臍帶提取物的制備方法和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于從臍帶有效提取有用成分的方法。本發(fā)明提供包含有用成分的臍帶提取物。依照本發(fā)明，所述臍帶提取物可用作血清替代物來培養(yǎng)來自動物的普通細胞和干細胞。還有，依照本發(fā)明的臍帶提取物可用于供組織修復的填充劑和敷料，和用于供改進皮膚的化妝用組合物。另外，本發(fā)明涉及用于分離和培養(yǎng)源自組織(如臍帶和脂肪組織)的干細胞的培養(yǎng)基組合物，和使用其分離和培養(yǎng)源自所述組織的干細胞的方法。
【專利說明】臍帶提取物的制備方法和使用方法
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求在韓國知識產(chǎn)權(quán)局2011年7月12日提交的韓國專利申請N0.10-2011-0068761和2011年7月11日提交的韓國專利申請N0.10-2011-0068261的權(quán)益，這兩者的公開內(nèi)容均通過引用而完整并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明的一個或多個實施方案涉及制備臍帶提取物的方法、臍帶提取物的血清替代物、用于分離和培養(yǎng)干細胞的組合物、和填充劑(filler)用于傷口愈合的用途。
[0004]發(fā)明背景
[0005]自建立身體外動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以來，血清一直被常規(guī)用于促進動物細胞的增殖。已廣泛用于原代細胞和穩(wěn)定細胞系的存活和增殖的血清，是一種僅其部分組成已知的混合物，如此尚未完全了解細胞培養(yǎng)中血清的生物學活性。還有，胎牛血清(FBS)從胎牛收集，如此FBS具有風險因子如支原體、病毒、朊病毒、細菌促細胞分裂原、激素、外來蛋白質(zhì)、生長因子和蛋白酶。此外，根據(jù)供應商的設備、技術(shù)標準和生產(chǎn)批號，F(xiàn)BS組成的質(zhì)量可能變化。已知迄今報告的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basal media)能使特定細胞生長；代替血清使用的細胞生長因子、粘附因子等是昂貴的；且已知基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長和代謝物生產(chǎn)沒有在包含血清的培養(yǎng)基中的那些那么穩(wěn)定(Cruz J.H.等，Cytotechnology, 26:59-64(1998)和 Hee-Chan Lee, A Basal medium in an Animal Cell Culture, BiotechnologyNews, 2 (3):242-25 2(1994))。
[0006]還有，包括FBS在內(nèi)的培養(yǎng)基常規(guī)用于連續(xù)培養(yǎng)處于未分化狀態(tài)的成人干細胞，而源自動物的蛋白質(zhì)源(包括FBS)在培養(yǎng)期間使用，其可能導致穩(wěn)定性問題如在開發(fā)用于臨床應用的干細胞治療物時在物種之間的污染。因此，從常規(guī)培養(yǎng)方法獲得的干細胞的臨床應用具有許多局限性。
[0007]作為一種克服使用源自動物的蛋白質(zhì)源(即FBS)的問題的方法，可使用一種利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法和一種使用包含人血清的培養(yǎng)基的方法。使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法包括在含大量細胞因子如生長激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，如此該方法是麻煩且不經(jīng)濟的。還有，使用包含人血清的培養(yǎng)基的方法還包括使用通過重組方法制備的大量細胞因子和使用昂貴的人血清作為蛋白質(zhì)源來進行培養(yǎng)，如此該方法是經(jīng)濟上低效的。
[0008]同時，干細胞可分類為成人干細胞(見于成人的各種組織和器官中)和胚胎干細胞(可從囊胚階段(blastodermic stage)的細胞獲得)。胚胎干細胞具有分化成各種細胞如神經(jīng)細胞、血液細胞和胰腺細胞的全能性(pluripotency);然而,胚胎干細胞自人胚胎獲得，如此受制于倫理問題。因此，不存在倫理問題的成人干細胞可容易地分離和培養(yǎng)，且能分化成各種細胞，如此，更多的關(guān)注將成人干細胞作為細胞治療產(chǎn)品的材料。
[0009]可從多種組織分離成人干細胞，其為可分化成各種組織細胞如脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、心細胞、肝細胞和神經(jīng)細胞的未分化的干細胞。其中，源自骨髓的間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)是成人干細胞的一個代表性的例子。[0010]然而，當干細胞供體的年齡增長時，BM-MSC的數(shù)目和增殖效力降低，而且骨髓提取對供體引起很大疼痛。因此，試圖從不同組織分離間充質(zhì)細胞。由于最近有各種報告稱間充質(zhì)細胞可從成人或胚胎的外周血、臍帶、胎盤和臍帶血分離，因此從各種組織獲得的間充質(zhì)細胞作為新的細胞治療產(chǎn)品的來源受到大量關(guān)注。
[0011]臍帶包含血管和血管周圍的結(jié)締組織(稱為Wharton’s jelly)。在妊娠期間，臍帶的長度可以為約30cm至60cm，臍帶的重量可以為約40g至約50g。而且，臍帶包含用于供應給胎兒的充足量的營養(yǎng)物、干細胞和前體細胞。最近，已報告源自臍帶的細胞具有BM-MSC特性。類似于骨髓和其他組織來源的間充質(zhì)干細胞，臍帶來源的干細胞表達細胞表面蛋白質(zhì)如⑶73、⑶90、⑶105、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44和HLA-ABC，但不表達細胞表面蛋白質(zhì)如⑶34和⑶45 (其為造血干細胞標志物)以及⑶14、⑶31、⑶33和HLA-DRa (其為組織相容性抗原)。此外，已報告從臍帶分離的干細胞同時表達0ct4、Sox2、Nanog等胚胎干細胞標志物。
[0012]臍帶來源的干細胞可分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，且比骨髓或脂肪來源的細胞在體外培養(yǎng)期間具有更好的有絲分裂活性。還報告臍帶來源的干細胞可分化成心肌細胞和神經(jīng)細胞。在這一方面，臍帶是一種可供應干細胞用于臨床應用的組織，且可用作細胞治療產(chǎn)品。
