從人b細(xì)胞產(chǎn)生的具有甲型流感病毒中和活性的結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生于人B細(xì)胞的具有甲型流感病毒中和活性的結(jié)合分子，根據(jù)本發(fā)明的具有甲型流感病毒中和活性的結(jié)合分子是這樣的結(jié)合分子，其產(chǎn)生自從感染甲型流感病毒之患者的血液中選擇的B細(xì)胞，并且具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性，因而可用于預(yù)防和治療來源于甲型流感病毒的疾病，并且可用于通過使用根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子來診斷流感病毒。
【專利說明】從人B細(xì)胞產(chǎn)生的具有甲型流感病毒中和活性的結(jié)合分子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的人單克隆抗體，其來源于人B細(xì)胞，所述人B細(xì)胞選擇自從甲型流感病毒的感染中恢復(fù)的患者的血液。
【背景技術(shù)】
[0002]流感是由流感病毒的呼吸系統(tǒng)感染引起的疾病，常發(fā)生在冬季。已知流感具有很高的感染性，并且影響所有年齡組，特別是老年人(Treanor J，2004，N Engl J Med.350(3):218-20)。流感病毒是包膜的RNA (核糖核酸)病毒,屬于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科，具有由八個(gè)反義單鏈RNA(核糖核酸)區(qū)段構(gòu)成的基因組。這些流感病毒被劃分為甲型、乙型和丙型。根據(jù)其主要表面蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，甲型流感病毒被進(jìn)一步劃分為亞型。到目前為止，已經(jīng)鑒別了 16種HA和9種NA (Cheung TK和Poon LL2007，Ann NYAcad Scill02:1-25)。流感病毒可根據(jù)其類型影響鳥、豬和人，并且具有由RNA區(qū)段構(gòu)成的基因組，因?yàn)檫@個(gè)原因，其基因可連續(xù)地突變和重組，產(chǎn)生新的遺傳改變(Treanor J，2004.NEngl JMed.350(3):218-20)。由于這種連續(xù)的突變，難以獲得針對(duì)流感病毒的永久免疫力，因此目前被認(rèn)為最有效的預(yù)防方法是這樣的方法，每年施用針對(duì)預(yù)計(jì)將流行之特定類型的流感病毒的疫苗以每年產(chǎn)生針對(duì)流感病毒的免疫力。
[0003]針對(duì)流感病毒的疫苗通常使用卵產(chǎn)生，但該生產(chǎn)方法是耗時(shí)且低效的方法。因此，該方法的問題在于難以每年在有限的時(shí)間框架內(nèi)生產(chǎn)足夠量的疫苗。為了解決這一問題，幾家藥物公司(GSK、Baxter等)已經(jīng)積極地進(jìn)行了通過細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生疫苗的方法的研究。此外，如果發(fā)生流感病毒感染大流行，則在短時(shí)間內(nèi)開發(fā)針對(duì)感染的疫苗是非常困難的。而且，由于與耐藥性突變 病毒出現(xiàn)相關(guān)的問題，抗病毒藥物并非完全可靠的。
[0004]為了克服這個(gè)問題，最近已積極地開發(fā)了針對(duì)流感病毒的抗體(Throsby等，2008，PloS 0ne3(e3942) ；Sui 等，2009, Nature structural & molecular biologyl6(265-273)；Simmons 等，2007，PloS Medicine4(el78) ；fframmert 等，2011, J Exp Med.208(181-193)；Corti 等，2011，Science333 (850-856))。
[0005]來自恢復(fù)患者的血液產(chǎn)物已經(jīng)被用于治療感染多種病毒的患者，以及用于治療流感感染大流行。例如，當(dāng)感染西班牙流感病毒的患者具有肺炎癥狀時(shí)，收集自從流感病毒感染恢復(fù)之患者的血液產(chǎn)物被用于治療流感病毒(Luke等，2006.Annals ofinternalmedicine.145:599)。因此，從人血漿中純化超免疫球蛋白(IgIv)并用于治療感染多種病毒的患者，但如上所述獲得的產(chǎn)物由于血液中潛在的感染原而可能是不安全的，并且對(duì)于大量生產(chǎn)是低效的。
[0006]人B細(xì)胞被用于篩選特定人單克隆抗體。然而，通過EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)永生化人B細(xì)胞的效率較低且耗時(shí)。為了克服這一缺點(diǎn)，已經(jīng)開發(fā)并使用了新技術(shù)。這些技術(shù)之一是利用RT-PCR法直接從B細(xì)胞獲得抗體的遺傳信息。例如，有一種方法包括:對(duì)表達(dá)針對(duì)特定抗原之抗體的B細(xì)胞進(jìn)行染色，使用FACS分選儀分離B細(xì)胞，通過RT-PCR方法從單個(gè)B細(xì)胞獲得抗體的遺傳信息，將所述遺傳信息插入到表達(dá)載體中，并將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞中以產(chǎn)生大量抗體。為了以更簡(jiǎn)便且更快速的方式進(jìn)行該生產(chǎn)方法，可以使用以下技術(shù)。新技術(shù)“芯片上的免疫斑點(diǎn)陣列測(cè)定”(immunospot arrayassay on a chip, ISAAC)能夠在幾周內(nèi)通過篩選單個(gè)B細(xì)胞(分泌特定單克隆抗體)獲得抗體基因(Jin等.，2009Nat Med.15，1088-1092)。這樣獲得的抗體是天然人抗體，其在免疫原性問題方面可以更有效。
[0007]公開內(nèi)容
[0008]技術(shù)問題
[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼所述結(jié)合分子的分離的核酸分子。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有插入其中的所述分離的核酸分子的表達(dá)載體。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的產(chǎn)生結(jié)合分子的細(xì)胞系。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于篩選結(jié)合分子的方法。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含所述結(jié)合分子的組合物。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用所述結(jié)合分子治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè) 目的是提供使用所述結(jié)合分子預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用所述結(jié)合分子診斷甲型流感病毒感染的方法。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，其包含所述結(jié)合分子。
[0019]技術(shù)方案
[0020]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子。
