包含來自基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的核酸的核酸構建物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供核酸，該核酸依次包含基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的、包含特定的核苷酸序列的5’非翻譯區(qū)、編碼基因型3a的丙型肝炎病毒的NS3蛋白的特定氨基酸序列、NS4A蛋白的特定氨基酸序列、NS4B蛋白的特定氨基酸序列、NS5A蛋白的特定氨基酸序列和NS5B蛋白的特定氨基酸序列的核苷酸序列、以及包含基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的特定的核苷酸序列的3’非翻譯區(qū)。
【專利說明】包含來自基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的核酸的核酸 構建物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及來自基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的核酸、包含該核酸的核酸構 建物和篩選抗丙型肝炎病毒物質的方法。

【背景技術】
[0002] 在丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus;以下記作HCV)的基礎研究和抗HCV藥的 開發(fā)研究中，可以高效率地擴增HCV的實驗系統(tǒng)必不可少。具體而言，需要在培養(yǎng)細胞中擴 增HCV的系統(tǒng)或在培養(yǎng)細胞中評價HCV的增殖的系統(tǒng)，如果可以建立這些系統(tǒng)，則認為上述 研究會飛躍性地進步。
[0003] 已知HCV是屬于黃病毒科的、以單鏈的（+)鏈有義RNA作為基因組的病毒，其成為 丙型肝炎的病因。HCV根據(jù)其基因型或血清型而分為多個類型，根據(jù)Simmonds等人的使用 HCV株的核苷酸序列的系統(tǒng)分析法，將HCV的基因型分為基因型1?6,并進一步將它們分 為亞型（非專利文獻1)。目前，關于HCV的多個基因型，正在確定基因組全長的核苷酸序列 (非專利文獻2?5)。
[0004] HCV的感染在全球廣泛存在，在日本、美國和歐州，基因型1的HCV感染患者的比例 多。而在印度、尼泊爾、巴基斯坦和澳大利亞，基因型3的HCV感染患者的比例多，這是其特 征（非專利文獻6和7)。
[0005] 直至近年，都無法使培養(yǎng)細胞感染上HCV、或者無法使HCV基因組在培養(yǎng)細胞中復 制，因此關于HCV的復制機制或感染機制的研究，需要使用黑猩猩作為實驗動物來進行體 內實驗。但是，通過由作為基因型lb的HCV的Coni株、HCV-N株和HCV-0株、以及作為基 因型la的HCV的H77c株制作了亞基因組復制子RNA，關于HCV的復制機制的研究，可以使 用培養(yǎng)細胞進行體外實驗（專利文獻1和非專利文獻8?11)。這里，HCV的亞基因組復制 子RNA是指包含一部分HCV基因組的RNA，該RNA不具有感染性HCV顆粒的產生能力，但將 其導入培養(yǎng)細胞中時可以自主復制來自HCV基因組的RNA。
[0006] 另外，由作為基因型2a的HCV的JFH-1株不僅制作了亞基因組復制子RNA、還制作 了在體外產生感染性HCV顆粒的全基因組復制子RNA，關于HCV的感染機制的研究，也可以 使用培養(yǎng)細胞進行體外實驗（非專利文獻12和13)。這里，HCV的全基因組復制子RNA是 指，包含HCV基因組的全長、即5'非翻譯區(qū)、結構基因、非結構基因和3'非翻譯區(qū)的RNA，將 其導入培養(yǎng)細胞中時可以自主復制來自HCV基因組的RNA。
[0007] 目前，具有在使用培養(yǎng)細胞的體外系統(tǒng)中產生感染性HCV顆粒的能力的RNA只有 來自基因型2a的JFH-1株的RNA，為了得到HCV疫苗的原料而可以通過體外系統(tǒng)大量制備 HCV顆粒的物質僅限于JFH-1株的HCV或來自JFH-1株的全基因組復制子。
[0008] 針對丙型肝炎的主要的治療是通過干擾素-α或干擾素-β的單獨療法和干擾 素-α與作為嘌呤-核苷衍生物的利巴韋林的聯(lián)合療法來進行的。但是，已知即使進行上 述治療，在所有治療患者中也僅約60%確認到療效，即使是表現(xiàn)出效果的患者，若中止治療 則有一半以上會復發(fā)。另外，干擾素的療效與HCV的基因型有關，已知其對基因型lb的效 果低，而對基因型2a或3a的效果較高（非專利文獻14)。關于干擾素的療效根據(jù)HCV的 基因型而不同的原因尚未明確，但認為其原因之一在于HCV的復制機制或復制效率存在差 異。
[0009] 近年來，作為針對丙型肝炎的新的治療藥，還正在開發(fā)抗來自HCV的蛋白酶或聚 合酶的抑制劑。但據(jù)報道，作為HCV的NS3/4蛋白酶抑制劑的TMC435雖然對除基因型3a 以外的基因型1?6的抑制效果高，但其對基因型3a的抑制效果低，其對HCV的效果根據(jù) 基因型而不同（非專利文獻15)。
[0010] 現(xiàn)有技術文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開2001-17187號公報； 非專利文獻 非專利文獻 l:Simmonds 等人，Hepatology, 1994 年，第 10卷，第 1321-1324 頁； 非專利文獻2 :Choo等人，Science, 1989年，第244卷，第359-362頁； 非專利文獻 3 :Kato 等人，Journal of Medical Virology, 1992 年，第 64 卷，第 334-339 頁； 非專利文獻 4 :0kamoto 等人，Journal of General Virology, 1992 年，第 73 卷， 第 673-679 頁； 非專利文獻 5 :Yoshioka 等人，Hepatology, 1992 年，第 16 卷，第 293-299 頁； 非專利文獻 6:GRAVITZ，Nature, 2011 年，第 474 卷，第 s2-s4 頁； 非專利文獻7 :Rehman 等人，Genetic Vaccines and Therapy, 2011 年，第9卷， 第2-5頁； 非專利文獻8 :Lomann等人，Science, 1999年，第285卷，第110-113頁； 非專利文獻9 :Blight等人，Science, 2000年，第290卷，第1972-1974頁； 非專利文獻 l〇:Friebe等人，Journal of Virology, 2001 年，第 75 卷，第 12047-12057 頁； 非專利文獻 11 :Ikeda 等人，Journal of Virology, 2002 年，第 76 卷，第 2997-3006 頁； 非專利文獻 12 :Kato 等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125 卷，第 1808-1817 頁； 非專利文獻 13 :Wakita 等人，Nature Medicine, 2005 年，第 11 卷，第 791-796 頁； 非 專 利文獻 14 ：Mori 等人,Biochemical and Biophysical Research Communications, 1992 年，第 183 卷，第 334-342 頁； 非專利文獻 15 :Reesink等人，Gastroenterology, 2010年，第 138卷，第 913-921 頁。


【發(fā)明內容】

[0011] 發(fā)明所要解決的課題 但是，目前制作的HCV的亞基因組復制子RNA僅限于來自基因型la、lb和2a的HCV株 的幾種，另外，關于產生感染性HCV顆粒的全基因組復制子RNA，正在制作的也只是來自由 嵌合基因構成的基因組的全基因組復制子RNA，所述嵌合基因是指來自基因型2a的JFH-1 株的基因組或來自不同于JFH-1株的株的結構基因與JFH-1株的非結構基因的嵌合基因。 因此，難以闡明HCV的基因型與HCV的復制機制或復制效率的關系，關于作為HCV疫苗的原 料的可以人工制備的HCV顆粒的種類，也僅限于基因型2a，這是現(xiàn)狀。
[0012] 而且，在使用來自相同基因型的HCV的亞基因組復制子RNA或全基因組復制子RNA 的研究中，無法在不同的基因型間比較HCV的復制機制或復制效率的差異，不依賴于基因 型而發(fā)揮療效的抗HCV藥的開發(fā)的線索尚未找到。
[0013] g卩，在HCV的研究領域和醫(yī)療領域中，為了開發(fā)不依賴于基因型的抗HCV藥、特別 是抗基因型3a的抗HCV藥，迫切希望獲得基因型3a的HCV株和制作基因型3a的HCV的復 制子RNA。
[0014] 因此，本發(fā)明的目的在于提供：新的基因型3a的HCV株、以及來自新的基因型3a 的HCV株的具有自主復制能力的復制子RNA。
[0015] 解決課題的方法 本發(fā)明人等為了解決上述課題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)了從急性丙型肝炎患者體內 分離的、作為新的基因型3a的HCV的S310A株，并由該S310A株成功制作了具有自主復制 能力的復制子RNA，從而完成了本發(fā)明。
[0016] SP,本發(fā)明包含以下內容。
[0017] [1]核酸，該核酸依次包含：基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的、包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1?340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)、編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸 編號1033?1663的NS3蛋白的氨基酸序列、氨基酸編號1664?1717的NS4A蛋白的氨基 酸序列、氨基酸編號1718?1978的NS4B蛋白的氨基酸序列、氨基酸編號1979?2430的 NS5A蛋白的氨基酸序列和氨基酸編號2431?3021的NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序 列、以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號9407?9655的核苷酸序列的3'非翻譯區(qū)（其 中，當該核酸為RNA時，將核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u))。
[0018] [2]上述[1]所述的核酸，其中， 上述編碼NS3蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 3437?5329的核苷酸序列， 上述編碼NS4A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 5330?5491的核苷酸序列， 上述編碼NS4B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 5492?6274的核苷酸序列， 上述編碼NS5A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 6275?7630的核苷酸序列， 上述編碼NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 7631?9406的核苷酸序列。
[0019] [3]上述[1]或[2]所述的核酸，其中，上述5'非翻譯區(qū)在SEQ ID NO: 1的核苷 酸編號1?340的核苷酸序列中包含1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加。
[0020] [4]核酸，該核酸是在上述[1]?[3]中任一項所述的核酸的核苷酸序列中具有 核苷酸突變的核酸，以SEQ ID N0: 14所示氨基酸序列為基準時，該核苷酸突變包括引起下 述（a)?（g)的至少一個氨基酸取代的核苷酸突變： (a) 第1286位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (b) 第2188位的蘇氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成組氨酸， (d) 第2210位的絲氨酸取代成異亮氨酸， (e) 第2496位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成賴氨酸。
[0021] [5]上述[1]?[4]中任一項所述的核酸，該核酸進一步包含丙型肝炎病毒基因 組的、編碼核心蛋白的核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列、 編碼P7蛋白的核苷酸序列和編碼NS2蛋白的核苷酸序列。
[0022] [6]上述[5]所述的核酸，其中， 編碼核心蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0: 14的氨基酸編號1?191的核心蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼E1蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0: 14的氨基酸編號192?383的E1蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼E2蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0: 14的氨基酸編號384?752的E2蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼P7蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0: 14的氨基酸編號753?815的p7蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼NS2蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0: 14的氨基酸編號816?1032的NS2 蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0023] [7]上述[5]所述的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 49?SEQ ID NO: 51中的任一個所不的核苷酸序列。
[0024] [8]上述[4]所述的核酸，該核酸包含SEQ ID N0: 17?SEQ ID N0: 23和SEQ ID NO: 54中的任一個所不的核苷酸序列。
[0025] 上述[1]?[8]所述的核酸可以進一步包含外來基因和/或IRES序列。
[0026] [9]丙型肝炎病毒的亞基因組復制子RNA，其包含上述[1]?[4]和[8]中任一項 所述的核酸。
[0027] [10]丙型肝炎病毒的全基因組復制子RNA，其包含上述[5]?[7]中任一項所述 的核酸。
[0028] [11]丙型肝炎病毒顆粒，其含有上述[5]?[7]中任一項所述的核酸作為病毒基 因組。
[0029] 上述[1]?[8]所述的核酸可以是DNA。另外，包含上述[1]?[8]所述的核酸、 特別是這樣的DNA的表達載體也是本發(fā)明的優(yōu)選方案。
[0030] [12]細胞，該細胞中導入有上述[1]?[8]中任一項所述的核酸。
[0031] [13]丙型肝炎病毒疫苗，該疫苗含有上述[11]所述的丙型肝炎病毒顆粒或其一 部分。
[0032] [14]丙型肝炎病毒的抗體，該抗體將上述[11]的丙型肝炎病毒顆粒為抗原識 別。
[0033] [15]抗丙型肝炎病毒物質的篩選方法，該篩選方法包括下述步驟： 培養(yǎng)步驟，在受檢物質的存在下和不存在下，培養(yǎng)上述[12]所述的細胞、或上述[11] 所述的丙型肝炎病毒顆粒和丙型肝炎病毒敏感性細胞的混合物； 定量步驟，定量上述培養(yǎng)步驟中在培養(yǎng)物中得到的亞基因組復制子RNA、全基因組復制 子RNA或丙型肝炎病毒顆粒的量；以及 評價步驟，上述定量步驟的結果，當在受檢物質的存在下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中定量到的亞 基因組復制子RNA、全基因組復制子RNA或丙型肝炎病毒顆粒的量分別少于在上述受檢物 質的不存在下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中定量到的亞基因組復制子RNA、全基因組復制子RNA或丙型 肝炎病毒顆粒的量時，評價為上述受檢物質具有抗丙型肝炎病毒活性。