[0013]然而，需要極大量的臍帶來源的干細胞以有效使用臍帶來源的干細胞。然而，可從臍帶獲得的干細胞數(shù)是有限的，而且許多干細胞在培養(yǎng)期間失去分化效力。然而，目前尚無已知的在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中有效分離和培養(yǎng)臍帶來源的干細胞的方法。在研究解決該問題的各種辦法時，發(fā)現(xiàn)當使 用臍帶來源的提取物時可有效分離并培養(yǎng)臍帶來源的干細胞，如此完成本發(fā)明。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本發(fā)明的一個或多個實施方案包括一種制備臍帶提取物的方法。
[0016]本發(fā)明的一個或多個實施方案包括一種血清替代物，其包含所述臍帶提取物。
[0017]本發(fā)明的一個或多個實施方案包括一種細胞培養(yǎng)基，其包含所述血清替代物。
[0018]本發(fā)明的一個或多個實施方案包括一種從臍帶分離臍帶來源的干細胞(包含臍帶提取物)的方法，和一種培養(yǎng)臍帶來源的干細胞的方法。
[0019]其他方面將部分在以下說明中列出，部分根據(jù)說明書將是明顯的，或者可通過實踐所呈現(xiàn)的實施方案學到。
[0020]附圖簡述
[0021]這些和/或其他方面根據(jù)以下對實施方案的描述，連同所附附圖將變得明顯和更容易領(lǐng)會的:
[0022]圖1是顯示在不同攪動時間洗脫的蛋白質(zhì)總量的圖；
[0023]圖2是顯示當改變培養(yǎng)基時和不改變培養(yǎng)基時在不同時間洗脫的蛋白質(zhì)總量之間的比較的圖；
[0024]圖3和4顯示不同臍帶大小時洗脫的蛋白質(zhì)總量；
[0025]圖5和6是顯示在不同的緩沖液pH下洗脫的蛋白質(zhì)總量和用于鑒定洗脫蛋白質(zhì)之間差異的SDS-PAGE結(jié)果的圖；
[0026]圖7和8是顯示根據(jù)洗脫方法洗脫的蛋白質(zhì)總量的圖；[0027]圖9和10是顯示從新鮮臍帶組織和從冷凍臍帶組織洗脫的蛋白質(zhì)之間差異的圖；
[0028]圖11是顯示緩沖液的量不同時洗脫的蛋白質(zhì)總量的圖；
[0029]圖12、13和14是顯示臍帶提取物(UCE)細胞因子的定量分析結(jié)果的圖；
[0030]圖15、16、17和18是顯示根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)添加物不同時的細胞增殖的圖和照片；
[0031]圖19和20是顯示在包含臍帶提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)骨髓和臍帶來源的干細胞，處理間充質(zhì)干細胞標志物，和實施熒光激活的細胞分選器(FACS)分析的結(jié)果的圖；
[0032]在這一方面，X軸指示強度而y軸指示細胞數(shù)(計數(shù))。在圖上寫出的⑶標志物可基于X軸和I軸的變化區(qū)分。該圖顯示將在包含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中生長的細胞與在包含臍帶提取物的培養(yǎng)基中生長的細胞進行比較；
[0033]圖21和22是，將包含UCE的透明質(zhì)酸衍生物(HAD)填充劑皮下注射給小鼠，再用蘇木精和曙紅染色后，顯示的照片，當其中包含臍帶提取物(UCE)時，更多的來自周圍組織的細胞流入到填充劑中；
[0034]圖23顯示依照一個實施方案，根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中臍帶提取物的濃度，臍帶來源的干細胞的增殖；
[0035]圖24顯示依照一個實施方案，在用臍帶來源的膠原包被的培養(yǎng)皿中臍帶來源干細胞的粘附和增殖(培養(yǎng))增加；
[0036]圖25顯示用不同濃度的膠原包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的臍帶來源干細胞數(shù)目的比較，以及2天后所增殖的臍帶來源干細胞數(shù)目的比較；
[0037]圖26顯示常規(guī)的分離臍帶來源干細胞的方法與依照本發(fā)明一個實施方案的分離臍帶來源干細胞的方法進行比較的結(jié)果；
[0038]圖27顯示依照圖26中所示6種方法分離和培養(yǎng)的細胞的圖像；
[0039]圖28顯示在分離臍帶來源的干細胞后15天回收的總細胞數(shù)；
[0040]圖29顯示依照圖26中所示6種分離和培養(yǎng)方法而分離和培養(yǎng)的免疫指示物的比較性分析結(jié)果；
[0041]在這一方面，X軸指示強度而y軸指示細胞數(shù)(計數(shù))。在圖上寫出的⑶標志物可基于X軸和I軸的變化區(qū)分；
[0042]圖30顯示了從3位不同供體的臍帶分離的提取物中507種人細胞因子、趨化因子、生長因子等的細胞因子陣列結(jié)果，還列出了每份臍帶中含量最大的10種細胞因子；
[0043]圖31顯示3份不同臍帶的提取物中共有的材料的比較圖。共有且含量最大的細胞因子是IGFBP-7、脂籠蛋白-1 ；
[0044]圖32顯示3份不同類型的臍帶中鑒定出的62種人細胞因子，按含量最大到最小的順序顯示。
[0045]圖33描述了 10種細胞因子的功能，所述細胞因子在人體中具有公知的功能。
[0046]圖34和35是比較臍帶提取物中和包含10% FBS的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)的干細胞之間的干性維持(sternness maintenance),其中比較了在初始傳代培養(yǎng)期間和在10輪傳代培養(yǎng)后干細胞的倍增時間(Td)；
[0047] 圖36顯示，用表達胚胎干細胞(ESC)特異性標志物的臍帶提取物，從臍帶組織分離的臍帶來源干細胞(UC-MSC)；
[0048]圖37顯示，從3位不同供體的臍帶提取物分離的所有干細胞對于⑶29、⑶73、CD90、CD105和CD166(都是間充質(zhì)干細胞特異性細胞表面標志)為陽性，而對于CD34和CD45為陰性；
[0049]圖38顯示，在用臍帶提取物培養(yǎng)干細胞期間，可見于干細胞分離的初始階段的胚胎干細胞特異性標志物在將FBS添加到培養(yǎng)基時不再表達，但在將臍帶提取物添加到培養(yǎng)基時維持。
[0050]發(fā)明詳述
[0051]現(xiàn)將對實施方案進行詳細提述，其中的實施例已例示在所附附圖中，其中貫穿本文類似的參考數(shù)字指類似的要素。在此方面，本發(fā)明的實施方案可具有不同的形式且不應理解為對本文列出的說明限制性的。因此，通過提及附圖僅在下文描述實施方案以解釋本發(fā)明的方面。如本文中使用的，術(shù)語“和/或”包括一種或多種所列關(guān)聯(lián)項目的任意和所有組合。表述如“至少一種”處于一組要素之前時，修飾整個要素組而非該組的單個元件。
[0052]本發(fā)明提供一種制備臍帶提取物(UCE)的方法。
[0053]本發(fā)明提供一種制備哺乳動物UCE的方法，依照一個實施方案，所述方法包括切割臍帶；將臍帶放置到緩沖液中；攪動使該臍帶浸滿緩沖液；并離心從所述攪動獲得的產(chǎn)物以獲得上清液如UCE。 [0054]本發(fā)明提供分離以下物質(zhì)的常規(guī)方法的改進方法:生長因子、細胞因子、趨化因子和結(jié)合于胞外基質(zhì)的糖蛋白如糖胺聚糖(GAG)，所述方法通過相對簡單的操作盡可能多地獲得活細胞和天然態(tài)細胞的有用成分。
