粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于能夠通過與二維培養(yǎng)同樣的培養(yǎng)方法在接近于生物體內(nèi)的環(huán)境下評價(jià)粘附性細(xì)胞的方法及其用途。粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，作為培養(yǎng)容器(10)，使用配置2個(gè)以上等效直徑D為期望的球狀體的直徑的1倍～5倍且高度H為上述等效直徑的0.3倍～5倍的培養(yǎng)空間(11)、并且表面的水接觸角為45度以下的容器。在配置于培養(yǎng)容器(10)中的多個(gè)培養(yǎng)空間(11)分別培養(yǎng)粘附性細(xì)胞的球狀體。
【專利說明】粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過與以往的二維培養(yǎng)(平面上的培養(yǎng))同樣的操作培養(yǎng)出不可能通過二維培養(yǎng)得到的均勻尺寸的粘附性細(xì)胞的球狀體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞開始用于藥劑的藥效試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)。但是，對于通過以往的培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞而言，細(xì)胞在二維方向上鋪展，形成與在生物體內(nèi)大大不同的形狀。因此，存在不具有本來的細(xì)胞功能，不能反映藥物在生物體內(nèi)的行為的問題。
[0003]因此，近年來，模仿生物體內(nèi)的組織形態(tài)的球狀體培養(yǎng)方法開始受到關(guān)注。例如，公開了使96多孔板的底面呈漏斗狀且在其中形成I個(gè)球狀體的方法(專利文獻(xiàn)I)。另外，可以列舉:通過在培養(yǎng)底面上形成微細(xì)的蜂窩結(jié)構(gòu)體而減弱細(xì)胞對機(jī)材的粘附性來形成球狀體的方法(專利文獻(xiàn)2)、使用外源性細(xì)胞聚集劑的方法(專利文獻(xiàn)3)等。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)1:日本專利第2716646號公報(bào)
[0007]專利文獻(xiàn)2:日本特開2002-335949號公報(bào)
[0008]專利文獻(xiàn)3:日本特開2008-22743號公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明所要解決的問題
[0010]但是，專利文獻(xiàn)I的培養(yǎng)方法中，在一個(gè)容器內(nèi)以懸浮的狀態(tài)形成I個(gè)球狀體。該方法中，更換培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞容易脫離，因此，存在更換培養(yǎng)基時(shí)操作繁瑣的問題。此外，由于在一個(gè)容器內(nèi)形成I個(gè)球狀體，因此難以應(yīng)用于例如6孔板、12孔板、24孔板、384孔板或者燒瓶形狀的容器。
[0011]另外，專利文獻(xiàn)2、3的培養(yǎng)方法能夠應(yīng)用于上述的培養(yǎng)板、燒瓶形狀的容器，但另一方面，不能控制球狀體的大小。因此，存在不能制作具有均勻直徑的球狀體的問題。
[0012]由此可見，以往的培養(yǎng)方法在市售的孔板、燒瓶形狀的容器中的應(yīng)用存在限度，或者即使能應(yīng)用也難以控制球狀體的直徑。因此，要求能夠應(yīng)用于各種培養(yǎng)容器的形狀、且通過控制球狀體的大小能夠培養(yǎng)具有均勻直徑的粘附性細(xì)胞的球狀體的新方法。
[0013]用于解決問題的方法
`[0014]本發(fā)明的粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)方法的一個(gè)方式中，作為培養(yǎng)容器，選擇配置2個(gè)以上等效直徑為期望的球狀體的直徑的I倍~5倍且高度為上述等效直徑的0.3倍~5倍的培養(yǎng)空間、并且該培養(yǎng)空間表面的水接觸角為45度以下的容器。在配置于選擇的培養(yǎng)容器中的多個(gè)培養(yǎng)空間內(nèi)分別培養(yǎng)粘附性細(xì)胞的球狀體。通過使用形成有與要培養(yǎng)的球狀體的尺寸相應(yīng)的培養(yǎng)空間的培養(yǎng)容器，對培養(yǎng)的球狀體的尺寸進(jìn)行控制。由此，能夠得到期望尺寸的球狀體。
