肽癌抗原-特異性t細(xì)胞的受體基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了針對(duì)WT1蛋白的WT1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)基因的CDR3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和氨基酸序列。也提供的是使用所述核苷酸序列和氨基酸序列來(lái)測(cè)試和治療癌癥的方法；和用于檢測(cè)含有所述核苷酸序列和氨基酸序列的癌癥的芯片、引物組、試劑盒和裝置。
【專利說(shuō)明】肽癌抗原-特異性T細(xì)胞的受體基因
技術(shù)背景
[0001]本發(fā)明涉及癌抗原特異性T細(xì)胞的受體基因中所含的多核苷酸和由該多核苷酸編碼的肽，以及使用它們的例如診斷、預(yù)后或治療監(jiān)測(cè)等癌癥檢查和癌癥治療等。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥治療包括用手術(shù)摘除癌癥、放射治療、用抗癌藥治療和免疫療法。在這些治療中，免疫療法在近年來(lái)特別引人注意，因?yàn)槠鋵?duì)癌癥更具選擇性和特異性且?guī)缀鯖](méi)有副作用。其中，大力進(jìn)行了通過(guò)將大量存在于多種種類的癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞中的WTl蛋白作為靶標(biāo)來(lái)治療癌癥和白血病的探索。為了研究靶向WTl的抗癌治療的機(jī)理并進(jìn)一步提高治療效果，有必要鑒定WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)基因的核苷酸序列和由該核苷酸序列編碼的受體肽的氨基酸序列。然而，截至目前為止，雖然進(jìn)行了一些研究(參見(jiàn)例如專利文獻(xiàn)I和非專利文獻(xiàn)1-5)，但對(duì)那些受體基因和受體肽的序列及其使用都知之甚少。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn) I: WO 2008/108257 Al 非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) I: Valmori D.等人，J.1mmunol.168: 4231-4240，2002非專利文獻(xiàn) 2: Dietrich PY.等人，Cancer Res.61: 2047-2054，2001非專利文獻(xiàn) 3: Coulie PG`.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.98:10290-10295, 2001
非專利文獻(xiàn) 4: Godelaine D.等人.J.1mmunol.171: 4893-4897，2003 非專利文獻(xiàn) 5: Mandruzzato S.等人，J.1mmunol.169: 4017-4024，2002。
[0004]發(fā)明概述 發(fā)明要解決的問(wèn)題
本發(fā)明的目的是揭示針對(duì)WTl蛋白的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的氨基酸序列以及編碼它們的基因的核苷酸序列，特別是其CDR3區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，以及在癌癥檢查(診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測(cè)等)和癌癥治療中使用這些信息。
[0005]解決問(wèn)題的手段
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究并首次確定了健康個(gè)體和HLA-A*0201陽(yáng)性患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的⑶R3的核苷酸序列和氨基酸序列，并因而完成了本發(fā)明。具體地講，本發(fā)明人首次鑒定了識(shí)別WTl癌抗原肽(WTl蛋白的第126-134個(gè)氨基酸；RMFPNAPYL (SEQ ID N0.: 1543))的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)基因的堿基序列。
[0006]因此，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容:
(I)多核苷酸，其具有編碼WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列，其中所述多核苷酸具有下述的DNA、與該DNA互補(bǔ)的RNA、或其互補(bǔ)序列，所述DNA具有SEQ ID No: 1-756所示的任何⑶R3核苷酸序列；
(2)上述(I)的多核苷酸，其中所述多核苷酸由下述的DNA、與其互補(bǔ)的RNA、或其互補(bǔ)序列組成，所述DNA由SEQ ID No: 1-756所示的任何⑶R3核苷酸序列組成；
(3)肽，其具有WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的⑶R3的氨基酸序列，其中所述肽具有SEQ ID No: 757-1512所示的任何⑶R3氨基酸序列；
(4)上述(3)的肽，其由SEQID No: 757-1512所示的任何CDR3氨基酸序列組成；
(5)(I)或⑵的多核苷酸、或(3)或(4)的肽作為癌標(biāo)志物的用途；
(6)在HLA-A*0201-陽(yáng)性患者中診斷癌癥的方法,包括評(píng)估在治療前得自所述患者的樣品中的WTl特異性CTL的克隆性(clonality)，所述WTl特異性CTL具有(I)或(2)的任何多核苷酸或者(3)或(4)的任何肽，其中在具有多重克隆性的WTl特異性CTL存在的情況下，當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL的種類更多，或當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL的克隆性更高時(shí)，判定治療前該患者患癌癥的可能性更高；
(7)上述(6)的方法，其中當(dāng)具有任何CDR3多核苷酸或任何CDR3肽且具有3種以上的克隆性的WTl特異性CTL的克隆性更高，或當(dāng)具有3種以上克隆性的WTl特異性CTL的種類更多時(shí)，判定治療如該患者患癌癥的可能性更聞;