[0055]本發(fā)明的方法可依照以下過程詳細描述:
[0056]首先，所述方法包括切割臍帶。
[0057]依照一個實施方案，首先切割臍帶。依照一個實施方案，切割臍帶增加緩沖液和臍帶組織之間的接觸表面以促進可用材料從臍帶組織的洗脫。
[0058]可用在實施方案中的臍帶包括各種哺乳動物的臍帶。所述哺乳動物優(yōu)選地是人、豬、馬、牛、小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、山羊和綿羊，更優(yōu)選地是人、豬、馬和牛，最優(yōu)選地是人。
[0059]可通過本領(lǐng)域中已知的各種方法實施臍帶切割。
[0060]依照一個實施方案,將臍帶切成長度為約0.5cm至約3.0cm,更優(yōu)選地約0.7cm至約2.5cm,而更優(yōu)選地約Icm至約2cm。
[0061]具體地,所述UCE可優(yōu)選從臍帶組織華通氏膠(Wharton’s jelly)中提取。在此方面，所述方法可另外包括從臍帶除去血和/或血管。
[0062]之后，所述方法可包括將切割的臍帶放置到緩沖液中。
[0063]將切割的臍帶放置到緩沖液中。本領(lǐng)域中使用的緩沖液/物可以是任何具有緩沖能力的緩沖液/物，并且可以是例如乙酸鈉、磷酸鈉、甘氨酸-HC1、Tris-HCl和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。更具體地，PBS可以以約2至約11，更優(yōu)選地約4至約10，更優(yōu)選地約5至約8，且更優(yōu)選地約6.8至約7.6的pH使用。
[0064]沒有具體限制用于浸沒切割的臍帶的緩沖液量，且優(yōu)選地可以是具有臍帶重量約2至約5倍，更優(yōu)選地約2至約4倍，更優(yōu)選地約2.5倍至約3.2倍重量的緩沖液。還有，切割的臍帶在放置到緩沖液中之前可用合適溶液(例如緩沖液)清洗。[0065]之后，所述方法包括攪動浸透在緩沖液中的臍帶。
[0066]依照一個實施方案，所述攪動可在約4°C至約10°C，且優(yōu)選地約4°C至約6°C的溫度進行。還有，所述攪動可實施約7小時至約24小時，優(yōu)選地約12小時至約24小時，且更優(yōu)選地約18小時至約24小時。
[0067]可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法來進行攪動，而且可使用磁條來攪動。
[0068]之后，將從攪動獲得的產(chǎn)物離心以獲得作為UCE的上清液。
[0069]將從攪動獲得的產(chǎn)物離心以最終獲得作為UCE的上清液。該上清液包含各種有用的蛋白質(zhì)如生長因子和細胞因子(結(jié)合于胞外基質(zhì))。
[0070]依照一個實施方案，所述離心可在約3，OOOrpm至約6，OOOrpm,更優(yōu)選地約
4,OOOrpm至約4，500rpm進行。所述離心可在約4°C至約10°C,更優(yōu)選地約4°C至約6°C的溫度進行。依照一個實施方案，所述離心可進行約2分鐘至約30分鐘，優(yōu)選地約5分鐘至約20分鐘，更優(yōu)選地約10分鐘至約15分鐘。
[0071]本發(fā)明提供依照一個實施方案的方法制備的UCE。
[0072]依照一個實施方案，所述UCE包含胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7 (IGFBP-7)、脂籠蛋白(Iipocallin)-1、CXCL14、瘦素(L印tin)R、IL_23、MIP_la、血管生成素、血小板反應蛋白(Thrombospondin)-2、IL-29、IL-4R 等(圖 31)作為主要成分。
[0073]UCE的主要細 胞因子以與抗血管發(fā)生、抗凋亡、生長和炎癥有關(guān)的效果著稱。
[0074]本發(fā)明提供包含UCE的血清替代物。
[0075]如本文中使用的，術(shù)語“血清”指在除去纖維素后血漿的剩余部分。血清常規(guī)用于在建立體外動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以后促進動物細胞的增殖。
[0076]如本文中使用的，術(shù)語“血清替代物”指可用于獲得與血清相同或相似效果的材料，且可以是可獲得相同或很好的效果而沒有使用血清如胎牛血清(FBS)的材料。
[0077]UCE可以是依照常規(guī)方法獲得的UCE ;然而，優(yōu)選地UCE可為依照上述實施方案獲得的UCE。更具體地，優(yōu)選從臍帶除去血以排除血清成分。
[0078]所述血清替代物可應用于所有可使用血清的領(lǐng)域。更具體地，血清替代物可用于培養(yǎng)細胞，更優(yōu)選地用于培養(yǎng)動物細胞。所述干細胞可以是任何類型的干細胞，如成人干細胞、間充質(zhì)干細胞、去分化的干細胞或組織來源的干細胞。
[0079]本發(fā)明提供包含血清替代物的細胞培養(yǎng)基。
[0080]依照一個實施方案，所述細胞培養(yǎng)基可包含各種動物細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人、豬、馬、牛、小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、山羊和綿羊細胞，更優(yōu)選地是人、豬、馬和牛細胞，最優(yōu)選地是人細胞。
[0081 ] 依照一個實施方案，所述細胞培養(yǎng)基可應用于干細胞培養(yǎng)。如本文中使用的，所述干細胞不受限制而且是具有干細胞特性的細胞，即能分化、不受限的增殖、并分化成特定細胞的細胞。所述干細胞可包括全能干細胞和多能(multipotent)干細胞，包括胚胎干(ES)細胞和胚胎生殖(EG)細胞。優(yōu)選地，所述干細胞可以是臍帶來源的干細胞(UC-MSC)。
[0082]依照一個實施方案，所述細胞培養(yǎng)基是血清替代物，且除了包含UCE以外，還可包含用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。例如，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可基于以下培養(yǎng)基制備:Eagles’ s 最小基本培養(yǎng)基(EMEM) (EMEM, Eagle, H.Sciencel30:432 (1959))、a -MEM(Stanner, C.P.等，Nat.New Biol.230:52 (1971))、Iscove's MEM(Iscove, N.等，J.Exp.Med.147:923 (1978))、培養(yǎng)基 199 (Morgan 等，Proc.Soc.Exp.Bi0.Med.,73:1 (1950))、CMRL1066、RPMI1640 (Moore 等，J.Amer.Med.Assoc.199:519(1967))、F12(Ham, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA53:288 (1965))、FlO (Ham, R.G.Exp.Cell Res.29:515 (1963))、Eagle’s培養(yǎng)基的 Dulbecco’s 修改(DMEM)(DMEM, Dulbecco, R.等，Virology8:396(1959))、DMEM 和 F12 的混合物(Barnes, D.等，Anal.Biochem.102:255 (1980) )、Way-mouth’sMB752/1 (ffaymouth, C.J.Natl.Cancer Inst.22:1003(1959))、McCoy，s5A (McCoy, T.A.,等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))和 MCDB 系列(Ham, R.G.等，體外14:11(1978))。