[0021]本發(fā)明還提供了編碼所述結(jié)合分子的分離的核酸分子。
[0022]本發(fā)明還提供了具有插入其中的所述分離的核酸分子的表達(dá)載體。
[0023]本發(fā)明還提供了用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的產(chǎn)生結(jié)合分子的細(xì)胞系。
[0024]本發(fā)明還提供了用于篩選結(jié)合分子的方法。
[0025]本發(fā)明還提供了包含所述結(jié)合分子的組合物。
[0026]本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，其包含所述結(jié)合分子。
[0027]本發(fā)明還提供了用于診斷甲型流感病毒的組合物，其包含所述結(jié)合分子。
[0028]本發(fā)明還提供了使用所述結(jié)合分子治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
[0029]本發(fā)明還提供了使用所述結(jié)合分子預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
[0030]本發(fā)明還提供了使用所述結(jié)合分子診斷甲型流感病毒感染的方法。
[0031]本發(fā)明還提供了用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，其包含所述結(jié)合分子。
[0032]有益效果
[0033]本發(fā)明的結(jié)合分子具有對(duì)甲型流感病毒的結(jié)合親和力和針對(duì)其的中和活性，因而可用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病，并且也可用于診斷甲型流感病毒感染。【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是一組圖，其示出為了確認(rèn)初步篩選的結(jié)合分子對(duì)H3血凝素(下文稱作“HA”)的結(jié)合親和力而進(jìn)行的ELISA的結(jié)果。
[0035]圖2示出載體pCT145 (A)和pCT147⑶的圖譜。
[0036]A:pCT145 載體；
[0037]B:pCT147 載體；
[0038]pac:編碼嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PAC)的基因；以及
[0039]DS:二重對(duì)稱(dyad symmetry)序列(EBNA1結(jié)合oriP中的二重對(duì)稱(DS)元件)
[0040]圖3是表達(dá)本發(fā)明之結(jié)合分子的表達(dá)載體的圖譜。
[0041]圖4示出使用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行的動(dòng)物(小鼠)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0042]圖5示出在使用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行動(dòng)物(雪貂)實(shí)驗(yàn)期間，測(cè)量感染H3N2(A/香港/68)流感病毒后鼻洗液和肺組織中病毒滴度改變的結(jié)果。
[0043]圖6示出在使用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行動(dòng)物(雪貂)實(shí)驗(yàn)期間，測(cè)量感染H5N1(A/越南/1203/04)流感病毒后 鼻洗液和肺組織中病毒滴度改變的結(jié)果。
[0044]最佳方式
[0045]下文中，將如下定義本文所使用的術(shù)語(yǔ)。
[0046]本文所用的術(shù)語(yǔ)“甲型流感病毒”指屬于正粘病毒科并且具有由八個(gè)反義單鏈RNA(核糖核酸)區(qū)段構(gòu)成的基因組的包膜病毒。這些流感病毒被劃分為甲型、乙型和丙型，并且根據(jù)其主要表面蛋白HA (血凝素)和NA (神經(jīng)氨酸酶)，甲型流感病毒被進(jìn)一步劃分為亞型。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了 16種HA和9種NA。
[0047]本文所用的表達(dá)“H3亞型病毒”指具有H3亞型HA的病毒，并且因而旨在包括H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N7、H3N8 和 H3N9 病毒。
[0048]本文所用的術(shù)語(yǔ)“血凝素”(下文中稱作“HA”)指流感病毒的包膜糖蛋白。HA介導(dǎo)流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的吸附和滲透。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了 16種HA亞型。
[0049]本文所用的術(shù)語(yǔ)“恢復(fù)或完全恢復(fù)的患者”指這樣的患者，其由于甲型流感病毒感染而為甲型流感病毒陽(yáng)性，但在給定時(shí)間階段后血液中甲型流感病毒為陰性。
[0050]本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合分子”指完整的免疫球蛋白，其包括單克隆抗體，例如嵌合、人源化或人單克隆抗體；或者指免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段或包含可變結(jié)構(gòu)域的片段，其與完整免疫球蛋白競(jìng)爭(zhēng)與免疫球蛋白的結(jié)合伴侶的特異性結(jié)合，例如甲型流感病毒的單體HA或三聚體HA。不論結(jié)構(gòu)為何，抗原結(jié)合片段結(jié)合被完整免疫球蛋白識(shí)別的相同抗原?？乖Y(jié)合片段可包含肽或多肽，其包含由結(jié)合分子之氨基酸序列的至少2、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250個(gè)連續(xù)氨基酸殘基組成的氨基酸序列?？乖Y(jié)合片段尤其包括Fab、F(ab' )、F(ab' )2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈卩遼菌體抗體、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)、四抗體(tetrabodies)、多肽(其含有足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白的至少一個(gè)片段)等。上述片段可以合成產(chǎn)生或者通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割產(chǎn)生，或者它們可以通過重組DNA技術(shù)遺傳改造。生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域公知的。
[0051]本文所用的術(shù)語(yǔ)“可藥用賦形劑”意指任何這樣的惰性物質(zhì)，其與活性分子(例如藥、試劑或結(jié)合分子)組合用于制備合適的或方便的劑型。可藥用賦形劑是這樣的賦形劑，其在所使用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，并且與包括藥、試劑或結(jié)合分子的制劑的其他成分是相容的。
[0052]本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指對(duì)預(yù)防或治療由甲型流感病毒感染導(dǎo)致的病癥有效的結(jié)合分子的量。