(8)檢測(cè)HLA-A*0201-陽(yáng)性患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的方法，其包括評(píng)估在治療前得自所述患者的樣品中的WTl特異性CTL的種類數(shù)量和克隆性，所述WTl特異性CTL具有(I)或(2)的任何多核苷酸或者(3)或(4)的任何肽，其中，當(dāng)所述患者中具有多重克隆性的WTl特異性CTL的種類比對(duì)所述免疫療法無(wú)反應(yīng)的受試者中更多時(shí)，判定該患者對(duì)WTl肽免疫療法具有敏感性；
(9)上述(8)的方法，其中在治療前患者中當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL克隆的種類越多或者克隆性越大時(shí)，判定該患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性越高；
(10)在HLA-A*2402-陽(yáng)性患者中監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的方法，其包括評(píng)估在免疫療法前后得自所述患者的樣品中的WTl特異性CTL克隆的克隆性，所述WTl特異性CTL克隆具有⑴或⑵的任何多核苷酸或者(3)或⑷的任何肽，其中當(dāng)任何WTl特異性CTL克隆的克隆性在免疫療法后比免疫療法前增加時(shí)，判定該患者對(duì)WTl肽免疫療法有反應(yīng)；
(11)上述(10)的方法，其中在WTl肽免疫療法之后，當(dāng)克隆性的增加率越大、或者具有增加的克隆性的克隆的種類越多時(shí)，判定患者對(duì)WTl肽免疫療法的反應(yīng)性越高；
(12)針對(duì)上述(3)或⑷的肽的抗體；
(13)芯片，其含有⑴或⑵的多核苷酸、(3)或⑷的肽、或者(12)的抗體；
(14)CDR3多肽擴(kuò)增用引物，其具有選自SEQID No: 1513-1538所示序列的序列；
(15)用于診斷癌癥的試劑盒、用于檢測(cè)患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的試劑盒、或用于監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測(cè)具有(I)或(2)的多核苷酸或者(3)或(4)的肽的WTl特異性CTL的工具(means)；
(16)用于診斷癌癥的裝置、用于檢測(cè)患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的裝置、或用于監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的裝置，所述裝置包括用于檢測(cè)具有(I)或(2)的多核苷酸或者(3)或⑷的肽的WTl特異性CTL的工具；
(17)上述(15)的試劑盒，其包含(13)的芯片或(14)的引物；(18)上述(16)的裝置，其中在所述裝置中使用(13)的芯片或(14)的引物；
(19)HLA-A*0201-陽(yáng)性癌癥患者的淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞中引入了含有⑴或⑵的多核苷酸序列的T細(xì)胞受體基因。
[0007]本發(fā)明還提供使用來(lái)自HLA-A*0201_陽(yáng)性患者的淋巴細(xì)胞的癌癥治療，其中將包含CDR3多核苷酸的T細(xì)胞受體基因引入到所述淋巴細(xì)胞中。
[0008]此外，本發(fā)明還提供針對(duì)⑶R3多肽的抗體及其用途。
[0009]發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)揭示了 WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈基因中所含的核苷酸序列以及由其編碼的肽的氨基酸序列，具體地講，揭示了 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列，使用這些多核苷酸和肽，可以進(jìn)行廣泛的癌癥檢查(診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測(cè)等)、有效的癌癥治療等。
[0010]附圖簡(jiǎn)述
[圖1-1]圖1-1顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆# ”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)?！懊Q”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和PT6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)N2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0011][圖1-2]圖1-2顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)。“名稱”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷`酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0012][圖1-3]圖1-3顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)?！懊Q”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)N2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0013][圖1-4]圖1-4顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)?！懊Q”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0014][圖1-5]圖1-5顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊 的數(shù)字表示參考編號(hào)。“名稱”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0015][圖1-6]圖1-6顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)?！懊Q”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。