[0083]依照另一個實施方案，提供用于組織修復的填充劑，所述填充劑包含UCE。
[0084]術(shù)語“用于組織修復的填充劑”指用于有效遮蓋皮膚上的皺紋和細紋的醫(yī)學組合物或化妝用組合物。
[0085]依照一個實施方案，用于組織修復的填充劑除了包含UCE以外包含填充劑的基礎(chǔ)成分，優(yōu)選為膠原、透明質(zhì)酸、聚丙烯酰胺凝膠、artecoll、autologen(自體膠原)或聚甲基丙烯酸酯、和膠原混合物。 [0086]依照一個實施方案，所述填充劑可包含蠟、彈性體(elastomer)、高級醇、表面活性劑、油、粉末、濕潤劑、水性聚合物、皮膚防護劑、防腐劑和/或香料(scent)。
[0087]還有，所述UCE可通過常規(guī)方法獲得，且優(yōu)選地可通過上述實施方案獲得。具體地，優(yōu)選從臍帶除去血以排除血清成分。
[0088]依照另一個實施方案,提供包含UCE的敷料(dressing)。
[0089]如本文中使用的，術(shù)語“敷料”指應用于人或動物身體的一部分供臨床或美學皮膚處理的藥物組合物。優(yōu)選地，所述敷料用于處理受損的皮膚、皮膚損傷和皮膚表面上的隨機遮斷物(interruption)(例如皮膚潰瘍、燒傷、切口、刺破、裂開的傷口、鈍性傷、痤瘡損傷和市)。所述敷料可包括貼劑(patch)、硬膏劑(plaster)、繃帶或紗布用于徹底運輸藥物。優(yōu)選地，敷料可應用于身體的內(nèi)部組織和外部組織，更優(yōu)選地應用于身體表面。
[0090]還有，所述UCE可通過常規(guī)方法獲得，且優(yōu)選地可通過上述實施方案獲得。具體地，優(yōu)選從臍帶除去血以排除血清成分。
[0091]依照另一個實施方案，提供一種包含UCE的抗皺或抗老化化妝用組合物。
[0092]依照一個實施方案，所述化妝用組合物可用于改進各種皮膚狀況。優(yōu)選地，本發(fā)明的化妝用組合物可對抗皺或抗老化有效。
[0093]依照一個實施方案，所述化妝用組合物中包含的生長因子以外的成分是常規(guī)包含在化妝用組合物中的活性成分，且所述成分可以是常規(guī)的補充物如穩(wěn)定劑、溶解劑(dissolution agent)、維生素、染料、香料和載體。
[0094]依照一個實施方案，所述化妝用組合物可制備成本領(lǐng)域中的任何常規(guī)制劑，其可以是但不限于，溶液、混懸劑、乳劑、糊劑、凝膠、乳膏、洗劑(lotion)、粉劑(powder)、阜(soap)、含表面活性劑的清潔劑、油、粉底(powder foundation)、乳液打底(emulsionfoundation)、臘打底(wax foundation)和噴劑，且更具體地，爽膚水(skin toner)、滋養(yǎng)性爽膚水、滋養(yǎng)霜(nourishing cream)、按摩乳膏(massage cream)、精華、眼霜、清潔霜(cleansing cream)、清潔水(cleansing water)、面膜(facial mask)、噴霧(spray)或粉。
[0095]依照一個實施方案，當所述制劑是糊劑、乳膏或凝膠時，可使用動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮(silicone)、膨潤土、二氧化硅、滑石、或鋅氧化物作為載體的組分。
[0096]依照一個實施方案，當所述制劑是粉劑或噴劑時，可使用乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣、或聚酰胺粉作為載體的組分。更具體地，當所述制劑是噴劑時，可包含推進物如氯氟烴、丙烷/ 丁烷、或二甲醚作為載體的組分。
[0097]依照一個實施方案，當所述制劑是溶液或乳劑時，可使用溶解劑或破乳劑作為載體的組分，其例子包括水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、
I,3- 丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
[0098]依照一個實施方案，當所述制劑是混懸劑時，可使用液體稀釋劑如水、乙醇和丙二醇；懸浮劑如乙氧基化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯(polyoxyethylenesorbitol ester)和聚氧乙烯山梨聚糖酯；微晶纖維素；氫氧化招氧化物(aluminummeta-hydroxide);膨潤土 ；瓊脂；或黃苗膠。
[0099]依照一個實施方案，當所述制劑是含表面活性劑的清潔劑時，可使用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、硫化琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽(isethionate)、咪唑啉(imidazolinium)衍生物、甲基taurate、肌氨酸鹽(sarcosinate)、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽、烴基酰氨基甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、乙氧基化的甘油脂肪酸酯、羊毛脂衍生物、或乙氧基化的甘油脂肪酸酯作為載體的組分。
[0100]依照另一個 實施方案，提供一種從臍帶分離干細胞的方法。
[0101]依照另一個實施方案，提供一種從哺乳動物臍帶分離干細胞的方法，所述方法包括將將分塊(morcellated)的臍帶組織連同包含哺乳動物UCE的細胞培養(yǎng)基組合物放置到細胞培養(yǎng)容器中；將所述臍帶組織用干細胞分離酶處理；并從臍帶組織分離干細胞。
[0102]所述哺乳動物可以是人、豬、馬、牛、小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、山羊和綿羊。
[0103]所述組織可選自下組:脂肪、臍帶、肝和骨膜。
[0104]所述細胞培養(yǎng)容器可以是用細胞粘附蛋白包被的細胞培養(yǎng)容器。在這一方面，細胞粘附蛋白可以是但不限于，哺乳動物臍帶來源的膠原、明膠、纖連蛋白、核纖層蛋白或聚-D-溶素。
