用于胸膜間皮瘤患者的早期發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)志物及其表達(dá)分析方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題是開發(fā)簡(jiǎn)便且廉價(jià)、可信度高的間皮瘤的檢查方法、和該檢查方法中使用的試劑盒。作為解決問題的方法是，本發(fā)明提供間皮瘤的檢查方法，包括受試者的血液和胸水中的至少任1種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟。有時(shí)所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟使用針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。本發(fā)明提供用于間皮瘤的診斷的試劑盒，包含針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。在本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述間皮瘤的診斷是判斷可能患間皮瘤的受試者是間皮瘤的患者還是健常者。本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述間皮瘤的診斷是判斷可能患間皮瘤的受試者是間皮瘤的患者還是除了間皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
【專利說明】用于胸膜間皮瘤患者的早期發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)志物及其表達(dá)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及間皮瘤的檢查方法、和用于間皮瘤的診斷的試劑盒。具體地，涉及包含血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白(Periostin)的濃度的測(cè)定步驟的間皮瘤的檢查方法、和包含針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體的用于間皮瘤的診斷的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]已知間皮瘤由于石棉的吸引而發(fā)生。間皮瘤根據(jù)發(fā)生部位而分類為胸膜間皮瘤、腹膜間皮瘤和心膜間皮瘤。胸膜中的發(fā)生最多，占全部間皮瘤的8成?9成(非專利文獻(xiàn)I)。良性的胸膜間皮瘤稱為纖維性間皮瘤，在肺炎、外傷等之后，胸膜發(fā)生纖維增生，結(jié)果形成局限性的腫塊；與此相對(duì)，惡性胸膜間皮瘤是由胸膜間皮(覆蓋包裹肺的胸膜的肺側(cè)表面的二重的膜)發(fā)生的腫瘤，是惡性度高的腫瘤。惡性胸膜間皮瘤進(jìn)行組合了外科療法、內(nèi)科療法和放射線療法的治療，但仍屬于預(yù)后差的腫瘤之一。間皮瘤具有潛伏期非常長(zhǎng)的特征，從向石棉的曝露到間皮瘤發(fā)生的時(shí)間為11?54年(中位數(shù)38.6年)。鑒于日本石棉使用最多的時(shí)期為1970?1990年，預(yù)計(jì)到2030年為止間皮瘤患者持續(xù)增加。該長(zhǎng)的潛伏期連同沒有對(duì)早期發(fā)現(xiàn)有用的篩選法的現(xiàn)狀，造成了發(fā)病發(fā)現(xiàn)的延遲。晚期例的經(jīng)過極不良，快速擴(kuò)散、數(shù)年以內(nèi)死亡的病例為大半。然而，對(duì)于可以治愈切除的早期發(fā)現(xiàn)例，卻可以期待長(zhǎng)期生存。因此，能夠早期發(fā)現(xiàn)的新的篩選檢查的開發(fā)成為迫切的課題。
[0003]惡性胸膜間皮瘤的早期診斷極困難，當(dāng)因?yàn)樾赝础⑿胤e水造成的呼吸困難等自覺癥狀而發(fā)現(xiàn)時(shí)，基本上已經(jīng)是晚期。作為在診斷惡性胸膜間皮瘤時(shí)有用的標(biāo)志物，可列舉胸水中的透明質(zhì)酸、CYFRA、CEA等，但具有作為樣品必須采集胸水、診斷精度低等大的問題。進(jìn)而，為了進(jìn)行確實(shí)的診斷，必須使用活檢材料進(jìn)行真正的病理組織診斷，精神、肉體、社會(huì)的負(fù)擔(dān)極大。另外，惡性胸膜間皮瘤作為組織型分為上皮型、肉瘤型、其混合型(雙相型)，但特別是肉瘤型沒有有效的診斷方法，預(yù)后劣惡。因此，多數(shù)情況下診斷為惡性間皮瘤診斷時(shí)，已經(jīng)大范圍擴(kuò)散、不可能進(jìn)行根治手術(shù)，預(yù)后極不良，I年生存率為50%左右，2年生存率為20%左右。
[0004]由于石棉曝露而非腫瘤性炎癥性的障害在肺、胸膜內(nèi)發(fā)生，因此石棉曝露者在間皮瘤未發(fā)病的階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)醫(yī)學(xué)影像學(xué)異常。因此，認(rèn)為醫(yī)學(xué)影像學(xué)檢查作為篩選有用性低。另外相對(duì)于曝露者的數(shù)，實(shí)際發(fā)病的病例的比例小。現(xiàn)狀是渴望對(duì)于石棉曝露者簡(jiǎn)便且廉價(jià)、可信度高的檢查方法。
[0005]首先，本
【發(fā)明者】們著眼于作為血中的腫瘤標(biāo)志物的間皮素(mesothelin)陽性例限于上皮型的間皮瘤，嘗試探索對(duì)于肉瘤型的胸膜間皮瘤例也能確認(rèn)陽性例的標(biāo)志物。肉瘤型胸膜間皮瘤的診斷被倡導(dǎo)必須進(jìn)行細(xì)胞診斷、胸膜活檢、圖像診斷，診斷極困難(非專利文獻(xiàn)2)。本
【發(fā)明者】們經(jīng)由利用了質(zhì)譜裝置的IDA(信息相關(guān)采集,Information DependentAnalysis)、運(yùn)用了數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析、使用了 DNA微陣列的與基因表達(dá)的比較、利用基序(motif)檢索的蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)、利用與內(nèi)標(biāo)資料的比較的定量化等工序，通過應(yīng)用蛋白質(zhì)組分析結(jié)果的挖掘技術(shù)來分析胸膜間皮瘤組織樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，嘗試獲得數(shù)百種蛋白質(zhì)的表達(dá)信息，并成功地獲得。
[0006]進(jìn)而為了進(jìn)行作為血液中的標(biāo)志物的候選縮小研究，進(jìn)行了以血液為對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)分析:利用了質(zhì)譜裝置的MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，Multiple Reaction Monitoring)。并且，對(duì)于所述數(shù)百種蛋白質(zhì)中的特別數(shù)十種蛋白質(zhì)，與作為對(duì)照的正常胸膜間皮組織樣品比較，確認(rèn)了在惡性胸膜間皮瘤組織樣品中其存在量增大。進(jìn)而，在惡性胸膜間皮瘤病例血液樣品中，與作為對(duì)照的除了間皮瘤以外的呼吸器官疾患病例比較，確認(rèn)了骨膜蛋白(Periostin)的濃度上升。
