新型α-1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型α-1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途。根據(jù)本發(fā)明，血液半衰期（t1/2）和血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）通過(guò)N-末端第1位至第25位之間的氨基酸突變以在動(dòng)物細(xì)胞中添加N-糖基化位點(diǎn)而得到顯著增加，因此，所述α-1抗胰蛋白酶變體具有非常好的體內(nèi)穩(wěn)定性并且保留了對(duì)彈性蛋白酶活性的抑制作用。因此，本發(fā)明的α-1抗胰蛋白酶變體可用于預(yù)防或治療α-1抗胰蛋白酶缺乏。
【專利說(shuō)明】新型α-1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新型α -1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]α -1抗胰蛋白酶是一種由394個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其分子量為約50，000道爾頓(Da)，并且其存在于哺乳動(dòng)物的血液中。α-l抗胰蛋白酶是主要的血液蛋白質(zhì)之一，其在血液中的濃度為約 2mg/mL (Robin ff.C.等人，Nature, 298，329-334，1982)，并且α -1抗胰蛋白酶也被稱為α -1蛋白酶抑制劑。α -1抗胰蛋白酶具有至少約100個(gè)天然生成的等位基因，并且根據(jù)等電聚焦(IEF)曲線將α-l抗胰蛋白酶的表型分為A類至Z類。本領(lǐng)域已知，在A類至Z類中，最豐富的M型等位基因存在于大多數(shù)人類的血液中，并且具有至少大約 75 種不同的同種型(Brantley, Μ.等人,Am.J.Med., 84 (suppl.6A), 13-31，1988),而且該M型等位基因保留了作為蛋白酶抑制劑的主要功能。
[0003]總體而言，本領(lǐng)域已知曉的是，大約90%的α-1抗胰蛋白酶的同種型存在于五種PiM亞型中，例如，Μ1、Μ2、Μ3、Μ4和Μ5。在這些亞型中，Μ1、Μ2和M3分別占約67%、約16%和約 ll%(Cox D.ff.&Billingsley D.G., FEBS Lett.，231，327-330，1986)。本領(lǐng)域已知，在這些亞型中，在M2和M3亞型的N末端起的第101位分別具有組氨酸(His)和精氨酸(Arg)，并且已知這些氨基酸的差別不會(huì)影響α -1抗胰蛋白酶的固有活性。
[0004]α-1抗胰蛋白酶是一種在3個(gè)位點(diǎn)上被糖基化的糖蛋白(Mega, Τ.等人，J.Biol.Chem.，255，4057-4061，1980)。X-射線晶體結(jié)構(gòu)顯示α-l抗胰蛋白酶由3個(gè)β片層和8個(gè)α螺旋構(gòu)成，與存在于血液中的其他蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑)類似(ElliotP.R.，等人，JMB，275，41`9-425，1988)。α-1抗胰蛋白酶起到抑制體內(nèi)各種不同類型的蛋白酶的作用，并且其在體內(nèi)所起到的與目前相關(guān)領(lǐng)域已知的疾病有關(guān)的主要作用是抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的活性(Beatty等人，J.Biol.Chem.，255，3931~3934，1980)。α -1抗胰蛋白酶的缺乏引起諸如肺氣腫之類的嚴(yán)重疾病，在肺氣腫這種疾病中，肺部功能由于彈性蛋白的分解而被削弱。而且，已有臨床報(bào)告表明修飾的α-l抗胰蛋白酶的蛋白質(zhì)不由肝臟正常分泌，而在肝臟中積累，這引起肝硬化的發(fā)作。
[0005]近年來(lái)，美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)了幾種從人類血液中提取的產(chǎn)品，并且這幾種產(chǎn)品已作為用于治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的治療劑上市銷售。這些產(chǎn)品的代表性的實(shí)例包括:Prolastin(由 Talecris Plasma Resources Inc 銷售)，Aralast(由 BaxterInc銷售)以及Zemaira (由CSL Behring Inc銷售),這些產(chǎn)品一般以60mg/kg的劑量通過(guò)靜脈注射每周一次給藥于人體。因此，蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)以4g至5g的大劑量每周一次給藥于成人患者持續(xù)一段較長(zhǎng)的時(shí)間。
