高滴度生產(chǎn)聚(α 1, 3葡聚糖)的制作方法
【專利摘要】公開了用于從蔗糖酶促制備聚(α1,3葡聚糖)的方法。來自唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfJ)用于將蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和聚(α1,3葡聚糖)。公開了施用半透膜連續(xù)除去gtf酶的副產(chǎn)物果糖，從而提高聚(α1,3葡聚糖)的滴度。
【專利說明】高滴度生產(chǎn)聚(ct 1, 3葡聚糖)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)多糖生產(chǎn)領(lǐng)域。具體地，它涉及經(jīng)由酶促反應(yīng)生產(chǎn)聚(α I, 3葡聚糖)。更具體地，它涉及提高在酶促反應(yīng)期間形成的聚(α 1，3葡聚糖)的滴度。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素是一種由葡萄糖經(jīng)由β (I, 4)糖苷鍵通過天然方法形成的多糖(AppliedFiber Science, F.Happeyj Ed.，Chapter 8，E.Atkins, Academic Press, New York,1979)，它作為纖維已經(jīng)獲得了商業(yè)上的聲譽，因為多種有用的產(chǎn)品由其制成。具體地，棉花是一種高純度形式的天然存在的纖維素，它在紡織品應(yīng)用方面的有益特性是熟知的。
[0003]纖維素在溶液中表現(xiàn)出充分的鏈延伸和主鏈剛度，形成液晶溶液(美國專利4，501，886)。然而，充分的多糖鏈延伸迄今已經(jīng)主要在β (I, 4)連接的多糖中完成。任何與葡聚糖多糖家族中的主鏈幾何形狀的顯著偏差將分子縱橫比降低至低于形成有序溶致液晶相所需的分子縱橫比的水平。另外，熟知的是重要的商業(yè)纖維素纖維如棉花和人造絲越來越多地出現(xiàn)與土地利用和環(huán)境印記相關(guān)的可持續(xù)性問題。
[0004]因此非常期望發(fā)現(xiàn)其他基于葡萄糖的多糖，其在膜、纖維和樹脂中具有實用性，這很大程度上是因為當前著重于從可再生資源中生產(chǎn)低成本的結(jié)構(gòu)材料。此外，此類聚合物提供在其整個壽命周期中環(huán)境友好的材料。
[0005]聚(a 1, 3葡聚糖)是一種葡聚糖聚合物，其特征在于具有α (1, 3)糖苷鍵，已經(jīng)通過接觸蔗糖水溶液與葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfj)分離出來，該酶分離自唾液鏈球菌{Streptococcus salivarius) (Simpson 等人,Microbiology, 141: 1451-1460,1995)。葡聚糖是指通過糖苷鍵連接的D-葡萄糖單體構(gòu)成的多糖。由聚(α 1, 3葡聚糖)制成的膜耐受高達150°C的溫度并提供對獲取自β (I, 4)連接的多糖聚合物的優(yōu)點(Ogawa等人，F(xiàn)iber Differentiation Methods,47: 353-362,1980)。
[0006]美國專利7,000,000公開了包含己糖單元的多糖纖維的制備，其中在聚合物內(nèi)至少50%的己糖單元經(jīng)由α (1, 3)糖苷鍵，利用唾液鏈球菌{Streptococcus salivarius)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶gtfj連接。本發(fā)明所公開的聚合物當它在溶劑或包含溶劑的混合物中以高于臨界濃度的濃度溶解時形成液晶溶液。從這一溶液中紡出高度適用于紡織品的連續(xù)的、高強度的、棉花樣纖維，并且以衍生形式或非衍生(再生)形式使用。美國專利7，000，000中的聚(α 1，3葡聚糖)以批量方法制備，其中聚(α 1, 3葡聚糖)的滴度通常小于25克聚(α 1, 3葡聚糖)/升反應(yīng)器體積。