[0007]骨膜蛋白最初稱為成骨細(xì)胞特異性因子-2 (0SF-2)，是作為在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞中特異地表達(dá)的基因而被分離鑒定的分子(非專利文獻(xiàn)3)。由骨膜蛋白基因所編碼的氨基酸序列包含一般的信號(hào)序列、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(Cysteine-richDomain)、4次重復(fù)的由約150個(gè)氨基酸組成的成束蛋白(Fasciclin) I結(jié)構(gòu)域、和羧基末端結(jié)構(gòu)域。骨膜蛋白中存在4種僅羧基末端區(qū)不同的剪接突變體的同種型。有骨膜蛋白不是在肺癌的腫瘤細(xì)胞本身、而是在腫瘤周圍的間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)4、5)；血清中的骨膜蛋白雖然沒有發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞性肺癌存在診斷中的有用性，但有可能成為預(yù)后的標(biāo)志物的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)4、5);在乳癌中高表達(dá)的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)6);在胸腺癌中高表達(dá)的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)7);在胰癌中高表達(dá)的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)8)。但是這些癌是與間皮瘤完全不同的病狀。進(jìn)而，有公開了識(shí)別骨膜蛋白的形成剪接突變體的羧基末端結(jié)構(gòu)域的第17外顯子的氨基酸的抗體在心疾患和其他癌種的診斷和治療中有效的專利申請(qǐng)(專利文獻(xiàn)1、2)。但是，關(guān)于骨膜蛋白的表達(dá)和在血中的存在、與間皮瘤的關(guān)系到目前為止未知。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:國際公開第W02007/077934號(hào)小冊(cè)子
[0011]專利文獻(xiàn)2:國際公開第W02009/001940號(hào)小冊(cè)子
[0012]非專利文獻(xiàn)
[0013]非專利文獻(xiàn)1:Fujimoto N.等、J Cancer Res Clin Oncol.、136:1755、2010
[0014]非專利文獻(xiàn)2:Husain 等、Arch.Pathol.Lab.Med.> 133:1317、2009
[0015]非專利文獻(xiàn)3: Takeshita S.等、Biochem J、294:271、1993
[0016]非專利文獻(xiàn)4: Sasaki H.等、Jpn J Cancer Res.、92:869、2001
[0017]非專利文獻(xiàn)5:Sasaki H.等、Cancer.、92:843、2001
[0018]非專利文獻(xiàn)6:Shao R.等、Mol Cell Biol.,24:3992,2004
[0019]非專利文獻(xiàn)7: Sasaki H.等、Cancer Lett.、72:37、2001
[0020]非專利文獻(xiàn)8:Baril P.等、0ncogene、26:2082、2007

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]發(fā)明要解決的課題
[0022]需要開發(fā)簡(jiǎn)便且廉價(jià)、可信度高的間皮瘤的檢查方法，和該檢查方法中使用的試劑盒。[0023]用于解決課題的方法
[0024]本發(fā)明提供間皮瘤的檢查方法，包括受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白(Periostin)蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟。
[0025]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法中，有時(shí)所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟使用針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。
[0026]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法中，有時(shí)所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體是與包含序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。
[0027]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法中，有時(shí)使用能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體。
[0028]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法中，有時(shí)所述間皮瘤是惡性胸膜間皮瘤。
[0029]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法中，有時(shí)所述間皮瘤是肉瘤型或雙相型的惡性胸膜間皮瘤。
[0030]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法中，有時(shí)所述血液樣品是受試者的血漿或血清的樣品O
[0031]本發(fā)明提供用于間皮瘤的診斷的試劑盒，包含針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。
[0032]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體是與包含序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。有時(shí)所述試劑盒通過ELISA法來測(cè)定人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度。
[0033]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體是能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體。