[0006]根據(jù)數(shù)據(jù)監(jiān)控(DMHC2364)分析可知，在美國(guó)和歐洲大約有200，000位患者具有與α-l抗胰蛋白酶有關(guān)的遺傳問(wèn)題，但是因?yàn)闆](méi)有得到適當(dāng)?shù)脑\斷，這些患者中僅有一些已得到治療。目前為醫(yī)用目的而研發(fā)的所有產(chǎn)品均為從人類血液中提取的α-l抗胰蛋白酶。這種從人類血液中提取的α-l抗胰蛋白酶可能帶有來(lái)自人體的病毒的風(fēng)險(xiǎn)，即使在生產(chǎn)過(guò)程中完全消除所述病毒，也有可能帶有來(lái)自人體的病毒，所述病毒可對(duì)人體引起致命性疾病，所述病毒例如，人免疫缺乏病毒(HIV)，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒。甚至當(dāng)α-l抗胰蛋白酶經(jīng)過(guò)檢測(cè)幾種病原體的血液篩選測(cè)試和病毒滅活過(guò)程時(shí)，也不可能徹底根除非常罕見(jiàn)的還不知曉的病原體。因此，在使用血液提取的α-l抗胰蛋白酶時(shí)總是有感染人體內(nèi)未知的病原體的風(fēng)險(xiǎn)。而且，穩(wěn)定提供未污染的血液用于生產(chǎn)商業(yè)需求量的α-l抗胰蛋白酶也遇到了問(wèn)題。
[0007]作為解決上述問(wèn)題的一個(gè)可選的方案，重組DNA技術(shù)可用于研發(fā)作為治療劑的α-l抗胰蛋白酶。因此，已對(duì)重組DNA技術(shù)進(jìn)行持續(xù)性研究，但是由于各種不同的限制因素，目前還沒(méi)有可商售的重組α -1抗胰蛋白酶。
[0008]本領(lǐng)域已知，因?yàn)樵谌甩?-1抗胰蛋白酶的三個(gè)位點(diǎn)(第46位的天冬酰胺，第83位的天冬酰胺，第247位的天冬酰胺)進(jìn)行了糖基化，所以人α -1抗胰蛋白酶具有3個(gè)N-多糖基團(tuán)。因?yàn)橥ㄟ^(guò)重組DNA方法，使用諸如大腸桿菌之類的微生物生成的α-l抗胰蛋白酶未被糖基化，所以當(dāng)將這樣生成的α-l抗胰蛋白酶給藥于人體時(shí)，其在體內(nèi)具有較短的半衰期(Karnaukhova 等人，Amino Acids, 30, 317-332, 2006, Garver Jr.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，84，1050-1054，1987)。為了解決這個(gè)問(wèn)題并且為了有效生成大量α-1抗胰蛋白酶，通過(guò)使α-l抗胰蛋白酶在植物中表達(dá)展開(kāi)研究。然而，有報(bào)道稱，雖然在植物中表達(dá)的重組α-l抗胰蛋白酶具有源于植物的糖基化，但是其體內(nèi)半衰期比人α-l抗胰蛋白酶的半衰期短(Huang 等人,Biotechnol.Prog., 17, 126-133，2001)。
[0009]為了增加α-l抗胰蛋白酶的體內(nèi)半衰期，Cantin等人報(bào)道了通過(guò)將聚乙二醇結(jié)合至在微生物中表達(dá)的α -1抗胰蛋白酶的半胱氨酸殘基得到的融合蛋白(Cantin等人，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，27，659-665，2002)。這篇文章說(shuō)明當(dāng)分子量為 20kDa 至40kDa的聚乙二醇結(jié)合至在微生物中表達(dá)的α -1抗胰蛋白酶的半胱氨酸殘基時(shí)，與在微生物中表達(dá)的α-1抗胰蛋白酶相比，結(jié)合聚乙二醇后的α-1抗胰蛋白酶具有增加的體內(nèi)半衰期，從而使該半衰期 與人α-l抗胰蛋白酶的半衰期基本類似。然而，當(dāng)聚乙二醇結(jié)合至蛋白質(zhì)時(shí)，各種異相反應(yīng)產(chǎn)物可通過(guò)化學(xué)副反應(yīng)形成。因此，需要額外的處理方法將這些異相反應(yīng)產(chǎn)物除去。而且，因?yàn)樵诮Y(jié)合了 PEG的α-l抗胰蛋白酶中沒(méi)有N-多糖基團(tuán)，所以，這可能會(huì)在用于治療人類時(shí)由暴露的氨基酸序列引起免疫原性問(wèn)題。
[0010]本領(lǐng)域已知，來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞的α -1抗胰蛋白酶的體內(nèi)半衰期與人α-l抗胰蛋白酶的體內(nèi)半衰期基本相同(Garver Jr.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，84，1050-1054，1987)。因此，在動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)具有與人α-l抗胰蛋白酶類似的結(jié)構(gòu)的α-l抗胰蛋白酶的方法可為優(yōu)選的。雖然來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞的α-l抗胰蛋白酶具有優(yōu)勢(shì)，但是使用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)α -1抗胰蛋白酶具有如下問(wèn)題:一般而言，使用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)α -1抗胰蛋白酶的方法比在微生物中生產(chǎn)α -1抗胰蛋白酶的方法更昂貴。