[0034] [16]上述[5]所述的核酸，其中，上述核酸為來自2個以上的丙型肝炎病毒株的 基因組的嵌合核酸，其從5'側往3'側依次包含： SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組以外的丙型肝炎病毒基因組的編碼核心蛋白的 核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列和編碼p7蛋白的核苷 酸序列； 編碼由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的序列構成的NS2蛋白的核苷酸序 列、編碼SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組以外的丙型肝炎病毒基因組的NS2蛋白的 核苷酸序列、或編碼由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的核苷酸序列構成的NS2 蛋白的核苷酸序列的一部分與編碼SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組以外的丙型肝炎 病毒基因組的NS2蛋白的核苷酸序列的一部分連接而成的編碼嵌合型NS2蛋白的核苷酸序 列；以及 SEQ ID NO: 1中的、編碼由核苷酸編號3437?5329的序列構成的NS3蛋白的核苷 酸序列、編碼由核苷酸編號5330?5491的序列構成的NS4A蛋白的核苷酸序列、編碼由核 苷酸編號5492?6274的序列構成的NS4B蛋白的核苷酸序列、編碼由核苷酸編號6275? 7630的序列構成的NS5A蛋白的核苷酸序列和編碼由核苷酸編號7631?9406的序列構成 的NS5B蛋白的核苷酸序列。
[0035] [17]核酸，該核酸是在上述[16]所述的核酸的核苷酸序列中具有核苷酸突變的 核酸，以SEQ ID N0: 14所示氨基酸序列為基準時，該核酸具有引起下述（a)?（g)中的至 少一個氨基酸取代的核苷酸突變： (a) 第1286位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (b) 第2188位的蘇氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成組氨酸， (d) 第2210位的絲氨酸取代成異亮氨酸， (e) 第2496位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代成甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成賴氨酸。
[0036] [18]上述[16]或[17]所述的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒 基因組以外的丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)，以代替上述包含SEQ ID NO: 1的核苷 酸編號1?340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)。
[0037] [19]丙型肝炎病毒的嵌合全基因組復制子RNA，其包含上述[16]?[18]所述的 核酸。
[0038] 本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權主張的基礎的日本國專利申請2011-189695 號的公開內容。
[0039] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，可以提供在培養(yǎng)細胞中具有自主復制能力的基因型3a的HCV的復制子 RNA。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1是表示HCV S310A株（野生型）的全長基因組RNA的結構（A)、S310A株 的HCV亞基因組復制子RNA表達載體pS310ASGR-Neo的結構（B)、以及通過T7聚合酶由 pS310ASGR-Neo合成的S310A株的HCV亞基因組復制子RNA的結構（C)的圖； 圖2表示導入了野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA的Huh7細胞的集落形成 的結果； 圖3表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克?。┲兴腍CV亞基因組復制子RNA 的拷貝數(shù)的定量結果； 圖4是表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克?。┲械膹椭谱覴NA復制對干擾素的 敏感性的圖； 圖5是表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克隆）中的復制子RNA復制對NS3蛋白 酶抑制劑VX-950的敏感性的圖； 圖6是表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克?。┲械膹椭谱覴NA復制對NS3蛋白 酶抑制劑BILN-2061的敏感性的圖； 圖7是表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克?。┲械膹椭谱覴NA復制對NS5B聚 合酶抑制劑JTK-109的敏感性的圖； 圖8是表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克隆）中的復制子RNA復制對NS5B聚 合酶抑制劑PSI-6130的敏感性的圖； 圖9是在pS310ASGR-Neo的結構上示意性地表示S310A亞基因組復制子復制細胞（克 ?。┲需b定的氨基酸取代（突變）的位置的圖； 圖10是表示突變體S310A株（導入了適應性突變的S310A株）的HCV亞基因組復制 子RNA表達載體的結構的圖； 圖11表示導入了野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA及其突變體的HCV亞基 因組復制子RNA的細胞的集落形成的結果； 圖12是表示插入了螢光素酶基因（Luc)來代替Neo基因的S310A株的HCV亞基因組 復制子RNA及其表達載體pS310ASGR-Luc的結構以及它們的制作過程的圖； 圖13是表示包含螢光素酶基因的突變體S310A株的HCV亞基因組復制子RNA的復制 能力（發(fā)光強度）的圖； 圖14是表示突變體S310A株（導入了適應性突變的S310A株）的HCV全基因組復制 子RNA(HCV全長基因組）的結構的圖； 圖15是表示突變體S310A株的HCV全基因組復制子RNA(HCV全長基因組）的HCV顆 粒產生能力（培養(yǎng)上清中的核心蛋白量）的圖； 圖16是表示來自突變體S310A株（導入了適應性突變的S310A株）、來自J6CF株、來 自JFH-1株和來自TH株的HCV基因組的結構、以及包含突變體S310A株的非結構基因和來 自J6CF株、來自JFH-1株或來自TH株的結構基因的嵌合HCV基因組的結構的圖。作為突變 體S310A株的HCV全基因組復制子RNA (全長基因組RNA突變體）的S310A R2198H、S310A S2210I或S310A R2895K分別包含R2198H、S2210I或R2895K的突變，在最上部顯示的HCV 基因組的結構上，匯總圖示這些突變的位置（實際上單獨包含各突變）。

【具體實施方式】
[0041] 本說明書中使用的科學用語、技術用語和命名法，只要沒有特別定義，則具有與本 領域技術人員通常所理解的意義相同的意義。另外，關于分子生物學和免疫學領域的普通 的技術和學術用語，是指基于Sambrook等人Molecular Cloning A Laboratory Manual (第 3 版、2001 年）和 Ed Harlow 等人的 Antibodies :A Laboratory Manual (1988 年）中記載 的方法和定義的用語。而且，本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請，其全體作為 參考而引用到本說明書中。
[0042] 丙型肝炎病毒（HCV)是以單鏈的（+)鏈有義RNA作為基因組的病毒。HCV的基因 組由5'非翻譯區(qū)（5' UTR)、編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、 NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列（病毒蛋白編碼區(qū)）和3'非翻 譯區(qū)（3' UTR)構成。HCV基因組（HCV全長基因組）是從5'側往3'側依次配置5' UTR、編 碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋 白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3'UTR而形成的RNA。為了與由一部分HCV基因組構成 的核酸進行區(qū)別，由其全長構成的HCV基因組還稱作"HCV全長基因組"、"全長HCV基因組"、 "HCV全長基因組RNA"、"全長HCV基因組RNA"或"全長基因組RNA"。
[0043] 作為HCV的實際狀態(tài)，其以病毒顆粒的形式存在。HCV的病毒顆粒（HCV顆粒）在 由HCV的結構蛋白構成的病毒殼的內部含有HCV基因組。
[0044] HCV的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白是形成HCV顆粒的"結構蛋白"，將編 碼該結構蛋白的核酸稱作"結構基因"。包含這些結構基因的HCV基因組上的序列還稱作 "結構區(qū)"。HCV的NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白是不形 成HCV顆粒的"非結構蛋白"，將編碼該非結構蛋白的核酸稱作"非結構基因"。包含這些非 結構基因的HCV基因組上的序列還稱作"非結構區(qū)"。非結構蛋白具有參與HCV基因組的復 制、HCV蛋白的加工等的功能。
[0045] HCV的5'非翻譯區(qū)（5' UTR)提供用于蛋白翻譯的內部核糖體進入位點（以下記 作IRES)和復制所必需的元件。HCV的5' UTR是指自基因組的5'末端起約360個核苷酸 的區(qū)。
[0046] HCV的3'非翻譯區(qū)（3, UTR)輔助HCV的復制。HCV的3' UTR包含可變區(qū)、PolyU 區(qū)和約100個核苷酸的附加區(qū)。
[0047] 在HCV中，10種病毒蛋白（核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋 白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白）以依次相連的1個前體蛋白（多聚蛋 白）的形式被翻譯，之后，利用細胞內和病毒的蛋白酶，分別成為10種成熟的病毒蛋白（核 心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和 NS5B蛋白）。
[0048] 已知HCV中有各種基因型，但已知各種基因型的HCV的基因組具有同樣的基因結 構。在本發(fā)明中，HCV的"基因型"是指，按照Simmonds等人的國際分類進行分類的基因型。
[0049] 由序列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸序列構成的核酸是自急性重癥丙型肝炎患者 分離的、作為新的基因型3a的HCV的S310A株的基因組。SEQ ID NO: 1所示序列是S310A 株的全長基因組RNA的cDNA序列，但將該核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u) 的序列是RNA序列。自患者分離HCV基因組的方法記載在Kato等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125 卷，第 1808-1817 頁中。
[0050] 在上述S310A株的全長HCV基因組序列（SEQ ID NO: 1)中，5'非翻譯區(qū)（5'UTR) 由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1?340的序列構成，核心蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的 核苷酸編號341?913的序列構成，El蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號914? 1489的序列構成，E2蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1490?2596的序列構 成，P7蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2597?2785的序列構成，NS2蛋白編 碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的序列構成，NS3蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號3437?5329的序列構成，NS4A蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的 核苷酸編號5330?5491的序列構成，NS4B蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 5492?6274的序列構成，NS5A蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號6275?7630 的序列構成，NS5B蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號7631?9406的序列構成， 3'非翻譯區(qū)（3, UTR)由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號9407?9655的序列構成。關于該 S310A株的全長HCV基因組的結構，見圖1A。
[0051] 具體而言，S310A株的全長HCV基因組（SEQ ID NO: 1)的5'非翻譯區(qū)（5, UTR) 由SEQ ID N0: 2所示核苷酸序列構成，核心蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 3所示核苷酸序 列構成，E1蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 4所示核苷酸序列構成，E2蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 5所示核苷酸序列構成，p7蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 6所示核苷酸序列構成， NS2蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 7所示核苷酸序列構成，NS3蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 8所示核苷酸序列構成,NS4A蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列構成，NS4B蛋 白編碼序列由SEQ ID N0: 10所示核苷酸序列構成，NS5A蛋白編碼序列由SEQ ID N0: 11 所示核苷酸序列構成，NS5B蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列構成，3'非翻 譯區(qū)（3, UTR)由SEQ ID N0: 13所示核苷酸序列構成。
[0052] S310A株的前體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0: 14所示。SEQ ID N0: 14所示 的S310A株的前體蛋白的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 1所示野生型S310A株的全長基 因組RNA的cDNA序列的核苷酸編號341?9406 (包含終止密碼子）的序列的部分的核苷 酸序列編碼。
[0053] 本發(fā)明提供：作為上述新的基因型3a的HCV的S310A株的基因組、以及來自該 S310A株的具有自主復制能力的復制子RNA或其核酸。
[0054] "核酸"包括RNA和DNA。另外，本說明書中的"蛋白編碼區(qū)"、"編碼蛋白的核苷酸 序列"、"編碼蛋白的序列"和"蛋白編碼序列"是指編碼規(guī)定的蛋白的氨基酸序列的核苷酸 序列，可以包含也可以不包含起始密碼子和終止密碼子。
[0055] 本說明書中，在核酸為RNA的情況下，當引用序列表的SEQ ID N0來特定RNA的核 苷酸序列或核苷酸時，該SEQ ID N0所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u)。