[0034]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)包含固定化了能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體中的一種的固體支持體、和針對(duì)所述2種抗體中的另一種的特異性結(jié)合配偶體(partner)。有時(shí)所述試劑盒通過夾心ELISA法來測(cè)定人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度。
[0035]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述間皮瘤的診斷是判斷可能患間皮瘤的受試者是否是間皮瘤的患者。
[0036]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述間皮瘤的診斷是判斷可能患間皮瘤的受試者是間皮瘤的患者還是除了間皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
[0037]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述間皮瘤的患者是惡性胸膜間皮瘤的患者。
[0038]本發(fā)明的用于間皮瘤的診斷的試劑盒中，有時(shí)所述間皮瘤的患者是肉瘤型或雙相型的惡性胸膜間皮瘤的患者。
[0039]本發(fā)明提供間皮瘤的診斷方法，包括受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟。
[0040]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟使用針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。
[0041]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體是與包含序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。
[0042]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟使用能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體。
[0043]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述間皮瘤的診斷是判斷可能患間皮瘤的受試者是否是間皮瘤的患者。
[0044]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述間皮瘤的診斷是判斷可能患間皮瘤的受試者是間皮瘤的患者還是除了間皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
[0045]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述間皮瘤的患者是惡性胸膜間皮瘤的患者。
[0046]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，有時(shí)所述間皮瘤的患者是肉瘤型或雙相型的惡性胸膜間皮瘤的患者。
[0047]本發(fā)明中，間皮瘤是來源于間皮細(xì)胞的腫瘤，根據(jù)基于原發(fā)組織的分類，也指胸膜間皮瘤、腹膜間皮瘤和心膜間皮瘤中的任一種。另外，根據(jù)基于構(gòu)成腫瘤組織的細(xì)胞型的分類，惡性間皮瘤也指上皮型、肉瘤型、和它們的混合型(雙相型)的任一種。本發(fā)明的間皮瘤有時(shí)是胸膜間皮瘤，有時(shí)是肉瘤型惡性胸膜間皮瘤。間皮瘤的檢查對(duì)于石棉曝露者的健康是重要的，因此本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法優(yōu)選應(yīng)用于胸膜惡性胸膜間皮瘤。在利用現(xiàn)有的生物化學(xué)標(biāo)志物的間皮瘤的檢查方法中，不能檢測(cè)出肉瘤型和雙相型的惡性胸膜間皮瘤，與此相對(duì)，本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法能夠檢測(cè)出肉瘤型和雙相型的惡性胸膜間皮瘤。因此，本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法優(yōu)選應(yīng)用于肉瘤型或雙相型的惡性胸膜間皮瘤。本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法有時(shí)用于從健常者中判別間皮瘤的患者。本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法有時(shí)用于從除了惡性胸膜間皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者中判別惡性胸膜間皮瘤的患者。這里，除了惡性胸膜間皮瘤以外的呼吸器官疾患是指肺癌、和除了癌以外的呼吸器官疾患。除了癌以外的呼吸器官疾患包含COPD和良性的胸膜間皮瘤，但不限于此。
[0048]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法中的受試者是指需要接受間皮瘤的檢查的所有人。有時(shí)本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法的受試者表現(xiàn)咳、痰、胸痛、呼吸困難等癥狀。有時(shí)所述受試者是可能患間皮瘤的受試者。所述可能患間皮瘤的受試者包含有所述癥狀的人、和/或經(jīng)歷了石棉吸引或曝露或者懷疑經(jīng)歷了石棉吸引或曝露的人，但不限于此。
[0049]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法中的血液樣品可以是全血、血漿、血清的任一種。所述血液樣品優(yōu)選為采血后分離的血漿或血清。用于本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法的采血、以及必要時(shí)的血漿或血清的調(diào)制使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知任一技術(shù)來實(shí)施。簡(jiǎn)潔地，在血漿的調(diào)制中，將包含EDTA、其他螯合劑、但不限于此的血液凝固抑制劑添加到采取的全血樣品中后，通過離心除去細(xì)胞成分。在血清的調(diào)制中，在采取的全血樣品中引起血液凝固反應(yīng)，通過離心分離而從血沉分離血清。用于本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法的胸水的采取、和必要時(shí)的胸水樣本的調(diào)制使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任一技術(shù)來實(shí)施(例如，請(qǐng)參照Porcel J.M.和LightR.W.(Am.Fam.Physician.>73:1211、2006))。
[0050]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)，是指包含序列號(hào)2所列舉的由630個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列的任一人骨膜蛋白基因產(chǎn)物、以及與識(shí)別包含序列號(hào)2的氨基酸序列的多肽的抗體結(jié)合的人骨膜蛋白基因座的任一突變體的基因產(chǎn)物。