[0011]同時(shí)，在α-l抗胰蛋白酶的環(huán)區(qū)域添加糖基化位點(diǎn)的技術(shù)已被認(rèn)為會(huì)使α-l抗胰蛋白酶的體內(nèi)半衰期增加?？傮w而言，可以推測(cè)，當(dāng)在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)被糖基化時(shí)，由于當(dāng)將糖基化的蛋白質(zhì)給藥于人體時(shí)其流體力學(xué)體積增大，因此與未糖基化的蛋白質(zhì)相比，糖基化的蛋白質(zhì)可被認(rèn)為具有增加的體內(nèi)半衰期。然而，從促紅細(xì)胞生成素的實(shí)例中可見(jiàn)，基于糖基化的位置的不同，向生理學(xué)活性蛋白質(zhì)中添加糖基化位點(diǎn)或改變糖基化位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期產(chǎn)生很大影響(Eliott等人，Nat.Biotechnol.，21，414-421，2003)。因此，為了增加體內(nèi)半衰期和生理穩(wěn)定性而向α -1抗胰蛋白酶中添加糖基化位點(diǎn)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要廣泛地證明向α-l抗胰蛋白酶的哪個(gè)或哪幾個(gè)位置添加糖基化位點(diǎn)。
[0012]綜上所述，為了提高α-l抗胰蛋白酶的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已有多種不同的使用重組DNA技術(shù)制備α -1抗胰蛋白酶的方法。然而，由于存在上述各種各樣的問(wèn)題，這些現(xiàn)有方法并不適用于作為藥物的α-l抗胰蛋白酶的研發(fā)。因此，本領(lǐng)域亟需一種新的用于研發(fā)在體內(nèi)具有非常好的穩(wěn)定性的重組α -1抗胰蛋白酶的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013][技術(shù)問(wèn)題]
[0014]為了制備具有臨床效用的重組α-l抗胰蛋白酶，本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)在α-l抗胰蛋白酶的各個(gè)不同的特定位置添加糖基化位點(diǎn)以制備α -1抗胰蛋白酶變體，發(fā)現(xiàn)該α -1抗胰蛋白酶變體在體內(nèi)具有非常好的穩(wěn)定性并且該α -1抗胰蛋白酶變體保留了對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用，具有顯著增加的血液半衰期(t1/2)以及顯著增加的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)。因此，本發(fā)明是基于上述這些事實(shí)完成的。
[0015][技術(shù)方案]
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)而制備的α -1抗胰蛋白酶變體。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一種示例性的實(shí)施方式，所述α -1抗胰蛋白酶變體可具有添加于其上的I至3個(gè)糖基化位點(diǎn)。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的另一示例性的實(shí)施方式，所述特定位點(diǎn)可存在于N-末端的第3位至第13位之間。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的又一示例性的實(shí)施方式，所述特定位點(diǎn)可存在于N-末端的第9位或第12位。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的再一示例性的實(shí)施方式，所述特定位點(diǎn)可位于第4位和第9位，第4位和第12位或第9位和第12位。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種制備α -1抗胰蛋白酶變體的方法，所述方法包括取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)由具有添加于其上的糖基化位點(diǎn)的α-l抗胰蛋白酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過(guò)所述細(xì)胞表達(dá)α -1抗胰蛋白酶變體蛋白，以及純化并回收表達(dá)的α-l抗胰蛋白酶變體蛋白。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的組合物，所述組合物包含作為活性成分的α-l抗胰蛋白酶變體，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
[0023]根據(jù)本發(fā)明 的一種示例性的實(shí)施方式，所述α -1抗胰蛋白酶缺乏可為慢性阻塞性肺病或肝硬化。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括將治療有效量的α-l抗胰蛋白酶變體給藥于患者，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供一種具有增加的體內(nèi)半衰期的α-l抗胰蛋白酶變體融合蛋白，其中，所述融合蛋白通過(guò)連接兩個(gè)α -1抗胰蛋白酶變體制備，其中每個(gè)α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供一種α -1抗胰蛋白酶變體融合蛋白，所述融合蛋白包括具有增加的體內(nèi)半衰期的異質(zhì)蛋白，其中，所述融合蛋白通過(guò)將α-l抗胰蛋白酶變體連接至所述異質(zhì)蛋白制備，并且所述α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的一種示例性的實(shí)施方式，所述α -1抗胰蛋白酶變體在357位(Ρ2位)上可具有氨基酸脯氨酸，該脯氨酸進(jìn)一步被天冬酰胺取代。