[0056] 在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供核酸，該核酸依次包含：基因型3a的丙型肝炎病 毒（例如S310A株或其突變體）的基因組的、包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1?340的 核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)、編碼SEQ ID N0: 14(由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列編碼的前 體蛋白）的氨基酸編號1033?1663的NS3蛋白的氨基酸序列、氨基酸編號1664?1717 的NS4A蛋白的氨基酸序列、氨基酸編號1718?1978的NS4B蛋白的氨基酸序列、氨基酸編 號1979?2430的NS5A蛋白的氨基酸序列和氨基酸編號2431?3021的NS5B蛋白的氨基 酸序列的核苷酸序列、以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號9407?9655的核苷酸序列的 3'非翻譯區(qū)。在另一優(yōu)選實施方式中，該核酸的5'非翻譯區(qū)在SEQ ID NO: 1的核苷酸編 號1?340的核苷酸序列中可以包含1個或多個（例如2?20個、優(yōu)選2?5個）核苷酸 的缺失、取代或添加。優(yōu)選該核酸的5'非翻譯區(qū)與SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1?340 的核苷酸序列具有95%以上、優(yōu)選97%以上、進一步優(yōu)選99%以上、例如99. 5%以上的核苷 酸序列同源性。
[0057] 在一實施方式中，本發(fā)明的核酸依次包含：包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1? 340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)、SEQ ID NO: 1的核苷酸編號3437?5329的編碼NS3蛋 白的氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸編號5330?5491的編碼NS4A蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸編號5492?6274的編碼NS4B蛋白的 氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸編號6275?7630的編碼NS5A蛋白的 氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸編號7631?9406的編碼NS5B蛋白的 氨基酸序列的核苷酸序列、以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號9407?9655的核苷酸序 列的3'非翻譯區(qū)。在另一優(yōu)選實施方式中，該核酸的5'非翻譯區(qū)在SEQ ID NO: 1的核苷 酸編號1?340的核苷酸序列中可以包含1個或多個（例如2?20個、優(yōu)選2?5個）核 苷酸的缺失、取代或添加。優(yōu)選該核酸的5'非翻譯區(qū)與SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1? 340的核苷酸序列具有95%以上、優(yōu)選97%以上、進一步優(yōu)選99%以上、例如99. 5%以上的核 苷酸序列同源性。
[0058] 本發(fā)明的核酸可以包含：丙型肝炎病毒基因組的、編碼核心蛋白的核苷酸序列、編 碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列、編碼p7蛋白的核苷酸序列和編碼NS2 蛋白的核苷酸序列。這樣的本發(fā)明的核酸能夠編碼HCV亞基因組復制子RNA。
[0059] 本發(fā)明的核酸可以進一步包含：丙型肝炎病毒基因組的、編碼核心蛋白的核苷酸 序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列、編碼p7蛋白的核苷酸序列和 編碼NS2蛋白的核苷酸序列。這樣的本發(fā)明的核酸能夠編碼HCV全基因組復制子RNA。此 時，編碼核心蛋白的核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列、編 碼P7蛋白的核苷酸序列和編碼NS2蛋白的核苷酸序列可以來自基因型3a的丙型肝炎病毒 (例如S310A株或其突變體）的基因組。
[0060] 當為來自基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的核苷酸序列時，編碼核心蛋白的核 苷酸序列優(yōu)選為編碼SEQ ID N0: 14的氨基酸編號1?191的核心蛋白的氨基酸序列的 核苷酸序列。另外，編碼El蛋白的核苷酸序列優(yōu)選為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號 192?383的El蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼E2蛋白的核苷酸序列優(yōu)選為編碼 SEQ ID NO: 14的氨基酸編號384?752的E2蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼p7 蛋白的核苷酸序列優(yōu)選為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號753?815的p7蛋白的氨基 酸序列的核苷酸序列。編碼NS2蛋白的核苷酸序列優(yōu)選為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編 號816?1032的NS2蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0061] 編碼核心蛋白的核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序 列、編碼P7蛋白的核苷酸序列和編碼NS2蛋白的核苷酸序列還可以來自基因型3a以外的 基因型（例如1&、113、2 &、213、2(3、313、4、5&或6&)的!1(^(例如!1(^的現(xiàn)有株）的基因組，此 時，它們成為嵌合型的核酸（嵌合核酸）。
[0062] 本發(fā)明的核酸可以是在上述核酸的核苷酸序列中包含1個或多個（優(yōu)選2?50 個、例如2?10個）核苷酸突變的核酸。對核苷酸突變沒有限定，但優(yōu)選為核苷酸的缺失、 取代或添加。核苷酸突變可以是不會引起氨基酸取代的同義取代，只要不喪失自主復制能 力，還可以是引起氨基酸取代的非同義取代。只要不喪失自主復制能力，氨基酸取代可以是 保守取代，也可以是非保守取代。
[0063] 本發(fā)明的核酸還可以包含來自基因型3a以外的基因型（例如la、lb、2a、2b、2c、 3b、4、5a或6a)的HCV (例如HCV的現(xiàn)有株）的基因組的5'非翻譯區(qū)，以代替包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1?340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)。
[0064] 本發(fā)明的核酸還可以包含外來基因（抗藥性基因或報道基因等）和IRES序列。
[0065] 本發(fā)明的核酸可以是HCV亞基因組復制子RNA或HCV全基因組復制子RNA等HCV 復制子RNA或編碼其的核酸。本發(fā)明的核酸例如可以是包含編碼HCV復制子RNA的核苷酸 序列的表達盒等。本發(fā)明的核酸可以是DNA、RNA、或DNA和RNA的嵌合等，還可以包含修飾 核苷酸等。
[0066] 在本發(fā)明中，"復制子RNA"是指具有在培養(yǎng)細胞（典型的是HCV敏感性細胞）內 進行自主復制的能力的RNA。導入到細胞中的復制子RNA進行自主復制、且其RNA拷貝在細 胞分裂后被分配到子細胞中，所以使用復制子RNA時可以穩(wěn)定地導入到細胞中。
[0067] HCV的復制子RNA(HCV復制子RNA)是指，包含HCV基因組RNA的一部分或全長、 且進行自主復制的RNA。將包含HCV基因組RNA的一部分且進行自主復制的RNA稱作HCV 亞基因組復制子RNA，將包含HCV基因組RNA的全長且進行自主復制的RNA稱作HCV全基 因組復制子RNA。"HCV復制子RNA"包含HCV亞基因組復制子RNA和HCV全基因組復制子 RNA雙方。
[0068] 本發(fā)明中的"HCV亞基因組復制子RNA"，其優(yōu)選從5'側往3'側依次包含HCV的 5'非翻譯區(qū)（5, UTR)、編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷 酸序列、以及3'非翻譯區(qū)（3' UTR)。另外，關于HCV亞基因組復制子RNA，為了對其進行檢 測，優(yōu)選包含外來基因（例如抗藥性基因或報道基因）和IRES序列，在這種情況下，優(yōu)選在 HCV亞基因組復制子RNA的NS3蛋白編碼區(qū)的5'側包含外來基因（抗藥性基因或報道基 因）和IRES序列。
[0069] 本發(fā)明的"HCV亞基因組復制子RNA"優(yōu)選包含本發(fā)明的核酸。本發(fā)明的"HCV亞 基因組復制子RNA"優(yōu)選由本發(fā)明的核酸表達的HCV亞基因組復制子RNA。本發(fā)明的一優(yōu) 選的"HCV亞基因組復制子RNA"的例子為：從5'側往3'側依次包含HCV的5'非翻譯區(qū) (5' UTR)、自編碼核心蛋白的核苷酸序列的5'末端起57個核苷酸的序列、外來基因（抗藥 性基因或報道基因 ）、I RES序列、編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋 白的核苷酸序列、以及3'非翻譯區(qū)（3' UTR)的HCV亞基因組復制子RNA。
[0070] 本發(fā)明中的"HCV全基因組復制子RNA"優(yōu)選從5'側往3'側依次配置HCV的5' 非翻譯區(qū)（5' UTR)、編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋 白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列和3'非翻譯區(qū)（3' UTR)而形成的HCV 全基因組復制子RNA。HCV全基因組復制子RNA可以進一步包含外來基因（抗藥性基因或 報道基因）和IRES序列。這種情況下，優(yōu)選在HCV全基因組復制子RNA的編碼核心蛋白的 核苷酸序列的5'側包含外來基因（抗藥性基因或報道基因）和IRES序列。
[0071] 當HCV全長基因組核酸具有自主復制能力時，該基因組是復制子RNA。將包含HCV 全長基因組核酸的復制子RNA稱作HCV全基因組復制子RNA。當由HCV全長基因組序列構 成的RNA(HCV全長基因組RNA)具有自主復制能力時，其是HCV全基因組復制子RNA。
[0072] 作為HCV復制子RNA (HCV全基因組復制子RNA和HCV亞基因組復制子RNA)和本 發(fā)明的核酸所能包含的抗藥性基因的例子，例如可以列舉：新霉素抗性基因、潮霉素抗性基 因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷?；D移酶基因 、Zeocin 抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、殺稻瘟菌素 S抗性基因等，優(yōu)選新霉素抗性基因、潮霉素抗 性基因，進一步優(yōu)選新霉素抗性基因。
[0073] 作為HCV復制子RNA和本發(fā)明的核酸所能包含的報道基因的例子，例如可以列舉 催化發(fā)光反應或顯色反應的酶的結構基因。作為優(yōu)選的報道基因的例子，可以列舉來自轉 座子Tn9的氯霉素乙酰轉移酶基因、來自大腸桿菌的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、 螢光素酶基因、綠色螢光蛋白基因、來自水母的水母素（4々才U Aaequorin)基因、分泌 型胎盤堿性磷酸酶（SEAP)基因等。
[0074] 在HCV復制子RNA或本發(fā)明的核酸中，可以只包含抗藥性基因或報道基因中的 任意一種，也可以包含兩者。在HCV復制子RNA或本發(fā)明的核酸中，可以包含1個也可以 包含2個以上的抗藥性基因或報道基因。包含2個以上的抗藥性基因或報道基因時，可以 將各基因與來自病毒的2A肽基因以形成正確的讀框（框架）的方式連接。作為2A肽， 可以列舉來自明脈扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus)的2A肽（T2A)、來自口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus)的 2A 膚（F2A)、來自馬鼻炎 A 病毒（Equin rhinitis A virus)的 2A 膚（E2A)、來自豬捷申病毒 l(Porcine teschovirus 1)的 2A膚（P2A) (Kim等 人，PoLos One·, 2011 年，第 6(4)卷，el8556)。
[0075] HCV復制子RNA和本發(fā)明的核酸所能包含的IRES序列與上述相同，例如是指可以 使核糖體結合在RNA內部并開始翻譯的內部核糖體結合位點。作為IRES序列的優(yōu)選的例 子，可以列舉EMCV IRES(腦心肌炎病毒的內部核糖體結合位點）、FMDV IRES、HCV IRES等， 更優(yōu)選 EMCV IRES 和 HCV IRES，最優(yōu)選 EMCV IRES。
[0076] 在HCV復制子RNA和本發(fā)明的核酸中，抗藥性基因和/或報道基因以由HCV復制 子RNA按照正確的讀框（框架）進行翻譯的方式連接。由HCV復制子RNA或本發(fā)明的核酸 編碼的蛋白優(yōu)選作為一系列的多肽被翻譯、表達后，被蛋白酶切斷形成各蛋白，以游離的方 式經(jīng)由蛋白酶切位點等彼此相連。
[0077] HCV敏感性細胞是指在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中容許HCV顆粒的感染或HCV復制子RNA的 復制的細胞，可以列舉Huh7細胞、！fepG2細胞、MY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞、或作為 Huh7細胞的衍生株的Huh7. 5細胞、Huh7. 5. 1細胞。另外，還可以列舉使CD81基因和/或 Claudinl基因在Huh7細胞、!fepG2細胞、頂Y-N9細胞、HeLa細胞或293細胞中表達的細胞 (Lindenbach等人，Science, 2005年，第 309 卷，第 623-626 頁；Evans 等人，Nature, 2007年，第446卷，第 801-805 頁；Akazawa 等人，J. Virol. 2007年，第 81 卷，第 5036-5045頁）。其中，特別優(yōu)選使用Huh7細胞或Huh7細胞的衍生株。需要說明的是，在 本發(fā)明中，"衍生株"是指由該細胞誘導的株。
[0078] 研究顯示：在HCV基因組的有效復制中，往往需要在基因組的核苷酸序列中發(fā)生 突變（Lohmann 等人，Journal of Virology, 2001 年，第 75 卷，第 1437-1449 頁）。將 提高復制能力的突變稱作適應性突變（adaptive mutation)。
[0079] 本發(fā)明的核酸和HCV復制子RNA也可以包含適應性突變。例如，作為上述的S310A 株的、HCV亞基因組復制子RNA的復制能力提高的適應性突變，以SEQ ID N0: 14所示氨基 酸序列（S310A株的前體蛋白的全長氨基酸序列）為基準時，可以列舉T1286I(第1286位 的蘇氨酸（Τ)突變成異亮氨酸（Ι))、Τ2188Α(第2188位的蘇氨酸（Τ)突變成丙氨酸（Α))、 R2198H(第2198位的精氨酸（R)突變成組氨酸（H))、S2210I(第2210位的絲氨酸（S)突變 成異亮氨酸（I))、T2496I (第2496位的蘇氨酸（T)突變成異亮氨酸（I))、R2895G (第2895 位的精氨酸（R)突變成甘氨酸（G))和R2895K (第2895位的精氨酸（R)突變成賴氨酸（K))。 通過將這些適應性突變單獨或組合導入本發(fā)明的核酸和HCV復制子RNA、例如上述S310A株 的HCV基因組中，可以獲得復制能力提高的HCV亞基因組復制子RNA或HCV全基因組復制子 RNA或編碼它們的核酸。在本發(fā)明中，本發(fā)明的核酸和HCV復制子RNA所具有的、更優(yōu)選的 核苷酸突變?yōu)椋阂鸢被嵝蛄械腡1286I的突變、R2198H的突變、S2210I的突變或R2895K 的突變的突變，進一步優(yōu)選的核苷酸突變?yōu)椋阂鸢被嵝蛄械腞2198H突變、S2210I突變 或R2895K突變的突變。另外，還可以單獨導入公知文獻記載的適應性突變，或者將其與上 述突變組合導入。將要導入的突變只要是來自上述S310A株的HCV復制子RNA的復制能力 提高的突變即可。需要說明的是，T1286I是NS3蛋白內的突變，T2188A、R2198H和S2210I 的突變是NS5A蛋白內的突變，T2496I、R2985G和R2985K是NS5B蛋白內的突變。