[0015]本發(fā)明的粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)方法的一個(gè)方式中，優(yōu)選培養(yǎng)空間的等效直徑為100 μ m~5000 μ m的范圍。此外，優(yōu)選將相鄰的培養(yǎng)空間隔開的壁的厚度為5 μ m~50 μ m的范圍，優(yōu)選將相鄰的上述培養(yǎng)空間隔開的壁的上表面與側(cè)面所成的角度為90度~135度的范圍。
[0016]另外，優(yōu)選在培養(yǎng)后的全部球狀體中，有60%以上的球狀體,其直徑在培養(yǎng)后的球狀體的直徑的平均值的正負(fù)5%的范圍內(nèi)，優(yōu)選球狀體為癌細(xì)胞。
[0017]此外，優(yōu)選培養(yǎng)容器為包含丙烯酸類樹脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯類樹脂、丙烯酸-苯乙烯類共聚樹脂、聚碳酸酯類樹脂、聚酯類樹脂、聚乙烯醇類樹脂、乙烯-乙烯醇類共聚樹脂、熱塑性彈性體、氯乙烯類樹脂和硅樹脂中的I種或它們的組合的樹脂成形品。
[0018]此外，優(yōu)選培養(yǎng)空間的表面以通過玻璃處理或通過等離子體處理形成官能團(tuán)而使水接觸角為45度以下的方式進(jìn)行了處理。
[0019]此外，優(yōu)選對培養(yǎng)空間的表面實(shí)施了下述中的任何一項(xiàng):包被有通過溫度、光中的任何一種使親水性和疏水性發(fā)生變化的聚合物；固定有抑制細(xì)胞粘附的親水性聚合物鏈；固定有磷脂或磷脂-高分子復(fù)合物。
[0020]發(fā)明效果
[0021]通過本發(fā)明，能夠通過與以往的二維培養(yǎng)同樣的操作高密度地培養(yǎng)均勻尺寸的粘附性細(xì)胞的球狀體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施方式的培養(yǎng)容器的構(gòu)成例的圖。
[0023]圖2是圖1所示的培養(yǎng)容器的沿I1-1I線的剖面圖。
[0024]圖3是說明在培養(yǎng)板的孔內(nèi)形成有本實(shí)施方式的培養(yǎng)容器的構(gòu)成例的示意圖。
[0025]圖4是表不在培養(yǎng)空間內(nèi)培養(yǎng)球狀體的狀態(tài)的不意圖。
[0026]圖5A是表不培養(yǎng)空間的另一形狀例的圖。
[0027]圖5B是表不培養(yǎng)空間的又一形狀例的圖。
[0028]圖6A是表不培養(yǎng)空間的另一側(cè)面的形狀例的剖面圖。
[0029]圖6B是表不培養(yǎng)空間的又一側(cè)面的形狀例的剖面圖。
[0030]圖6C是表不培養(yǎng)空間的又一側(cè)面的形狀例的剖面圖。
[0031]圖7是表示實(shí)施例1的結(jié)果的照片。
[0032]圖8是表示實(shí)施例2的結(jié)果的照片。
[0033]圖9是表示比較例I的結(jié)果的照片。
[0034]圖10是表示比較例2的結(jié)果的照片。
[0035]圖11是表示實(shí)施例3的結(jié)果的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下，參考附圖對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明并不限定于以下的實(shí)施方式。為了明確說明，以下的記載和附圖進(jìn)行了適當(dāng)省略和簡化。各附圖中，對具有同一構(gòu)成或功能的構(gòu)成要素和相應(yīng)部分賦予同一標(biāo)號，并省略其說明。[0037]圖1中示出了本發(fā)明的實(shí)施方式的培養(yǎng)容器的構(gòu)成例。圖2中示出了沿圖1的I1-1I線的剖面圖。
[0038]培養(yǎng)容器10具有培養(yǎng)空間11、壁12和底部13。