[0028][有益效果]
[0029]根據(jù)本發(fā)明的α -1抗胰蛋白酶變體，由于其血液半衰期(t1/2)和血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)通過(guò)在α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位和第25位之間的氨基酸突變添加N-糖基化位點(diǎn)而得到顯著增加，因此具有非常好的體內(nèi)穩(wěn)定性并且保留了對(duì)彈性蛋白酶活性的抑制作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體在預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏方面有用。而且，根據(jù)本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體可用于治療α-l抗胰蛋白酶缺乏，并且當(dāng)異質(zhì)蛋白連接至α-l抗胰蛋白酶變體時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體可用于提高異質(zhì)蛋白的體內(nèi)半衰期。`【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]在下面的【具體實(shí)施方式】以及附圖中對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的這些特征、方面和優(yōu)勢(shì)以及其他特征、方面和優(yōu)勢(shì)進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。在附圖中:
[0031]圖1為表示根據(jù)本發(fā)明的α -1抗胰蛋白酶載體(ρΤ003)的示意圖。
[0032]圖2為表示根據(jù)本發(fā)明的α -1抗胰蛋白酶變體的序列和位點(diǎn)的圖。
[0033]圖3為表示根據(jù)本發(fā)明的純化的α -1抗胰蛋白酶及其變體的SDS-PAGE結(jié)果的圖。
[0034]圖4為根據(jù)本發(fā)明繪制的在皮下給藥之后血漿衍生的α -1抗胰蛋白酶和在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組α-l抗胰蛋白酶的藥代動(dòng)力學(xué)圖。
[0035]圖5為根據(jù)本發(fā)明繪制的在皮下給藥之后α -1抗胰蛋白酶及其變體的藥代動(dòng)力學(xué)圖。
[0036]圖6為根據(jù)本發(fā)明繪制的在皮下給藥之后血漿衍生的α -1抗胰蛋白酶和重組α -1抗胰蛋白酶變體的藥代動(dòng)力學(xué)圖。
[0037]圖7為根據(jù)本發(fā)明繪制的在皮下給藥和靜脈內(nèi)給藥之后α -1抗胰蛋白酶變體的藥代動(dòng)力學(xué)圖。
[0038]圖8為根據(jù)本發(fā)明繪制的在靜脈內(nèi)給藥之后α -1抗胰蛋白酶及其二聚體的藥代動(dòng)力學(xué)圖。[0039]圖9為根據(jù)本發(fā)明繪制的在皮下給藥之后人生長(zhǎng)激素/ α -1抗胰蛋白酶變體融合物的藥代動(dòng)力學(xué)圖。
[0040]圖10為根據(jù)本發(fā)明繪制的在皮下給藥之后粒細(xì)胞集落刺激因子/ α -1抗胰蛋白酶變體融合物的藥代動(dòng)力學(xué)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041]本發(fā)明涉及通過(guò)取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)而制備的α -1抗胰蛋白酶變體。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的α -1抗胰蛋白酶變體的特征在于:除了 α _1抗胰蛋白酶的三個(gè)糖基化位點(diǎn)(第46位的天冬酰胺、第83位的天冬酰胺和第247位的天冬酰胺)之外，對(duì)α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸進(jìn)行取代以添加N-糖基化位點(diǎn)。所添加的糖基化位點(diǎn)的數(shù)目不受限制。例如，糖基化位點(diǎn)的數(shù)目可為I至3。
[0043]可在人α -1抗胰蛋白酶的N-末端的特定位點(diǎn)添加N-糖基化位點(diǎn)以形成序列Asn-X-Thr/Ser,該序列是編碼N-末端的第I位至第25位之間的N-多糖結(jié)合位點(diǎn)的序列。優(yōu)選地，用天冬酰胺取代存在于人α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第3位至第13位之間的氨基酸谷酰胺(優(yōu)選地，存在于N-末端的第9位或第12位的氨基酸谷酰胺)以添加糖基化位點(diǎn)。通過(guò)添加糖基化位點(diǎn)而形成的變體可具有如下結(jié)構(gòu):在該結(jié)構(gòu)的第4位和第9位、第4位和第12位或第9位和第12位添加糖類。除了本文所述的特定位點(diǎn)之外，α -1抗胰蛋白酶變體可在N-末端的25位之內(nèi)的另一位點(diǎn)上被糖基化。