[0053]下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0054]本發(fā)明人分離了外周血單核細(xì)胞(PBMC)，其來自從甲型流感病毒感染恢復(fù)之患者收集的血液。使用ISAAC方法從分離的PBMC篩選產(chǎn)生針對(duì)Hl亞型HA之單克隆抗體的B細(xì)胞。通過RT-PCR方法獲得用于在篩選的B細(xì)胞中產(chǎn)生針對(duì)HA之單克隆抗體的遺傳信息，并將其插入至PcDNA載體。將該載體轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞系，然后初步選取82種抗體。為了更精確地測(cè)量對(duì)HA的結(jié)合親和力，將插入pcDNA載體的所有抗體轉(zhuǎn)染到人F2N細(xì)胞中，并且通過使用H3亞型的單體HA和三聚 體HA作為抗原的HA-ELISA比較分析從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，從而二次選擇6種抗體(CT129、CT135、CT147、CT149、CT163和CT166抗體)，與單體HA相比它們與三聚體HA以更高程度反應(yīng)。為了檢查所選擇的抗體針對(duì)多種流感病毒的中和活性，進(jìn)行了微量中和測(cè)試(以下稱為“MN測(cè)試”)和凝血抑制測(cè)試(以下稱為“HI測(cè)試”)。一些抗體表現(xiàn)出針對(duì)多種流感病毒的高或低的中和活性，但所有抗體在HI測(cè)試中顯示陰性反應(yīng)。通過MN測(cè)試，選擇了顯示針對(duì)多種病毒之中和活性的CT149抗體。將所選擇抗體的基因插入到具有高抗體表達(dá)效率的MarEx表達(dá)載體，然后將載體轉(zhuǎn)染入F2N細(xì)胞。將源自經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗體進(jìn)行用于更多種流感病毒的MN測(cè)試。結(jié)果顯示，CT149抗體不僅具有Hl和H3亞型病毒的中和活性,而且還具有H5、H7和H9亞型病毒的中和活性(見表4)。此外，在使用H3亞型流感病毒進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CT149抗體針對(duì)H3N2感染表現(xiàn)出優(yōu)異的預(yù)防和治療效果(參見圖4)?；谏鲜鼋Y(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)完成了發(fā)明，所述發(fā)明涉及針對(duì)甲型流感病毒感染進(jìn)行保護(hù)的抗甲型流感病毒單克隆抗體。
[0055]因而，本發(fā)明提供了具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
[0056]所述結(jié)合分子優(yōu)選為抗體。所述抗體優(yōu)選為Fab片段、Fv片段、雙抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，但不限于此。
[0057]在本發(fā)明中，所述結(jié)合分子結(jié)合甲型流感病毒表面上的HA。另外，所述結(jié)合分子優(yōu)選來源于B細(xì)胞，所述B細(xì)胞存在于從甲型流感病毒HlNl亞型感染恢復(fù)的患者的血液中。
[0058]特別地，CT149抗體不僅具有針對(duì)組I (H1、H5和H9)流感病毒而且具有針對(duì)組2 (H3和H7)流感病毒的中和活性。
[0059]在本發(fā)明中，甲型流感病毒可以是HlNl亞型，并且甲型流感病毒HlNl亞型可以是A/俄亥俄州/07/2009。而且，甲型流感病毒可以是H5N1亞型，并且甲型流感病毒H5N1亞型可以是A/越南/1203/04x PR8。另外，甲型流感病毒可以是H7N2亞型，并且甲型流感病毒H7N2亞型可以是A/火雞/維吉尼亞/02x PR8。此外，甲型流感病毒可以是H9N2亞型，并且甲型流感病毒H9N2亞型可以是選自以下的任意一種或更多種Al綠翅水鴨/209/TX/2009和A/ck/HK/G9/97x PR8。在本發(fā)明中，甲型流感病毒還可以是H3N2亞型，并且甲型流感病毒H3N2亞型可以是選自以下的任意一種或更多種:A/布里斯班/10/07、A/威斯康星州 /67/05、A/ 懷俄明州 /3/03.rg、A/ 北京 /353/89-X109、A/ 北京 /32/92-R-H3、A/ 約翰內(nèi)斯堡 /33/94R-H3、A/ 南昌 /933/95、A/ 悉尼 /5/97 和 A/ 巴拿馬 /2007/99。
[0060]在本發(fā)明中，根據(jù)由Kabat等設(shè)計(jì)的系統(tǒng)(參見Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest (第 5 版)，National Institutes of Health, Bethesda,MD.(1991))使用常規(guī)方法確定可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。本發(fā)明中使用的CDR計(jì)數(shù)根據(jù)Kabat方法進(jìn)行，但本發(fā)明還涵蓋了包含通過其他方法(包括MGT方法、Chothia方法和AbM方法)確定的CDR的結(jié)合分子。
[0061]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈多肽序列:輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:1、7、13和15所示多肽序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ ID NO:2、8和16所示多肽序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQID NO:3或9所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)。
[0062]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含以下重鏈多肽序列:重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:4或10所示多肽序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ IDNO:5、11、14和17所示多肽序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQID NO:6或12所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)。
[0063]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈和重鏈多肽序列:輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:1、7、13和15所示多肽序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:2、8和16所示多肽序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:3或9所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)；以及重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ IDNO:4或10所示多肽序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ IDNO:5、11、14和17所示多肽序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:6或12所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)。