[0039]培養(yǎng)空間11為由壁12和底部13分隔成的區(qū)域，成為培養(yǎng)細(xì)胞的三維空間區(qū)域(培養(yǎng)區(qū)域)。培養(yǎng)空間11也簡稱為“空間”或“微空間”。
[0040]壁12為分隔培養(yǎng)空間11的隔壁，也可以說是在培養(yǎng)容器10上形成凹凸圖案的凸部。
[0041]底部13作為培養(yǎng)容器10的基板發(fā)揮功能，并且，配置培養(yǎng)空間11的一側(cè)的表面成為培養(yǎng)區(qū)域(培養(yǎng)表面)的一部分。
[0042]圖1、2中，關(guān)于培養(yǎng)容器10中的培養(yǎng)空間11，示出了等效直徑D、高度H、壁12的寬度W(厚度)和底部13的厚度T。圖1、2中，示出了底部13與壁12作為一體而制作的情況。
[0043]等效直徑D是指與培養(yǎng)空間11內(nèi)切的內(nèi)切圓的直徑。更詳細(xì)而言，等效直徑D是指與培養(yǎng)空間11的底部13平行的面的形狀(正面的形狀)的內(nèi)切圓的直徑，換言之，是指與培養(yǎng)空間11的高度H的方向垂直的面的形狀的內(nèi)切圓的直徑。在培養(yǎng)空間11的正面的形狀隨著高度H而不同的情況下，將培養(yǎng)粘附性細(xì)胞的空間區(qū)域的最大值作為等效直徑。
[0044]高度H為從培養(yǎng)空間11的底至壁12的上表面的長度，也可以說是培養(yǎng)空間11的深度。另外，在培養(yǎng)底面為平面的情況下，高度H與壁12的高度相同。壁12的寬度W也可以說是鄰接的培養(yǎng)空間11之間的距離。
[0045]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用具有多個(gè)等效直徑D為期望的球狀體的直徑的I~5倍且高度H(深度)為等效直徑D的0.3倍~5倍的培養(yǎng)空間11、并且該培養(yǎng)空間表面的水接觸角為45度以下的培養(yǎng)容器10，在各培養(yǎng)空間11內(nèi)培養(yǎng)粘附性細(xì)胞，能夠培養(yǎng)均勻直徑的粘附性細(xì)胞的球狀體。因此，通過根據(jù)期望的球狀體的大小來選擇配置在培養(yǎng)容器10內(nèi)的培養(yǎng)空間11的大小，能夠控制培養(yǎng)的球狀體的大小。
[0046]圖3是說明在培養(yǎng)板的孔內(nèi)形成有本實(shí)施方式的培養(yǎng)容器的構(gòu)成例的示意圖。培養(yǎng)板I中形成有多個(gè)孔21，相鄰的孔21之間由分隔部22隔開。各孔21與培養(yǎng)容器10對應(yīng)，包含多個(gè)培養(yǎng)空間11和壁12。
[0047]在各孔21內(nèi)、換言之在培養(yǎng)容器10內(nèi)，多個(gè)培養(yǎng)空間11如圖1所示配置成陣列狀。各孔21中所含的培養(yǎng)空間11的個(gè)數(shù)依賴于培養(yǎng)板上制作的孔21的個(gè)數(shù)(孔21的大小)和培養(yǎng)空間11以及壁12的大小。圖3為用于說明構(gòu)成而減少培養(yǎng)空間11的個(gè)數(shù)來表示的示意圖，各孔21中所含的培養(yǎng)空間11的個(gè)數(shù)與實(shí)際不同。此外，圖1、2中，示出了9個(gè)培養(yǎng)空間11。這是為了說明而表示的，并不與實(shí)際的培養(yǎng)容器10(孔21)中所含的培養(yǎng)空間11的個(gè)數(shù)對應(yīng)。
[0048]參考圖1~3，對用于形成期望的球狀體的微米級的培養(yǎng)空間11的形狀、大小的一例和培養(yǎng)表面的親水化處理方法、培養(yǎng)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0049]關(guān)于培養(yǎng)空間11的等效直徑，需要考慮到球狀體的大小隨細(xì)胞增殖而使其直徑增大。在此重要的是，確保使球狀體不與相鄰的培養(yǎng)空間11的細(xì)胞接觸的培養(yǎng)空間11。因此，培養(yǎng)空間11的等效直徑D優(yōu)選為期望的球狀體的直徑的I~5倍的范圍，更優(yōu)選為