[0044]本發(fā)明還涉及制備α -1抗胰蛋白酶變體的方法，所述方法包括取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第 25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)，在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)由具有添加于其上的糖基化位點(diǎn)的α-l抗胰蛋白酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)溶液中表達(dá)α-l抗胰蛋白酶變體蛋白，以及純化并回收表達(dá)的α-l抗胰蛋白酶變體蛋白。
[0045]重組DNA技術(shù)可用作上述添加N-糖基化位點(diǎn)的技術(shù)，并且氨基酸可通過(guò)基因操縱被取代、插入和除去以添加N-糖基化位點(diǎn)。人α-l抗胰蛋白酶的N-末端的大約20個(gè)氨基酸構(gòu)成α-l抗胰蛋白酶的X-射線晶體結(jié)構(gòu)中不易被檢測(cè)到的區(qū)域(PDB編碼:1QLP，2QUG, 3CWL, 1PSI, 7API, IKCT (www.pdb.0rg))。在這種情況下，α -1抗胰蛋白酶的N-末端區(qū)域具有非常靈活且不被結(jié)構(gòu)化的三維結(jié)構(gòu)。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的α -1抗胰蛋白酶變體可通過(guò)使用定點(diǎn)誘變法使至少一個(gè)氨基酸發(fā)生突變來(lái)制備。例如，當(dāng)人α -1抗胰蛋白酶的第9位上的谷酰胺被天冬酰胺取代或第148位上的甘氨酸被天冬酰胺取代時(shí)，并且當(dāng)修飾的人α -1抗胰蛋白酶在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，在取代谷酰胺(第9位)或甘氨酸(第148位)的天冬酰胺殘基上形成糖基化位點(diǎn)。而且，當(dāng)?shù)?48位上的甘氨酸被蘇氨酸取代時(shí)，在第146位的天冬酰胺上形成新的糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)可以這種方式添加至α -1抗胰蛋白酶的各個(gè)不同的位置。
[0047]在本發(fā)明中，α -1抗胰蛋白酶變體通過(guò)在人α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上進(jìn)行氨基酸取代而添加除了人α-l抗胰蛋白酶的三個(gè)糖基化位點(diǎn)(第46位的天冬酰胺、第83位的天冬酰胺和第247位的天冬酰胺)之外的N-糖基化位點(diǎn)來(lái)制備，所述α-l抗胰蛋白酶的N-末端在α-l抗胰蛋白酶(AlAT)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)中未被結(jié)構(gòu)化。隨后，所述α-l抗胰蛋白酶變體在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)，并且使用色譜法純化至高純度。
[0048]在SDS-PAGE測(cè)試中，在比野生型α -1抗胰蛋白酶更高的位置上出現(xiàn)的染色帶上觀察到純化的具有添加于其上的N-糖基化位點(diǎn)的α-l抗胰蛋白酶變體。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明α -1抗胰蛋白酶變體的分子量通過(guò)糖基化作用而提高。
[0049]而且，純化的α -1抗胰蛋白酶變體由于血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)和體內(nèi)半衰期(t1/2)的顯著提高而在體內(nèi)具有非常好的穩(wěn)定性。然而，在用蘇氨酸取代α-l抗胰蛋白酶第26位上的氨基酸的變體(I26T)的情況下，體內(nèi)穩(wěn)定性沒(méi)有改善，甚至通過(guò)添加N-糖基化位點(diǎn)也沒(méi)有使體內(nèi)穩(wěn)定性得到改善。而且，如W02008/151845中所描述的將糖基化位點(diǎn)添加至環(huán)區(qū)域(環(huán)A、環(huán)B、環(huán)C、環(huán)D或環(huán)E)或環(huán)區(qū)域附近的α -1抗胰蛋白酶變體未對(duì)體內(nèi)穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著的改善作用。此外，因?yàn)榄h(huán)區(qū)域的糖基化可影響實(shí)質(zhì)上作為蛋白酶抑制劑起作用的α-l抗胰蛋白酶的活性，所以，選擇不影響α-l抗胰蛋白酶活性的糖基化位點(diǎn)非常重要。