[0064]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含選自以下多肽序列的任一種多肽序列:由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:I 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:2 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:3 所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定SEQ ID NO:4所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:5所示⑶R2區(qū)和SEQ ID NO:6所示⑶R3區(qū)；由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:7所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:8所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:9所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:10所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:11所示⑶R2區(qū)和SEQ ID NO:12所示⑶R3區(qū)；由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:13所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:8所示CDR2區(qū)和SEQID NO:9所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:10所示CDRl區(qū)，SEQ IDNO:14所示CDR2區(qū)和SEQ IDNO:6所示CDR3區(qū)；以及由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:15所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:16所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:9所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:10所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO: 17 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO: 12 所示 CDR3 區(qū)。
[0065]在本發(fā)明中，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ IDNO:37所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:38所示多肽序列。
[0066]在本發(fā)明中，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ IDNO:39所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:40所示多肽序列。
[0067]在本發(fā)明中，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ IDNO:41所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:42所示多肽序列。[0068]此外，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:43所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:44所示多肽序列。
[0069]所述結(jié)合分子優(yōu)選地具有針對(duì)選自以下任一種的中和活性:甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亞型。而且，甲型流感病毒H3亞型優(yōu)選為H3N2，但不限于此。
[0070]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈多核苷酸序列:輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO: 19、25和35所示多核苷酸序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:20或26所示多核苷酸序列的任一種CDR3區(qū)。
[0071]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含以下重鏈多核苷酸序列:重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ IDNO:21、27和31所示多核苷酸序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ ID NO:22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:23,29和33所示多核苷酸序列的任一種⑶R3區(qū)。
[0072]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈和重鏈多核苷酸序列:輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:18、24、30和34所不多核苷酸序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:19、25和35所不多核苷酸序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:20或26所示多核苷酸序列的任一種⑶R3區(qū)；以及重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確 定的選自SEQ ID NO:21、27和31所示多核苷酸序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQ IDNO:23,29和33所示多核苷酸序列的任一種CDR3區(qū)。