1.5~3倍的范圍。[0050]在本發(fā)明的培養(yǎng)方法的一個(gè)方式中，為了形成直徑100 μ m的粘附性細(xì)胞的球狀體，使用具有規(guī)則地配置有期望的球狀體的直徑的I~5倍的范圍、即、等效直徑D為100~500 μ m的范圍且高度H為等效直徑的0.3~5倍的范圍的培養(yǎng)空間11的底部13的培養(yǎng)容器10。
[0051]例如，對培養(yǎng)作為粘附性細(xì)胞的癌細(xì)胞的情況進(jìn)行了研究。根據(jù)非專利文獻(xiàn) I (Juergen Friedrich 等著、“Spheroid-based drug screed:considerations andpracitical approach，，、Nature Protocols vol.4N0.32009、pp309_324),在將粘附性細(xì)胞用于藥物的篩選的情況下，增殖的癌細(xì)胞中小的為200 μ m，最大的球狀體尺寸根據(jù)來源的器官各不相同，也有增殖到1000 μ m以上的情況。此外，在500 μ m~600 μ m的球狀體中觀察到與生物體內(nèi)的腫瘤中特征性的腫瘤中心發(fā)生的繼發(fā)性細(xì)胞死亡類似的現(xiàn)象。因此，培養(yǎng)空間11的等效直徑優(yōu)選為200 μ m~4000 μ m的范圍，更優(yōu)選為500 μ m~3000 μ m的范圍。
[0052]關(guān)于培養(yǎng)空間11的高度H，本發(fā)明的培養(yǎng)空間11使用比一般的培養(yǎng)方法中使用得空間更深的空間。具體而言，一般的培養(yǎng)方法中，粘附性細(xì)胞通過增強(qiáng)與培養(yǎng)空間11的表面的細(xì)胞粘附性而增殖、維持。該培養(yǎng)方法中，為了提高氨基酸、氧的供給性，不在如本實(shí)施方式這樣的、培養(yǎng)空間11的等效直徑D為期望的球狀體的直徑的I~5倍的范圍且高度H為等效直徑D的0.3~5倍的范圍的深空間內(nèi)培養(yǎng)。
[0053]另一方面，本發(fā)明中，為了如后所述抑制細(xì)胞粘附性，需要設(shè)計(jì)能夠供給氨基酸、氧等且球狀體不脫離的最佳高度H。關(guān)于培養(yǎng)空間11，研究了各種高度H、等效直徑D，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)空間11的高度H的最佳范圍為培養(yǎng)空間11的等效直徑D的0.3倍~5倍的范圍，更優(yōu)選為0.5~2倍的范圍。其理由之一在于，培養(yǎng)空間11的高度H只要在更換培養(yǎng)基時(shí)球狀體不從培養(yǎng)空間11脫離即可，并且，為了充分進(jìn)行培養(yǎng)基中所含的氨基酸、氧供給營養(yǎng)成分，空間的深度越淺越優(yōu)選。
[0054]壁12的寬度W為將培養(yǎng)空間11與鄰接的培養(yǎng)空間11隔開的壁12的厚度。因此，為了防止壁12的上表面上的細(xì)胞增殖且使細(xì)胞容易進(jìn)入培養(yǎng)空間11內(nèi)，壁12的寬度W為5~50 μ m的范圍即可，優(yōu)選為I個(gè)以下細(xì)胞體的大小、即5~30 μ m的范圍，更優(yōu)選為5~IOym的范圍。此外，從同樣的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選壁12的上表面與培養(yǎng)空間11的側(cè)面所成的角Θ為90~135度的范圍，更優(yōu)選為90度~120度的范圍。
[0055]圖4中示出了表示在培養(yǎng)空間11內(nèi)培養(yǎng)球狀體的狀態(tài)的示意圖。圖4中，使用圖2所示的剖面圖，將球狀體9用O記號表示。球狀體9在多個(gè)培養(yǎng)空間11內(nèi)分別進(jìn)行培養(yǎng)。
[0056]在圖3所示的培養(yǎng)板I中培養(yǎng)的情況下，對每個(gè)孔21進(jìn)行培養(yǎng)條件的設(shè)定、培養(yǎng)基的更換等。因此，由于各孔21中能夠形成多個(gè)培養(yǎng)空間11，因而能夠在相同條件下培養(yǎng)多個(gè)球狀體。此外，可以使用孔板培養(yǎng)球狀體，因此，能夠利用以往的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的裝置等。