[0016][圖1-7]圖1-7顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)。“名稱”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0017][圖1-8]圖1-8顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)?！懊Q”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有 以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0018][圖1-9]圖1-9顯示本發(fā)明中已鑒定的健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆數(shù)(克隆性)等。在圖中，“克隆#”表示克隆號(hào)，點(diǎn)左邊的數(shù)字表示νβ鏈的家族號(hào)，點(diǎn)右邊的數(shù)字表示參考編號(hào)?！懊Q”一欄表示克隆所來(lái)自的受試者，HD1、HD2、HD3、HD4和HD5分別是指健康個(gè)體，而PT1、PT2、PT3、PT4、PT5和ΡΤ6是指實(shí)體癌患者并且分別是指患有以下癌癥的患者:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、盲腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細(xì)節(jié)。核苷酸序列由來(lái)源于V區(qū)、NI區(qū)、D區(qū)、(P)Ν2區(qū)或J區(qū)的各部分表示。核苷酸序列的右邊一欄表示構(gòu)成核苷酸序列的序列來(lái)自哪個(gè)區(qū)。各核苷酸序列編碼的氨基酸序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單字母密碼表示。氨基酸序列右邊兩欄是指各健康個(gè)體中的克隆性和各癌癥患者中的克隆性。最右邊一欄是指各克隆的總克隆性。
[0019][圖2-1]圖2-1概述了得自健康個(gè)體和HLA-A*0201_陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。[0020][圖2-2]圖2-2概述了得自健康個(gè)體和HLA-A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同。“細(xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0021][圖2-3]圖2-3概述了得自健康個(gè)體和HLA-A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0022][圖2-4]圖2-4概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同。“細(xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0023][圖2-5]圖2-5概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同。“細(xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0024][圖2-6]圖2-6概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞`受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同。“細(xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0025][圖2-7]圖2-7概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0026][圖2-8]圖2-8概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同。“細(xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0027][圖2-9]圖2-9概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同。“細(xì)胞#”是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0028][圖2-10]圖2-10概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#，，是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的或“**”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0029][圖2-11]圖2-11概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#，，是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0030][圖2-12]圖2-12概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL`)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#，，是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的“ ”或“ ** ”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0031][圖2-13]圖2-13概述了得自健康個(gè)體和HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖中，最左邊一欄“名稱”是指健康個(gè)體或癌癥患者，且各符號(hào)的含義與圖1中的相同?！凹?xì)胞#，，是指得自每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞編號(hào)。TRBV、TRBJ和TRBD分別與圖1的V名稱、J名稱和D名稱具有相同含義。在表不核苷酸序列時(shí),點(diǎn)被省略(圖1中未省略)。氨基酸序列右邊的或“**”是指排列了兩個(gè)以上的相同序列。
[0032]實(shí)施發(fā)明的方式