[0080] 向本發(fā)明的核酸和HCV復制子RNA、例如分離的基因型3a的野生型HCV基因組中 導入突變時，可以采用PCR法或市售的突變導入試劑盒（例如東洋紡社制的KOD-Plus-誘 變試劑盒等）。作為PCR法，例如，以將基因型3a的野生型HCV基因組RNA的cDNA克隆化 的載體為模板，使用由該cDNA的序列設計的、包含將要導入的突變的正向和反向引物實施 PCR，從而可以擴增目標序列部分。具體而言，合成多個彼此具有重復序列的不同的PCR產 物，混合這些PCR產物，以其為模板，使用包含目標核酸的5'端的正向引物和包含該核酸的 互補鏈的5'端的反向引物進行PCR，從而可以擴增該目標核酸。用限制酶切斷所合成的核 酸的各末端，再與將用相同的酶切斷的野生型HCV基因組RNA的cDNA克隆化的載體連接。 這樣的操作的基本技術例如還記載在國際公開第04/104198號、國際公開第06/022422號、 Wakita 等人，2005 年，Nature Medicine,第 11 號，第791-796頁和 Lindenbach 等人， 2005 年，Science,第 309 號，第 623-626 頁中。
[0081] 作為本發(fā)明的核酸和HCV亞基因組復制子RNA的一實施方式，可以列舉從5'側往 3'側依次包含上述的S310A株的全長HCV基因組（SEQ ID NO: 1)中的5'非翻譯區(qū)（5'UTR) (SEQ ID NO: 2)、NS3 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 9)、 NS4B蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白編 碼序列（SEQ ID NO: 12)和 3' 非翻譯區(qū)（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的核酸。
[0082] 作為本發(fā)明的核酸和HCV亞基因組復制子RNA的另一實施方式，可以列舉：在從 5'側往3'側依次包含S310A株的全長HCV基因組（SEQ ID NO: 1)中的5'非翻譯區(qū)（5'UTR) (SEQ ID NO: 2)、NS3 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 9)、 NS4B蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白編 碼序列（SEQ ID NO: 12)和3'非翻譯區(qū)（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的核苷酸序列中，包含 選自 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 和 R2895K 的至少一個突變的核酸。 作為本發(fā)明的核酸和HCV亞基因組復制子RNA，還優(yōu)選列舉從5'側往3'側依次包含S310A 株的全長HCV基因組中的5'非翻譯區(qū)（5' UTR)、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、 NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3'非翻譯區(qū)（3' UTR)、并且 還包含T1286I、R2198H或R2895K的突變的核酸。作為本發(fā)明的核酸和HCV亞基因組復制 子RNA，進一步優(yōu)選列舉：從5'側往3'側依次包含S310A株的全長HCV基因組中的5'非 翻譯區(qū)（5' UTR)、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編 碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3'非翻譯區(qū)（3, UTR)、并且還包含R2198H或R2895K的突變 的核酸。
[0083] 上述的HCV亞基因組復制子RNA可以進一步包含抗藥性基因和/或報道基因以及 IRES序列。此時，優(yōu)選在5' UTR的下游插入抗藥性基因或/和報道基因，并進一步在其下 游插入IRES序列。
[0084] 作為本發(fā)明的HCV亞基因組復制子RNA的進一步優(yōu)選的實施方式，可以列舉由 SEQ ID N0: 16所示核苷酸序列構成的核酸（野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA、 圖1C)。作為本發(fā)明的HCV亞基因組復制子RNA的另一優(yōu)選實施方式，可以列舉在SEQ ID NO: 16 所示核苷酸序列中導入有選自 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 和 R2895K的突變的RNA，更優(yōu)選列舉導入有T1286I、R2198H或R2895K的突變的RNA。例如，可 以例示包含SEQ ID N0: 17 (在野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA中包含T1286I 的突變的序列）、SEQ ID N0: 18(在野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA中包含 R2198H的突變的序列）或SEQ ID N0: 19 (在野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA 中包含R2895K的突變的序列）所示核苷酸序列的核酸。
[0085] 構成本發(fā)明的HCV亞基因組復制子RNA的核酸可以是：雖然在引起上述突變的核 苷酸以外的核苷酸中進一步具有其他突變，但與包含上述突變的核酸具有相同的復制能力 的核酸。作為這樣的其他突變，可以列舉1個或多個核苷酸的取代，該具有其他突變的核酸 優(yōu)選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu)選97%以上的核苷酸 序列同源性。而且，作為這樣的其他突變，可以列舉1個或多個核苷酸的缺失或添加。此時， 該具有其他突變的核酸優(yōu)選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步 優(yōu)選97%以上的核苷酸序列同源性，并且，當其他突變?yōu)榫幋a蛋白的序列內的缺失或添加 時，優(yōu)選被翻譯成蛋白的氨基酸序列的讀框不偏移。而且，作為這樣的其他突變，可以列舉 HCV基因組的5'非翻譯區(qū)內或3'非翻譯區(qū)內的1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，該 具有其他突變的核酸優(yōu)選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu) 選97%以上的核苷酸序列同源性。而且，作為這樣的其他突變，可以列舉編碼HCV基因組的 HCV蛋白的核苷酸序列（病毒蛋白編碼區(qū)）內的1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，該 具有其他突變的核酸優(yōu)選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu) 選97%以上的核苷酸序列同源性，并且，當其他突變?yōu)槿笔Щ蛱砑訒r，優(yōu)選被翻譯成HCV蛋 白的氨基酸序列的讀框不偏移。
[0086] 在本說明書中，氨基酸或氨基酸殘基通過生物學領域通常使用的氨基酸的單字母 符號或 3 字母符號（Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第二版， 1989年）來記載。這樣書寫的氨基酸還包含進行了氫氧化、糖鏈加成、硫酸化等翻譯后修飾 的氨基酸。
[0087] 在本說明書中，有時通過"以SEQ ID NO: "X"所示的…氨基酸序列為基準時第 "Y"位的（氨基酸）"的表述來指定SEQ ID N0所示氨基酸序列中的特定位置的氨基酸。例 如，"以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前體蛋白的氨基酸序列為基準時第"Y"位的（氨基 酸）"的記載是指，在SEQ ID N0: 14所示HCV的S310A株的前體蛋白的氨基酸序列中，以 N末端的第1氨基酸（甲硫氨酸）作為第1位時，該氨基酸是位于第"Y"位的氨基酸殘基。 采用"以SEQ ID NO: "X"所示的…氨基酸序列為基準時第"Y"位的（氨基酸）"的表述指 定的氨基酸，只要其在序列比對上與SEQ ID NO: "X"的第"Y"位的氨基酸對應即可，例如 其在SEQ ID NO: "X"的序列突變體（末端切斷序列等）中可以位于第"Y"位，但也可以不 位于第"Y"位。具體而言，例如記載為"以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前體蛋白的氨基 酸序列為基準時，由第2496位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸的S310A株的NS3蛋白、NS4A蛋 白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的氨基酸序列構成的前體蛋白"時，例如還是指在SEQ ID N0: 14中雖然位于第2496位但由于SEQ ID N0: 14的氨基酸序列的N末端的末端切 斷（截短）而使其距末端切斷序列上的N末端的位置不是第2496位的蘇氨酸在蛋白中被 取代成異亮氨酸。
[0088] 在本說明書中，R2895K等的書寫表示特定位置的氨基酸的取代，根據(jù)文脈還表示 引起該氨基酸取代的核苷酸突變。例如，核酸的核苷酸發(fā)生突變，原始核酸所編碼的氨基酸 序列中的第2895位R (精氨酸）取代成K (賴氨酸）時，有時將該核苷酸突變稱作R2895K取 代（突變）。另外，有時將編碼具有該突變的氨基酸序列的核酸稱作包含R2895K取代（突 變）的核酸、或導入了 R2895K取代（突變）的核酸。或者，還有時將這樣的突變稱作引起 氨基酸序列中的R2895K取代（突變）的核苷酸突變、或引起氨基酸序列中的R2895K取代 (突變）的突變。例如，有時將導入了 R2895K取代（突變）的HCV復制子RNA稱作R2895K 突變體HCV復制子RNA。同時具有多個突變時，例如，具有T2496I的氨基酸取代和R2895K 的氨基酸取代時，有時表述為"包含T2496I/R2895K的取代（突變"氨基酸取代"有時 表述為"氨基酸突變"。
[0089] 引起特定的氨基酸取代的核苷酸突變可以根據(jù)周知的遺傳密碼表來選擇。例如， 引起R2895K取代的突變是導致由編碼精氨酸的密碼子"CGU"、"CGC"、"CGA"、"CGG"、"AGA" 或"AGG"變?yōu)榫幋a賴氨酸的密碼子"AAA"或"AAG"的突變。在S310A株的全長基因組序列 (SEQ ID NO: 1)中，引起R2895K取代的核苷酸突變是使密碼子"AGA"（SEQ ID NO: 1的第 9023位?第9025位）變?yōu)?AAG"或"AAA"的突變。即，這是使SEQ ID NO: 1的第9024 位?第9025位的核苷酸序列由5' -GA-3'突變成5' -AG-3'、或者使第9024位的核苷酸由 G突變成A的核苷酸突變。
[0090] 同樣，以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前體蛋白的氨基酸序列為基準時，第2198 位的精氨酸取代成組氨酸的氨基酸取代記作R2198H。在S310A株的全長基因組序列（SEQ ID NO: 1)中，引起R2198H取代的核苷酸突變是指使編碼精氨酸的密碼子"C⑶"（SEQ ID NO: 1的第6932位?第6934位）變成編碼組氨酸的密碼子"CAU"或"CAC"的突變。
[0091] 同樣，以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前體蛋白的氨基酸序列為基準時，第1286 位的蘇氨酸取代成異亮氨酸的氨基酸取代記作T1286I。在S310A株的全長基因組序列（SEQ ID NO: 1)中，引起T1286I取代的核苷酸突變是使編碼蘇氨酸的密碼子"ACU"(SEQ ID N0: 1的第4196位?第4198位）變?yōu)榫幋a異亮氨酸的密碼子"AUU"、"AUC"或"AUA"的突變。
[0092] 另外，在本說明書中，SEQ ID N0所示核苷酸序列的核苷酸編號是以在SEQ ID N0 所不核苷酸序列中以5'末端的第1核苷酸為第1位而附上了核苷酸編號的編號為基準。
[0093] HCV亞基因組復制子RNA通過由表達載體進行轉錄（表達）即可獲得。與HCV亞 基因組復制子RNA表達載體的構建有關的基本技術記載在Lohmann等人，Science, 1999 年，第 285 卷，第 110-113 頁和 Kato 等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125卷， 第1808-1817頁中。具體而言，例如，通過在5'側往3'側的方向將5'非翻譯區(qū)（5'UTR)、 編碼核心蛋白的區(qū)的57個核苷酸、外來基因（抗藥性基因或報道基因 ）、EMCV IRES序列、 編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列以及3'非翻譯 區(qū)（3' UTR)依次連接的cDNA插入T7啟動子的下游，可以構建HCV亞基因組復制子RNA表 達載體。需要說明的是，在各核苷酸序列的連接中，在連接位點可以包含限制酶切位點等添 加序列。
[0094] 上述的HCV亞基因組復制子RNA，可以利用聚合酶由構建的HCV亞基因組復制子 RNA表達載體合成。例如，作為以在T7啟動子的控制下將HCV cDNA克隆化的核酸為模板在 體外制作RNA的方法，可以列舉使用MEGAscript T7試劑盒（Ambion公司）等進行的合成。 由該載體轉錄的HCV亞基因組復制子RNA被導入細胞中時進行自主復制。本發(fā)明包含導入 有HCV亞基因組復制子RNA的細胞。
[0095] 作為啟動子，不僅使用T7啟動子，還可以使用SP6啟動子、T3啟動子、T5啟動子等 任意的啟動子，但優(yōu)選17啟動子。
[0096] 作為載體，可以使用 pUC19 (TaKaRa 公司）、pBR322 (TaKaRa 公司）、pGEM-T、pGEM_T Easy、pGEM_3Z (均由 Promega 公司制）、pSP72 (Promega 公司）、pCRII (Invitrogen 公司）、 pT7Blue(Novagen公司）等各種載體。
[0097] 作為將要導入HCV亞基因組復制子RNA的細胞，只要是容許HCV亞基因組復制子 RNA的復制的細胞即可，可以列舉上述的HCV敏感性細胞。特別優(yōu)選使用Huh7細胞或Huh7 細胞的衍生株。
[0098] 作為將HCV亞基因組復制子RNA導入細胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例 如，可以列舉磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂質轉染法、顯微注射法、電穿孔法，但優(yōu)選 列舉脂質轉染法和電穿孔法，進一步優(yōu)選列舉電穿孔法。
[0099] 作為評價導入的HCV亞基因組復制子RNA的復制能力的方法，可以列舉測定HCV 亞基因組復制子RNA所連接的外來基因的功能、即通過該基因的表達而表現(xiàn)出來的功能。 當外來基因為抗藥性基因時，計測在含有藥物的選擇培養(yǎng)基中增殖的細胞數(shù)或細胞的集落 數(shù)，從而可以評價HCV亞基因組復制子RNA的復制能力。此時，細胞數(shù)或細胞的集落數(shù)越 多，則可以評價為復制能力越高。當外來基因為酶時，通過計測其酶活性，可以評價HCV亞 基因組復制子RNA的復制能力。此時，酶活性越高，則可以評價為復制能力越高。作為其他 方法，通過利用定量的RT-PCR定量已復制的RNA的量，也可以直接評價HCV亞基因組復制 子RNA的復制能力。
[0100] 本發(fā)明的HCV全基因組復制子RNA還包含HCV全長基因組RNA本身，可以按照與上 述的HCV亞基因組復制子RNA相同的程序來制作。關于本發(fā)明的HCV全基因組復制子RNA， 通過將上述的HCV亞基因組復制子RNA的復制能力有所提高的適應性突變與上述的HCV亞 基因組復制子RNA同樣地導入基因型3a的野生型的S310A株等的HCV全長基因組RNA中， 可以制作HCV全基因組復制子RNA。這里，將在野生型的S310A株的HCV全長基因組RNA中 導入有上述適應性突變的HCV基因組稱作S310A株突變體或突變體S310A株。
[0101] 作為導入突變的方法，可以利用上述方法將突變導入野生型的S310A株的HCV全 長基因組中，也可以通過將野生型的HCV基因組的結構基因部分與亞基因組復制子突變體 連接而導入突變。
[0102] 上述HCV全基因組復制子RNA的一實施方式涉及復制子RNA，該復制子RNA從5' 側往3'側依次包含S310A株的全長基因組RNA(SEQ ID N0: 1)、即5'非翻譯區(qū)（5' UTR) (SEQ ID N0: 2)、核心蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 3)、E1蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 4)、E2 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 5)、p7蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 6)、NS2蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 7)、NS3 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 9)、NS4B 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白編碼序列 (SEQ ID NO: 12)和 3' 非翻譯區(qū)（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)。