[0057]將球狀體9的直徑DSP設(shè)為值dsp (dsp為正的數(shù)值)時(shí)，培養(yǎng)空間11的等效直徑D為值dsp~值dsp的5倍的范圍(dsp≤D≤5dsp)。另外，培養(yǎng)空間11的高度H為值dsp的0.3倍~值dsp的25倍(5X5)的范圍(0.3dsp≤H≤25dsp)。
[0058]培養(yǎng)空間11的形狀(正面的形狀)或與底部13平行的面的形狀不限定于圖1所示的形狀，例如，可以為圖5A~5B所示的形狀，也可以為其他形狀(橢圓、菱形等)。為了形成更高密度且具有均勻直徑的球狀體，優(yōu)選為左右對稱結(jié)構(gòu)。
[0059]培養(yǎng)空間11的側(cè)面的形狀不限定于圖2所示的圓柱狀，例如，可以為圖6A~6C所示的形狀。
[0060]作為構(gòu)成培養(yǎng)容器10的材料，從丙烯酸類樹脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯類樹月旨、丙烯酸-苯乙烯類共聚樹脂、聚碳酸酯類樹脂、聚酯類樹脂、聚乙烯醇類樹脂、乙烯-乙烯醇類共聚樹脂、熱塑性彈性體、氯乙烯類樹脂和硅樹脂中的I種或它們的組合中選擇。
[0061]從觀察性的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)容器10的底部13的厚度T優(yōu)選為1mm以下。但是，只要不妨礙使用顯微鏡觀察，也可以為1_以上，不對底部13的厚度T進(jìn)行限定。通過確保培養(yǎng)容器的底部13的觀察性，能夠直接使用培養(yǎng)板來觀察培養(yǎng)的球狀體。
[0062]接著對培養(yǎng)表面的特性進(jìn)行說明。對于培養(yǎng)表面，為了在各培養(yǎng)空間11內(nèi)裝入培養(yǎng)基，另外，在使用包被溶液的情況下，該溶液如果不進(jìn)入培養(yǎng)空間11內(nèi)則不能包被表面，因此，優(yōu)選使水接觸角為45度以下。更優(yōu)選為O度~20度的范圍。另外,水接觸角的值以在與培養(yǎng)容器10相同的條件下制作不形成培養(yǎng)空間11和壁12的凹凸圖案的平板并測定而得到的值為前提。
[0063]關(guān)于以陣列狀配置培養(yǎng)空間11的表面，該表面的疏水性高、水接觸角超過45度時(shí)，即潤濕性低的情況下，添加培養(yǎng)基或包被溶液時(shí)，氣泡容易進(jìn)入空間內(nèi)，有時(shí)產(chǎn)生不能培養(yǎng)細(xì)胞的空間。因此，需要以使水接觸角為45度以下的方式進(jìn)行親水化。作為親水化的方法，可以列舉:蒸鍍SiO2的方法、進(jìn)行等離子體處理的方法。
[0064]此外，為了提高球狀體的形成率，優(yōu)選抑制細(xì)胞粘附性。為了抑制細(xì)胞粘附性，可以使用水接觸角為45度以下、優(yōu)選為40度以下、更優(yōu)選為20度以下的表面。關(guān)于抑制細(xì)胞粘附性與水接觸角的關(guān)系，例`如，記載在非專利文獻(xiàn)I (Y Ikada著、“Surface modificationof polymers for medical applications，，、Biomaterialsl994, vol.15N0.10，pp725_736)中。
[0065]作為使水接觸角為45度以下的方法，可以列舉:在培養(yǎng)底面上蒸鍍玻璃的方法、使用等離子體處理法在表面上形成官能團(tuán)的方法。可以使用通過等離子體處理等在表面上形成官能團(tuán)或包被能夠利用光或溫度控制親水/疏水性的聚合物的方法。此外，可以包被磷脂-高分子復(fù)合物。也可以在進(jìn)行上述的表面處理后，固定聚乙二醇、磷脂-高分子復(fù)合物等親水性聚合物。
[0066]實(shí)施例
[0067]以下，對本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。
[0068][實(shí)施例1、2、比較例I]
[0069]1.培養(yǎng)容器的制作
[0070]對于實(shí)施例1、2和比較例1，作為圖1、2所示的規(guī)則地排列有培養(yǎng)空間11的培養(yǎng)容器10，通過光刻法制作以下的等效直徑D、寬度W和高度H的圖案，進(jìn)行電鍍Ni，得到具有對應(yīng)的凹凸形狀的模具。
