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列；細(xì)胞因子靶向多肽或衍生自細(xì)胞因子靶向多肽的氨基酸序列；和絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或衍生自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽的氨基酸序列。本發(fā)明也涉及在各種治療和診斷適應(yīng)癥中使用所述分子的方法、以及產(chǎn)生所述分子的方法。
[0003]發(fā)明背景
異常絲氨酸蛋白酶活性或蛋白酶與蛋白酶抑制劑不平衡可導(dǎo)致蛋白酶-介導(dǎo)的組織破壞和炎性反應(yīng)。因 此，需要靶向異常絲氨酸蛋白酶活性和/或蛋白酶與蛋白酶抑制劑不平衡的治療藥和治療。
[0004]發(fā)明概述
本文所述的融合蛋白包括至少一個包含乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列(多肽I)和第二多肽(多肽2)。此外，本文所述的融合蛋白包括含有乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列(多肽I)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。具體地講，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和第二多肽，或含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽、第二多肽和第三多肽，其中第二和第三多肽可包含以下的至少一種:Fc多肽或衍生自Fe多肽的氨基酸；白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列；細(xì)胞因子靶向多肽或衍生自細(xì)胞因子靶向多肽的氨基酸序列；和絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或衍生自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽的氨基酸序列。
[0005]本文中可互換使用的術(shù)語“融合蛋白”和“融合多肽”是指與至少第二多肽或衍生自第二多肽的氨基酸序列操作性連接的含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽或衍生自含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列。所述融合蛋白的個性化元件(individualized element)可以各種方式中的任一種連接，所述方式包括例如直接連接，使用媒介物或間隔肽，使用接頭區(qū)，使用鉸鏈區(qū)或同時使用接頭和鉸鏈區(qū)。在某些實(shí)施方案中，接頭區(qū)可以落入鉸鏈區(qū)序列內(nèi)，或者，鉸鏈區(qū)可以落入接頭區(qū)序列內(nèi)。優(yōu)選地，接頭區(qū)是肽序列。例如，接頭肽包含0-40個氨基酸的任何一處，身0-35個氨基酸、0-30個氨基酸、0-25個氨基酸、或0_20個氨基酸。優(yōu)選地，鉸鏈區(qū)是肽序列。例如，鉸鏈肽包含0-75個氨基酸的任何一處，食0-70個氨基酸、
0-65個氨基酸或0-62個氨基酸。在融合蛋白同時包含接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)的實(shí)施方案中，優(yōu)選接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)各自是肽序列。在這些實(shí)施方案中，鉸鏈肽和接頭肽一起包括0-90個氨基酸的任何一處，濟(jì)^/7 0-85個氨基酸或0-82個氨基酸。
[0006]在某些實(shí)施方案中，融合蛋白的基于WAP結(jié)構(gòu)域的部分和基于第二多肽的部分可通過媒介結(jié)合多肽而非共價連接。在某些實(shí)施方案中，融合蛋白的基于WAP結(jié)構(gòu)域的部分和基于第二多肽的部分可以是非共價連接的。
[0007]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可具有以N-端到C-端方向或以C-端到N-端方向的下式之一:
多肽l(a)-鉸鏈1-多肽2(b)
多肽l(a)-接頭λ -多肽2(b)
多妝l(a) _接頭λ _絞鏈《 _多妝2(b)
多妝l(a) _絞鏈? "接頭λ _多妝2(b)
多肽l(a)-多肽2(b)-多肽3(。)
多肽l(a)-鉸鏈w -多肽2(b)_鉸鏈w -多肽3ω 多妝l(a) _接頭λ _多妝2(b)-接頭-多妝3(。)
多肽l(a)-鉸鏈《 -接頭λ -多肽2(b)_鉸鏈w -接頭? -多肽3(。)多肽l(a)-接頭λ _絞鏈《 _多妝2(b)-接頭-絞鏈多妝3(。)
其中η是0-20的整數(shù)，其中m是1_62的整數(shù)，其中a、b和c是至少I的整數(shù)。這些實(shí)施方案包括上式及其任何變化或組合。例如，式中多肽的順序也包括多肽3(。)-多肽l(a)_多肽2(b)、多肽2(b)-多肽3 (c)-多肽l(a)或其任何變化或組合。
[0008]在某些實(shí)施方案中，所述多肽I序列包含含有乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的多肽。WAP結(jié)構(gòu)域是50個氨基酸的進(jìn)化保守的序列基序，在以特征性的4-二硫鍵核心排列(也稱為4-二硫鍵核心基序)中發(fā)現(xiàn)含有8個半胱氨酸。WAP結(jié)構(gòu)域序列基序是功能基序，其特征在于在多種蛋白中的絲氨酸蛋白酶抑制活性。適用于本文提供的融合蛋白的含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽，以非限制性實(shí)例方式包括分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)、彈性蛋白酶抑制劑(Elafin)和附睪蛋白酶抑制劑(Eppin)。
[0009]在某些實(shí)施方案中，所述多肽I序列包含分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)多肽序列或衍生自SLPI的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述多肽I序列包含SLPI蛋白部分，例如，WAP2結(jié)構(gòu)域或其亞部分。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，SLPI多肽序列或衍生自SLPI的氨基酸序列衍生自人SLPI多肽序列。
[0010]在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含具有以下氨基酸序列的全長人SLPI多肽序列::KFSSGI,FPFI, ^t,I,ALGTLA? KAVEGSGE5F FASVCrPKFS AQC:.?YE:K?E CQ-SFKO"PGK