[0103] 上述HCV全基因組復制子RNA的另一實施方式涉及在S310株的全長基因組RNA 中導入有上述適應性突變的核酸。作為該HCV全基因組復制子RNA的優(yōu)選的實施方式，可 以列舉：在從5'側往3'側依次包含上述的S310A株的全長基因組RNA(SEQ ID NO: 1)、即 5'非翻譯區(qū)（5, UTR) (SEQ ID NO: 2)、核心蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 3)、E1蛋白編碼序 列（SEQ ID NO: 4)、E2 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 5)、p7 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 6)、 NS2蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 7)、NS3蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白編碼序 列（SEQ ID NO: 9)、NS4B 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 12)和 3' 非翻譯區(qū)（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的核 苷酸序列中包含 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 或 R2895K 的突變的 RNA。 優(yōu)選列舉：在從5'側往3'側依次包含S310A株的全長基因組RNA (SEQ ID NO: 1)、即5' 非翻譯區(qū)（5' UTR)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序 列、NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A 蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3'非翻譯區(qū)（3' UTR)的核苷酸序列中包含R2198H、 S2210I或R2895K的突變的核酸。
[0104] HCV全基因組復制子RNA可以進一步包含抗藥性基因和/或報道基因、以及IRES 序列。此時，優(yōu)選在5'非翻譯區(qū)（5'UTR)的下游插入抗藥性基因或/和報道基因，并進一 步在其下游插入IRES序列。
[0105] 作為上述HCV全基因組復制子RNA的進一步優(yōu)選的實施方式，可以列舉包含SEQ ID NO: 49(包含S2210I的突變的全基因組核苷酸序列）、SEQ ID NO: 50(包含R2198H的 突變的全基因組核苷酸序列）或SEQ ID N0: 51 (包含R2895K的突變的全基因組核苷酸序 列）所示核苷酸序列的RNA。具體而言，由SEQ ID N0: 49所示具有引起第2210位的絲氨 酸取代成異亮氨酸的取代的突變的核苷酸序列構成的核酸、由SEQ ID N0: 50所示具有引 起第2198位的精氨酸取代組氨酸的取代的突變的核苷酸序列構成的核酸、或由SEQ ID N0: 51所示具有引起第2895位的精氨酸取代成賴氨酸的取代的突變的核苷酸序列構成的核酸 符合。
[0106] 構成本發(fā)明的HCV全基因組復制子RNA的核酸可以是：雖然在引起上述突變的核 苷酸以外的核苷酸中進一步具有其他突變，但與包含上述突變的核酸具有同等的復制能力 的核酸。作為這樣的其他突變，可以列舉1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，該具有其 他突變的核酸優(yōu)選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu)選97% 以上的核苷酸序列同源性。而且，作為這樣的其他突變，可以列舉HCV基因組的5'非翻譯 區(qū)內或3'非翻譯區(qū)內的1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，該具有其他突變的核酸優(yōu) 選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu)選97%以上的核苷酸序 列同源性。而且，作為這樣的其他突變，可以列舉編碼HCV基因組的HCV蛋白的核苷酸序列 (病毒蛋白編碼區(qū)）內的1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加，該具有其他突變的核酸優(yōu) 選與原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu)選97%以上的核苷酸序 列同源性，并且當其他突變?yōu)槿笔Щ蛱砑訒r，優(yōu)選被翻譯成HCV蛋白的氨基酸序列的讀框 不偏移。
[0107] 上述的HCV全基因組復制子RNA的制作中使用的表達載體可以利用國際公開第 05/080575號中記載的技術來制作。具體而言，利用常規(guī)方法重建HCV的全長基因組RNA所 對應的cDNA，并將其插入啟動子的下游，制作DNA克隆。上述啟動子優(yōu)選為質粒克隆中所含 的啟動子。作為啟動子，可以使用T7啟動子、SP6啟動子、T3啟動子、T5啟動子等，優(yōu)選T7 啟動子。作為載體，可以使用pUC19(TaKaRa公司）、pBR322(TaKaRa公司）、pGEM-T、pGEM-T Easy、pGEM_3Z (均由 Promega 公司制）、pSP72 (Promega 公司）、pCRII (Invitrogen 公司）、 pT7Blue(Novagen 公司）等。
[0108] 由表達載體制作HCV全基因組復制子RNA時，以所制作的上述DNA克隆為模板，利 用聚合酶合成RNA。以在T7啟動子的控制下將HCV cDNA克隆化的核酸為模板，在體外制作 RNA時，可以使用MEGAscript T7試劑盒（Ambion公司）等進行合成。RNA的合成可以利用 常規(guī)方法從5' UTR開始。當DNA克隆為質?？寺r，還可以使用通過限制酶從質?？寺≈?切出的DNA片段作為模板，合成RNA。需要說明的是，優(yōu)選所合成的RNA的3'末端與HCV基 因組RNA的3' UTR的末端一致，不添加或者不刪除其他的序列。
[0109] 上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸若被導入培養(yǎng)細胞（典型的是HCV敏感 性細胞）中，則進行自主復制，產生HCV顆粒（丙型肝炎病毒），另外，若用含有上述的HCV 全基因組復制子RNA或其核酸作為病毒基因組的HCV顆粒感染培養(yǎng)細胞（典型的是HCV敏 感性細胞），則產生HCV顆粒。即，導入了上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸的培養(yǎng) 細胞、或被含有上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸作為病毒基因組的HCV顆粒感染 的培養(yǎng)細胞可用于HCV顆粒的大量生產。
[0110] 更具體而言，由導入了上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸的培養(yǎng)細胞（典 型的是HCV敏感性細胞）、或被含有上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸作為病毒基因 組的HCV顆粒（丙型肝炎病毒）感染的培養(yǎng)細胞（典型的是HCV敏感性細胞）產生的HCV 顆粒，其進一步感染其他的培養(yǎng)細胞（典型的是HCV敏感性細胞），在該細胞內HCV的基因 組RNA被復制、包裝，可以反復產生HCV顆粒。用HCV顆粒感染培養(yǎng)細胞時，例如可以將導 入了 HCV全基因組復制子RNA或其核酸的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)上清添加在HCV敏感性細胞（例 如Huh7細胞）中來實施。
[0111] 作為將要導入上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸的細胞、或將要感染上述 HCV顆粒（丙型肝炎病毒）的細胞，優(yōu)選培養(yǎng)細胞，只要是容許HCV復制子RNA的復制或HCV 顆粒的形成的細胞即可，可以列舉上述的HCV敏感性細胞。特別優(yōu)選使用Huh7細胞或Huh7 細胞的衍生株。
[0112] 作為將HCV全基因組復制子RNA導入細胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例 如，可以列舉磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂質轉染法、顯微注射法、電穿孔法，但優(yōu)選 列舉脂質轉染法和電穿孔法，進一步優(yōu)選列舉電穿孔法。
[0113] 作為評價導入的HCV全基因組復制子RNA的復制能力的方法，可以列舉測定HCV 全基因組復制子RNA所連接的外來基因的功能、即通過該基因的表達而表現(xiàn)出來的功能。 當外來基因為抗藥性基因時，計測在含有藥物的選擇培養(yǎng)基中增殖的細胞數(shù)或細胞的集落 數(shù)，從而可以評價HCV全基因組復制子RNA的復制能力。此時，細胞數(shù)或細胞的集落數(shù)越 多，則可以評價為復制能力越高。當外來基因為酶時，通過計測其酶活性，可以評價HCV全 基因組復制子RNA的復制能力。此時，酶活性越高，則可以評價為復制能力越高。作為其他 方法，通過利用定量性的RT-PCR定量復制的RNA的量，也可以直接評價HCV全基因組復制 子RNA的復制能力。
[0114] 需要說明的是，本發(fā)明還包含：包含上述核酸的病毒基因組和含有上述核酸作為 病毒基因組的丙型肝炎病毒顆粒（丙型肝炎病毒）。
[0115] 上述的HCV全基因組復制子RNA或其核酸在培養(yǎng)細胞中具有HCV顆粒產生能力。 在評價HCV全基因組復制子RNA或其核酸是否具有HCV顆粒產生能力時，只要將該RNA導 入細胞中，測定其細胞培養(yǎng)上清中的HCV顆粒的存在即可。
[0116] 關于細胞的HCV顆粒產生能力，可以使用抗構成釋放到培養(yǎng)上清中的HCV顆粒的 蛋白、例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗體來檢測。另外，通過使用特異性引物的RT-PCR 法擴增培養(yǎng)上清中的HCV顆粒所含有的HCV全基因組復制子RNA并進行檢測，從而也可以 間接檢測HCV顆粒的存在。
[0117] 作為所產生的HCV顆粒是否具有感染能力的評價方法，用導入了 HCV全基因組復 制子RNA或其核酸的細胞的培養(yǎng)上清處理HCV敏感性細胞（例如Huh7細胞），例如在48小 時后將細胞用抗核心抗體進行免疫染色，計數(shù)感染細胞數(shù)，或者使細胞提取物在SDS-聚丙 烯酰胺凝膠中電泳，通過蛋白質印跡法檢測核心蛋白，由此即可進行判斷。
[0118] 本發(fā)明還提供來自包含基因型3a的HCV(例如S310A株）的2個以上的丙型肝 炎病毒株的基因組的嵌合核酸。具體而言，提供包含基因型3a的S310A株的基因組序列、 S310A株的HCV基因組（SEQ ID NO: 1)以外的HCV基因組、例如各種基因型（la、lb、2a、2b、 3a、3b等）的HCV現(xiàn)有株或基因型3a以外的基因型的HCV的基因組序列的嵌合型HCV基因 組（嵌合HCV基因組）、嵌合型HCV亞基因組復制子RNA (嵌合HCV亞基因組復制子RNA)、 嵌合型HCV全基因組復制子RNA (嵌合HCV全基因組復制子RNA)和嵌合型HCV顆粒（嵌合 HCV顆粒）等。這里，嵌合HCV基因組和嵌合HCV全基因組復制子RNA分別是指包含2個以 上的不同株的HCV的基因組序列的HCV基因組和HCV全基因組復制子RNA，由這些嵌合HCV 基因組或嵌合HCV全基因組復制子RNA產生的HCV顆粒稱作嵌合型HCV顆粒。本發(fā)明的核 酸還包含這樣的嵌合HCV基因組。
[0119] 上述的嵌合HCV基因組可以是包含S310A株或S310A株突變體（導入了適應性突 變的S310A株）的非結構基因和其以外（S310A株和S310A株突變體以外）的HCV株的結 構基因的HCV的嵌合基因組。上述的嵌合HCV基因組可以具有適應性突變等的突變，還可 以使用S310A株突變體來制作。上述的嵌合HCV基因組中使用的S310A株突變體，具體而 言，在 S310A 株中包含 112861、了21884、1?2198!1、522101、了24961、1?28956或1?28951(的突變， 優(yōu)選包含R2198H、S2210I或R2895K的突變。進一步具體而言，S310A株突變體可以是包含 SEQ ID N0: 49(包含S2210I的突變的全基因組核苷酸序列）、SEQ ID N0: 50(包含R2198H 的突變的全基因組核苷酸序列）或SEQ ID NO: 51 (包含R2895K的突變的全基因組核苷酸 序列）所示核苷酸序列的核酸。
[0120] 嵌合HCV基因組例如從5'側往3'側依次包含丙型肝炎病毒的編碼核心蛋白的核 苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列和編碼p7蛋白的核苷酸 序列，而且還包含序列表的SEQ ID NO: 1中的、編碼由核苷酸編號3437?5329的序列構成 的NS3蛋白的核苷酸序列、編碼由核苷酸編號5330?5491的序列構成的NS4A蛋白的核苷 酸序列、編碼由核苷酸編號5492?6274的序列構成的NS4B蛋白的核苷酸序列、編碼由核 苷酸編號6275?7630的序列構成的NS5A蛋白的核苷酸序列和編碼由核苷酸編號7631? 9406的序列構成的NS5B蛋白的核苷酸序列。
[0121] 另外，本發(fā)明的嵌合HCV基因組例如可以是核酸，所述核酸從5'側往3'側以編碼 核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白 和NS5B蛋白的核苷酸序列的順序包含： S310A株以外的丙型肝炎病毒的基因組（例如丙型肝炎病毒的現(xiàn)有株的基因組或基因 型3a以外的基因型的HCV的基因組）的編碼核心蛋白的核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷 酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列和編碼p7蛋白的核苷酸序列； 編碼由序列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的序列構成的NS2蛋白的 核苷酸序列、編碼S310A株以外的丙型肝炎病毒的基因組（例如丙型肝炎病毒的現(xiàn)有株的 基因組或基因型3a以外的基因型的HCV的基因組）的NS2蛋白的核苷酸序列、或編碼由序 列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的序列構成的NS2蛋白的核苷酸序列的 一部分與編碼S310A株以外的丙型肝炎病毒的基因組（例如丙型肝炎病毒的現(xiàn)有株的基因 組或基因型3a以外的基因型的HCV的基因組）的NS2蛋白的核苷酸序列的一部分連接而 成的編碼嵌合型NS2蛋白的核苷酸序列；以及 序列表的SEQ ID NO: 1中的、編碼由核苷酸編號3437?5329的序列構成的NS3蛋 白的核苷酸序列、編碼由核苷酸編號5330?5491的序列構成的NS4A蛋白的核苷酸序列、 編碼由核苷酸編號5492?6274的序列構成的NS4B蛋白的核苷酸序列、編碼由核苷酸編號 6275?7630的序列構成的NS5A蛋白的核苷酸序列和編碼由核苷酸編號7631?9406的序 列構成的NS5B蛋白的核苷酸序列。
[0122] 本發(fā)明的嵌合HCV基因組在5'末端可以包含基因型3a的HCV基因組的5'非翻 譯區(qū)、例如包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號1?340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)；取而代 之，在5'末端可以包含S310A株的HCV基因組（SEQ ID NO: 1)以外的HCV基因組、例如各 種基因型的HCV現(xiàn)有株的基因組或基因型3a以外的基因型的丙型肝炎病毒基因組的5'非 翻譯區(qū)。