[0071 ].實(shí)施例1:D=100 μ m、ff=20 μ m、H=50 μ m (H/D=0.5)
[0072].實(shí)施例 2:D=200 μ m、ff=20 μ m、H=IOO μ m (H/D=0.5)
[0073].比較例 I:D=200 μ m、ff=20 μ m、H=50 μ m (H/D=0.25)[0074]實(shí)施例1、2、比較例I中，使用該模具，通過熱壓成形在聚苯乙烯上進(jìn)行凹凸圖案形狀的轉(zhuǎn)印，制作上述尺寸的樹脂基材。制作通過真空蒸鍍在該樹脂基材表面上形成了IOOnm的二氧化硅膜的薄膜，通過激光熔敷法將薄膜粘貼在聚苯乙烯制的無底面的24孔板上后，進(jìn)行Y射線滅菌。這樣，制作了形成有在各孔中具有多個(gè)培養(yǎng)空間11的培養(yǎng)容器10的24孔的培養(yǎng)板。
[0075]比較例2使用市售(Becton,Dickinson and Company制、7 r ^ > (注冊商標(biāo)))的Y射線滅菌完畢的平面狀的24孔培養(yǎng)板。比較例2為以平面狀進(jìn)行培養(yǎng)的以往的二維培養(yǎng)。
[0076]全部培養(yǎng)板的水接觸角均為45度以下。水接觸角使用自動(dòng)接觸角測定裝置0CA20(英弘精機(jī)株式會(huì)社制)測定。對于實(shí)施例1、2和比較例I的培養(yǎng)板，在相同條件下制作不具有形成培養(yǎng)空間11的凹凸圖案的平板狀板并測定水接觸角。對于比較例2，通過目視可以明確地確認(rèn)水接觸角為45度以下。
[0077]2.細(xì)胞培養(yǎng)和觀察
[0078]在全部培養(yǎng)板的孔中加入300 μ LI體積％MPC溶液，在4°C下放置24小時(shí)后，使用吸液器吸取溶液，使用完全干燥后的培養(yǎng)板。
[0079]細(xì)胞使用人HT29結(jié)腸癌(DS 7 r —7 /SM才J 力 > 公司)細(xì)胞。
[0080]使用培養(yǎng)燒瓶(C0RNIGN公司制)，在37°C、5體積％C02溫箱內(nèi)增殖至預(yù)定的細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)基使用含有10體積％胎牛血清(FBS:Fetal Bovine Serum)的DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium，達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基)(SIGMA公司制)培養(yǎng)基。使用培養(yǎng)燒瓶(C0RNIGN公司制`)，在5體積％C02溫箱內(nèi)增殖至預(yù)定的細(xì)胞數(shù)。使用0.25體積％胰蛋白酶溶液將增殖后的細(xì)胞從培養(yǎng)底面剝離，通過離心分離法回收細(xì)胞。將回收的細(xì)胞放入含有10體積％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，以使細(xì)胞濃度為500000個(gè)/cm2的方式接種細(xì)胞。然后，將細(xì)胞在37°C、5體積％C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。
[0081]細(xì)胞培養(yǎng)后，使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0082]對于觀察結(jié)果，使用以下的計(jì)算式計(jì)算球狀體形成率(A)、球狀體直徑平均值(Dav)和球狀體直徑的平均值±5%的直徑的球狀體的比例(B)。將計(jì)算結(jié)果示于表1。
[0083].球狀體形成率A (%)=
[0084](球狀體的個(gè)數(shù))X100/(使用倒置顯微鏡觀察到的I個(gè)視野的空間的個(gè)數(shù))
[0085].球狀體直徑平均Dav ( μ m)=
[0086](各球狀體的直徑的合計(jì)值)/(全部球狀體的個(gè)數(shù))
[0087].球狀體直徑的平均值土 5%的直徑的球狀體的比例B (%)=
[0088](平均值土5%的直徑的球狀體的個(gè)數(shù))X 100/ (全部球狀體的個(gè)數(shù))
[0089]表1
【權(quán)利要求】