[0051]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度，可以通過任何方法測(cè)定。一般地，人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度，使用能與人骨膜蛋白蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的任一分子來測(cè)定。人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度優(yōu)選使用與人骨膜蛋白蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的抗體來測(cè)定。這里，與人骨膜蛋白蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的抗體有時(shí)選自多克隆抗體或單克隆抗體、該抗體的抗原結(jié)合片段、以及包含該抗原結(jié)合片段的重組抗體或嵌合抗體中。
[0052]與人骨膜蛋白蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的多克隆抗體或單克隆抗體使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任一技術(shù)來制作。本說明書的實(shí)施例中公開了與人骨膜蛋白蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的單克隆抗體的制作技術(shù)，但本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法可以不限于所述實(shí)施例中記載的單克隆抗體地實(shí)施。
[0053]本說明書中的“抗體的抗原結(jié)合片段”，是指參加抗原結(jié)合的抗體的部分。所述抗原結(jié)合部位由重(H)鏈和輕(L)鏈的N末端的可變(V)區(qū)的氨基酸殘基形成。所述抗原結(jié)合片段除了包含將完整的多克隆抗體或單克隆抗體分別用蛋白質(zhì)分解酶木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分解而得的Fab片段或F(ab’)2片段之外，還包含F(xiàn)v片段，該Fv片段包含非共價(jià)結(jié)合的、包含較多地保持天然抗體分子的抗原識(shí)別能力和結(jié)合能力的抗原結(jié)合部位的％和\區(qū)的雜2聚體。
[0054]本發(fā)明的抗體中，有時(shí)重組抗體通過包括轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)菌宿`主、或者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)牟溉轭惣?xì)胞宿主的抗體基因的表達(dá)克隆化來調(diào)制。本發(fā)明的抗體中，有時(shí)嵌合抗體是以所述本發(fā)明的重組抗體的抗原結(jié)合部位能與所述多肽結(jié)合的方式通過同種或異種的抗體的恒定結(jié)構(gòu)域來支持的融合蛋白質(zhì)。所述嵌合抗體包含:包含與抗體輕鏈可變區(qū)(')可操作地連接的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的單鏈可變部抗體(scFv),和由駱§它科(CameIidae,包含駱駝、單峰駱駝、羊駝)的動(dòng)物產(chǎn)生的沒有輕鏈的IgG類的駱駝重鏈抗體(HCAb)或其重鏈可變部結(jié)構(gòu)域(VhD)。所述重組抗體可以使用來源于原核生物和真核生物的基因表達(dá)系統(tǒng)大量地調(diào)制。
[0055]本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、有時(shí)試劑盒和/或診斷方法中的“受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟”，通過與受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的骨膜蛋白結(jié)合的抗骨膜蛋白抗體、該抗骨膜蛋白抗體的特異性結(jié)合配偶體等標(biāo)記來檢測(cè)或定量。有時(shí)所述抗骨膜蛋白抗體直接地或介由接頭(linker)而被生物素那樣的低分子配基、酶、放射性同位素、色素、熒光色素、化學(xué)發(fā)光性化合物等標(biāo)記。針對(duì)抗骨膜蛋白抗體的特異性結(jié)合配偶體包含能與抗骨膜蛋白抗體特異性地結(jié)合的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的所有物質(zhì)。所述針對(duì)抗骨膜蛋白抗體的特異性結(jié)合配偶體以受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定沒有障礙為條件，可以是能與抗骨膜蛋白抗體結(jié)合的任何受體或配基。所述受體或配基有時(shí)是蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)、其他生物體高分子。本發(fā)明中使用的針對(duì)抗骨膜蛋白抗體的特異性結(jié)合配偶體有時(shí)選自多克隆抗體或單克隆抗體、該抗體的抗原結(jié)合片段、和包含該抗原結(jié)合片段的嵌合抗體或重組抗體中?？贵w的抗原結(jié)合片段是指參加抗原結(jié)合的抗體的部分。所述抗原結(jié)合部位由重(H)鏈和輕(L)鏈的N末端的可變(V)區(qū)的氨基酸殘基形成。有時(shí)所述針對(duì)抗骨膜蛋白抗體的特異性結(jié)合配偶體被酶、放射性同位素、色素、熒光色素等標(biāo)記。所述酶是過氧化物酶(POD)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、堿性磷酸酶(ALP)等。所述酶一般與適當(dāng)?shù)牡孜锝M合使用。檢測(cè)的步驟有時(shí)包括用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度的步驟、和/或用發(fā)光計(jì)測(cè)裝置測(cè)定發(fā)光或熒光的強(qiáng)度的步驟。進(jìn)而有時(shí)與膠乳顆粒等其他微粒結(jié)合。此時(shí)，有時(shí)檢測(cè)的步驟包括用比濁計(jì)測(cè)定濁度的步驟。有時(shí)定量的步驟包括:將與已知濃度或量的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的抗骨膜蛋白抗體的量數(shù)值化而作圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟；和使用所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，從與未知濃度或量的受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的所述抗骨膜蛋白抗體的量，計(jì)算出該受試者的所述血液樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度或量的步驟。