[0123] 這樣的嵌合HCV基因組的例子如圖16所示，例如可以列舉：包含J6CF株、JFH-1 株或TH株的5'非翻譯區(qū)、結構基因（核心?p7)和其NS2基因的N末端側的一部分（例 如編碼自NS2蛋白的N末端起第1?第16位的氨基酸序列的序列）、以及S310A株的NS2 基因的后續(xù)的C末端側的序列（例如編碼自NS2蛋白的N末端起第17?第217位的氨基 酸序列的序列）和NS2基因以外的非結構基因（NS3?NS5B)和3'非翻譯區(qū)的嵌合HCV基 因組。這些嵌合 HCV 基因組可以包含 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 或 R2895K的突變。
[0124] 本發(fā)明還提供包含這些嵌合HCV基因組的嵌合全基因組復制子RNA。
[0125] 關于嵌合HCV基因組的制作，例如可以通過將作為S310A株突變體的基因組的 結構基因的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的編碼序列與其他HCV株的結構基因 重組來制作。該基本技術例如記載在Wakita等人，Nature Medicine, 2005年，第11 卷，第 791-796 頁；Lindenbach 等人，Science，2005 年，第 309 卷，第 623-626 頁； Pietschmann等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A·，2007年，第 103卷，第7408-7413 頁中。
[0126] 在使用HCV株的核苷酸序列的系統(tǒng)分析法中，HCV被分為基因型1?基因型6這6 個類型，并進一步將各類型分為若干個亞型。作為已知的HCV的現(xiàn)有株的例子，具體而言， 作為基因型la的HCV株，已知有H77株（GenBank檢索號AF011751);作為遺傳型lb型的 HCV株，已知有J1株（GenBank檢索號D89815)、Conl株（GenBank檢索號AJ238799、有時還 稱作 Con-1 株、coni 株）、TH 株（Wakita 等人，The Journal of Biological Chemistry, 1994年，第 269 卷，第 14205-14210 頁；日本特開 2004-179 號公報）、HCV-N株（GenBank 檢索號AF139594)和HCV-0株（GenBank檢索號AB191333);作為基因型2a的HCV株，已知 有JFH-1株（GenBank檢索號AB047639、有時還稱作JFH1株）、J6CF株（GenBank檢索號 AF177036)、JCH-1 株（GenBank 檢索號 AB047640)、JCH-2 株（GenBank 檢索號 AB047641)、 JCH-3 株（GenBank 檢索號 AB047642)、JCH-4 株（GenBank 檢索號 AB047643)、JCH-5 株 (GenBank檢索號AB047644)和JCH-6株（GenBank檢索號AB047645)。而且，作為基因型2b 的HCV株，已知有HC-J8株（GenBank檢索號D01221)等；作為基因型3a的HCV株，已知有 NZL1 株（GenBank 檢索號 D17763)、K3a/650 株（GenBank 檢索號 D28917)、S52 株（GenBank 檢索號⑶814263)等；作為基因型3b的HCV株，已知有Tr-Kj株（GenBank檢索號D49374) 等；作為基因型4a的HCV株，已知有ED43株（GenBank檢索號Y11604)等。關于其他株，也 已經(jīng)報道了 GenBank 檢索號的列表（Tokita 等人，Journal of General Virology, 1998 年，第 79 卷，第 1847-1857 頁；Cristina, J. & Colina, R·，Virology Journal, 2006年，第3卷，第1-8頁）。
[0127] 在一實施方式中，上述的嵌合HCV基因組是核酸，該核酸包含來自將編碼來自 S310A株突變體以外的HCV株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、來自S310A株突變 體或S310A株突變體以外的HCV株的NS2蛋白、以及來自S310A株突變體的NS3蛋白、NS4A 蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列從5'側往3'側以編碼核心蛋白、 E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋 白的核苷酸序列的順序配置而形成的HCV的嵌合基因。另外，上述的NS2蛋白可以是S310A 株突變體的NS2蛋白與來自S310A株及其突變體以外的HCV株的NS2蛋白的嵌合型NS2蛋 白（嵌合NS2蛋白）。這里，既是HCV的S310A株以外又是S310A株突變體以外的HCV株優(yōu) 選為上述的HCV的現(xiàn)有株。
[0128] 這里，嵌合NS2蛋白是指，S310A株突變體的NS2蛋白的一部分氨基酸序列與來自 S310A株和S310A株突變體以外的HCV株的NS2蛋白的一部分氨基酸序列連接，整體上由 NS2的全長氨基酸序列構成的NS2蛋白。在上述嵌合HCV基因組的核酸中，NS2蛋白可以來 自S310A株突變體，或者可以是由來自S310A株突變體以外的HCV株的NS2蛋白的一部分 與來自S310A株突變體的NS2蛋白的剩余部分構成的嵌合NS2蛋白。此時，該嵌合NS2蛋 白與非嵌合的NS2蛋白具有相同的功能。例如，當來自S310A株突變體以外的HCV株的NS2 蛋白的一部分由編碼NS2蛋白的N末端的氨基酸殘基?第16位氨基酸殘基的核苷酸序列 構成時，來自S310A株及其突變體的NS2蛋白的剩余部分由編碼自N末端起第17位的氨基 酸殘基?C末端的氨基酸殘基的核苷酸序列構成。
[0129] 上述的嵌合HCV基因組的核酸優(yōu)選進一步在上述編碼核心蛋白的核苷酸序列的 5'側包含5' UTR、以及在上述編碼NS5B蛋白的區(qū)的3'側包含3' UTR。5' UTR和/或3' UTR 只要是來自任意的HCV株的序列即可，優(yōu)選為來自S310A株突變體以外的HCV株的5' UTR 和來自S310A株突變體的3' UTR。
[0130] 在上述的嵌合HCV基因組中，S310A株突變體以外的HCV株、S卩HCV的現(xiàn)有株優(yōu)選 屬于基因型la、lb或2a的株。屬于基因型la的株例如包含H77株。屬于基因型lb的株例 如包含TH株、Coni株、J1株和它們的衍生株。屬于基因型2a的株例如包含JFH-1株、J6CF 株等。優(yōu)選株為JFH-1株、J6CF株或TH株，特別優(yōu)選為JFH-1株。需要說明的是，S310A株 及其突變體以外的HCV株的基因組核苷酸序列信息可以由上述的文獻或GenBank獲取。
[0131] 上述嵌合HCV基因組的核酸例如是來自J6CF株和S310A株的嵌合核酸，并且包含 選自T1286I、S2210I、R2198H和R2895K的至少一個突變。上述嵌合HCV基因組的核酸例如 是來自JFH-1株和S310A株的嵌合核酸，并且包含選自T1286I、S2210I、R2198H和R2895K 的至少一個突變。上述嵌合HCV基因組的核酸例如是來自TH株和S310A株的嵌合核酸，并 且包含選自T1286I、S2210I、R2198H和R2895K的至少一個突變。
[0132] 圖16顯示：S310A株突變體（導入了 R2198H、S2210I或R2895K的適應性突變的 S310A株）、J6CF株、JFH-1株和TH株的HCV的HCV基因組的結構、以及作為嵌合核酸的例子 的包含S310A株突變體（導入了 R2198H、S2210I或R2895K的適應性突變的S310A株）的非 結構基因和J6CF株、JFH-1株或TH株的結構基因的嵌合HCV基因組（分別為J6CF/S310A、 JFH-1/S310A、TH/S310A)的結構。在圖 16 所示的嵌合核酸 J6CF/S310A、JFH-1/S310A、TH/ S310A中，5 '非翻譯區(qū)與結構區(qū)相同來自HCV株（分別為J6CF株、JFH-1株或ΤΗ株），3 '非 翻譯區(qū)與非結構區(qū)相同來自S310A株，NS2編碼序列與結構區(qū)相同是來自HCV株（分別為 J6CF株、JFH-1株或ΤΗ株）的NS2序列與來自S310A株的NS2序列的嵌合序列。這些嵌合 核酸具有R2198H、S2210I或R2895K的適應性突變。
[0133] 本發(fā)明提供：包含上述嵌合HCV基因組的核酸的HCV病毒基因組、包含上述嵌合 HCV基因組的核酸作為病毒基因組的丙型肝炎病毒、HCV全基因組復制子RNA、表達載體或 嵌合HCV顆粒。該嵌合HCV顆粒具有下述特征：在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中可以高效率地產生，還具 有高感染性。
[0134] 嵌合HCV基因可以如下制作：以將各HCV基因組RNA的cDNA克隆化的載體為模 板，以合成DNA為引物進行PCR，擴增各HCV基因的必要區(qū)并連接，由此即可制得。
[0135] 而且，將嵌合HCV基因 cDNA與T7啟動子等啟動子的下游的適當?shù)南拗泼盖形稽c 連接，可以制作用于合成HCV基因組RNA的表達載體。若將由該表達載體轉錄的RNA導入 HCV敏感性細胞（例如Huh7細胞等）中，則發(fā)生病毒的復制和包裝，可以產生感染性HCV顆 粒。
[0136] 包含上述嵌合HCV基因的HCV全基因組復制子RNA在細胞內具有復制能力、或者 具有HCV顆粒產生能力、以及所產生的HCV顆粒的感染性均可通過上述方法來確認。
[0137] 本發(fā)明還提供抗丙型肝炎病毒物質的篩選方法，該篩選方法使用上述的HCV亞基 因組復制子RNA、HCV全基因組復制子RNA或丙型肝炎病毒顆粒。
[0138] 導入了上述HCV亞基因組復制子RNA的培養(yǎng)細胞可用于篩選抑制HCV亞基因組復 制子RNA的復制的化合物。即，在受檢物質的存在下，培養(yǎng)導入了上述HCV亞基因組復制子 RNA的培養(yǎng)細胞，檢測所得培養(yǎng)物中的復制子RNA，從而可以篩選抗HCV物質。這里，培養(yǎng)物 包含培養(yǎng)上清或細胞破碎物。這種情況下，培養(yǎng)物中不存在復制子RNA、或者與在受檢物質 的不存在下相比少時，可以判定為上述受檢物質能夠抑制HCV亞基因組復制子RNA的復制。
[0139] 例如，將由從5'側到3'側的方向依次連接有上述S310A株或其突變體的5'非翻 譯區(qū)（5'UTR)(SEQ ID N0: 2)、核心蛋白編碼序列（SEQ ID N0: 3)的57個核苷酸、螢光素 酶基因 、EMCV IRES序列、NS3蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 9)、NS4B 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B 蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 12)和3'非翻譯區(qū)（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的RNA構成的 HCV亞基因組復制子RNA導入Huh7細胞中，接著添加受檢物質，在48?72小時后測定螢光 素酶活性。關于與未添加受檢物質相比能夠抑制螢光素酶活性的受檢物質，可以判定其具 有抑制HCV亞基因組復制子RNA的復制的作用。
[0140] 將上述HCV全基因組復制子RNA或其核酸導入培養(yǎng)細胞（典型的是HCV敏感性細 胞）中而得到的HCV顆粒（包含嵌合HCV顆粒），除了可用于篩選抑制HCV的感染的中和抗 體或化合物以及抑制HCV的復制的化合物外，還可適用于作為疫苗的用途、作為用于制作 抗HCV抗體的抗原的用途。
[0141] 將上述HCV顆粒用于篩選抑制HCV的感染或復制的物質時，可以列舉下述方法： 在受檢物質的存在下或不存在下，培養(yǎng)產生上述HCV顆粒的細胞、或者培養(yǎng)上述HCV顆粒 和HCV敏感性細胞、即培養(yǎng)上述HCV顆粒和HCV敏感性細胞的混合物、或者培養(yǎng)感染了上 述HCV顆粒的HCV感染細胞，檢測所得培養(yǎng)物中的HCV復制子RNA或HCV顆粒。這里，檢測 是指定量培養(yǎng)物中的HCV復制子RNA或HCV顆粒的量。此時，培養(yǎng)物中不存在HCV復制子 RNA和HCV顆粒、或者與在受檢物質的不存在下相比少時，可以評價為上述受檢物質可以抑 制HCV的感染或復制。
[0142] 具體而言，例如，在受檢物質的存在下和不存在下，同時培養(yǎng)上述HCV顆粒和HCV 敏感性細胞，檢測所得培養(yǎng)物中的HCV復制子RNA或HCV顆粒，判定該受檢物質是否抑制 HCV復制子RNA的復制或HCV顆粒的形，從而可以篩選抗HCV物質。
[0143] 關于培養(yǎng)物中的HCV復制子RNA的檢測，可以列舉測定HCV亞基因組復制子RNA 所連接的外來基因的功能、即通過該基因的表達而表現(xiàn)出來的功能。例如，當外來基因為酶 時，通過計測其酶活性，可以檢測HCV復制子RNA。作為其他方法，通過利用定量的RT-PCR 定量已復制的RNA的量，也可以檢測HCV復制子RNA。
[0144] 檢測培養(yǎng)物中的HCV顆粒的存在時，通過使用抗構成釋放到培養(yǎng)上清中的HCV顆 粒的蛋白（例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白）的抗體進行檢測，或者用抗非結構蛋白的 抗體進行免疫染色，檢測感染細胞中的非結構蛋白的存在，或者利用使用了特異性引物的 RT-PCR法擴增培養(yǎng)上清中的HCV顆粒所含有的HCV基因組RNA并進行檢測，也可以間接檢 測HCV顆粒的存在。
[0145] 另外，當篩選中使用的HCV全基因組復制子RNA包含外來基因時，具體而言，例如 可以列舉：由從5'側到3'側的方向依次連接有S310A株突變體的HCV的5' UTR、核心蛋白 編碼序列的57個核苷酸、螢光素酶基因 、EMCV IRES序列、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼 序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列、NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋 白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3' UTR的RNA 構成的HCV全基因組復制子RNA。需要說明的是，在各核苷酸序列的連接中，在連接位點可 以包含限制酶切位點等添加序列。將上述HCV全基因組復制子RNA導入Huh7細胞中，得到 HCV顆粒，用該HCV顆粒感染HCV敏感性細胞，同時添加受檢物質，在48?72小時后測定螢 光素酶的活性。關于與未添加受檢物質相比抑制螢光素酶活性的物質，可以判定其具有抑 制HCV的感染的作用。在上述方法中，抗HCV物質被選擇作為可以抑制病毒感染或復制的 物質。
[0146] 另外，在上述方法中，還可以使用包含上述HCV全基因組復制子RNA或其核酸的病 毒基因組、以及含有上述HCV全基因組復制子RNA或其核酸作為病毒基因組的丙型肝炎病 毒。
[0147] 而且，本發(fā)明還提供含有上述丙型肝炎病毒顆粒（HCV顆粒）的丙型肝炎病毒疫苗 (HCV疫苗）。
[0148] 作為疫苗的用途，具體而言,還可以將上述HCV顆?；蚱湟徊糠种苯幼鳛橐呙鐏?使用，但優(yōu)選利用該領域已知的方法將其減毒或滅活后使用。病毒的滅活可以通過將福爾 馬林、丙內酯、戊二醛等滅活劑例如添加混合在病毒游離液中，使其與病毒反應而達成 (Appaiahgari, Μ· B. &Vrati，S·，Vaccine, 2004 年，第 22 卷，第 3669-3675 頁）。
[0149] 上述HCV疫苗可以制成溶液或懸浮液的任一種形式進行給藥?；蛘?，可以以適合 溶解或懸浮在液體中的固態(tài)物（例如冷凍干燥調整物）的形態(tài)來制備，使其在臨用前可以 重新構成。這樣的固態(tài)物或制備物可以乳濁、或者可以在脂質體中膠囊化。
[0150] 在HCV顆粒等活性免疫原性成分中，經(jīng)?？梢曰旌纤帉W上可接受的、適合于活性 成分的賦形劑。在適當?shù)馁x形劑中，例如有水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等或它們的混 合物。
[0151] 而且，如果需要，上述HCV疫苗可以含有少量的助劑（例如加濕劑或乳化劑）、pH 緩沖劑和/或提高疫苗效能的佐劑。
[0152] 佐劑是該免疫系統(tǒng)的非特異性刺激因子。它們會增強宿主對上述HCV疫苗的免疫 應答。因此，在優(yōu)選方式中，上述HCV疫苗包含佐劑。佐劑的效能通過測定通過給予由HCV 顆粒構成的疫苗而產生的抗體量即可確定。
[0153] 對有效的佐劑的例子沒有限定，包含下述佐劑：氫氧化鋁、N-乙酰基-胞壁 酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺（thr-MDP)、N-乙?；?正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨 酰胺（CGP11637、稱作nor-MDP)、N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨 酸-2- (Γ -2' -二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基）-乙胺（CGP19835A、稱作MTP-PE) 和RIBI。RIBI是在2%角鯊烯/Tween (注冊商標）80乳劑中含有從細菌中提取的3種成分、 即單磷脂A、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架（HPL+TDM+CWS)的佐劑。