本發(fā)明人用由WTl肽/HLA-A*0201復(fù)合體組成的WTl四聚體對(duì)癌癥患者的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色，使用FACS —一分離WTl四聚體陽(yáng)性細(xì)胞；從分離的各細(xì)胞產(chǎn)生cDNA，通過(guò)應(yīng)用PCR法確定了編碼CDR3的核苷酸序列(圖1-1至1-9和圖2-1至2-13 ；SEQ ID No: 1-756)，所述CDR3包含在WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(以下可稱為“WT1特異性CTL”)的T細(xì)胞受體(以下可稱為“TCR”)的νβ鏈中。根據(jù)這些結(jié)果，還確定了 CDR3的氨基酸序列(圖1-1至1-9和圖2-1至2-13 ；SEQ ID No: 757-1512)。這些序列是由本發(fā)明首次確定的。
[0033]因此，一方面，本發(fā)明提供多核苷酸，該多核苷酸具有編碼得自健康個(gè)體和HLA-A*0201-陽(yáng)性患者的WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的⑶R3的核苷酸序列，其中該多核苷酸具有有SEQ ID No: 1_756所示的任何⑶R3核苷酸序列的DNA、與該DNA互補(bǔ)的RNA、或其互補(bǔ)序列。如本文所用，這些DNA和RNA分子及其互補(bǔ)的多核苷酸統(tǒng)稱為“⑶R3多核苷酸”。例如，除了包含SEQ ID No: 1_756所示的核苷酸序列的DNA之外，⑶R3多核苷酸還包括含有這些序列的DNA。另外，例如，除了與含有SEQID No: 1-756所示的核苷酸序列的DNA互補(bǔ)的RNA之外，⑶R3多核苷酸還包括含有這些序列的RNA。此外，例如，⑶R3多核苷酸包括:具有所述DNA或RNA的序列的多核苷酸、以及與所述RNA互補(bǔ)的多核苷酸?！阿荝多核苷酸”包括具有編碼“⑶R3肽”的簡(jiǎn)并序列的那些。
[0034]另一方面，本發(fā)明提供具有WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的⑶R3的氨基酸序列的肽，其中⑶R3的氨基酸序列是SEQ ID No: 757-1512中任一個(gè)所示。如本文所用，這些肽統(tǒng)稱為“⑶R3肽”。例如，除了含有在SEQ ID No: 757-1512所示的任何⑶R3氨基酸序列的肽之外，⑶R3肽還包括含有這些⑶R3氨基酸序列的肽(例如νβ鏈肽或其一部分)。另外，由在SEQ ID No: 757-1512所示的氨基酸序列組成或包含該序列的肽也包括在“⑶R3肽”中，該序列中一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選1-3個(gè)、I個(gè)或2個(gè)、或I個(gè))氨基酸被取代、添加或缺失SEQ ID No。然而，要求這些肽與原來(lái)的肽具有同等功能。這些⑶R3肽是由上述⑶R3多核苷酸編碼的。
[0035]CDR3區(qū)是最多樣化的部分，也是與抗原識(shí)別的特異性最密切相關(guān)的部分。因此，本發(fā)明的⑶R3多核苷酸序列和⑶R3肽序列被認(rèn)為是HLA-A*0201-陽(yáng)性患者中的WTl特異性CTL特有的。因此，只要編碼某T細(xì)胞的TCR νβ鏈基因的CDR3區(qū)的多核苷酸或?qū)?yīng)于CDR3區(qū)的肽具有本發(fā)明的多核苷酸或肽的序列，該T細(xì)胞就被認(rèn)為是WTl特異性的。因此，本發(fā)明的CDR3多核苷酸和CDR3肽可用作多種多樣的癌癥的標(biāo)志物，用于諸如癌癥診斷、患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的診斷、以及測(cè)試患者對(duì)WTl肽免疫療法的反應(yīng)性。
`[0036]只要是從含有WTl的細(xì)胞產(chǎn)生的癌癥，本發(fā)明的⑶R3多核苷酸和⑶R3肽就可存在于任何種類的癌癥患者的淋巴細(xì)胞中。已知WTl是多種癌癥和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的癌抗原。因此，本發(fā)明的CDR3多核苷酸和CDR3肽以及本發(fā)明的如下所述的方法，無(wú)論是否是實(shí)體癌或是血液系統(tǒng)癌癥，都可以適用于幾乎所有種類的癌癥，例如包括但不限于:諸如急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性髓細(xì)胞白血病、骨髓發(fā)育不良綜合征和移植同種的造血干細(xì)胞后的復(fù)發(fā)等血液惡性腫瘤；諸如舌癌、牙齦癌、口底癌、咽癌、喉癌、唾液腺癌和甲狀腺癌等實(shí)體癌癥；諸如乳癌、肺癌和胸腺癌等胸部癌癥；諸如結(jié)腸癌、小腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、膽管癌、胃腸道內(nèi)分泌腫瘤和胃腸道類癌等胃腸道癌癥；諸如腎癌、尿路上皮癌、生殖細(xì)胞瘤、維爾姆斯瘤、前列腺癌、子宮體癌、宮頸癌、子宮肉瘤和卵巢惡性腫瘤等泌尿及生殖道癌；諸如骨原發(fā)性惡性腫瘤(例如骨肉瘤和尤因肉瘤)和軟組織肉瘤等肌骨骼惡性腫瘤；諸如皮膚癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性惡性淋巴瘤、髓母細(xì)胞瘤和PNET等其他癌癥。
[0037]可以使用常規(guī)的基因工程技術(shù)和/或化學(xué)合成工序來(lái)制造⑶R3多核苷酸或⑶R3肽。例如，CDR3多核苷酸可從細(xì)胞中分離或經(jīng)化學(xué)合成。CDR3多核苷酸也可以使用諸如PCR等已知的方法來(lái)擴(kuò)增。另外，例如，可以將CDR3多核苷酸(任選使用已知的方法擴(kuò)增到合適水平)整合至合適的載體中并引入到合適的細(xì)胞中，或者可以采用生物射彈轟擊或電穿孔而引入到合適的細(xì)胞中。然后，對(duì)引入了 CDR3多核苷酸的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以表達(dá)，從而獲得CDR3多核苷酸或肽?？捎玫妮d體和細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)移的條件、培養(yǎng)條件以及分離基因和肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可適當(dāng)選擇使用。化學(xué)合成可用于制造CDR3多核苷酸或CDR3肽。這類化學(xué)合成法是已知的，基因的化學(xué)合成法包括使用amidite的固相DNA合成以及1-4膦酸酯法；肽的化學(xué)合成法包括Fmoc法。