[0050]本發(fā)明還確認(rèn)了純化的α-l抗胰蛋白酶變體保留了對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用。此外，本領(lǐng)域已知人α-l抗胰蛋白酶的結(jié)合速率常數(shù)通常為1.0iOJXlO5M^(Boudier C., 1994)至 UTXlO6IVr1S-1 (Terashima Μ,等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.,52(4) ,516-523，1999)。根據(jù)本發(fā)明，野生型人α-1抗胰蛋白酶及其變體的結(jié)合速率常數(shù)和平衡常數(shù)與人α-l抗胰蛋白酶的結(jié)合速率常數(shù)和平衡常數(shù)類似。由此可見(jiàn)，α -1抗胰蛋白酶的N-末端的糖基化不影響對(duì)彈性蛋白酶活性的抑制作用。
[0051]本發(fā)明還涉及具有增加的體內(nèi)半衰期的α-1抗胰蛋白酶變體融合蛋白。在本文中，融合蛋白通過(guò)將兩個(gè)α -1抗胰蛋白酶變體彼此連接來(lái)制備。
[0052]本發(fā) 明的發(fā)明人制備了 α -1抗胰蛋白酶雙變體，在該雙變體中，357位(α -1抗胰蛋白酶變體的Ρ2位置)的氨基酸脯氨酸被天冬酰胺進(jìn)一步取代，本發(fā)明的發(fā)明人制備了融合蛋白，在該融合蛋白中，粒細(xì)胞集落刺激因子與α-l抗胰蛋白酶的雙變體連接，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試并確定融合蛋白具有提高的體內(nèi)穩(wěn)定性(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5)。從這些結(jié)果可知，當(dāng)將生理活性蛋白連接至α-1抗胰蛋白酶的雙變體時(shí)，諸如生理活性蛋白之類的異質(zhì)蛋白的體內(nèi)半衰期增加。
[0053]因此，本發(fā)明涉及α-1抗胰蛋白酶變體融合蛋白，在該融合蛋白中，另一異質(zhì)蛋白的體內(nèi)半衰期通過(guò)將所述異質(zhì)蛋白連接至α-l抗胰蛋白酶變體而增加。所述異質(zhì)蛋白的種類不受限制，但是可為生理活性肽或生理活性蛋白。
[0054]具有增加的半衰期的α -1抗胰蛋白酶變體融合蛋白可通過(guò)將兩個(gè)或兩個(gè)以上純化的α-1抗胰蛋白酶變體連接來(lái)制備。在先前的研究中，Sytkowski, A.J.等人報(bào)道了當(dāng)使用合適的連接體連接促紅細(xì)胞生成素(EPO)以制備EPO-EPO融合蛋白時(shí)，所述融合蛋白相對(duì)于EPO單體具有顯著增加的活性和較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期(Sytkowski, A.J.，等人，J.Biol.Chem.，274，24773-24778，1999)。因此，當(dāng)將兩個(gè)或兩個(gè)以上本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體彼此連接時(shí)，可預(yù)見(jiàn)到，融合蛋白的半衰期相對(duì)于α-l抗胰蛋白酶變體單體增加。進(jìn)一步地，當(dāng)具有較短的體內(nèi)半衰期的生理活性肽或免疫調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞因子等與根據(jù)本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體連接時(shí)，可預(yù)見(jiàn)到，體內(nèi)半衰期顯著增加，從而顯示出充分的穩(wěn)定作用。[0055]本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的組合物，所述組合物包含作為活性成分的α-l抗胰蛋白酶變體。
[0056]此外，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療α -1抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括將治療有效量的α-l抗胰蛋白酶變體給藥于患者。
[0057]如上所述，根據(jù)本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體，由于通過(guò)在α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間進(jìn)行氨基酸突變而添加N-糖基化位點(diǎn)使血液半衰期(t1/2)和血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)顯著增加，具有非常好的體內(nèi)穩(wěn)定性并且保留了對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的α-l抗胰蛋白酶變體在預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏方面有用。α -1抗胰蛋白酶缺乏包括慢性阻塞性肺病(COPD)或肝硬化，優(yōu)選地包括肺氣腫，但是本發(fā)明不限于此。