[0154] 根據(jù)需要，可以在上述HCV疫苗中加入具有佐劑活性的一種以上的化合物。作為 該【技術領域】公知的佐劑的具體例子，可以列舉：弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、維生素 E、非離子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物油、植物油和卡波普（Carbopol)。作為特別適 合粘膜使用的佐劑，例如可以列舉大腸桿菌（E. coli)易熱性毒素（LT)或霍亂（Cholera) 毒素（CT)。作為其他適當?shù)淖魟?，例如可以列舉：氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁、油性乳劑（例 如Bayol (注冊商標）或Marcol 52(注冊商標））、皂苷或維生素 E增溶劑。
[0155] 上述HCV疫苗通常進行胃腸外給藥，例如通過皮下注射或肌肉內注射等注射進行 給藥。作為適合于其他給藥方式的其他處方，可以列舉栓劑和某種情況下的口服處方藥。
[0156] 在皮下、皮內、肌肉內、靜脈內給藥的注射劑中，作為與上述HCV疫苗在藥學上相 容的載體或稀釋劑的具體例子，可以列舉：穩(wěn)定化劑、碳水化合物（例如山梨醇、甘露醇、淀 粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血清或脫脂乳等含蛋白的物質、以及 緩沖液（例如磷酸緩沖液）。
[0157] 作為栓劑中使用的現(xiàn)有的粘合劑和載體，例如可以包含聚亞烷基二醇或三甘油。 這樣的栓劑可以由含有0. 5%?50%的范圍、優(yōu)選1%?20%的范圍的活性成分的混合物形 成?？诜幏剿幒型ǔＪ褂玫馁x形劑。作為該賦形劑，例如可以列舉：藥用級的甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
[0158] 上述HCV疫苗制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋處方藥或粉末劑的形 態(tài)，含有10%?95%、優(yōu)選25%?70%的活性成分（HCV顆粒或其一部分）。該HCV疫苗以適 合于給藥劑型的方法、以及具有預防和/或治療效果的量進行給藥。關于應該給藥的抗原 量，通常每次給藥為0. 01# g?100, 〇〇〇# g的范圍，但這取決于被給藥的患者、該患者的免 疫系統(tǒng)中的抗體合成能力和所期望的防御程度。另外，還取決于口服、皮下、皮內、肌肉內、 靜脈內給藥途徑等給藥途徑。
[0159] 另外，上述HCV疫苗可以按照單獨給藥時間表或聯(lián)合給藥時間表進行給藥。優(yōu)選 為聯(lián)合給藥時間表。按照聯(lián)合給藥時間表進行給藥時，接種開始時進行1~1〇的分別給藥， 接著按照維持和/或強化免疫應答所必需的時間間隔進行給藥，例如作為第2次給藥，可在 1~4個月后進行分別的給藥。根據(jù)需要，幾個月后可以繼續(xù)進行給藥。給藥的方案也至少部 分性地根據(jù)個體的必要性來決定，取決于醫(yī)生的判斷。上述HCV疫苗有下述的使用方法：將 其給予健康人，在健康人體內誘導對HCV的免疫應答，對于新的HCV感染則預防性使用。而 且，該疫苗還有下述的使用方法：將疫苗給予感染了 HCV的患者，在生物體內誘導對HCV的 強免疫反應，從而用作排除HCV的治療性疫苗。
[0160] 而且，上述HCV顆粒作為用于制作抗HCV抗體的抗原是有效的。通過將上述HCV 顆粒給予哺乳類或鳥類，可以制作抗體。作為哺乳類動物，可以列舉小鼠、大鼠、兔、山羊、綿 羊、馬、牛、豚鼠、單峰駝、雙峰駝、大洋駝等。單峰駝、雙峰駝和大洋駝適合于制作僅由Η鏈 構成的抗體。作為鳥類動物，可以列舉雞、鵝、鴕鳥等?？梢圆杉o予了上述HCV顆粒的動 物的血清，按照已知的方法獲得抗體。
[0161] 本發(fā)明還提供這些抗HCV抗體。優(yōu)選該抗HCV抗體可以用作能夠滅活HCV的中和 抗體。
[0162] 使用用上述HCV顆粒進行了免疫的動物的細胞，可以制作產生單克隆抗體產 生細胞的雜交瘤。雜交瘤的制造方法眾所周知，可以采用Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 年）中記載的方法。
[0163] 單克隆抗體產生細胞可以通過細胞融合來制作，還可以按照通過導入癌基因 DNA 或感染Epstein-Barr病毒使B淋巴細胞不死化的其他方法來制作。
[0164] 通過上述方法得到的單克隆抗體或多克隆抗體對HCV的診斷或治療、預防有效。
[0165] 使用上述HCV顆粒作為抗原而制作的抗體，其作為藥物可以和藥學上可接受的溶 解劑、添加劑、穩(wěn)定劑、緩沖液等同時給藥。給藥途徑可以是任一種給藥途徑，但優(yōu)選為皮 下、皮內、肌肉內給藥，更優(yōu)選靜脈內給藥。
[0166] 本發(fā)明還提供HCV的治療或預防方法，該方法包括：將上述的本發(fā)明的疫苗或抗 體給予需要治療的受檢體。
[0167] 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的疫苗或抗體的藥物組合物。該藥物組合物可以包含溶 解劑、添加劑、穩(wěn)定劑、緩沖液等藥學上可接受的載體。 實施例
[0168] 以下，列舉實施例，以更具體地說明本發(fā)明。但是，這些實施例是用于進行說明，并 不限制本發(fā)明的技術范圍。
[0169] (實施例1)野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA表達載體的構建 自感染了基因型3a的HCV的71歲的急性丙型肝炎患者分離HCV病毒株，命名為S310A 株。該患者在59歲時被診斷為感染了基因型3a的HCV，4年后由于肝硬化而接受了肝臟移 植。具體而言，使用Isogen-LS(Nippon Gene公司）從患者血清中提取RNA并進行純化， 使用隨機六聚體引物來合成cDNA。根據(jù)已知的4種基因型3a的HCV基因組的保守序列 (GenBank 檢索號 AF046866、D28917、X76918 和 D17763)設計 PCR 引物，使用已合成的 cDNA， 分成9個片段來擴增cDNA。對于不易得到擴增產物的5'末端的序列，利用5' RACE法得到 了擴增產物。將各片段克隆到測序用克隆載體、pGEM-T EASY(Pr〇mega公司）中。利用常規(guī) 方法分析這些克隆的核苷酸序列，確定S310A株的全長基因組RNA序列。利用常規(guī)方法合 成該全長基因組RNA所對應的cDNA片段。S310A株的全長基因組RNA序列所對應的cDNA 序列見 SEQ ID NO: 1。
[0170] 使用如上操作得到的自急性丙型肝炎患者分離的、作為新的基因型3a的HCV株的 S310A株的全長基因組RNA所對應的cDNA(全長基因組cDNA; SEQ ID NO: 1)的非結構區(qū)， 如下操作，構建作為HCV亞基因組復制子RNA表達載體的質粒pS310ASGR-Neo。S310A株的 全長基因組RNA、HCV亞基因組復制子RNA表達載體pS310ASGR-Neo和由該表達載體表達的 HCV亞基因組復制子RNA的結構見圖1。需要說明的是，為了與包含氨基酸突變的突變體進 行區(qū)別，在本發(fā)明中，將不包含氨基酸突變的S310A株稱作野生型S310A株。
[0171] 野生型S310A株的全長基因組的核苷酸序列見SEQ ID N0: 1。另外，S310A株的 5'UTR的核苷酸序列見SEQ ID N0: 2、核心蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 3、E1蛋白編碼序 列見SEQ ID NO: 4、E2蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 5、p7蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 6、 NS2蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 7、NS3蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 8、NS4A蛋白編碼序列 見SEQ ID NO: 9、NS4B蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 10、NS5A蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 11、NS5B蛋白編碼序列見SEQ ID NO: 12、3'UTR的核苷酸序列見SEQ ID NO: 13。需要說 明的是，SEQ ID NO: 1?13中記載著DNA序列，但在意指RNA序列時，將各SEQ ID NO所 示核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u)。
[0172] 由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列（野生型S310A株的全長基因組序列）編碼的HCV 前體蛋白（多聚蛋白）的氨基酸序列見SEQ ID NO: 14。SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列 由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核苷酸編號341?9406(包含終止密碼子）編碼。另外， S310A株的前體蛋白中的NS3蛋白?NS5B蛋白的區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID N0: 15。該 SEQ ID NO: 15的氨基酸序列（NS3?NS5B區(qū)）對應于SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的 氨基酸第1033位?第3021位。
[0173] HCV亞基因組復制子RNA表達載體pS310ASGR_Neo的構建，根據(jù)Kato等人的文獻 (Gastroenterology, 2003年，第 125卷，第 1808-1817 頁）和國際公開第 04/104198 號 中所示的程序進行。
[0174] 具體而言，首先，將野生型S310A株的全長基因組RNA(圖1A)的cDNA在T7啟動 子的控制下插入質粒載體pUC19中，制作重組質粒pS310A。接著，用新霉素抗性基因（neo: 還稱作新霉素磷酸轉移酶基因）和EMCV IRES(腦心肌炎病毒的內部核糖體結合位點）取 代重組質粒PS310A的結構區(qū)（編碼核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白）和非結構區(qū) 的一部分，從而構建質粒pS310ASGR-Neo。將其命名為HCV亞基因組復制子RNA表達載體 pS310ASGR-Neo。
[0175] 圖1B顯示HCV亞基因組復制子RNA表達載體pS310ASGR-Neo的結構。在表達載 體pS310ASGR-Neo中，5' UTR、自核心蛋白編碼序列的N末端起57個核苷酸（HCV IRES)、 NS3?NS5B蛋白編碼序列和3'UTR是來自S310A株的序列。圖中，"T7"是指T7啟動子。 17啟動子是使用T7 RNA聚合酶由各表達載體轉錄HCV亞基因組復制子RNA所必需的序列 元件。"neo"表示新霉素抗性基因 ，"EMCV IRES"表示腦心肌炎病毒的內部核糖體結合位 點。"C"表示核心蛋白編碼序列、"E1"表示E1蛋白編碼序列、"E2"表示E2蛋白編碼序列、 "P7"表示p7蛋白編碼序列、"NS2"表示NS2蛋白編碼序列、"NS3"顯示NS3蛋白編碼序列、 "4A"顯示NS4A蛋白編碼序列、"4B"顯示NS4B蛋白編碼序列、"NS5A"顯示NS5A蛋白編碼 序列、以及"NS5B"顯示NS5B蛋白編碼序列。如圖1C所示，由表達載體pS310ASGR-Neo制 作的HCV亞基因組復制子RNA(S310A株的HCV亞基因組復制子RNA)是轉錄了 T7啟動子下 游的區(qū)的RNA。另夕卜，圖中的'?coRI"、"PmeI"、"SnaBI"和"XbaI"表示限制酶切位點。需 要說明的是，在圖9、10、12、14、16中，圖中的書寫也相同。
[0176] 表達載體pS310ASGR-Neo在T7啟動子的下游連接有S310A亞基因組復制子RNA 的cDNA。S310A株的HCV亞基因組復制子RNA的cDNA核苷酸序列見SEQ ID NO: 16。
[0177] (實施例2)野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA的制作 用限制酶Xbal切斷實施例1中構建的表達載體pS310ASGR-Neo。接著，在10?20// g 的Xbal切斷片段中加入20U綠豆核酸酶（總反應液量為50// L)，在30°C下培養(yǎng)30分鐘。 綠豆核酸酶是催化選擇性地分解雙鏈DNA中的單鏈部分使其變得平滑的反應的酶。通常， 直接使用上述Xbal切斷片段作為模板DNA，利用RNA聚合酶進行RNA轉錄時，合成在3'末 端過剩地添加有作為Xbal的識別序列的一部分的CUAG這4個核苷酸的復制子RNA。因此， 在本實施例中，通過用綠豆核酸酶處理Xbal切斷片段，從Xbal切斷片段中除去CTAG這4 個核苷酸。
[0178] 之后，對于包含Xbal切斷片段的綠豆核酸酶處理后的溶液，通過進行按照常規(guī)方 法的蛋白除去處理，純化除去了 CTAG這4個核苷酸的Xbal切斷片段，將其作為之后的反應 中使用的模板DNA。使用Ambion公司的MEGAscript (注冊商標），通過利用T7啟動子的轉 錄反應，在體外由該模板DNA合成RNA。具體而言，根據(jù)制造商的使用說明書調制20//L包 含0. 5?1. 0// g模板DNA的反應液，使其在37°C下反應3小時?16小時。
[0179] RNA合成結束后，在反應溶液中添加2U DNase I，在37°C下反應15分鐘，從而除去 模板DNA，再利用酸性苯酚進行RNA提取，從而獲得由pS310ASGR-Neo轉錄的野生型S310A 株的HCV亞基因組復制子RNA(圖1C) (SEQ ID N0: 16)。
[0180] (實施例3) S310A株的HCV亞基因組復制子復制細胞克隆的建立 利用電穿孔法將實施例2中制作的野生型S310A株的HCV亞基因組復制子RNA(1// g、 3//g、10//g或30//g)導入Huh7細胞中。將進行了電穿孔處理的Huh7細胞（3 X106個） 接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16小時?24小時后，向培養(yǎng)皿中添加 G418 (新霉素）。之后，每周交 換2次培養(yǎng)液，同時繼續(xù)培養(yǎng)。
[0181] 自接種時起培養(yǎng)21天后，用結晶紫將活細胞染色。其結果，關于導入了 10//g和 30// g的S310A株的HCV亞基因組復制子RNA的細胞，可以確認到集落形成（圖2)。集落 形成表示在該細胞中HCV亞基因組復制子RNA被復制。其結果顯示出：使用野生型S310A 株的基因組非結構區(qū)制作的HCV亞基因組復制子RNA在培養(yǎng)細胞中具有自主復制能力。
[0182] 關于確認到集落形成的、導入了上述HCV亞基因組復制子RNA的細胞，由上述的培 養(yǎng)21天后的培養(yǎng)皿進一步克隆活細胞的集落，繼續(xù)培養(yǎng)。通過這樣的集落的克隆，可以建 立10株細胞克隆。將這些細胞克隆命名為S310A亞基因組復制子復制細胞，另外，給各克 隆附上克隆編號（編號：1?10)。在如此操作而建立的細胞克隆中，導入的S310A株的HCV 亞基因組復制子RNA正在進行自主復制。
[0183] (實施例4) S310A亞基因組復制子復制細胞內的HCV亞基因組復制子RNA的拷貝 數(shù)的定量 使用建立的10個克隆（克隆編號：1?10)的S310A亞基因組復制子復制細胞，定量細 胞內的HCV亞基因組復制子RNA的拷貝數(shù)。HCV亞基因組復制子RNA的拷貝數(shù)的定量根據(jù) Takeuchi 等人的文獻（Gastroenterology, 1999 年，第 116 卷，第 636-642 頁）和 Kato 等人的文獻（Gastroenterology, 2003年，第125卷，第1808-1817頁）中所示的方法 進行。