1.一種粘附性細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使用配置2個(gè)以上等效直徑為期望的球狀體的直徑的I倍~5倍且高度為所述等效直徑的0.3倍~5倍的培養(yǎng)空間、并且該培養(yǎng)空間表面的水接觸角為45度以下的培養(yǎng)容器，在多個(gè)培養(yǎng)空間培養(yǎng)粘附性細(xì)胞的球狀體。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中，所述培養(yǎng)空間的等效直徑為ΙΟΟμπ!~5000 μ m的范圍。
3.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，將相鄰的所述培養(yǎng)空間隔開的壁的厚度為5 μ m~50 μ m的范圍。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，將相鄰的所述培養(yǎng)空間隔開的壁的上表面與側(cè)面所成的角度為90度~135度的范圍。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在培養(yǎng)后的全部球狀體中，有60%以上的球狀體，其直徑在培養(yǎng)后的球狀體的直徑的平均值的正負(fù)5%的范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述球狀體為癌細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)容器為包含丙烯酸類樹脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯類樹脂、丙烯酸-苯乙烯類共聚樹脂、聚碳酸酯類樹月旨、聚酯類樹脂、聚乙烯醇類樹脂、乙烯-乙烯醇類共聚樹脂、熱塑性彈性體、氯乙烯類樹脂和硅樹脂中的I種或它們的組合的樹脂成形品。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)空間的表面以通過玻璃處理使水接觸角為45度以下的方式進(jìn)行了處理。
9.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)空間的表面以通過等離子體處理形成官能團(tuán)而使水接觸角為45度以下的方式進(jìn)行了處理。
10.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)空間的表面上包被有通過溫度、光中的任何一種使親水性和疏水性發(fā)生變化的聚合物。
11.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)空間的表面上固定有抑制細(xì)胞粘附的親水性聚合物鏈。
12.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)空間的表面上固定有磷脂或磷脂-高分子復(fù)合物。
13.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，以通過玻璃處理使水接觸角為45度以下的方式對所述培養(yǎng)空間的表面進(jìn)行處理后，將通過溫度、光中的任何一種使親水性和疏水性發(fā)生變化的聚合物、抑制細(xì)胞粘附的親水性聚合物鏈、以及磷脂或磷脂-高分子復(fù)合物中的任何一種聚合物固定在所述培養(yǎng)容器的表面上。
14.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，以通過等離子體處理形成官能團(tuán)而使水接觸角為45度以下的方式對所述培養(yǎng)空間的表面進(jìn)行處理后，將通過溫度、光中的任何一種使親水性和疏水性發(fā)生變化的聚合物、抑制細(xì)胞粘附的親水性聚合物鏈、以及磷脂或磷脂-高分子復(fù)合物中的任何一種聚合物固定在所述培養(yǎng)容器的表面上。
【文檔編號】C12N5/09GK103814125SQ201280045911
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月20日
【發(fā)明者】江尻洋子, 綾野賢, 細(xì)田雅也, 田崎剛 申請人:株式會(huì)社可樂麗