f:1 KRCC PDTCGI KCLr: PvDTPU PT?R5:卩GKC? VTYGQCLMLN PPtJFCEMPGO CKP1.: Lr>?CMG
12.: Mcms-rjs?'/ ka (seo id ?)
在某些實(shí)施方案中， 所述融合蛋白包含人SLPI多肽序列，其與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
[0011]在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含全長人SLPI多肽序列部分，其中所述部分具有以下氨基酸序列:
【權(quán)利要求】
1.分離的融合蛋白，其包含與第二多肽操作性連接的至少一個含有人乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一個: 免疫球蛋白Fe多肽或衍生自免疫球蛋白Fe多肽的氨基酸序列； 細(xì)胞因子靶向多肽或衍生自細(xì)胞因子靶向多肽的序列； 絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽或衍生自絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽的序列；或 白蛋白多肽或衍生自血清白蛋白多肽的氨基酸序列。
2.分離的融合蛋白，其包含與第二多肽操作性連接的至少一個人分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一個: 免疫球蛋白Fe多肽； 細(xì)胞因子靶向多肽； α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽； α -1抗胰蛋白酶(AAT)多肽和免疫球蛋白Fe多肽；和 人白蛋白(HSA)多肽。
3.分離的融合蛋白，其包含與第二多肽操作性連接的至少一個人彈性蛋白酶抑制劑多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一個: 免疫球蛋白Fe多肽； 細(xì)胞因子靶向多肽； α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽； α -1抗胰蛋白酶(AAT)多肽和免疫球蛋白Fe多肽；和 人白蛋白(HSA)多肽。
4.權(quán)利要求2的分離的融合蛋白，其中所述人SLPI多肽是全長SLPI多肽或衍生自人SLPI多肽。
5.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中SLPI多肽包含選自SEQID NO: 1、2和3的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求3的分離的融合蛋白，其中所述人彈性蛋白酶抑制劑多肽是全長彈性蛋白酶抑制劑多肽或衍生自人彈性蛋白酶抑制劑多肽。
7.權(quán)利要求3和6中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中彈性蛋白酶抑制劑多肽包含選自SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽是人Fe多肽。
9.權(quán)利要求8的分離的融合蛋白，其中人Fe多肽是人IgM多肽或人IgG多肽。
10.權(quán)利要求9的分離的融合蛋白，其中所述人IgGFe多肽是人IgGl多肽、人IgG2 Fe多肽、人IgG3 Fe多肽或人IgG4 Fe多肽。
11.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽包含選自SEQ ID NO: 7、8、9、10和11的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中所述含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和所述免疫球蛋白Fe多肽經(jīng)由鉸鏈區(qū)、接頭區(qū) 、或經(jīng)由鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者操作性連接。
13.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述SLPI多肽和所述免疫球蛋白Fe多肽經(jīng)由鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)、或經(jīng)由鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者操作性連接。
14.權(quán)利要求3或6中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述彈性蛋白酶抑制劑多肽和所述免疫球蛋白Fe多肽經(jīng)由鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)、或經(jīng)由鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者操作性連接。
15.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)、所述接頭區(qū)或所述鉸鏈區(qū)和所述接頭區(qū)兩者包含肽序列。
16.權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中所述白蛋白多肽是人血清白蛋白(HSA)多肽或衍生自HSA多肽。
17.權(quán)利要求2、3或16中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述HSA多肽包含SEQIDNO: 14的氨基酸序列或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求2、3或16中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述HSA多肽包含HSA結(jié)構(gòu)域3。
19.權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中所述含有WAP-結(jié)構(gòu)域的多肽經(jīng)由白蛋白結(jié)合多肽與HSA操作性連接。
20.權(quán)利要求19的分離的融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是抗體或抗體片段或者衍生自抗體或抗體片段。
21.權(quán)利要求20的分離的融合蛋白，其中所述抗體或抗體片段是嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體。
22.權(quán)利要求19的分離的融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是肽。