[0073]本發(fā)明還提供了具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子，其由選自以下多核苷酸序列的多核苷酸序列構(gòu)成:由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat 方法確定的 SEQ ID NO: 18 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:19 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:20 所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:21所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:22所示⑶R2區(qū)和SEQ ID NO:23所示⑶R3區(qū)；由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:24所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:25所示CDR2區(qū)和SEQ IDNO:26所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:27所示CDRl區(qū)，SEQID NO:28所示⑶R2區(qū)和SEQ ID NO:29所示⑶R3區(qū)；由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:30所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:25所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:26所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:31所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:32所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:33所示CDR3區(qū)；以及由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:34所示⑶Rl區(qū)，SEQ IDNO:35所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:26所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQID NO:31 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:36 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:29 所示 CDR3 區(qū)。
[0074]在本發(fā)明中，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ IDNO:45所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:46所示多核苷酸序列。
[0075]而且，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:47所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:48所示多核苷酸序列。
[0076]此外，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:49所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:50所示多核苷酸序列。[0077]另外，所述結(jié)合分子優(yōu)選地由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:51所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:52所示多核苷酸序列。
[0078]所述結(jié)合分子優(yōu)選地具有針對(duì)選自以下任一種的中和活性:甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亞型。而且，甲型流感病毒H3亞型優(yōu)選為H3N2，但不限于此。
[0079]本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選為抗體，但不限于此。所述抗體優(yōu)選為Fab片段、Fv片段、雙抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。此外，本發(fā)明還涵蓋了具有結(jié)合甲型流感病毒HA之能力以及與本發(fā)明結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HA的所有抗體片段。另外，本發(fā)明還涵蓋了所述結(jié)合分子的功能性變體。如果結(jié)合分子的變體可以與本發(fā)明結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)與甲型流感病毒H3亞型或其片段的特異性結(jié)合，則認(rèn)為它們是本發(fā)明結(jié)合分子的功能性變體。特別地，如果功能性變體可以結(jié)合甲型流感病毒HA或其片段，并且具有針對(duì)該HA或片段的中和活性，則認(rèn)為它們是本發(fā)明的功能性變體。功能性變體包括但不限于這樣的衍生物，其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本相似，但含有例如未在本發(fā)明親本結(jié)合分子中發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)修飾、化學(xué)和/或生物化學(xué)。這樣的修飾包括，例如乙?；?、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附接、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、PEG化、蛋白裂解加工、磷酸化等?；蛘撸δ苄宰凅w可以是包含這樣的氨基酸序列的結(jié)合分子，所述氨基酸序列相比于親本結(jié)合分子的氨基酸序列含有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替代、插入、缺失或其組合。此外，功能性變體可包含在氨基或羧基末端的任一或兩者的氨基酸序列截?cái)?。根?jù)本發(fā)明的功能性變體與親本單克隆抗體相比可以具有相同或不同(更高或更低)的結(jié)合親和力，但仍能結(jié)合甲型流感病毒HA或其片段。例如，與本發(fā)明的親本結(jié)合分子相比，根據(jù)本發(fā)明的功能性變體可以對(duì)甲型流感病毒HA或其片段有升高或降低的結(jié)合親和力。優(yōu)選地，對(duì)可變區(qū)(包括但不限于框架區(qū)、高變區(qū)特別是CDR3區(qū))的氨基酸序列進(jìn)行修飾。一般而言，輕鏈或重鏈區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)(包含三個(gè)CDR)以及較保守區(qū)(所謂的框架區(qū)(FR))。高變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。旨在落入本發(fā)明范圍內(nèi)的功能性變體與本文所限定 的親本單克隆抗體有至少約50-99%、優(yōu)選至少約60-99%、更優(yōu)選至少約80-99%、甚至更優(yōu)選至少約90-99%、特別是至少約95-99%以及特別是至少約97-99%的氨基酸序列同源性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法例如Gap或最佳擬合(Bestfit)以最優(yōu)比對(duì)待比較的氨基酸序列并確定相似或一致的氨基酸殘基?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的一般分子生物學(xué)方法(包括PCR、寡核苷酸定向突變和定點(diǎn)突變)或者通過有機(jī)合成方法(但不限于此)來改變親本單克隆抗體或其部分以獲得功能性變體。