[0038]因此，又一方面，本發(fā)明提供診斷HLA-A*0201_陽(yáng)性患者的癌癥的方法，該方法包括評(píng)估在治療前得自所述患者的樣品中的、具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL的克隆性，其中在具有多重克隆性的WTl特異性CTL存在的情況下，當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL的種類更多，或當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL的克隆性更高時(shí)，判定治療前該患者患癌癥的可能性更高。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“克隆性”是指檢測(cè)到具有相同核苷酸序列或者氨基酸序列的細(xì)胞的頻率。為了考察克隆性，一般使用可以識(shí)別單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞分選儀?！盎颊摺卑ū粦岩捎邪┌Y和患有癌癥的人。當(dāng)進(jìn)行所述方法時(shí)，可將具有多重克隆性的WTl特異性CTL的種類或具有多重克隆性的WTl特異性CTL的克隆性與未患癌癥的人進(jìn)行比較。
[0039]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢查患者中具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL的克隆性，可以判定該患者是否患有癌癥。從圖1-1至1-9和2-1至2-13可知，在健康個(gè)體(HDl至HD5)中，具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL的克隆性對(duì)幾乎所有的克隆為1，對(duì)少數(shù)克隆為2或3，對(duì)更少數(shù)克隆為4 (僅I個(gè)克隆)；然而，相比之下，在治療前的所有癌癥患者(PTl至PT6)都無(wú)一例外地具有多重克隆性，所述克隆性為具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL的克隆性。與健康個(gè)體相比，其克隆性的數(shù)目更大，這樣的細(xì)胞種類也更多。治療前患者中的克隆性的增加以及具有多重克隆性的細(xì)胞種類的增加，表 明了患者體內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞的防護(hù)與攻擊已經(jīng)開(kāi)始的可能性。
[0040]鑒于這些結(jié)果，如果在檢查來(lái)自受試者的樣品時(shí)，在具有任何⑶R3多核苷酸或⑶R3肽的WTl特異性CTL中發(fā)現(xiàn)多重克隆性，就可以判定患者有患癌癥的可能性。此外，治療前受試者中的具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL的克隆性越大，或者具有多重克隆性的WTl特異性CTL的種類越多，那么可以判定受試者患癌的可能性越高。另外，在上述判定方法中，當(dāng)治療前患者中的具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽且具有3種以上的克隆性的WTl特異性CTL的克隆性越大，或者當(dāng)具有3種以上的克隆性的WTl特異性CTL的種類越多，那么可以判定患者患癌的可能性越高。
[0041]又一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)HLA-A*0201_陽(yáng)性患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的方法，該方法包括評(píng)估在治療前得自所述患者的樣品中的、具有權(quán)利要求1的任何多核苷酸或權(quán)利要求2的任何肽的WTl特異性CTL的克隆的克隆性和種類數(shù)目，其中當(dāng)該患者中具有多重克隆性的WTl特異性CTL克隆的種類比無(wú)反應(yīng)的受試者中更多時(shí)，則該患者被判定為對(duì)WTl肽免疫療法具有敏感性。
[0042]具有任何CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL在患者中起到抵抗癌細(xì)胞的作用。在這個(gè)過(guò)程中，認(rèn)為治療前已具有多重克隆性的克隆通過(guò)WTl肽免疫療法可進(jìn)一步增加克隆性或者保持其克隆性。還認(rèn)為，當(dāng)有盡可能多種類的克隆，使得在總體上有效的WTl特異性CTL克隆的數(shù)目和種類增加時(shí)，WTl免疫療法更有可能成功。更嚴(yán)格地說(shuō)，當(dāng)患者中的具有多重克隆性的WTl特異性CTL克隆的種類比無(wú)反應(yīng)受試者中更多時(shí)，可以判定該患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性高。
[0043]某一克隆的克隆性的增加顯示出WTl肽免疫療法在一定時(shí)期奏效。即使某些克隆的克隆性可能暫時(shí)增加而之后下降，其他WTl特異性CTL的克隆性也可增加以補(bǔ)充其效果?？紤]到對(duì)癌細(xì)胞的效果，更希望克隆性有較大的增加。因此，在WTl肽免疫療法之后，克隆性的增加越大、或具有增加的克隆性的克隆的種類越多，可以認(rèn)為對(duì)WTl肽免疫療法的反應(yīng)性高。
[0044]又一方面，本發(fā)明提供用于在HLA-A*0201_陽(yáng)性患者中監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的方法，該方法包括評(píng)估在治療前后得自所述患者的樣品中的、具有權(quán)利要求1的任何多核苷酸或權(quán)利要求2的任何肽的WTl特異性CTL克隆的克隆性，其中當(dāng)任何WTl特異性CTL克隆的克隆性在治療后比治療前增加時(shí)，則該患者被判定為對(duì)WTl肽免疫療法有反應(yīng)。