為了制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要有濃度或量已知的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)至少2種即可，為了確保定量精度優(yōu)選，為3種或4種以上。有時(shí)檢測(cè)或定量的步驟包括通過洗滌而除去未與受試樣品結(jié)合的抗骨膜蛋白抗體和其他抗體的步驟。這里將使用被酶標(biāo)記的抗體等的測(cè)定技術(shù)稱為ELISA法。并且，將為了將所述樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)捕捉到固體支持體、和為了檢測(cè)或定量捕捉到該固體支持體的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)，而使用能同時(shí)與人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗人骨膜蛋白蛋白質(zhì)抗體的測(cè)定技術(shù)，稱為夾心ELISA法。所述2種抗人骨膜蛋白抗體可以是表位不同的2種單克隆抗體，也可以是單克隆抗體與多克隆抗體。
[0056]本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法中，在確定受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度時(shí)，在所述濃度顯示高于基準(zhǔn)值的值的情況下，判斷所述受試者有間皮瘤的嫌疑。所述基準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的統(tǒng)計(jì)處理計(jì)算出。
[0057]有時(shí)本發(fā)明的間皮瘤的檢查方法、試劑盒和/或診斷方法中的“受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟”通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種手法實(shí)施。例如，有時(shí)所述手法除了已經(jīng)說明的ELISA法和膠乳凝集法之外，還通過表面等離子體共振法來實(shí)施。
[0058]有時(shí)用于實(shí)行本發(fā)明的免疫學(xué)的分析方法的試劑盒除了包含本發(fā)明的抗骨膜蛋白抗體之外，還包含用于制成標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度或量的對(duì)照樣品。所述對(duì)照樣品有時(shí)是人骨膜蛋白蛋白質(zhì)，和/或其融合蛋白質(zhì)。
[0059]本發(fā)明提供以能實(shí)行本發(fā)明的間皮瘤的診斷方法的方式構(gòu)成的骨膜蛋白的免疫學(xué)的分析裝置。所述裝置包含=CCD相機(jī)等檢測(cè)單元，分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、比濁計(jì)、表面等離子體共振測(cè)定器等測(cè)定單元，用于試劑、洗滌液和/或樣品的注入和/或除去的分配器單元，用于ELISA法用多孔板和/或表面等離子體共振用傳感器芯片的操作的機(jī)械臂單元，用于這些單元的控制的控制單元等。
[0060]本說明書中所提及的全部文獻(xiàn)其全體通過引用而包含在本說明書中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1是顯示人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域的位置、各同種型的結(jié)構(gòu)、與本發(fā)明的骨膜蛋白抗體制作中使用的免疫原的結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系的模式圖。
[0062]圖2A是使用以P0STN781涂布的微板，研究以人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN781為免疫原而制作的單克隆抗體的反應(yīng)性的結(jié)果的圖。
[0063]圖2B是使用以P0STN630涂布的微板，研究以人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN630為免疫原而制作的單克隆抗體的反應(yīng)性的結(jié)果的圖。
[0064]圖3是顯示間皮瘤患者和健常者的血漿樣本各自的骨膜蛋白的濃度的分布的圖。
[0065]圖4是對(duì)于間皮瘤患者的血漿樣本將同一樣本的骨膜蛋白和SMRP的血漿中的濃度作圖而得的相關(guān)圖。
[0066]圖5是將患者樣本中的血漿樣本與血清樣本中的骨膜蛋白濃度進(jìn)行比較而得的圖。
[0067]圖6是將本實(shí)施例的惡性胸膜間皮瘤、肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患(圖6中表示為“呼吸器官疾患”)的患者樣本中的骨膜蛋白濃度的分布進(jìn)行比較而得的圖。
[0068]圖7是顯示以骨膜蛋白濃度為標(biāo)志物的、相對(duì)于合并了肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患的除了間皮瘤以外的呼吸器官疾患患者的、本實(shí)施例的惡性胸膜間皮瘤患者樣本的ROC曲線。
[0069]圖8是表示株化癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的骨膜蛋白的測(cè)定結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0070]以下說明的本發(fā)明的實(shí)施例僅是為了例示，并不限定本發(fā)明的技術(shù)的范圍。本發(fā)明的技術(shù)的范圍僅由專利權(quán)利要求書的記載來限定?？梢砸圆幻撾x本發(fā)明的宗旨為條件，進(jìn)行本發(fā)明的變更，例如，本發(fā)明的構(gòu)成要件的補(bǔ)加、刪除和置換。
[0071]實(shí)施例1
[0072]抗骨膜蛋白抗體的制作
[0073](I)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)
[0074]圖1是顯示人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域的位置、各同種型的結(jié)構(gòu)、與本發(fā)明的骨膜蛋白抗體制作中使用的免疫原的結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系的模式圖。在圖1中，EMI和成束蛋白I分別表示EMILIN同源結(jié)構(gòu)域和成束蛋白同源結(jié)構(gòu)域。isol?4分別表示人骨膜蛋白的同種型I?4。P0STN781表示在人骨膜蛋白蛋白質(zhì)同種型3的781個(gè)氨基酸的多肽的羧基末端融合myc標(biāo)簽和his標(biāo)簽(表示為“mychis”)而得的重組蛋白質(zhì)。P0STN630表示在包含至4個(gè)成束蛋白結(jié)構(gòu)域的、人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的全部同種型中共有的630個(gè)氨基酸的多肽的羧基末端融合了 myc標(biāo)簽和his標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)。人骨膜蛋白蛋白質(zhì)同種型3的781個(gè)氨基酸的氨基酸序列在序列號(hào)I中列舉。人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的所有同種型中共有的包含至4個(gè)成束蛋白結(jié)構(gòu)域的630個(gè)氨基酸的氨基酸序列在序列號(hào)2中列舉。