[0080]本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明結(jié)合分子的分離的核酸分子。
[0081]本發(fā)明的核酸分子涵蓋根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過將本發(fā)明抗體的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為多核苷酸序列所獲得的所有核酸分子。因此，可以制備多種具有開放閱讀框(ORF)的多核苷酸序列并且它們也包含在本發(fā)明核酸分子的范圍內(nèi)。
[0082]本發(fā)明還提供了具有插入其中的所述分離的核酸分子的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可優(yōu)選地來源于選自(但不限于)以下的任一種，由Celltrion Inc.(韓國(guó))生產(chǎn)的MarEx表達(dá)載體、廣泛市售可得的PCDNA載體、F、RU RPU Col、pBR322、ToL、Ti載體；黏粒；嗜菌體例如 λ (lambda), λ 形(Iambdoid)、Μ13、Mu、Ρ1、Ρ22、Q μ、T-even、Τ2、Τ3、Τ7 等；以及植物病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何表達(dá)載體可以用于本發(fā)明中，并且表達(dá)載體的選擇取決于所選宿主細(xì)胞的性質(zhì)。宿主細(xì)胞中載體的引入可以通過(但不限于)以下進(jìn)行:磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、Iipofectamin轉(zhuǎn)染或電穿孔,并且本領(lǐng)域任何技術(shù)人員均可以選擇并使用適合所用表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的引入方法。優(yōu)選地，所述載體含有一個(gè)或更多個(gè)可選擇標(biāo)記，但不限于此，并且也可以使用不含可選擇標(biāo)記的載體?？蛇x擇標(biāo)記的選擇可以取決于所選的宿主細(xì)胞，盡管這對(duì)于本發(fā)明而言不是關(guān)鍵的，因?yàn)檫@是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
[0083]為了便于本發(fā)明核酸分子的純化，可以將標(biāo)簽序列插入到表達(dá)載體中。標(biāo)簽的實(shí)例包括但不限于，六組氨酸標(biāo)簽、血凝素標(biāo)簽、myc標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何便于純化的標(biāo)簽都可以在本發(fā)明中使用。
[0084]本發(fā)明還提供了細(xì)胞系，其產(chǎn)生具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，所述細(xì)胞系具有以上描述的轉(zhuǎn)染到其中的表達(dá)載體。
[0085]在本發(fā)明中，所述細(xì)胞系可以包括哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲細(xì)胞、真菌或細(xì)菌來源的細(xì)胞，但不限于此。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選使用選自(但不限于)以下的任一種作為宿主細(xì)胞:CH0細(xì)胞、F2N細(xì)胞、CSO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Bowes黑素瘤細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、911細(xì)胞、AT1080細(xì)胞、A549細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞?？梢栽诒景l(fā)明中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用作哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的任何細(xì)胞。
[0086]本發(fā)明還提供了從感染有甲型流感病毒的患者篩選具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟:1)從感染甲型流感病毒的患者中篩選其血液為甲型流感病毒陰性的患者；2)從步驟I)篩選的患者收集血液；3)從步驟2)中收集的患者血液中分離B細(xì)胞；4)從步驟3)中分離的B細(xì)胞篩選產(chǎn)生結(jié)合血凝素(HA)之結(jié)合分子的B細(xì)胞；5)從步驟4)篩選的B細(xì)胞提取RNA ；6)從步驟5)中提取的RNA擴(kuò)增結(jié)合分子基因；7)將步驟6)中擴(kuò)增的基因克隆到表達(dá)載體中；8)將步驟7)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中；9)從來源于步驟8)中構(gòu)建之經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié)合分子篩選結(jié)合HA的結(jié)合分子；10)制備并培養(yǎng)用于經(jīng)篩選結(jié)合分子的細(xì)胞系；11)從步驟10)的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化結(jié)合甲型流感病毒HA的結(jié)合分子；12)再確認(rèn)步驟11)中純化的結(jié)合分子是否具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性；以及13)篩選步驟12)中經(jīng)確認(rèn)具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
[0087]上述篩選方法中的結(jié)合分子優(yōu)選為抗體，但不限于此。所述抗體優(yōu)選為Fab片段、Fv片段、雙抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。此外，本發(fā)明還涵蓋了具有結(jié)合甲型流感病毒HA之能力以及與本發(fā)明結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HA的所有抗體片段。