[0045]由于WTl肽免疫療法而增加其克隆性的克隆的存在表明對(duì)WTl肽免疫療法的反應(yīng)性。換句話說(shuō)，克隆性的增加表明WTl肽免疫療法在一定時(shí)期奏效。這些克隆性的增加可以是暫時(shí)性的或持續(xù)性的。如果某些克隆的克隆性可能僅暫時(shí)增加而之后下降，那么其他WTl特異性CTL的克隆性將增加以補(bǔ)充其效果?？紤]到對(duì)癌細(xì)胞的效果，更希望克隆性有較大的增加。因此，在WTl肽免疫療法之后，克隆性的增加越大、或具有增加的克隆性的克隆的種類越多，可以判定患者對(duì)WTl肽免疫療法的反應(yīng)性越高。根據(jù)癌癥的種類和部位,可使用適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)檢查癌細(xì)胞的數(shù)目及性質(zhì)。
[0046]在上述監(jiān)測(cè)治療的方法中，雖然比較WTl肽免疫療法前后的克隆性,但治療前后的時(shí)間間隔可以是任何長(zhǎng)度。例如，可以是幾天、I周、2周、3周、4周、2個(gè)月、3個(gè)月或更長(zhǎng)。
[0047]在上述本發(fā)明的方法中，用于評(píng)估克隆性和確定克隆的種類(即確定CDR3肽的氨基酸序列或編碼其的核苷酸序列)的工具和方法是本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地進(jìn)行這些操作。例如,如本說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施例所示,可使用FACSAria系統(tǒng)等已知的分選裝置、以及諸如PCR等基因擴(kuò)增方法(例如使用選自表1中所列序列的引物組)。為了以更嚴(yán)格或更明確的方式分析本發(fā)明的CDR3多核苷酸或CDR肽，人們只需確認(rèn)在V β鏈基因的⑶R3的核苷酸序列、IMGT、J區(qū)和D區(qū)是否示于圖1-1至1_9和2_1至2_13即可。這種確認(rèn)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)。
[0048]WTl肽免疫療法也是已知的。例如，可通過(guò)對(duì)HLA-A*0201_陽(yáng)性患者，經(jīng)例如透皮途徑給予HLA-A*0201限制性WTl肽(例如WTl126:氨基酸序列:RMFPNAPYL (SEQ ID No:1543)或WTl187:氨基酸序列:SLGEQQYSV (SEQ ID No: 1544))來(lái)進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，單劑量是μ g/kg體重至mg/kg體重的數(shù)量級(jí)，可以以一周至數(shù)周的間隔給藥。
[0049]又一方面，本發(fā)明提供含有CDR3多核苷酸或與其互補(bǔ)的多核苷酸的芯片；含有⑶R3肽的芯片；或者含有針對(duì)⑶R3肽的抗體的芯片。這些芯片可以是微芯片、微列陣等形式。這些芯片的生產(chǎn)可以按常規(guī)方法進(jìn)行；例如，可以在玻璃基底上固定針對(duì)CDR3多核苷酸或⑶R3肽而產(chǎn)生的抗體。固定在芯片上的⑶R3多核苷酸或與其互補(bǔ)的多核苷酸、⑶R3肽或針對(duì)CDR3肽的抗體的種類可以是一種至全部種類；優(yōu)選將全部種類都固定，以進(jìn)行全面分析。例如，可以將包含與SEQ ID No: 1-756所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的所有種類的多核苷酸都固定在芯片上；備選地，例如，還可以將特異性地識(shí)別并結(jié)合包含SEQID No: 757-1512所示的氨基酸序列的所有肽的抗體都固定在芯片上。可將⑶R3多核苷酸或與其互補(bǔ)的多核苷酸、⑶R3肽、針對(duì)⑶R3肽的抗體放置在芯片上的任何位置。[0050]這些芯片可用于例如上述的癌癥診斷。樣品可以是患病組織、諸如血液和淋巴液等體液、或黏膜。優(yōu)選樣品是外周血。例如，當(dāng)分析CDR3多核苷酸時(shí)，按常規(guī)方法從細(xì)胞中提取核酸，使用其上固定了包含與SEQ ID No: 1-756所不的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的所有種類的多核苷酸的芯片，可以檢查樣品中存在的雜交DNA的種類和數(shù)量。另外，例如，當(dāng)分析CDR3肽時(shí)，使用其上固定了抗體的芯片，可以檢查樣品中存在的特異性結(jié)合的肽的種類和數(shù)量，所述抗體特異性地識(shí)別并結(jié)合包含SEQ ID No: 757-1512所示的氨基酸序列的所有種類肽。
[0051]在這一點(diǎn)上，本發(fā)明提供特異性地識(shí)別⑶R3肽并與之結(jié)合的抗體。優(yōu)選這類抗體特異性地識(shí)別并結(jié)合SEQ ID No: 757-1512所示的任何氨基酸序列。制備這樣的抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0052]典型地，樣品中的DNA或置于芯片上的DNA序列被標(biāo)記以指示雜交的有無(wú)和雜交量。例如，可以通過(guò)將針對(duì)SEQ ID No: 757-1512的CDR3肽的各抗體在芯片上陣列并測(cè)試其與樣品中存在的CDR3肽的特異性結(jié)合，鑒定樣品中的CDR3肽的存在與否或種類。典型地，樣品中的肽或芯片上的抗體被標(biāo)記，使得可以判定特異性結(jié)合的存在與否。能夠指示雜交或特異性結(jié)合的存在與否以及量的標(biāo)記是已知的，包括例如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)和發(fā)色團(tuán)標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地選擇合適的標(biāo)記。上述芯片可用于同時(shí)分析多個(gè)樣品。
[0053]可以使用諸如DNA印跡法、RNA印跡法、菌落雜交和ELISA等已知方法，以及利用上述芯片，分析和鑒定本發(fā)明的⑶R3多核苷酸和⑶R肽。
[0054]如上所述，使用實(shí)施例中所示的引物、特別是表1所示的引物組，已鑒定了本發(fā)明的⑶R3 DNA。因此，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增⑶R多核苷酸的引物，所述引物具有選自SEQ IDNo: 1513-1538所示序列的序列。例如，含有SEQ ID No: 3391-3415所示引物的引物組可用于CDR3核苷酸的擴(kuò)增。