[0075](2)人骨膜蛋白的cDNA獲得
[0076]基于人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的4種同種型的cDNA序列(同種型1:NM_006475、同種型 2:ΝΜ_001135934、同種型 3:NM_001135935、同種型 4:NM_001135936)，在同種型 I ?4所共有的5’ UTR區(qū)和3’ UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物。在第I階段的PCR反應(yīng)中使用的引物是5’ -AATTCTGAGCTCTCCAAAGCCC-3’(序列號(hào) 3)和 5’ -GGCTAACTCCACAAITTCCCTC-3’(序列號(hào)4)，第2階段的PCR反應(yīng)中使用的引物是5’ -CGGAGAGACTCAAGATGATTCC-3’(序列號(hào)5)和 5’ -TCCTGAAGTCAACTTGGCTCTC-3’ (序列號(hào) 6)。以插入了人 cDNA 文庫的混合物(mosaiccDNA (商標(biāo))、Genofi, LLC、San Clemente, CA92673)為模板，使用 PCR 擴(kuò)增酶(KOD FX、東洋紡織株式會(huì)社)和所述引物通過巢式PCR來擴(kuò)增包含骨膜蛋白的蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長(zhǎng)的cDNA。第I階段的PCR反應(yīng)在將[98°C 20秒、55°C 20秒、68°C 2分30秒]進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的條件下實(shí)施，第2階段的PCR反應(yīng)在將[98°C 15秒、55°C 15秒、68°C 2分30秒]進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的條件下實(shí)施。第2階段的PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆化到克隆化載體pT7BlueT-Vector (Novagen、夕株式會(huì)社)中，使用自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystem)確認(rèn)堿基序列?？寺』腸DNA與同種型3 —致，因而命名為POSTNiso3-pT7。
[0077](3)人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
[0078]作為用于使動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)的載體，使用由CMV啟動(dòng)子控制、通過IRES序列使目的基因的產(chǎn)物與嘌呤霉素-EGFP融合蛋白質(zhì)同時(shí)表達(dá)的pQCxmhlPG。PQCxmhIPG是由
【發(fā)明者】們對(duì)BD Retro-X(商標(biāo))Q Vectors的pQCXIP載體進(jìn)行改變而制作的。P0STN781表達(dá)載體如下構(gòu)建。目的序列的PCR擴(kuò)增，以P0STNiso3-pT7作為模板，使用 KOD FX 來進(jìn)行。使用 5’ 引物(5，-CGGGCGGCCGCACCATGATTCCCTTTTTAC-3’、序列號(hào) 7、下劃線部為 NotI 識(shí)別序列)、和 3’ 引物(5，-TTTTTGGACTCGAGCTGAGAACGACCTTCC-3’、序列號(hào)
8、下劃線部為XhoI識(shí)別序列)。反應(yīng)條件是將[94°C 15秒、55°C 15秒、68°C 2分30秒]進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用限制性酶NotI和XhoI消化，插入pQCxmhlPG的Not1-XhoI部位，從而構(gòu)建表達(dá)載體pQCxmhIPG-P0STN781。P0STN630表達(dá)載體如下構(gòu)建。目的序列的PCR擴(kuò)增，以上述P0STNiso3-pT7為模板，使用Pfu酶(口 J力株式會(huì)社)進(jìn)行。使用 5’ 引物(5，-CGGGCGGCCGCACCATGATTCCCTTTTTAC-3’、序列號(hào) 9、下劃線部為 NotI識(shí)別序列)和3’引物(5’ -GGTGTCTCGAGTGGATAGAGGAGTTTATC-3’、序列號(hào)10、下劃線部為XhoI識(shí)別序列)。反應(yīng)條件是將[98 °C 15秒、55 °C 15秒、68°C 2分30秒]進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用限制性酶NotI和XhoI消化，插入pQCxmhlPG的Not1-XhoI部位，從而構(gòu)建表達(dá)載體pQCxmhIPG-P0STN630。
[0079]為了建立人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)細(xì)胞株，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系統(tǒng)(Pantropic Retroviral Expression System、Clontech、K1063-1、夕力 9 才株式會(huì)社)。在涂布了膠原蛋白的IOOmm盤中準(zhǔn)備80~90%匯合狀態(tài)的GP2-293 (Clontech、K1063-1、夕力5 ”'4才株式會(huì)社)，使用Lipofectamine2000，將所述表達(dá)載體pQCxmhIPG-P0STN781 或 pQCxmhIPG_P0STN630、與 pVSV-G (Clontech ；K1063-1) 一起共轉(zhuǎn)染各11.2 μ g。48小時(shí)后，回收包含病毒顆粒的上清，通過超速離心(18，000轉(zhuǎn)/分注、1.5小時(shí)、4°C )將所述病毒顆粒作為沉淀物分離。所述沉淀物用30 μ L的TNE(50mM Tris-HCl (pH值7.8)、130mM NaClUmM EDTA)懸浮，調(diào)制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體濃縮液。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體濃縮液5 μ L用包含8 μ g/mL海美溴銨(H-9268、'> V ^ r <j ,千''J \ η >株式會(huì)社)、和10%牛血清的DMEM(D5796、'> V ^ r )V .; ?千y' ^ >株式會(huì)社)150 μ L稀釋，調(diào)制含有病毒顆粒的培養(yǎng)基。在96孔微板中將以約40%匯合的狀態(tài)準(zhǔn)備的293Τ培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為所述含有病毒顆粒的培養(yǎng)基，進(jìn)行pQCxmhIPG-P0STN781或pQCxmhIPG_P0STN630的基因?qū)搿Ｋ龌驅(qū)牒?，用包? μ g/mL的嘌呤霉素(P-8833、'> V ^ r <j y千y' ^ >株式會(huì)社)、和10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)的表達(dá)細(xì)胞株P(guān)0STN781/st293T 和 P0STN630/st293T。