[0105]所述哺乳動物臍帶來源的膠原可通過一種制備哺乳動物臍帶來源的膠原的方法制備，所述方法包括(i)將用過氧化氫處理的哺乳動物臍帶組織磨碎；(ii)將臍帶組織用乙酸和胃蛋白酶處理，然后將其離心；(iii)設定從離心獲得的上清液的PH并向其添加NaCl以浸沒膠原；并(iv)分離浸沒的膠原。
[0106]在依照一個實施方案的從哺乳動物臍帶分離干細胞的方法中，優(yōu)選在實施過程
(i)后實施過程(ii)約I至約3天。
[0107]過程(ii)的干細胞分離酶可以是膠原酶，更優(yōu)選地是I型膠原酶。更優(yōu)選地，在過程(ii)中，以高達約180U/ml至約220U/ml的量包含I型膠原酶且可以處理約2小時至約6小時。
[0108]還有，優(yōu)選依照上文實施方案中所述方法來制備UCE。
[0109]依照另一個實施方案，提供一種通過使用UCE來培養(yǎng)干細胞的方法。
[0110]依照另一個實施方案，通過一種培養(yǎng)干細胞的方法，所述方法包括向干細胞培養(yǎng)基添加UCE，并通過使用該干細胞培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)干細胞。[0111]細胞培養(yǎng)容器可用細胞粘附蛋白包被。所述干細胞可以是組織來源的干細胞。而且，所述干細胞可以是動物干細胞，更優(yōu)選地是人來源的干細胞。還有，所述干細胞可以是任何類型的干細胞如成人干細胞、間充質(zhì)干細胞、去分化的干細胞和組織來源的干細胞。
[0112]還有，所述細胞粘附蛋白可以是膠原、明膠、纖連蛋白、核纖層蛋白或聚-D-溶素，但細胞粘附蛋白不限于此。
[0113]所述組織可選自下組:脂肪、臍帶、肝和骨膜，但組織不限于此。
[0114]所述干細胞培養(yǎng)基不能包含血清。
[0115]還有，所述干細胞可以是任何動物干細胞，可以是ES細胞、成人干細胞和去分化的干細胞，并且可以是其中至少一種來自下組的基因表達的細胞:0ct4、Sox2、KLF4和Nanog。更具體地,所述細胞可持續(xù)表達至少一種選自下組的基因:0ct4、Sox2、KLF4和Nanog，其為ES細胞特異性基因，即使在細胞傳代培養(yǎng)時也如此。
[0116]還有，所述干細胞可對⑶29、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166為選擇性陽性的，而對⑶34和⑶45為選擇性陰性的。
實施例
[0117]<實施例1>比較不同攪動時間的蛋白質(zhì)洗脫總量
[0118]將臍帶切成約0.5cm至約2.0cm的長度，用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，以臍帶重量3倍的重量向其加入PBS，在4°C的溫度攪動約30分鐘至約24小時而不替換PBS，然后攪動約24小時至約200小時同時替換PBS以獲得中間產(chǎn)物。將對中間產(chǎn)物在4，500rpm和4°C離心10分鐘所收集的上清液用作臍帶來源的提取物(臍帶提取物，UCE)，然后進行Bradford分析來量化蛋白質(zhì)。
[0119]隨著攪動時間增加，洗脫的蛋白質(zhì)的量也增加，在攪動7小時后洗脫平均為約
2.5ug/ml的蛋白質(zhì),在攪動24小時后洗脫平均為約2.7ug/ml的蛋白質(zhì)(圖1)。
[0120]還有，從攪動開始點到攪動后24小時，洗脫的蛋白質(zhì)的量隨著時間增加；然而，當攪動(UCE)同時替換PBS時，洗脫的蛋白質(zhì)的量在從攪動開始點60小時后快速降低(圖2)。
[0121]<實施例2>比較不同臍帶大小的蛋白質(zhì)洗脫總量
[0122]將臍帶切成約0.5cm至約2.0cm的長度(圖3)，用PBS(pH7.0)清洗2次或更多次，以臍帶重量3倍的重量向其加入PBS，然后在4°C的溫度攪動4天。將對中間產(chǎn)物在4，500rpm和4°C離心10分鐘所收集的上清液用作臍帶來源的提取物(UCE)，然后進行Bradford分析來量化蛋白質(zhì)。臍帶大小不同，洗脫的蛋白質(zhì)總量未有太多變化，而當攪動同時替換PBS時，洗脫的蛋白質(zhì)的總量快速降低(圖4)。
[0123]<實施例3>比較不同緩沖液pH的蛋白質(zhì)洗脫總量
[0124]將臍帶切成約0.5cm至約2.0cm的長度，以臍帶重量3倍的重量向其加入PBS(pH2、pH7、或pHll)，然后在4°C的溫度攪動24小時以獲得中間產(chǎn)物。將中間產(chǎn)物在4，500rpm和4°C離心10分鐘，將從其獲得的上清液用作臍帶來源的提取物(UCE)。然后進行Bradford分析來量化蛋白質(zhì)。
[0125] 當使用pH2的PBS時，總共洗脫47.2mg(2.36mg/ml)的蛋白質(zhì)，而當使用pH7的PBS時，總共洗脫49mg (2.45mg/ml)的蛋白質(zhì)，而當使用pHlI的PBS時，總共洗脫43.8mg(2.19mg/ml)的蛋白質(zhì)。如此，可以得出結(jié)論，PBSpH不同,洗脫的蛋白質(zhì)總量沒有很大不同(圖5)，但當使用pH2的PBS時，攪動后產(chǎn)物的粘度增加。
[0126]還有，當在每份已進行蛋白質(zhì)定量的UCE上實施十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠考馬斯染色時，UCE的蛋白質(zhì)條帶彼此相似(圖6)。
[0127]<實施例4>比較不同洗脫方法的蛋白質(zhì)洗脫總量
[0128]將臍帶切成約0.5cm至約2.0cm的長度，然后用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，向約8g臍帶加入15ml PBS并勻漿化，攪動(在4°C溫度24小時)或溫育(在37°C溫度24小時)以獲得中間產(chǎn)物。將中間產(chǎn)物在4，500rpm和4°C離心10分鐘，并將從其獲得的上清液用作UCE,通過Bradford分析來量化蛋白質(zhì)。
[0129]經(jīng)勻衆(zhòng)，總共洗脫27.3mg(l.95mg/ml)的蛋白質(zhì)，經(jīng)攪動，總共洗脫
30.72mg(3.61mg/ml)的蛋白質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)，總共洗脫19.34mg(2.28mg/ml)的蛋白質(zhì)。因此,可以得出結(jié)論，當在4°C攪動時，洗脫最大量的蛋白質(zhì)(圖7)。
[0130]還有，當在上述條件下對經(jīng)蛋白質(zhì)定量的UCE進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠考馬斯染色時，UCE的蛋白質(zhì)條帶彼此相似(圖8)。
[0131]因此得知，4°C攪動是一種獲得大量蛋白質(zhì)，同時防止在勻漿和37°C培養(yǎng)期間可能發(fā)生的蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低的方法。
[0132]<實施例5>比較儲存臍帶組織的不同方法的蛋白質(zhì)洗脫總量