23.權(quán)利要求19的分離的融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域3或衍生自鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域3的序列。
24.權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中所述含有WAP-結(jié)構(gòu)域的多肽與HSA多肽共價連接。
25.權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中所述含有WAP-結(jié)構(gòu)域的多肽與HSA多肽非共價連接。
26.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的分離的融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子靶向多肽是細(xì)胞因子受體多肽或細(xì)胞因子受體多肽的衍生物，結(jié)合細(xì)胞因子受體的細(xì)胞因子靶向多肽，或結(jié)合人細(xì)胞因子的細(xì)胞因子靶向多肽。
27.權(quán)利要求26的分離的融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子受體是人細(xì)胞因子受體多肽。
28.權(quán)利要求27的分離的融合蛋白，其中所述人細(xì)胞因子受體多肽包含多個亞單位。
29.權(quán)利要求27的分離的融合蛋白，其中所述人細(xì)胞因子受體是以下的受體:TNFa、IgE、IL-12、IL-23、IL-6、IL-1 a、IL-1 β、IL-17、IL-13、IL-12 和 IL-23 的 p40 亞單位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27 或 IL-32。
30.權(quán)利要求26的分離的融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子靶向多肽是抗體或抗體片段。
31.權(quán)利要求30的分離的融合蛋白，其中所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體。
32.權(quán)利要求26的分離的融合蛋白，其中所述人細(xì)胞因子是TNFa、IgE、IL-12、IL-23、IL-6、IL-1 a、IL-1 β、IL-17, IL-13, IL-12 和 IL-23 的 p40 亞單位、IL-4, IL-10, IL-2,IL-18、IL-27 或 IL-32。
33.權(quán)利要求32的分離的融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子是人TNFa。
34.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的分離的融合蛋白，其中AAT多肽包含SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 38的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽、含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得絲氨酸蛋白酶抑制劑多肽、含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和免疫球蛋白Fe多肽中的至少2種經(jīng)由鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或經(jīng)由鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者操作性連接。
36.權(quán)利要求2的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fe多肽中的至少2種經(jīng)由鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或經(jīng)由鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者操作性連接。
37.權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的分離的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)、所述接頭區(qū)或所述鉸鏈區(qū)和所述接頭區(qū)兩者包含肽序列。
38.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中修飾所述Fe多肽以增強(qiáng)FcRn結(jié)合。
39.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽包含以下突變的至少一個:Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu 或 Met428Leu 和 Asn434Ser。
40.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自SEQIDNO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ IDNO: 27、SEQ ID NO : 28 和 SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 37 的氨基酸序列。
41.在有需要的受試者中治療異常絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥或緩解其癥狀的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合蛋白。
42.在有需要的受試者中治療炎性疾病或病癥或緩解其癥狀的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合蛋白。
43.在有需要的受試者中治療感染性疾病或病癥或緩解其癥狀的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合蛋白。
44.權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
【文檔編號】C12P21/08GK103946388SQ201280041897
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月28日
【發(fā)明者】J.C.蒂默, B.P.埃克爾曼, G.B.京瑟, P.L.恩蓋, H.陳, Q.德弗勞瓦 申請人:英伊布里克斯有限責(zé)任公司