[0058]除了 α -1抗胰蛋白酶變體之外，根據(jù)本發(fā)明的組合物還可包括至少一種已知的具有預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏作用的活性成分。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的組合物可被制成除了上述用于給藥的活性成分之外還進(jìn)一步包括至少一種藥學(xué)上可用的載體。所述藥學(xué)上可用的載體可與選自鹽水、無(wú)菌水、林格氏(Ringer’ s)溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、丙三醇、乙醇及其混合物中的至少一種聯(lián)合使用。在需要時(shí)，可添加諸如抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑之類的另一常規(guī)添加劑。稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑也可加至組合物中，所述組合物隨后可被配制成注射用制劑、丸劑、膠囊、顆?；蚱瑒＿M(jìn)一步地，根據(jù)疾病或成分，所述組合物可通過(guò)使用相關(guān)領(lǐng)域已知的合適方法或在Remington’s Pharmaceutical Science (最新版本，Mack Publishing Company, Easton PA)中公開(kāi)的方法被配制成理想的劑型。
[0060]根據(jù)本發(fā)明的組合物可根據(jù)期望的方法口服給藥或腸胃外給藥(例如，靜脈注射、皮下注射或腹膜內(nèi)注射、吸入 給藥或局部施用)，并且通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的α -1抗胰蛋白酶變體可將本發(fā)明的組合物用于基因療法。組合物的劑量可根據(jù)患者的體重、年齡、性別和健康狀況、飲食、給藥時(shí)間、給藥方法、釋放速率以及疾病的嚴(yán)重程度而發(fā)生改變。雖然每周給藥一次的α -1抗胰蛋白酶變體的劑量低于60mg/kg ( α -1抗胰蛋白酶的劑量),但是該劑量能夠使組合物表現(xiàn)出基本相同的臨床療效。而且，當(dāng)以與野生型α-l抗胰蛋白酶相同的劑量給藥α-l抗胰蛋白酶變體時(shí)，可預(yù)見(jiàn)到的是，所述組合物表現(xiàn)出相同的臨床療效，甚至當(dāng)給藥持續(xù)期進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，所述組合物也表現(xiàn)出相同的臨床療效。
[0061]本發(fā)明的組合物可單獨(dú)使用或與手術(shù)、激素療法、藥物治療以及使用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的方法聯(lián)合使用。
[0062]下文提供優(yōu)選的實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例以有助于理解本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本文提供的詳細(xì)描述僅僅意在更好地理解本發(fā)明，而無(wú)意限定本發(fā)明的范圍。
[0063]實(shí)施例1: α -1抗胰蛋白酶及其變體和二聚體的制備
[0064]1-1.構(gòu)律表汰載體DAVl
[0065]將基于工業(yè)使用目的通過(guò)對(duì)母體載體pSGHVO (GenBank登錄號(hào):AF285183)進(jìn)行合適地修飾研制得到的PAVl載體用作本發(fā)明克隆所需的表達(dá)載體。所述母體載體是實(shí)驗(yàn)室載體，在源于人的蛋白質(zhì)以高濃度過(guò)表達(dá)且從動(dòng)物細(xì)胞中釋放出來(lái)，但所述蛋白質(zhì)在諸如大腸桿菌之類的細(xì)菌中表達(dá)時(shí)不表現(xiàn)出活性的情況下，將所述實(shí)驗(yàn)室載體構(gòu)建為易于純化具有生理活性的蛋白質(zhì)。然而，因?yàn)槟阁w載體在用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)受到各種限制，所以對(duì)母體載體進(jìn)行修飾以在具有高蛋白質(zhì)表達(dá)水平的工業(yè)中使用，這是pSGHVO載體的最大的優(yōu)點(diǎn)。
[0066]1-2.構(gòu)律α-1杭胰蛋白酶(亞型M3)載體(DT003)
[0067]為了構(gòu)建α-l抗胰蛋白酶載體，通過(guò)將α-l抗胰蛋白酶(M3)基因克隆至pAVl載體中，使用hMU001448 (KRIBB)作為模板構(gòu)建α-1抗胰蛋白酶載體(PT003)。具體而言，hMU001448 (KRIBB)模板通過(guò)使用兩個(gè)引物(XhoAT正向引物(5，-CCC TCC TCG AGA ATGCCG TCT TCT GTC TCG-3，, SEQ ID NO:1)和 ATNot 反向引物(5，-GGG CCC GCG GCC GCAGTT ATT TTT GGG TGG G_3，, SEQ ID N0:2))的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的核苷酸的兩端由兩種限制性酶XhoI和NotI消化，并且與具有Xhol/Notl限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體PAVl融合，從而構(gòu)建α-l抗胰蛋白酶載體(PT003，SEQ ID NO: 39)。該α-l抗胰蛋白酶載體(PT003)示例性地顯示于圖1。