[0080](4)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的純化
[0081]人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)的表達(dá)細(xì)胞株P(guān)0STN781/st293T和P0STN630/st293T通過293細(xì)胞用的無血清培養(yǎng)基CD293(Invitrogen、9 4 7 f ^ ^ 口 y'—文' ''J ^ >株式會(huì)社)各 IL 來培養(yǎng)。從培養(yǎng)上清中，使用 TALON Purification Kit (Clontech、K1253-1)回收重組蛋白質(zhì)P0STN781和P0STN630，用PBS透析。用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡來確認(rèn)純化蛋白質(zhì)。使用蛋白檢測(cè)試劑盒II(BioRad、500-0002JA、八4才？ 9 ^卜'' 9術(shù)9卜1J 一文株式會(huì)社)確定蛋白質(zhì)濃度。
[0082](5)針對(duì)人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)的單克隆抗體的制作
[0083]將如⑷中說明的那樣純化的人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN781和P0STN630與等量的完全弗氏佐劑(F5881、V V ^ r IV Y 千y' ^ >株式會(huì)社)混合而乳化，對(duì)每I只BALB/c小鼠(4周齡、雌性)每隔3~7天致敏5~20 μ g，致敏6次。在最終免疫的3天后從小鼠摘出淋巴細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3U1 (P3-X63Ag8Ul)進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0084]細(xì)胞融合按照常規(guī)方法如下進(jìn)行。全部培養(yǎng)基中的胎牛血清通過在56°C保溫30分鐘保溫的處理而滅能。P3U1用添加了青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。摘出的小鼠淋巴細(xì)胞與P3U1以1:10~1:2的比例混合而離心。一邊對(duì)沉淀的細(xì)胞緩緩添加50%聚乙二醇4000(1.09727.0100、^ ^ 株式會(huì)社)一邊平穩(wěn)地混合后，離心。沉淀的融合細(xì)胞用含 15% FBS 的 HAT 培養(yǎng)基(RPMI1640、HAT_supplement (Invitrogen、11067-030、3 A y吁9 ) u j—文j \ ^ >株式會(huì)社)、青霉素和鏈霉素)適宜稀釋，以每孔200 μ L接種于96孔微板。融合細(xì)胞在CO2孵育箱(5% C02、37°C )中培養(yǎng)，在剛剛形成集落之后，取樣培養(yǎng)上清，進(jìn)行篩選。篩選中，選擇通過免疫中使用的針對(duì)以P0STN781或P0STN630涂布的96孔板的ELISA法而顯示陽性的孔的融合細(xì)胞集落。用含15%胎牛血清的 HT 培養(yǎng)基(RPMI1640、HT-supplement(Invitrogen、21060-017)、青霉素和鏈霉素)擴(kuò)大培養(yǎng)后，通過有限稀釋法進(jìn)行克隆化。這樣，以人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN781為免疫原得到了雜交瘤克隆為 13 個(gè)(抗體號(hào):# 3-4-5、# 3-6-1、# 3-9-2、# 3-10-2、# 3-11-4、#3-20-3、# 3-27-1、# 3-28-3、# 3-29-1、# 3-30-1、# 3-31-3、# 3-33-3、# 3-34-1)。以人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN630為免疫原得到了雜交瘤克隆13個(gè)(# 6_1_2、# 6_3_1、
#6-9-1、 # 6-10-2、 # 6-13-2、 # 6-14-3、 # 6-16-3、 # 6-19-1、 # 6-20-1、 # 6-23-5、
#6-43-1、# 6-45-1、# 6-88-1)。
[0085](6)抗人骨膜蛋白單克隆抗體的反應(yīng)性
[0086](5)中所得的抗人骨膜蛋白單克隆抗體對(duì)人骨膜蛋白的反應(yīng)性如下驗(yàn)證。從各雜交瘤克隆的培養(yǎng)上清中，通過使用蛋白A-Sepharose的一般親和性純化法來純化單克隆抗體。所得的純化抗體分別以5 μ g/mL為最大濃度進(jìn)行連續(xù)稀釋，人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN781或P0STN630對(duì)各自的免疫原的反應(yīng)強(qiáng)度通過ELISA法確認(rèn)。
[0087]圖2A是使用以500ng/mL的P0STN781涂布的微板研究以人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN781為免疫原的單克隆抗體的反應(yīng)性的結(jié)果的圖。圖2B是使用以500ng/mL的P0STN630涂布的微板研究使用人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)P0STN630作為免疫原的單克隆抗體的反應(yīng)性的結(jié)果的圖。如圖2A和B所示，確認(rèn)了全部單克隆抗體克隆與作為免疫原的重組蛋白質(zhì)之間濃度依賴性地發(fā)生反應(yīng)。另一方面，對(duì)具有與所述人骨膜蛋白重組蛋白質(zhì)相同的myc標(biāo)簽和his標(biāo)簽的、其他來源于人的重組蛋白質(zhì)，也同樣地通過ELISA法研究了反應(yīng)性，結(jié)果不反應(yīng)。因此，確認(rèn)了(5)中得到的單克隆抗體均不是識(shí)別標(biāo)簽序列的寡肽的抗體。另外，以P0STN781為免疫原得到的13個(gè)單克隆抗體全部與P0STN630反應(yīng)。因此，可以得到如下結(jié)論:本實(shí)施例中得到的全部抗人骨膜蛋白單克隆抗體，識(shí)別包含到4個(gè)成束蛋白結(jié)構(gòu)域的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的全部同種型所共有的630個(gè)氨基酸(序列號(hào)2)的多肽。[0088](7)夾心ELISA法的構(gòu)建