[0184] 該方法是使用 TaqMan 探針法（Parkin Elmer 公司，Applied Biosystems 公司） 的檢測系統(tǒng)。具體而言，首先，利用常規(guī)方法從S310A亞基因組復制子復制細胞中提取總 RNA。接下來，使用rTth DNA聚合酶，由總RNA合成cDNA，以所合成的cDNA為模板，使用引 物5，-CGGGAGAGCCATAGTGG-3，（SEQIDN0:24)和5，-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3，（SEQID N0:25)進行PCR擴增。此時，加入具有核苷酸序列5'-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'（SEQ ID NO: 26)、且在其5'末端結合有作為熒光色素的6' -羧基-熒光素（FAM)、在3'末端結 合有作為猝滅劑的6'-羧基-四甲基-羅丹明（TAMRA)的探針。若該探針存在，則在擴增過 程中利用Taq聚合酶的5'核酸外切酶活性，與模板cDNA雜交的探針被分解，熒光色素從探 針中游離出來，猝滅劑所產生的抑制被解除，發(fā)出熒光。因此，使用ABI Prism 7700 (Parkin Elmer公司、Applied Biosystems公司）檢測該熒光，定量HCV亞基因組復制子RNA的拷貝 數(shù)。
[0185] 作為比較對照，使用導入了基因型2a的JFH-1株的HCV亞基因組復制子RNA的細 胞（JFH-1亞基因組復制子復制細胞）。需要說明的是，JFH-1株的HCV亞基因組復制子RNA 表達載體（其結構從5'側往3'側依次包含JFH-1株的HCV的5'非翻譯區(qū)（5' UTR)、核心 蛋白編碼區(qū)的5'末端的57個核苷酸的序列、新霉素抗性基因 、EMCV IRES序列、編碼NS3蛋 白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3'非翻譯區(qū)（3'UTR)) 的構建和HCV亞基因組復制子RNA的制作根據(jù)Kato等人的文獻（Gastroenterology, 2003 年，第125卷，第1808-1817頁）和國際公開第04/104198號中記載的方法實施。Huh7 細胞中的導入和拷貝數(shù)定量按照與上述相同的方法進行。
[0186] 定量結果見圖3。圖的橫軸的數(shù)字表示S310A亞基因組復制子復制細胞克隆的克 隆編號。另外，縱軸表示每1# g的細胞的總RNA在細胞內的HCV亞基因組復制子RNA的拷 貝數(shù)。需要說明的是，棒圖上部的數(shù)值表示各細胞內的HCV亞基因組復制子RNA的拷貝數(shù)。
[0187] 其結果，在建立的10個克隆的S310A亞基因組復制子復制細胞中，檢測到與JFH-1 亞基因組復制子復制細胞同等或其以上的RNA拷貝數(shù)。顯示出：來自S310A株的HCV亞基 因組復制子RNA具有與JFH-1株的HCV亞基因組復制子RNA幾乎同等或其以上的復制能力。
[0188] (實施例5)抗病毒藥對S310A亞基因組復制子復制細胞中的復制子RNA復制的 效果 研究抗病毒藥對建立的S310A亞基因組復制子復制細胞（克?。┲械膹椭谱覴NA復制 的效果。
[0189] 將S310A亞基因組復制子復制細胞（克隆）和JFH-1亞基因組復制子復制細胞接 種在24孔板中，使達到每孔5 X 104個細胞，第二天，向孔中分別添加干擾素 -a (IFN-〃）、 作為NS3蛋白酶抑制劑的VX-950 (特拉匹韋（telaprevir)) (Lin等人，Journal of Biological Chemistry, 2004年，第 279 卷，第 17508-17514頁）和BILN-2061(Daniel 等人，Nature, 2003年，第426卷，第186-189頁）、以及作為NS5B聚合酶抑制劑的 JTK-109 (Hirashima 等人，Journal of Medicinal Chemistry, 2006 年，第 49 卷，第 4721-4736 頁）和PSI-6130 (Clark 等人，Journal of Medicinal Chemistry, 2005 年， 第48卷，第5504-5508頁），使之作用3天。之后，回收細胞，提取總RNA，按照與實施例4 相同的方法定量細胞內的HCV亞基因組復制子RNA的拷貝數(shù)。
[0190] 其結果見圖4?8。圖的橫軸表示添加的抑制劑的濃度。另外，縱軸表示HCV RNA 量的變化率，其表示以未添加抑制劑時（〇 IU或0 M)的每1// g細胞的總RNA的亞基因組 復制子RNA量為100%時，添加了抑制劑時的亞基因組復制子RNA量的比率（%)。關于各抑 制劑濃度，棒圖的最左的條（白）表示JFH-1亞基因組復制子復制細胞中的結果，左起第 二位的條（亮灰色）表示S310A亞基因組復制子復制細胞克隆6中的結果，左起第三位的 條（黑）表示S310A亞基因組復制子復制細胞克隆9中的結果，最右的條（暗灰色）表示 S310A亞基因組復制子復制細胞克隆10中的結果。
[0191] 使IFN-α作用的結果顯示出JFH-1和S310A亞基因組復制子RNA在細胞內的RNA 復制被IFN- a顯著抑制（圖4)。
[0192] 另一方面，關于作為NS3蛋白酶抑制劑的VX-950和BILN-2061，確認到對JFH-1亞 基因組復制子的復制抑制作用，但沒有抑制S310A亞基因組復制子的復制（圖5、6)。由此 暗示：基因型3a的NS3蛋白酶不同于基因型2a的NS3蛋白酶，其沒有被現(xiàn)有NS3蛋白酶抑 制劑抑制。
[0193] 另外，使作為NS5B聚合酶抑制劑的JTK-109和PSI-6130作用的結果，JFH-1亞基 因組復制子沒有受到JTK-109所帶來的RNA復制抑制，但在S310A亞基因組復制子中，通過 JTK-109分別確認到顯著的RNA復制抑制（圖7)。另一方面，使PSI-6130作用時，JFH-1和 S310A亞基因組復制子的RNA復制均濃度依賴性地受到抑制（圖8)。
[0194] 以上顯示出：本發(fā)明的基因型3a的亞基因組復制子適合作為評價抑制基因型3a 復制的藥物的工具。
[0195] 另外，還顯示出：來自基因型3a的HCV株的亞基因組復制子的復制能力受到不同 于來自基因型2a的HCV株的亞基因組復制子的復制能力的因素的影響。這并非是指本發(fā) 明的限定性的解釋，認為在基因型3a和2a中由HCV基因組編碼的聚合酶的結構不同，其結 果，藥物化合物的效果也不同。
[0196] (實施例6) S310A亞基因組復制子復制細胞內的HCV亞基因組復制子RNA的序列 分析 進行實施例3中建立的S310A亞基因組復制子復制細胞（克?。﹥却嬖诘腍CV亞基因 組復制子RNA的序列分析。
[0197] 首先，從建立的10個克隆和進一步添加的1個克隆共計11個克隆的S310A亞基 因組復制子復制細胞中提取總RNA，利用RT-PCR法擴增其中所含的HCV亞基因組復制子 RNA。在以由HCV亞基因組復制子RNA通過逆轉錄合成的cDNA為模板的PCR擴增中，使用 5, -TAATACGACTCACTATAG-3'（SEQ ID N0: 27)和 5, -GCGGCTCA CGGACCTTTCAC-3,（SEQ ID NO: 28)作為引物。將PCR擴增產物克隆到測序用克隆載體中，利用常規(guī)方法進行序列分 析。
[0198] 序列分析的結果，由S310A亞基因組復制子復制細胞內的HCV亞基因組復制子RNA 鑒定的適應性突變見表1。
[0199] [表 1]

【權利要求】
1. 核酸，該核酸依次包含：基因型3a的丙型肝炎病毒基因組的、包含SEQ ID NO: 1 的核苷酸編號1?340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)、編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號 1033?1663的NS3蛋白的氨基酸序列、氨基酸編號1664?1717的NS4A蛋白的氨基酸序 列、氨基酸編號1718?1978的NS4B蛋白的氨基酸序列、氨基酸編號1979?2430的NS5A 蛋白的氨基酸序列和氨基酸編號2431?3021的NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列、以 及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號9407?9655的核苷酸序列的3'非翻譯區(qū)，其中，當該 核酸為RNA時，將核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u)。
2. 權利要求1所述的核酸，其中， 上述編碼NS3蛋白的的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 3437?5329的核苷酸序列， 上述編碼NS4A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 5330?5491的核苷酸序列， 上述編碼NS4B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 5492?6274的核苷酸序列， 上述編碼NS5A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 6275?7630的核苷酸序列， 上述編碼NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 7631?9406的核苷酸序列。
3. 權利要求1或2所述的核酸，其中，上述5'非翻譯區(qū)在SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 1?340的核苷酸序列中包含1個或多個核苷酸的缺失、取代或添加。
4. 核酸，該核酸是在權利要求1?3中任一項所述的核酸的核苷酸序列中具有核苷 酸突變的核酸，以SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列為基準時，該核苷酸突變包括引起下述 (a)?（g)的至少一個氨基酸取代的核苷酸突變： (a) 第1286位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (b) 第2188位的蘇氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成組氨酸， (d) 第2210位的絲氨酸取代成異亮氨酸， (e) 第2496位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成賴氨酸。
5. 權利要求1?4中任一項所述的核酸，該核酸進一步包含丙型肝炎病毒基因組的、編 碼核心蛋白的核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列、編碼p7 蛋白的核苷酸序列和編碼NS2蛋白的核苷酸序列。
6. 權利要求5所述的核酸，其中， 編碼核心蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號1?191的核心蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼E1蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號192?383的E1蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼E2蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號384?752的E2蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼P7蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號753?815的p7蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 編碼NS2蛋白的核苷酸序列為編碼SEQ ID NO: 14的氨基酸編號816?1032的NS2 蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
7. 權利要求5所述的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 49?SEQ ID NO: 51中的任一個所不的核苷酸序列。
8. 權利要求4所述的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 17?SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 54中的任一個所不的核苷酸序列。
9. 丙型肝炎病毒的亞基因組復制子RNA，其包含權利要求1?4和8中任一項所述的 核酸。
10. 丙型肝炎病毒的全基因組復制子RNA，其包含權利要求5?7中任一項所述的核 酸。
11. 丙型肝炎病毒顆粒，其含有權利要求5?7中任一項所述的核酸作為病毒基因組。
12. 細胞，該細胞中導入有權利要求1?8中任一項所述的核酸。
13. 丙型肝炎病毒疫苗，該疫苗含有權利要求11所述的丙型肝炎病毒顆?；蚱湟徊?分。
14. 丙型肝炎病毒的抗體，該抗體將權利要求11的丙型肝炎病毒顆粒為抗原識別。
15. 篩選抗丙型肝炎病毒物質的方法，該方法包括下述步驟： 培養(yǎng)步驟，在受檢物質的存在下和不存在下，培養(yǎng)權利要求12所述的細胞、或權利要 求11所述的丙型肝炎病毒顆粒和丙型肝炎病毒敏感性細胞的混合物； 定量步驟，定量上述培養(yǎng)步驟中在培養(yǎng)物中得到的亞基因組復制子RNA、全基因組復制 子RNA或丙型肝炎病毒顆粒的量；以及 評價步驟，上述定量步驟的結果，當在受檢物質的存在下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中定量到的亞 基因組復制子RNA、全基因組復制子RNA或丙型肝炎病毒顆粒的量分別少于在上述受檢物 質的不存在下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中定量到的亞基因組復制子RNA、全基因組復制子RNA或丙型 肝炎病毒顆粒的量時，評價為上述受檢物質具有抗丙型肝炎病毒活性。
16. 權利要求5所述的核酸，其中，上述核酸為來自2個以上的丙型肝炎病毒株的基因 組的嵌合核酸，其從5'側往3'側依次包含： SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組以外的丙型肝炎病毒基因組的編碼核心蛋白的 核苷酸序列、編碼E1蛋白的核苷酸序列、編碼E2蛋白的核苷酸序列和編碼p7蛋白的核苷 酸序列； 編碼由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的序列構成的NS2蛋白的核苷酸序 列、編碼SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組以外的丙型肝炎病毒基因組的NS2蛋白的 核苷酸序列、或編碼由SEQ ID NO: 1的核苷酸編號2786?3436的核苷酸序列構成的NS2 蛋白的核苷酸序列的一部分與編碼SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組以外的丙型肝炎 病毒基因組的NS2蛋白的核苷酸序列的一部分連接而成的編碼嵌合型NS2蛋白的核苷酸序 列；以及 SEQ ID NO: 1中的、編碼由核苷酸編號3437?5329的序列構成的NS3蛋白的核苷 酸序列、編碼由核苷酸編號5330?5491的序列構成的NS4A蛋白的核苷酸序列、編碼由核 苷酸編號5492?6274的序列構成的NS4B蛋白的核苷酸序列、編碼由核苷酸編號6275? 7630的序列構成的NS5A蛋白的核苷酸序列和編碼由核苷酸編號7631?9406的序列構成 的NS5B蛋白的核苷酸序列。
17. 核酸，該核酸是在權利要求16所述的核酸的核苷酸序列中具有核苷酸突變的核 酸，以SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列為基準時，該核酸具有引起下述（a)?（g)中的至少 一個氨基酸取代的核苷酸突變： (a) 第1286位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (b) 第2188位的蘇氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成組氨酸， (d) 第2210位的絲氨酸取代成異亮氨酸， (e) 第2496位的蘇氨酸取代成異亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代成甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成賴氨酸。
18. 權利要求16或17所述的核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因組 以外的丙型肝炎病毒基因組的5'非翻譯區(qū)，以代替上述包含SEQ ID NO: 1的核苷酸編號 1?340的核苷酸序列的5'非翻譯區(qū)。
19. 丙型肝炎病毒的嵌合全基因組復制子RNA，其包含權利要求16?18中任一項所述 的核酸。
【文檔編號】C12Q1/02GK104126008SQ201280042305
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年8月31日 優(yōu)先權日:2011年8月31日
【發(fā)明者】脅田隆字, M.薩伊德, P.莫雷, C.岡迪奧, 橫川寬 申請人:日本國立感染癥研究所, 法國國家健康和醫(yī)學研究所, 東麗株式會社