[0068]1-3.α-l抗胰蛋白酶(M3)變體的制備
[0069]為了制備具有添加于其上的糖基化位點(diǎn)的多種α -1抗胰蛋白酶變體，將實(shí)施例1-2中制備的α-1抗胰蛋白酶載體(ρΤ003)用作模板。下表1中所列的正向引物和反向引物對(duì)以及誘變?cè)噭┖?Enzynomix, EZchange?定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?用于制備α -1抗胰蛋白酶變體。α -1抗胰蛋白酶變體的序列和位點(diǎn)如圖2所示。
[0070]因?yàn)樗笑?-1抗胰蛋白酶變體的突變目的是為了添加N-糖基化位點(diǎn)，所以，原始氨基酸通常被天冬酰胺取代以形成序列Asn-X-Thr，已知序列Asn-X-Thr為動(dòng)物細(xì)胞中的N-糖基化位點(diǎn)。然而，在一些情況下，為了使用在原始DNA序列中出現(xiàn)的天冬酰胺殘基，用蘇氨酸取代與天冬酰胺殘基相鄰的氨基酸。
[0071]表1
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種α-l抗胰蛋白酶變體，該變體通過(guò)對(duì)α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸進(jìn)行取代以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
2.如權(quán)利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述α-1抗胰蛋白酶變體具有添加于其上的I個(gè)至3個(gè)糖基化位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述特定位點(diǎn)存在于所述N-末端的第3位至第13位之間。
4.如權(quán)利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述特定位點(diǎn)存在于所述N-末端的第9位或第12位。
5.如權(quán)利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述特定位點(diǎn)存在于第4位和第9位、第4位和第12位或第9位和第12位。
6.一種制備α-1抗胰蛋白酶變體的方法，所述方法包括: a)取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)； b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 用其上添加有糖基化位點(diǎn)的α-1抗胰蛋白酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞； c )通過(guò)所述細(xì)胞表達(dá)α-l抗胰蛋白酶變體蛋白；以及 d)純化并回收表達(dá)的α-l抗胰蛋白酶變體蛋白。
7.一種用于預(yù)防或治療α-1抗胰蛋白酶缺乏的組合物，所述組合物包含作為活性成分的α-l抗胰蛋白酶變體，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述α-l抗胰蛋白酶缺乏是慢性阻塞性肺病或肝硬化。
9.一種預(yù)防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括: 將治療有效量的α-l抗胰蛋白酶變體給藥于患者，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
10.一種具有增加的體內(nèi)半衰期的α-1抗胰蛋白酶變體融合物，其中，所述融合物通過(guò)連接兩個(gè)α -1抗胰蛋白酶變體來(lái)制備，每個(gè)α -1抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α _1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
11.一種包含具有提高的體內(nèi)半衰期的異質(zhì)蛋白的α-l抗胰蛋白酶變體融合物，其中，所述融合物通過(guò)將α-l抗胰蛋白酶變體連接至所述異質(zhì)蛋白來(lái)制備，并且，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過(guò)取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點(diǎn)上的氨基酸以添加糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
12.如權(quán)利要求11所述的α-1抗胰蛋白酶變體融合物，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體在第357位具有氨基酸脯氨酸，該脯氨酸進(jìn)一步被天冬酰胺取代，所述第357位為Ρ2位置。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103827141SQ201280044912
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月15日
【發(fā)明者】樸淳宰, 鄭惠信, 李尚美, 金知宣 申請(qǐng)人:阿特根公司