[0089]由于作為夾心ELISA法的檢測(cè)側(cè)抗體使用，因而將本實(shí)施例中得到的全部單克隆抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記。即，在抗體溶液中對(duì)每Img抗體混合16.7 μ L的IOmM EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo、7 f ^、>株式會(huì)社)，在室溫孵育I小時(shí)后，用PBS透析，除去未標(biāo)記的生物素。從26個(gè)單克隆抗體克隆中，如下通過使用全部26 X 26的組合來確定適合夾心ELISA法的捕捉和檢測(cè)的抗體克隆的組合。首先，將在0.1M NaHC03、0.1M Na2COjP
0.15% Proclinl50(SUPELC0、'> 夕''K >j ” 千 y' ^ >株式會(huì)社)的溶液中以 10 μ g/mL的濃度稀釋后的26個(gè)抗體克隆，分別在96孔微板的各孔中添加各50μ L，在4°C靜置過夜或室溫靜置2小時(shí)，將抗體固定化于所述微板的孔底面。除去所述溶液后，分注封閉緩沖液(添加了 1% BSA(Proliant) ,0.15% Proclinl50 和 5%蔗糖的 PBS)各 150yL(4°C靜置過夜或室溫靜置2小時(shí))。除去所述封閉緩沖液后，分注用添加了 1% BSA、0.1% Tween20、
0.15% Proclinl50 和 50 μ g/mL MAK-33 (口 '> Λ i r J % r λ ” I 株式會(huì)社)的PBS稀釋成10ng/mL、lng/mL或Ong/mL的濃度的P0STN781蛋白質(zhì)50 μ L，室溫靜置I小時(shí)。除去所述P0STN781蛋白質(zhì)溶液后，用PBS-0.05 % Tween20洗滌3次。分注5 μ g/mL的濃度的用生物素標(biāo)記的26個(gè)抗體克隆，在室溫靜置I小時(shí)。將所述生物素標(biāo)記抗體克隆的溶液除去后，分注用PBS-0.05% Tween20洗滌3次。分注用1% BSA、0.135M NaCU0.1%p-Hydroxyphenylace、0.15% Proclinl50> 10mg/L 溴酌.藍(lán)和 20mM HEPES 稀釋至 20000 倍的鏈霉親和素_polyHRP40 (SDT, 7 f - 株式會(huì)社)各50 μ L，在室溫靜置I小時(shí)。除去所述鏈霉親和素_polyHRP40溶液后，用PBS-0.05% Tween20洗滌3次。分注TMB-US (Moss、^7 ? /sm才株式會(huì)社)各50 μ L，室溫靜置30分鐘使其顯色后，分注50 μ L的0.18Μ H2SO4使顯色停止。用分光吸光度計(jì)測(cè)定吸光度Α450/Α620。選擇P0STN781蛋白質(zhì)10ng/mL的孔與0ng/mL的孔之間的吸光度的差為2.0以上、且抗原Ing/mL的孔與0ng/mL的孔之間吸光度的差為1.0以上的抗體組合。選擇的單克隆抗體的組合如表1。
`[0090]表1
【權(quán)利要求】
1.間皮瘤的檢查方法，其特征在于，包括受試者的血液和胸水中的至少任I種樣品中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間皮瘤的檢查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟使用針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的間皮瘤的檢查方法，其特征在于，所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體，是與包含序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的間皮瘤的檢查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的濃度的測(cè)定步驟，使用能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間皮瘤的檢查方法，其特征在于，所述間皮瘤是惡性胸膜間皮瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間皮瘤的檢查方法，其特征在于，所述間皮瘤是肉瘤型或雙相型的惡性胸膜間皮瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6的任一項(xiàng)所述的間皮瘤的檢查方法，其特征在于，所述血液樣品是受試者的血漿或血清的樣品。
8.用于間皮瘤的診斷的試劑盒，其特征在于，包含針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用 于間皮瘤的診斷的試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體，是與包含序列號(hào)2所記載的氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)人骨膜蛋白蛋白質(zhì)的抗體，是能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于間皮瘤的診斷的試劑盒，其特征在于，包含:固定化了能同時(shí)與所述人骨膜蛋白蛋白質(zhì)結(jié)合的2種抗體中的一種的固體支持體、和針對(duì)所述2種抗體中的另一種的特異性結(jié)合配偶體。
12.根據(jù)權(quán)利要求8?11的任一項(xiàng)所述的用于間皮瘤的診斷的試劑盒，所述間皮瘤的診斷，是判斷可能患間皮瘤的受試者是否是間皮瘤的患者。
13.根據(jù)權(quán)利要求8?11的任一項(xiàng)所述的用于間皮瘤的診斷的試劑盒，所述間皮瘤的診斷，是判斷可能患間皮瘤的受試者是間皮瘤的患者還是除了間皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用于間皮瘤的診斷的試劑盒，其特征在于，所述間皮瘤的患者是惡性胸膜間皮瘤的患者。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于間皮瘤的診斷的試劑盒，其特征在于，所述間皮瘤的患者是肉瘤型或雙相型的惡性胸膜間皮瘤的患者。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK103842823SQ201280045049
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月15日
【發(fā)明者】柳澤圣, 高橋隆, 橫井香平, 長(zhǎng)谷川好規(guī), 小野健一郎, 八木香澄, 增田瞳, 竹內(nèi)俊幸 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人名古屋大學(xué), 株式會(huì)社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 株式會(huì)社昂考米克斯