[0133]將臍帶切成約0.5cm至約2.0cm的長度，然后用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，向約Ilg臍帶加入約33ml PBS,攪動(在4°C溫度24小時)或冷凍(在-80°C 6天)，然后攪動(在4°C溫度24小時)以獲得中間產(chǎn)物。將中間產(chǎn)物在4，500rpm和4°C離心10分鐘，并將從其獲得的上清液用作UCE，通過Bradford分析來量化蛋白質(zhì)。
[0134]冷凍的臍帶比新鮮臍帶多洗脫了約7mg蛋白質(zhì)(圖9)。然而，在上述條件下經(jīng)蛋白質(zhì)定量后的UCE進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠考馬斯染色后，UCE的蛋白質(zhì)條帶彼此相似(圖10)。
[0135]<實施例6>比較不同緩沖液的量的蛋白質(zhì)洗脫量
[0136]將臍帶切成約0.5cm至約2.0cm的長度，然后用PBS (pH7.0)清洗2次或更多次，向約Ilg臍帶加入約22ml (1:2)、約33ml (1:3)、或約55ml (1:5) PBS,并在4°C攪動24小時。將臍帶在4，500rpm和4°C離心10分鐘，將從其獲得的上清液用作UCE，然后通過Bradford分析來量化蛋白質(zhì)。
[0137]當切割的臍帶在具有2倍臍帶重量的PBS中攪動時，總共洗脫53.76mg(3.16mg/ml)的蛋白質(zhì)，在具有3倍臍帶重量的PBS中攪動時，總共洗脫64.23mg(2.47mg/ml)的蛋白質(zhì)，在具有5倍臍帶重量的PBS中攪動時，總共洗脫73.78mg(l.48mg/ml)的蛋白質(zhì)，如此，可以得出結(jié)論，當PBS的量增加時，洗脫的蛋白質(zhì)的總量也增加(圖11)。當PBS的總量增加時，蛋白質(zhì)的總量也增加，但最終UCE的蛋白質(zhì)濃度降低。如此，需要另外的濃縮過程來產(chǎn)生最佳濃度的蛋白質(zhì)，而在此過程中洗脫的蛋白質(zhì)可能損失掉。
[0138]<實施例7>對UCE主要蛋白質(zhì)的定性和定量分析
[0139]為了分析UCE中包含的蛋白質(zhì)中主要成分如生長因子、趨化因子和細胞因子的類型和比較量，使用能分析507種不同類型蛋白質(zhì)的RayBio人細胞因子陣列試劑盒。3位供體捐獻了 Img的3種不同類型的UCE，將其經(jīng)膜處理后進行反應。從中測出的點用MultiGauge程序分析點強度。
[0140]其結(jié)果顯示于附圖和表中。
[0141]圖30顯示了從3位不同供體的臍帶分離的提取物中507種不同類型的人細胞因子、趨化因子和生長因子的細胞因子陣列結(jié)果，還顯示了不同供體的提取物中10種含量最大的細胞因子。
[0142]圖31是一種比較性定量圖，其顯示從3份不同臍帶分離的提取物中共有的材料。共有且含量最大的材料是IGFBP-7、脂籠蛋白-1等。
[0143]圖32連續(xù)顯示3份不同類型臍帶中鑒定出的62種人細胞因子，含量從最大到最小。
[0144]圖33描述了 10種細胞因子的功能，所述細胞因子在人體中具有公知的功能。
[0145]對UCE中42種公知的細胞因子類型進行定量分析。lmg/ml的UCE樣品與42種細胞因子類型進行抗體-抗原反應，其使用MILLIPLEX?Human細胞因子/趨化因子面板(42重:EGF, Eotaxin, FGF-2, Flt_3Ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN α 2, IFNy , IL-lra, IL-1 α，IL-1 β，IL-2, sIL_2Ra，IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p40)，IL-12(p70)，IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1 a，MIP-1β，PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, sCD40L, TGF a，TNF a，TNF β 和 VEGF ;Mi I lipore 的產(chǎn)品)，然 后使用Luminex200系統(tǒng)進行定量分析。
[0146]作為細胞因子定量分析的結(jié)果，鑒定出平均1，400pg/ml的FGF_2、1，480pg/ml的G-CSF、860pg/ml 的 MCP_l、900pg/ml 的 GR0、700pg/ml 的 IL-1ra 和 620pg/ml 的 IP-10 是提取的細胞因子中的主要成分(圖12)。
[0147]<實施例8>基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)添加物不同時的細胞增殖
[0148]將其中除去血清的UCE以0、0.1,0.2,0.5、或lmg/ml的濃度處理。作為對照組，在包含10%血清(SH30919.03，Hyclone的產(chǎn)品)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)UC-MSC、骨髓來源的干細胞(BM-MSC)和皮膚成纖維細胞，然后每2天進行10% WST-1測定(EZ-3000，Daeillab的產(chǎn)品)達總共7天。加入WST-1測定試劑使得該試劑為培養(yǎng)基的10%，在與培養(yǎng)條件相同的條件下反應約I小時，并測量450nm處的吸光度。
[0149]WST-1測定的結(jié)果是，當在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以不同濃度UCE處理時，發(fā)現(xiàn)濃度為
0.2mg/ml時UC-MSC、BM-MSC和皮膚成纖維細胞的細胞增殖速率與含10% FBS的培養(yǎng)基中的細胞相同，而當UCE以0.5mg/ml或更高濃度處理時，增殖的細胞比含10% FBS的培養(yǎng)基中的更多(圖15-17)。
[0150]還有，發(fā)現(xiàn)在包含UCE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長的細胞在細胞培養(yǎng)期間具有比含10%FBS的培養(yǎng)基中生長的細胞形態(tài)更小(圖18)。
[0151]<實施例9>維持UCE中干細胞的分化效力
[0152]在包含10% FBS和0.2mg/ml UCE的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)骨髓和UC-MSC，將從其獲得的產(chǎn)物用間充質(zhì)干細胞標志物處理，然后進行熒光激活的細胞分選器(FACS)分析。
[0153]FACS分析的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)在包含UCE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細胞維持間充質(zhì)干細胞特異性細胞表面標志物，如此，發(fā)現(xiàn)這些干細胞不顯示諸如分化等干細胞特性的變化(圖 19 和 20)。