[0088]另外，本發(fā)明還涵蓋了所述結(jié)合分子的功能性變體。如果結(jié)合分子的變體可以與本發(fā)明結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)與甲型流感病毒H3亞型或其片段的特異性結(jié)合，則認(rèn)為它們是本發(fā)明結(jié)合分子的功能性變體。特別地，如果功能性變體可以結(jié)合甲型流感病毒HA或其片段，并且具有針對(duì)該HA或片段的中和活性，則認(rèn)為它們是本發(fā)明的功能性變體。功能性變體包括但不限于這樣的衍生物，其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本相似，但含有例如未在本發(fā)明親本結(jié)合分子中發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi) 修飾、化學(xué)和/或生物化學(xué)。這樣的修飾包括，例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附接、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、PEG化、蛋白裂解加工、磷酸化等。或者，功能性變體可以是包含這樣的氨基酸序列的結(jié)合分子，所述氨基酸序列相比于親本單克隆抗體的氨基酸序列含有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替代、插入、缺失或其組合。此外，功能性變體可包含在氨基或羧基末端的任一或兩者的氨基酸序列截?cái)?。根?jù)本發(fā)明的功能性變體與親本單克隆抗體相比可以具有相同或不同(更高或更低)的結(jié)合親和力，但仍能結(jié)合甲型流感病毒HA或其片段。例如，與親本結(jié)合分子相比，根據(jù)本發(fā)明的功能性變體可以對(duì)甲型流感病毒HA或其片段有升高或降低的結(jié)合親和力。優(yōu)選地，對(duì)可變區(qū)(包括但不限于框架區(qū)、高變區(qū)特別是CDR3區(qū))的氨基酸序列進(jìn)行修飾。一般而言，輕鏈或重鏈區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)(包含三個(gè)CDR)以及較保守區(qū)(所謂的框架區(qū)(FR))。高變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。旨在落入本發(fā)明范圍內(nèi)的功能性變體與本文所限定的親本單克隆抗體有至少約50-99%、優(yōu)選至少約60-99%、更優(yōu)選至少約80-99%、甚至更優(yōu)選至少約90-99%、特別是至少約95-99%以及特別是至少約97-99%的氨基酸序列同源性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法例如Gap或最佳擬合(Bestfit)以最優(yōu)比對(duì)待比較的氨基酸序列并確定相似或一致的氨基酸殘基?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的一般分子生物學(xué)方法(包括PCR、寡核苷酸定向突變和定點(diǎn)突變)或者通過有機(jī)合成方法(但不限于此)來改變親本單克隆抗體或其部分以獲得功能性變體。
[0089]本發(fā)明還提供了包含上述結(jié)合分子的組合物。
[0090]除了具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子之外，本發(fā)明的組合物可以包含可藥用賦形劑。可藥用賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0091]本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，所述組合物包含上述結(jié)合分子。
[0092]除了具有針對(duì)甲 型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子之外，本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物可以包含可藥用賦形劑?？伤幱觅x形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0093]此外，本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物可以包含至少5種其他治療劑。本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物可以包含結(jié)合甲型流感病毒HA或其片段的多種單克隆抗體，并從而表現(xiàn)出中和活性的協(xié)同效應(yīng)。
[0094]此外，本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物還可以包含一種或更多種其他治療劑或診斷劑。所述治療劑包括但不限于抗病毒藥。這種藥的實(shí)例包括抗體、小分子、有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。
[0095]本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物在制造和儲(chǔ)存條件下必須是無(wú)菌且穩(wěn)定的。此外，它可以是粉末的形式，以在遞送之前或遞送時(shí)在適當(dāng)?shù)目伤幱觅x形劑中重構(gòu)。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，其從預(yù)先滅菌過濾的粉末溶液產(chǎn)生活性成分和任何其他期望成分的粉末?；蛘?，本發(fā)明的組合物可以是溶液形式，并且可以在遞送之前或遞送時(shí)添加和/或混合適當(dāng)?shù)目伤幱觅x形劑以提供單位劑量的可注射形式。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的可藥用賦形劑適用于高藥物濃度，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性并且如需要可延緩吸收。
[0096]本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物的最佳施用途徑的選擇將受幾種因素的影響，所述因素包括:組合物中活性分子的物理化學(xué)性質(zhì)、臨床狀況的緊迫性和活性分子的血漿濃度與期望的治療效果之間的關(guān)系。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子可與保護(hù)它們免于快速釋放的載體一起制備，如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢栽诒景l(fā)明中使用生物可降解和生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用防止抗體失活的材料或化合物包被或與其共同施用。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子可與適當(dāng)?shù)妮d體(例如，脂質(zhì)體或稀釋劑)一起施用。
[0097]本發(fā)明的預(yù)防性和治療性組合物的施用途徑可分為經(jīng)口和腸胃外途徑。優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)途徑，但不限于此。
[0098]經(jīng)口劑型可以配制成片劑、藥片(troche)、錠劑(lozenge)、水性或油性混懸劑、可分散粉劑或顆粒劑、乳劑、硬膠囊、軟明膠膠囊、糖漿或酏劑、丸劑、糖衣丸劑(dragee)、液體、凝膠或漿(slurry)。這些制劑可以包含藥用賦形劑，其包括但不限于，惰性稀釋劑、?；瘎┖捅澜鈩⒄澈蟿?、潤(rùn)滑劑、防腐劑、著色劑、調(diào)味劑或增甜劑、植物油或礦物油、潤(rùn)濕劑和增稠劑。
[0099]用于腸胃外施用的制劑可以是水性或非水性等滲無(wú)菌無(wú)毒注射或輸注溶液或懸液的形式。該溶液和懸液可以包含在使用劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒的試劑，例如1，3_ 丁二醇、林格氏溶液(Ringer' s solution), Hank' s溶液、等滲氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部麻醉劑、防腐劑、緩沖劑、粘度增加劑或溶解性增加劑、水溶性抗氧化劑、油溶性抗氧化劑和金屬螯合劑。