[0007]可期望開發(fā)提高通過酶促反應(yīng)形成的聚(α 1, 3葡聚糖)的滴度的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明是從可再生原料中生產(chǎn)用于纖維、膜、和紙漿的聚(α 1, 3葡聚糖)的方法。聚合物直接在一步酶促反應(yīng)中使用重組葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfj)作為催化劑并使用蔗糖作為底物制備。[0009]在一個方面，本公開發(fā)明是用于在反應(yīng)體系中生產(chǎn)聚(α I, 3葡聚糖)的方法，該反應(yīng)體系包括通過半透膜分隔開的兩個室，其中:
a)第一室包含酶反應(yīng)溶液，所述酶反應(yīng)溶液包含: i)蔗糖；和
?)至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶；并且
b)第二室通過與酶反應(yīng)溶液接觸的半透膜與第一室分隔開，其中果糖和其他低分子量部分能夠透過半透膜，但聚(α 1，3葡聚糖)不能透過半透膜，這有利于在將聚(α I, 3葡聚糖)和至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶保留在第一室內(nèi)的同時連續(xù)去除果糖和其他低分子量部分。
[0010]在另一方面，本公開發(fā)明是其中通過至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶由蔗糖生產(chǎn)滴度為30-200克/升的聚(α 1，3葡聚糖)的方法。
[0011]DNA序列描述
SEQ N0.1是成熟葡糖基轉(zhuǎn)移酶的合成基因序列，其已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌(β.coli)中表達。
[0012]SEQ N0.2 是質(zhì)粒 pMP52 的 DNA 序列。
[0013]SEQ N0.3 是成熟葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfj 酶；EC 2.4.1.5 ；GENBANK? AAA26896.1)的DNA 序列，該酶來自唾液鏈球菌{Streptococcus salivarius、(ATCC 25975)。
【具體實施方式】
`[0014]聚(α I, 3葡聚糖)是潛在的低成本聚合物，其能夠利用唾液鏈球菌{Streptococcus salivarius)的gtfj酶,從可再生資源如鹿糖中酶促產(chǎn)生。已經(jīng)顯示選擇的包含具有α (I, 3)糖苷鍵的己糖單元的聚合物當在某些條件下溶解在溶劑中時能夠形成有序液晶溶液(美國專利7，000, 000)。此外，此類溶液能夠被紡成連續(xù)的、高強度的棉花樣纖維。在美國專利7，000，000中，使用分批酶促反應(yīng)，利用gtfj將蔗糖轉(zhuǎn)化成聚(α I,3葡聚糖)和副產(chǎn)物果糖與明串珠菌二糖，它們積聚在反應(yīng)器中。因為已知積聚的果糖在酶促反應(yīng)期間競爭葡糖基部分，可用的葡萄糖向聚(α 1，3葡聚糖)的轉(zhuǎn)化隨后受到阻礙，因此限制每單位反應(yīng)器體積期望產(chǎn)物的最終滴度。
[0015]如本文所用，術(shù)語“明串珠菌二糖”是指由通過α (I, 5)鍵連接的葡萄糖和果糖組成的二糖。
[0016]如本文所用，術(shù)語“葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)”是指由口腔鏈球菌如唾液鏈球菌{Streptococcus分泌的酶,其利用鹿糖糖苷鍵的高自由能合成聚(α I, 3葡聚糖)。糖苷鍵能夠連接兩個單糖形成二糖。糖苷鍵可為α或β構(gòu)型并且能夠產(chǎn)生例如 α (I, 2)、α (I, 3)、α (I, 4)、α (I, 6)、β (I, 2)、β (I, 3)、β (I, 4)或 β(I, 6)的鍵。如本文所用，術(shù)語“α (I, 3)糖苷鍵”是指通過在鄰近葡萄糖環(huán)上的環(huán)碳I和3彼此接合葡萄糖分子的一類共價鍵。
[0017]如本文所用，術(shù)語“聚(α I, 3葡聚糖)”是指高分子量的直鏈聚合物，其獲取自得自經(jīng)由α (I, 3)糖苷鍵連接的葡萄糖單元的多糖分子。
[0018]本發(fā)明涉及提高在使用一種或多種gtf酶的酶促反應(yīng)中由蔗糖制得的多糖、聚(α I, 3葡聚糖)的滴度的方法。術(shù)語“酶促反應(yīng)”是指通過gtf酶進行的反應(yīng)。本發(fā)明的“酶反應(yīng)溶液” 一般是指在緩沖溶液中包含至少一種gtf酶的反應(yīng)混合物，該緩沖溶液包含蔗糖和可能一種或多種引物以將蔗糖轉(zhuǎn)化成聚(a 1，3葡聚糖)。