[0055]本發(fā)明還提供含有用于檢測(cè)具有⑶R3多核苷酸或⑶R3肽的WTl特異性CTL的工具的、用于診斷癌癥的試劑`盒；用于測(cè)試患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的試劑盒；或用于監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的試劑盒。本發(fā)明還提供含有用于檢測(cè)具有CDR3多核苷酸或CDR3肽的WTl特異性CTL的工具的、用于診斷癌癥的裝置；用于測(cè)試癌癥患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的裝置；或監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的裝置。諸如上述引物組等用于擴(kuò)增基因的部分，上述芯片或用于分析得自芯片的信息的工具，可作為構(gòu)成成分用于試劑盒中，或用于裝置中。
[0056]再一方面，本發(fā)明涉及來(lái)自HLA-A*0201_陽(yáng)性患者的淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞摻入了含有⑶R3多核苷酸序列的T細(xì)胞受體基因。HLA-A*0201-陽(yáng)性個(gè)體包括未患癌癥的人和癌癥患者。HLA-A*0201-陽(yáng)性個(gè)體可以是例如健康個(gè)體、骨髓移植供體或癌癥患者。優(yōu)選所述淋巴細(xì)胞是外周血淋巴細(xì)胞，所述外周血淋巴細(xì)胞中引入了含有本發(fā)明的CDR3多核苷酸的WTl特異性CTL的TCR的V β鏈基因、以及WTl特異性CTL的TCR的V α鏈基因。在制備這樣的外周血淋巴細(xì)胞時(shí)，WTl特異性CTL的TCR的νβ鏈的單種基因可用于獲得多種外周血淋巴細(xì)胞，其繼而被引入患者體內(nèi)。然而，從改善治療效果的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用WTl特異性CTL的TCR的νβ鏈的多種基因以獲取多種外周血淋巴細(xì)胞，其繼而被引入到患者體內(nèi)。或者，優(yōu)選根據(jù)個(gè)體情況選擇待引入的合適基因的核苷酸序列，因?yàn)榛蛑械闹委熡行У暮塑账嵝蛄锌梢蚧颊吆桶┌Y種類而異。另外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)癌癥的“治療”不僅包括例如抑制癌癥進(jìn)展、減少癌癥、消除癌癥等處理，而且也包括預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。
[0057]制備待引入的基因的方法和將基因引入外周血淋巴細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以將待引入的基因整合到合適的載體中，然后再引入合適的細(xì)胞中，或者可以通過(guò)生物射彈轟擊和電穿孔而引入到合適的細(xì)胞中。基因轉(zhuǎn)移和細(xì)胞培養(yǎng)的其他條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。
[0058]將如上所述已引入基因的淋巴細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，以獲得大量的WTl特異性CTL。然后，可將所得的WTl特異性CTL引入到癌癥患者中，以殺滅表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞，從而進(jìn)行癌癥治療。當(dāng)進(jìn)行這類癌癥治療時(shí)，優(yōu)選將基因如上所述地引入得自應(yīng)當(dāng)進(jìn)行治療的癌癥患者的外周血淋巴細(xì)胞中，并將所得WTl特異性CTL引入同一癌癥患者中。
[0059]可將上述癌癥治療與包括抗癌藥物及放射治療在內(nèi)的其他癌癥治療聯(lián)用。上述癌癥治療具有廣泛的應(yīng)用。它們?cè)谏衔氖抢拘缘模窍拗菩缘摹?br> [0060]再一方面，本發(fā)明提供針對(duì)CDR3肽的抗體及其使用方法。制備這樣的抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。這樣的抗體可以用于檢測(cè)或鑒定受試者樣品中的淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞在其νβ鏈中具有本發(fā)明的CDR3肽的氨基酸序列或包含上述序列的氨基酸序列。例如，針對(duì)含有SEQ ID No: 757-1512的任何氨基酸序列的肽的抗體可用于檢測(cè)或鑒定癌癥特異性淋巴細(xì)胞。這些抗體也可用于實(shí)施本發(fā)明的方法，例如，用于診斷癌癥的方法。
[0061 ] 這種抗體還可以與具有本發(fā)明的CDR3氨基酸序列的淋巴細(xì)胞接觸以激活它們。由此激活的淋巴細(xì)胞可用于治療癌癥。優(yōu)選將得自癌癥患者的淋巴細(xì)胞激活，必要時(shí)，使其增殖，并通過(guò)將淋巴細(xì)胞返給患者以進(jìn)行癌癥治療。這樣的抗體還可以用于富集目標(biāo)WTl特異性T細(xì)胞。例如，這樣的抗體可以用于在癌癥患者中富集WTl特異性T細(xì)胞，從而輔助癌癥治療。
[0062]又一方面，本發(fā)明提供用于鑒定實(shí)體癌癥的位置和大小的方法，該方法包括:在用可檢測(cè)標(biāo)記作標(biāo)記之后，給予上述的本發(fā)明的外周血淋巴細(xì)胞，然后檢查所述標(biāo)記的位置和數(shù)量。所述標(biāo)記可以是已知標(biāo)記，例如锝-99等放射性標(biāo)記，以及突光標(biāo)記。用于標(biāo)記細(xì)胞的方法也是已知的。標(biāo)記的檢測(cè)和信號(hào)的定量測(cè)定也是本領(lǐng)域已知的；它們可以通過(guò)使用輻射計(jì)數(shù)器、熒光測(cè)定、或者通過(guò)活組織檢查取得組織標(biāo)本來(lái)進(jìn)行。
[0063]下文參考實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但應(yīng)該理解，本發(fā)明不視為限于此。
[0064]實(shí)施例1
Α.實(shí)驗(yàn)方法和所用材料
(I)細(xì)胞樣品