[0154]還有，以3天的倍增時間的間隔使用UCE進行干細胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)，比較這些干細胞與含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細胞的干性。
[0155]其結(jié)果顯示于圖34和35。圖34和35顯示在UCE中和在包含10% FBS的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)的干細胞之間的干性維持的實驗結(jié)果比較，其中比較在初始傳代培養(yǎng)期間和在10輪傳代培養(yǎng)后干細胞的倍增時間(Td)值。
[0156]在包含0.3mg/ml UCE且沒有10% FBS的培養(yǎng)基中生長的干細胞的增殖速率和Td與在包含10% FBS的培養(yǎng)基中生長的干細胞的增殖速率和Td沒有很大不同，而且實際上以更高的速率增殖(小差異)。選擇0.3mg/ml的UCE濃度從而干細胞可能顯示與10% FBS中相似的增殖水平。這些干細胞的增殖比用更高濃度UCE處理的干細胞的增殖更快。
[0157]<實施例10>UCE和膠原的制備
[0158]將臍帶切成約Icm至約2cm的長度，然后用Dulbecco的PBS (DPBS)清洗2次或更多次。接著，將臍帶用70%乙醇溶液處理，在4°C溫度反應I小時，然后用蒸餾水清洗2次或更多次以對臍帶稱重。隨后，將臍帶用具有臍帶重量約3倍重量的DPBS處理，在4°C溫度處理24小時，然后從其收集UCE。將收集的UCE通過使用直徑0.22 μ m的最終濾器過濾，然后儲存于4°C溫度。 [0159]向剩余臍帶加入3% H2O2溶液，然后在4°C溫度處理約12小時至約24小時。接著，將剩余臍帶用蒸餾水清洗2次或更多次直至泡沫消失。然后，將剩余臍帶用重量為臍帶重量約10倍的0.5M乙酸溶液處理，并通過使用攪動器和勻漿器將剩余臍帶組織磨碎。將剩余臍帶用基于重量10%的胃蛋白酶處理，然后在4°C溫度反應24小時。將剩余臍帶在10，OOOrpm和4°C溫度離心30分鐘。離心后，使用NaOH將從其獲得的上清液的pH設為7以消除胃蛋白酶的活性。測量經(jīng)PH調(diào)節(jié)的溶液的體積，然后用NaCl處理使得基于經(jīng)pH調(diào)節(jié)的溶液的體積為2.4M。攪動經(jīng)pH調(diào)節(jié)的溶液直至所有NaCl溶解然后在4°C溫度豎立約12小時至約24小時直至膠原鹽析和沉淀。將經(jīng)pH調(diào)節(jié)的溶液在10，OOOrpm和4V溫度離心30分鐘后，分離鹽析出的膠原團粒并稱重。將膠原團粒在重量為膠原團粒重量10倍的蒸餾水中稀釋，并通過超濾系統(tǒng)將稀釋后的膠原團粒脫鹽和濃縮。最后，將脫鹽后的膠原團粒通過過濾除去微生物，凍干，然后儲存。
[0160]從其收集的UCE通過Bradford分析來定量,如上述制備的膠原通過輕脯氨酸分析定量。
[0161]<實施例11>用UCE和膠原包被在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞
[0162]將膠原以50μg/ml的濃度溶解于蒸餾水(D.W.)，然后在培養(yǎng)皿上于培養(yǎng)箱中處理I小時以便將其包被。在包被后，從其去除膠原溶液，用磷酸鹽緩沖液清洗2次或更多次，在室溫完全干燥，然后培養(yǎng)細胞。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以0、0.1和0.2mg/ml的UCE濃度處理來培養(yǎng)細胞，將包含10% FBS的培養(yǎng)基用作對照組，并每2天實施WST-1測定(EZ-3000，Daeillab產(chǎn)品)一共達7天來比較細胞生長。以10%向培養(yǎng)基添加WST-1測定試劑，然后在相同培養(yǎng)條件下反應約I小時，并測量450nm處的吸光度(圖23和24)。
[0163]<實施例12>比較不同分離方法的細胞回收率和臍帶干細胞的增殖
[0164]通過無Ca2+和Mg2+的DPBS除去臍帶外部的血，除去外部羊膜，并從臍帶除去2個動脈以比較下述6種細胞分離方法。
[0165]〈12-1〉第一種臍帶干細胞分離方法
[0166]將組織用膠原酶處理，并將細胞培養(yǎng)在包含10% FBS的培養(yǎng)基中。具體地，將除去血的組織切成Imm3的大小，用包含200U/ml膠原酶I型的a-MEM處理5小時來分離細胞，且將2 X IO3個細胞布置于每Icm2的培養(yǎng)皿(包含α-ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、
0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS)以將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，其中在37°C的溫度供應5%的CO2。
[0167]〈12-2〉第二種臍帶干細胞分離方法
[0168]在用膠原酶處理組織后，將細胞培養(yǎng)在包含0.2mg/ml UCE的培養(yǎng)基中。具體地，將除去血的組織切成Imm3的大小，用包含200U/ml膠原酶I型的a-MEM處理5小時來分離細胞，且將2 X IO3個細胞布置于每Icm2的培養(yǎng)皿(包含α -ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS)以將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，其中在37°C的溫度供應5%的 CO2。
[0169]〈12-3〉第三種臍帶干細胞分離方法
[0170]將組織培養(yǎng)在包含10% FBS的培養(yǎng)基中，將細胞培養(yǎng)在包含10% FBS的培養(yǎng)基中。具體地，將除去血的組織切成Imm3的大小，然后置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS的a -MEM中，將組織培養(yǎng)7天，當細胞表現(xiàn)為貼于底部時，將細胞用包含200U/ml膠原酶I型的α-ΜΕΜ處理4小時直至所有胞外基質(zhì)溶解，然后將從其獲得的產(chǎn)物離心并用PBS清洗以僅分離細胞。之后，將2Χ IO3個細胞布置于每Icm2的培養(yǎng)皿(包含α -ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS)以將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，其中在37 °C的溫度供應5 %的CO2。
[0171]〈12-4〉第四種臍帶干細胞分離方法
[0172]將組織培養(yǎng)在包含0.2mg/ml UCE的培養(yǎng)基中，用膠原酶處理，然后將細胞培養(yǎng)在包含0.2mg/ml UCE的培養(yǎng)基中。具體地，將除去血的組織切成Imm3的大小，然后置于用膠原包被的皿中以將該細胞置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS的α-ΜΕΜ中，將組織培養(yǎng)7天，當細胞表現(xiàn)為貼于底部時，將細胞用包含200U/ml膠原酶I型的a -MEM處理4小時。之后，將2Χ IO3個細胞布置于每Icm2的膠原包被的培養(yǎng)皿(包含α -ΜΕΜ，其中包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS)以將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，其中在37 °C的溫度供應5 %的CO2。