[0019]在本發(fā)明中使用的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可為任何gtf酶。使用的gtf酶可來自任何鏈球菌istreprococci)。適用的gtf酶可為例如唾液鏈球菌(^Streptococcus salivarius)的gtfj、來自變異鏈球菌{Streptococcus mu tans)的gtfB和gtfC,以及來自汗毛鏈球菌{Streptococcusdownef)的gtf I。具體地，鏈球菌屬^Streptococcus)菌種可為唾液鏈球菌 ^Streptococcus salivarius) 0 更具體地，gtf 酶可為唾液鏈球菌 ^Streptococcussali varius)的 gtfj (E.C.2.4.1.5)酶。
[0020]在一個實施例中，酶反應(yīng)溶液可僅包含一種如本文所述的gtf?酶。在另一個實施例中，酶反應(yīng)溶液可包含多于一種類型的gtf酶的組合。
[0021]對于本發(fā)明而言，足量的gtfj酶可使用如實例中所述用于gtfj生產(chǎn)的重組大腸桿菌(￡ coli)菌株生產(chǎn)。設(shè)計密碼子優(yōu)化基因并在大腸桿菌iB.coli)中表達的方法是本領(lǐng)域為人們所熟知的。
[0022]用于培養(yǎng)重組微生物的方法是本領(lǐng)域為人們所熟知的。表達期望gtf?酶以實施本發(fā)明反應(yīng)的重組微生物可在任何容器中生長，諸如，例如:多種類型的燒瓶(帶擋板的和不帶擋板的)；任何能夠高溫高壓消毒的容器，其能夠進行密封和溫度控制；或者任何類型的發(fā)酵罐。在一個實施例中，在本發(fā)明中用于聚(a I, 3葡聚糖)生產(chǎn)的gtfj酶的生產(chǎn)可通過在發(fā)酵罐中培養(yǎng)表達gtfj酶的重組大腸桿菌0: coli) MG1655/pMP52來獲得。
[0023]在本發(fā)明中用作將蔗糖轉(zhuǎn)化成聚(a I, 3葡聚糖)的催化劑的唾液鏈球菌{Streptococcus sali varius) gtf J酶是依賴引物的gtf酶。如本專利申請所述的依賴引物的gtf酶是指在聚(a I, 3葡聚糖)合成期間需要在酶反應(yīng)溶液中存在用作酶引物的引發(fā)分子的gtf酶。因此本文所用術(shù)語“引物”是指能夠用作依賴引物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的引發(fā)劑的任何分子。多種其他的葡糖基轉(zhuǎn)移酶是不依賴引物的酶。不依賴引物的酶不需要存在實施反應(yīng)的引物。出于本發(fā)明的目的，可在聚(a 1，3葡聚糖)合成期間的相同酶促反應(yīng)體系中使用不依賴引物的酶、和/或依賴引物的gtf酶中的任一種或兩者。
[0024]gtfj是依賴引物的酶。在本發(fā)明中，葡聚糖是復(fù)合支化的葡聚糖，它用作gtfj酶的引物。雖然gtf是依賴引物的酶，利用該酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成聚(a 1，3葡聚糖)也可發(fā)生在缺乏引物的情況下。
[0025]通過唾液鏈球菌{Streptococcus sali varius)的gtf J酶生產(chǎn)聚(a I, 3葡聚糖)受到其副產(chǎn)物果糖的抑制。當果糖在酶反應(yīng)溶液中積聚時，它可能通過據(jù)推測競爭可用的葡糖基部分抑制聚(a 1，3葡聚糖)的酶促產(chǎn)生，這導(dǎo)致形成二糖，明串珠菌二糖。在本發(fā)明中，為了降低對果糖gtfj的效應(yīng)，可連續(xù)除去酶反應(yīng)溶液中的果糖以防止它在酶反應(yīng)溶液中積聚至抑制水平。出于本發(fā)明的目的，反應(yīng)體系可包括半透膜，其分隔第一室中包含的酶反應(yīng)溶液(其包含一種或多種gtf酶、一種或多種引物和蔗糖)與第二室中包含的圍繞緩沖液。如本文所用，術(shù)語“室”是指能夠保持酶反應(yīng)溶液或酶反應(yīng)溶液的產(chǎn)物的任何容器。室可由能夠保持酶反應(yīng)溶液的玻璃、塑料、金屬、膜、隔膜或任何其他類型的惰性材料制成。如本文所用，術(shù)語“半透膜”是指將允許某些分子或離子通過擴散作用通過，同時保留一些其他分子的膜?；旧暇哂性?2，000和100，000道爾頓之間的截留分子量的任何半透膜將允許果糖和其他低分子量部分通過，同時保留酶和聚(a 1，3葡聚糖)，它可適用于本發(fā)明。如本文所用，術(shù)語“其他低分子量部分”是指具有低于1000道爾頓的分子量的多種化合物，它們可存在于酶反應(yīng)溶液中。由于從第一室中包含的酶反應(yīng)溶液中除去了副產(chǎn)物果糖，可減少明串珠菌二糖的形成。在本發(fā)明的一個實施例中，可使用透析管作為半透膜以從酶反應(yīng)溶液中除去副產(chǎn)物果糖。