外周血樣品得自5個(gè)健康志愿者(HDl至HD5)和6個(gè)HLA_A*0201-陽(yáng)性實(shí)體癌患者(PTl至PT6)。健康個(gè)體和癌癥患者的HLA等位基因是:HD1:0201/2402, HD2:0201/0206,HD3:0201/2602, HD4:0201/3303, HD5:0201/2402, PTl:0201/2402, PT2:0201/2402,PT3:0201/2402, PT4:0201/2402, ΡΤ5:0201/2402, PT6:0201/2402。將所得外周血樣品進(jìn)行Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala,瑞典)密度梯度離心,分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)并冷凍儲(chǔ)存在-170° C，直到使用。
[0065](2)流式細(xì)胞術(shù)分析和分選
首先，將每一樣品2 X IO6 PBMC在FACS緩沖液(含2%胎牛血清的PBS)中在37°C用PE綴合的HLA-A*0201-WT1 126-134四聚體(MBL，東京，日本)染色30分鐘。然后，在暗處，在冰上，用下述的5種不同熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)它們?nèi)旧?5分鐘:FHC-標(biāo)記的抗CD4、CD14、CD16、CD19 和 CD56、抗 CD3-PerCP、抗 CD8-APC-Cy7 (BD Bioscience, San Jose, CA)、抗CD45RA-APC 和抗 CCR7_PE_Cy7 (BD Pharmingen, San Diego, CA)。將染色的細(xì)胞用 FACS 緩沖液洗滌兩次。使用FACSAria系統(tǒng)(BD Biosciences)進(jìn)行分選，并使用FACSDiva軟件(BDBiosciences)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果，從CD4_CD14_CD16_CD19_CD56_-細(xì)胞的級(jí)分中得到單一的HLA-A*0201-WT1126_134 四聚體 +CD3+CD8+ 細(xì)胞，它們被定義為 WTl-Tet+ 細(xì)胞。
[0066](3)從分選的單一細(xì)胞合成TCR-β鏈的cDNA
在含有反應(yīng)混合物(反應(yīng)體積20 μ I)的PCR管中直接分選如上所述地獲得的單一WTl-Tet+細(xì)胞，通過(guò)在50°C孵育90分鐘進(jìn)行cDNA合成，然后將樣品在95°C孵育5分鐘，用于終止反應(yīng)。RT反應(yīng)溶液的組成見(jiàn)表1。
[0067]
【權(quán)利要求】
1.多核苷酸，其具有編碼WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ鏈的CDR3的核苷酸序列，其中所述多核苷酸具有下述的DNA、與該DNA互補(bǔ)的RNA、或其互補(bǔ)序列，所述DNA具有SEQ ID No: 1-756所示的任何⑶R3核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸由下述的DNA、與其互補(bǔ)的RNA、或其互補(bǔ)序列組成，所述DNA由SEQ ID No: 1-756所示的任何⑶R3核苷酸序列組成。
3.肽，其具有WTl特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的T細(xì)胞受體(TCR)的Vβ鏈的CDR3的氨基酸序列，其中所述肽具有SEQ ID No: 757-1512所示的任何⑶R3氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的肽，其由SEQID No: 757-1512所示的任何⑶R3的氨基酸序列組成。
5.權(quán)利要求1或2的多核苷酸、或權(quán)利要求3或4的肽作為癌標(biāo)志物的用途。
6.在HLA-A*0201-陽(yáng)性患者中診斷癌癥的方法，其特征在于，評(píng)估在治療前得自所述患者的樣品中的WTl特異性CTL的克隆性，所述WTl特異性CTL具有⑴或⑵的任何多核苷酸或者(3)或(4)的任何肽，其中在具有多重克隆性的WTl特異性CTL存在的情況下，當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL的種類更多，或當(dāng)具有多重克隆性的WTl特異性CTL的克隆性更聞時(shí)，判定治療如該患者患癌癥的可能性更聞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中當(dāng)具有任何CDR3多核苷酸或任何CDR3肽且具有3種以上克隆性的WTl特異性CTL的克隆性更高，或當(dāng)具有3種以上克隆性的WTl特異性CTL的種類更多時(shí)，判定治療如該患者患癌癥的可能性更聞。
8.針對(duì)權(quán)利要 求3或4的肽的抗體。
9.芯片，其含有權(quán)利要求1或2的多核苷酸、權(quán)利要求3或4的肽、或者權(quán)利要求8的抗體。
10.CDR3多肽擴(kuò)增用引物，其具有選自SEQ ID No: 1513-1538所示序列的序列。
11.用于診斷癌癥的試劑盒、用于檢測(cè)患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的試劑盒、或用于監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測(cè)具有權(quán)利要求1或2的多核苷酸或者權(quán)利要求3或4的肽的WTl特異性CTL的工具。
12.用于診斷癌癥的裝置、用于檢測(cè)患者對(duì)WTl肽免疫療法的敏感性的裝置、或用于監(jiān)測(cè)WTl肽免疫療法的裝置，所述裝置包括用于檢測(cè)具有權(quán)利要求1或2的多核苷酸或者權(quán)利要求3或4的肽的WTl特異性CTL的工具。
13.權(quán)利要求11的試劑盒，其包含權(quán)利要求9的芯片或權(quán)利要求10的引物。
14.權(quán)利要求12的裝置，其中在所述裝置中使用權(quán)利要求9的芯片或權(quán)利要求10的引物。
15.HLA-A*0201-陽(yáng)性癌癥患者的淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞中引入了含有權(quán)利要求1或2的多核苷酸序列的T細(xì)胞受體基因。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103764826SQ201280042412
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月28日
【發(fā)明者】杉山治夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所