[0173]〈12-5〉第五種臍帶干細胞分離方法
[0174]將組織培養(yǎng)在包含10% FBS的培養(yǎng)基中。具體地，將除去血的組織切成Imm3的大小，然后置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS的a -MEM中，然后在37°C溫度供應5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0175]〈12-6〉第六種臍帶干細胞分離方法
[0176]將組織培養(yǎng)在包含0.2mg/ml UCE的培養(yǎng)基中。具體地，將除去血的組織切成Imm3的大小，然后置于包含100U/ml的青霉素、0.1 μ g/ml鏈霉素和10% FBS的a -MEM中，然后在37°C溫度供應5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0177]<實施例13>通過RT-PCR鑒定ES細胞標志物
[0178]將細胞團粒用無Ca2+和Mg2+的DPBS清洗，向其加入1ml裂解緩沖液(iNtRONBiotechnology產(chǎn)品),并依照可自iNtRON Biotechnology獲得的手冊中描述的方法從其分離總RNA。將I μ g RNA通過使用cDNA合成試劑盒(iNtRON Biotechnology產(chǎn)品)在20 μ L的反應溶液中逆轉(zhuǎn)錄，反應溶液包含反應緩沖液、ImM dNTP混合物、0.5 μ g/ μ L oligo (dT) 15、20U RNase抑制劑和20U of AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。反應在42 °C溫度進行60分鐘。將從其獲得的RT產(chǎn)物(cDNA)進行PCR，其通過使用2X PCR Master混合溶液試劑盒(iNtRON Biotechnology產(chǎn)品)，包含10 μ L的反應溶液，反應溶液包含IX Taq緩沖液、0.25U Taq聚合酶、IOpM有義和反義基因特異性引物。擴增一共進行32個循環(huán)且每個循環(huán)包括94°C 30秒的變性，退火30秒，和在72°C溫度的30秒延伸。在完成反應后，將從其獲得的PCR產(chǎn)物加載到2%瓊脂糖凝膠中用于電泳。電泳后將凝膠用溴化乙錠染色，并通過使用紫外線獲得DNA圖像。
[0179][表1]
[0180]弓丨物的DNA序列信息
[0181]
【權(quán)利要求】
1.一種制備哺乳動物臍帶提取物的方法，所述方法包括: 切割臍帶； 將該臍帶放到緩沖液中； 攪動浸在緩沖液中的臍帶； 并離心從所述攪動獲得的產(chǎn)物以獲得上清液。
2.依照權(quán)利要求1制備的臍帶提取物。
3.權(quán)利要求2的臍帶提取物，其中所述臍帶提取物包含胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7(IGFBP-7)、脂籠蛋白-1、CXCL14、瘦素R、IL-23、MIP_la、血管生成素、血小板反應蛋白-2、IL-29和IL-4R的蛋白。
4.一種包含臍帶提取物的血清替代物。
5.權(quán)利要求4的血清替代物，其中所述臍帶提取物是依照權(quán)利要求1的方法制備的。
6.一種細胞培養(yǎng)基,其包含權(quán)利要求4的血清替代物。
7.權(quán)利要求6的細胞培養(yǎng)基，其中所述細胞是動物細胞。
8.權(quán)利要求7的細胞培養(yǎng)基，其中所述動物細胞是干細胞。
9.權(quán)利要求8的細胞培養(yǎng)基，其中所述干細胞是臍帶來源的干細胞。
10.一種用于組織修復的填充劑，其包含臍帶提取物。
11.權(quán)利要求10的用于組織修復的填充劑，其中所述臍帶提取物是依照權(quán)利要求1的方法制備的。
12.一種從哺乳動物臍帶分離干細胞的方法，所述方法包括: 將分塊的臍帶組織與包含哺乳動物臍帶提取物的細胞培養(yǎng)基組合物放置到細胞培養(yǎng)容器中； 將所述臍帶組織用酶處理；并 從所述臍帶組織分離干細胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述細胞培養(yǎng)容器用細胞粘附蛋白包被。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述細胞粘附蛋白選自下組:哺乳動物胎盤來源的膠原、明膠、纖連蛋白、核纖層蛋白和聚-D-溶素。
15.—種培養(yǎng)干細胞的方法，所述方法包括: 向干細胞培養(yǎng)基添加臍帶提取物；并 通過使用所述干細胞培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)干細胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細胞培養(yǎng)容器用細胞粘附蛋白包被。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述干細胞是組織來源的干細胞。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述組織選自下組:脂肪、臍帶、肝和骨膜。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述干細胞培養(yǎng)基不包含血清。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述細胞粘附蛋白選自下組:哺乳動物胎盤來源的膠原、明膠、纖連蛋白、核纖層蛋白和聚-D-溶素。
21.權(quán)利要求15的方法，其中所述干細胞是表達至少一種選自下組的基因的細胞:0ct4、Sox2、KLF4 和 Nanog。
22.權(quán)利要求15的方法，其中所述干細胞對于⑶29、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166是選擇性陽性的，而對于CD34和CD45是選擇性陰性的。
23.權(quán)利要求15的方法，其中當通過使用臍帶提取物來培養(yǎng)所述干細胞時，所述干細胞甚至在傳代培養(yǎng)時均持續(xù)表達至少一種選自下組的基因:0ct4、Sox2、KLF4和Nanog，所述基因都是胚胎干細胞特異性基因。
【文檔編號】C12N5/074GK103998048SQ201280044164
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月11日
【發(fā)明者】崔容秀, 金仙美, 李榮濬 申請人:車比奧及戴奧斯泰有限公司