[0026]對于本發(fā)明，酶反應(yīng)溶液可保持在20°C至25°C的溫度下。
[0027]本發(fā)明產(chǎn)生作為低成本材料的聚(a I, 3葡聚糖)，它可經(jīng)濟地獲取自易于再生的蔗糖原料，用于多種用途，包括纖維、膜、和紙漿。具體地，期望例如聚(a I, 3葡聚糖)纖維將功能上取代棉花和再生纖維素纖維，導(dǎo)致新紡織品纖維與前述材料相比具有最小的環(huán)境影響和優(yōu)異的可持續(xù)性。 [0028]實例
從下述實例中能夠更充分地認識到本文所公開的組合物和方法的有利特性和效應(yīng)。所述實例所基于的實施例的方法僅僅是代表性的，并且選擇那些實施例來示例本發(fā)明，并不表示未在這些實例中描述的材料、組分、反應(yīng)物、條件、規(guī)格、步驟或技術(shù)就不適用于實施這些方法，也不表示未在這些實例中描述的主題被排除在所附權(quán)利要求及其等同物范疇之外。
[0029]材料
透析管(Spectrapor 25225-226，12000 截留分子量)購自 VWR (Radnor，PA)。
[0030]葡聚糖和乙醇購自Sigma Aldrich。蔗糖購自VWR。
[0031]7153 消泡劑購自 Cognis Corporation (Cincinnati, OH)。
[0032]所有其他化學制品購自此類化學制品的常用供應(yīng)商。
[0033]種子培養(yǎng)基
用于發(fā)酵罐培養(yǎng)起始培養(yǎng)物的種子培養(yǎng)基，包含:酵母提取物(Amberx 695，5.0克/升，g/L)，K2HP04 (10.0g/L), KH2PO4 (7.0g/L)，二水合檸檬酸鈉(1.0g/L)，(NH4)2SO4 (4.0g/0，1%304七水合物(1.(^/1)和檸檬酸鐵銨(0.10g/L)。培養(yǎng)基pH使用5N氫氧化鈉或H2SO4調(diào)節(jié)至6.8，并且培養(yǎng)基在燒瓶中滅菌。滅菌后加入葡萄糖(20mL/L的50%重量/重量溶液)和氨芐青霉素(4mL/L的25mg/mL原液)。
[0034]發(fā)酵罐培養(yǎng)基
在發(fā)酵罐中使用的生長培養(yǎng)基包含=KH2PO4 (3.50g/L), FeSO4七水合物(0.05g/L)，MgSO4七水合物(2.0g/L), 二水合檸檬酸鈉(1.90g/L)，酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L),7153 消泡劑(0.25 毫升 / 升，mL/L), NaCl (1.0g/L), CaCl2 二水合物(10g/L)，和 NIT 痕量元素溶液(10mL/L)。NIT痕量元素溶液包含一水合檸檬酸(10g/L)，MnSO4水合物(2g/L)，NaCl (2g/L)，F(xiàn)eSO4 七水合物(0.5g/L)，ZnSO4 七水合物(0.2g/L)，CuSO4 五水合物(0.02g/L)和NaMoO4 二水合物(0.02g/L)。滅菌后加入葡萄糖(12.5g/L的50%重量/重量溶液)和氨節(jié)青霉素(4mL/L的25mg/mL原液)。
[0035]實例I
構(gòu)建葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfj)表達菌株
編碼成熟葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtfj ；EC 2.4.1.5)的基因根據(jù)GENBANK? (登錄號M64111.1)的報告來自唾液鏈球菌(ococctts sali varius) (ATCC 25975),它使用經(jīng)優(yōu)化在大腸桿菌(疋co7i)中表達的密碼子(DNA 2.0，Menlo Park, CA)。將核酸產(chǎn)物(SEQ ID NO:1)亞克隆進pjexpress404? (DNA 2.0,Menlo Park CA)以生成標識為 PMP52 (SEQ ID NO:
2)的質(zhì)粒。質(zhì)粒pMP52用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(疋coli)MG1655 (ATCC 47076?)以生成標識為MG1655/pMP52的菌株。用于構(gòu)建葡糖基轉(zhuǎn)移酶表達菌株的所有方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可由相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員實施，無需過度實驗。
[0036]實例2
在發(fā)酵中產(chǎn)生重組gtfj
在發(fā)酵罐中產(chǎn)生重組gtfj酶起始于制備表達gtfj酶的大腸桿菌W.coli)菌株MG1655/pMP52的前種子培養(yǎng)物，如實例I所述進行構(gòu)建。將種子培養(yǎng)基的IOmL等分試樣加A 125ml 一次性帶擋板燒瓶并用1.0mL在20%甘油中的大腸桿菌(疋coli) MG1655/pMP52培養(yǎng)物接種。使這一培養(yǎng)物在37°C、300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)振蕩條件下生長3小時。
[0037]發(fā)酵罐中起始的種子培養(yǎng)物通過將0.5L種子培養(yǎng)基加到2L振蕩燒瓶中進行制備。將1.0mL前種子培養(yǎng)物無菌轉(zhuǎn)移到燒瓶中的0.5L種子培養(yǎng)基中，并且在37°C和300rpm條件下培養(yǎng)5小時。在光密度550nm (OD550) >2時將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到14L發(fā)酵罐(Braun，Perth Amboy, NJ)中，該發(fā)酵罐包含8L上述發(fā)酵罐培養(yǎng)基，溫度為37°C。
[0038]使大腸桿菌(疋coli) MG1655/pMP52細胞在發(fā)酵罐中生長，并且當培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度降至0.5g/L時開始葡萄糖進料(50%重量/重量葡萄糖溶液，包含1%重量/重量MgSO4-7H20)o進料開始時為0.36克進料/分鐘(g進料/分鐘)，并且每小時分別逐漸提高到 0.42,0.49,0.57,0.66,0.77,0.90,1.04,1.21,1.41 1.63,1.92,2.2g 進料 / 分鐘。之后速率保持恒定。使用YSI葡萄糖分析儀(YSI，Yellow Springs, Ohio)監(jiān)測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度。當葡萄糖濃度超過0.lg/L時，進料速率下降或暫時中止進料。當細胞達到OD550為70時，通過加入9mL` 0.5M IPTG (異丙基-P -D_l_硫代半乳糖苷)開始誘導(dǎo)葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。溶解氧(DO)濃度控制在25%的空氣飽和度。首先通過葉輪攪拌速率(400至1200rpm)并且隨后通過通風速率(2至10標準升/分鐘，slpm)控制D0。將pH控制在6.8。NH4OH (14.5%重量/體積，w/v)和H2SO4 (20% w/v)用于pH控制。將回壓保持在0.5巴。在不同的間隔(20、25和30小時)，將5mL 7153消泡劑加到發(fā)酵罐中以抑制發(fā)泡。在加入IPTG后8小時通過離心收獲細胞并將其儲存在_80°C作為細胞漿。
[0039]實例3
由細胞漿制備gtfj粗制酶提取物
將上文獲取的細胞漿懸浮在PH 7.2的50mM磷酸鉀緩沖液中，濃度為150g/L，制備漿液。漿液在12，000psi(Rannie型機，APV-1000或APV 16.56)下勻化并且勻漿冷卻至4°C。中度攪拌，每升細胞勻漿加入50g絮凝物溶液(Aldrich n0.409138，在pH 7.0的5OmM磷酸鈉緩沖液中濃度為5%)。將攪拌降低至輕度攪拌，保持15分鐘。隨后通過在5-10°C，在4500rpm離心3小時澄清細胞勻漿。包含粗制gtfj酶提取物的上清液用30千道爾頓(kDa)截留分子量的膜濃縮(大約5X)。gftj酶溶液中的蛋白濃度通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定法(Sigma Aldrich)測定為 4_8g/L。
[0040]實例4
使用半透膜改善聚(a I, 3葡聚糖)的滴度
這個實例展示去除和/或稀釋在蔗糖轉(zhuǎn)化成聚(a 1，3葡聚糖)期間形成的副產(chǎn)物果糖提高聚(a 1，3葡聚糖)的滴度。在這個實例中使用透析管作為半透膜，因為它允許在酶促反應(yīng)期間形成的副產(chǎn)物果糖從管內(nèi)部滲到透析管外部。
[0041 ] 這個實例中的酶反應(yīng)溶液包含8L蔗糖原液(表1 )，24g作為引物的葡聚糖T-1OjP
1.0體積%的gtf酶。
[0042]表1
【權(quán)利要求】
1.用于在反應(yīng)體系中生產(chǎn)聚(α1, 3葡聚糖)的方法，所述反應(yīng)體系包括通過半透膜分隔開的兩個室，其中: a)第一室包含酶反應(yīng)溶液，所述酶反應(yīng)溶液包含: i)蔗糖；和 ?)至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶；并且 b)第二室通過與所述酶反應(yīng)溶液接觸的半透膜與所述第一室分隔開，其中果糖能夠透過所述半透膜，但聚(α 1，3葡聚糖)不能透過所述半透膜，這有利于在將聚(α 1, 3葡聚糖)和所述至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶保留在所述第一室內(nèi)的同時連續(xù)移除果糖和其他低分子量部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶反應(yīng)溶液保持在20°C至25°C的溫度下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包含至少一種引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述半透膜有利于將聚(α1，3葡聚糖)積聚至從30克/升至200克/升范圍的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述半透膜具有12，000至100，000道爾頓的截留分子量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述半透膜是透析管。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶來源于鏈球菌Cs trep tococci)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶選自gtfj、gtfB、gtfC 和 gtfL.
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶來自唾液鏈球菌{Streptococcus salivarius) 0
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述唾液鏈球菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶是gtfj。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述至少一種引物是葡聚糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶是不依賴引物的酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶是依賴引物的酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶反應(yīng)溶液中存在多于一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多于一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶包括至少一種依賴引物的酶和至少一種不依賴引物的酶的混合物。
【文檔編號】C12P19/18GK103764834SQ201280043600
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月9日
【發(fā)明者】J.P.奧布里恩, M.S.帕伊內(nèi) 申請人:納幕爾杜邦公司