[0100]本發(fā)明還提供了用于診斷甲型流感病毒的組合物，其包含綴合物，所述綴合物包含與具有針對(duì)抗甲型流感病毒之中和活性的上述結(jié)合分子連接的標(biāo)簽。
[0101]根據(jù)本發(fā)明的用于診斷的組合物包含至少一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)簽，例如可檢測(cè)部分/試劑。所述標(biāo)簽可以非共價(jià)連接至本發(fā)明的結(jié)合分子。所述標(biāo)簽也可以通過共價(jià)鍵合直接連接至結(jié)合分子?；蛘?，所述標(biāo)簽也可以通過一個(gè)或更多個(gè)連接化合物連結(jié)至結(jié)合分子。用于將標(biāo)簽連接到結(jié)合分子的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。優(yōu)選地，作為標(biāo)簽的可檢測(cè)部分/試劑為選自以下的 任一種:酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬和非放射性順磁金屬離子，但不限于此。
[0102]本發(fā)明還提供了用于治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向患有疾病的對(duì)象施用治療有效量的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的本發(fā)明結(jié)合分子。
[0103]在本發(fā)明的治療方法中，甲型流感病毒優(yōu)選地為選自以下的任一種:H1、H3、H5、H7和H9亞型，并且甲型流感病毒H3亞型優(yōu)選為H3N2，但不限于此。
[0104]在本發(fā)明的治療方法中，可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何治療劑與本發(fā)明結(jié)合分子一起施用。
[0105]在本發(fā)明的治療方法中，由甲型流感病毒引起的疾病可以是選自以下的任一種:流感新毒株、大流行流感和季節(jié)性流感，但不限于此。
[0106]在本發(fā)明的治療方法中，可以調(diào)整具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的劑量以提供最佳的響應(yīng)。所述劑量為例如0.01-200mg/kg，優(yōu)選0.l-150mg/kg并且更優(yōu)選l-100mg/kg，但不限于此。每天可以施用若干分次劑量，或者所述劑量可以按照由個(gè)體情況的急切需要所指示地相應(yīng)地減少或增加。施用模式并不限于本發(fā)明，可以由主治醫(yī)師決定。
[0107]在本發(fā)明的治療方法中，具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的施用途徑可以分為經(jīng)口和腸胃外施用途徑。優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)途徑，但不限于此。
[0108]本發(fā)明還提供了用于預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法將向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康木哂嗅槍?duì)甲型流感病毒之中和活性的本發(fā)明結(jié)合分子。[0109]在本發(fā)明的預(yù)防方法中，可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何預(yù)防劑與本發(fā)明的結(jié)合分子一起施用。
[0110]在本發(fā)明的預(yù)防方法中，可以調(diào)整具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的劑量以提供最佳的響應(yīng)。所述劑量為例如0.01-200mg/kg，優(yōu)選0.l_150mg/kg，并且更優(yōu)選l-100mg/kg，但不限于此。每天可以施用若干分次劑量，或者所述劑量可以按照由個(gè)體狀情況的急切需要所指示的相應(yīng)地減少或增加。施用模式并不限于本發(fā)明，可以由主治醫(yī)師決定。
[0111]在本發(fā)明的預(yù)防方法中，具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的施用途徑可以分為經(jīng)口和腸胃外施用途徑。優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)途徑，但不限于此。
[0112]本發(fā)明還提供了用于診斷患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步驟:1)將樣品與具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的本發(fā)明結(jié)合分子相接觸；以及2)檢測(cè)所述結(jié)合分子與樣品之間 的反應(yīng)。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步驟:1)將樣品與本發(fā)明的診斷組合物相接觸；以及2)檢測(cè)結(jié)合分子與樣品之間的反應(yīng)。
[0113]在本發(fā)明的診斷方法中，甲型流感病毒優(yōu)選為選自以下的任一種:H1、H3、H5、H7和H9亞型，甲型流感病毒H3亞型優(yōu)選為H3N2，但不限于此。
[0114]在本發(fā)明的診斷方法中，本發(fā)明的結(jié)合分子(如果需要)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與用于診斷和檢測(cè)的標(biāo)簽連接。
[0115]在本發(fā)明的診斷方法中，樣品優(yōu)選地為選自以下的任一種:痰、唾沫(spittle)、血液、肺細(xì)胞、肺組織粘液、呼吸系統(tǒng)組織和唾液，但不限于此。樣品可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方法制備。
[0116]在本發(fā)明的診斷方法中，用于檢測(cè)反應(yīng)的方法可以是選自以下的一種:均相和非均相結(jié)合免疫測(cè)定，例如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、FACS、BIAC0RE和Western印跡分析，但不限于此，在本發(fā)明中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何檢測(cè)方法。
[0117]本發(fā)明還提供了用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，所述試劑盒包含:1)具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的本發(fā)明結(jié)合分子；以及2)容器。
[0118]另外，本發(fā)明還提供了用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，所述試劑盒包含:1)用于診斷甲型流感病毒的本發(fā)明組合物；以及2)容器。
[0119]在本發(fā)明的診斷試劑盒中，甲型流感病毒優(yōu)選地為選自以下的任一種:H1、H3、H5、H7和H9亞型，甲型流感病毒H3亞型優(yōu)選為H3N2，但不限于此。
[0120]在本發(fā)明的診斷試劑盒中，容器2)包含固體支持物。本發(fā)明的結(jié)合分子可以附接到固體支持物，并且該固體支持物可以是多孔或無(wú)孔的，平的或非平的。
實(shí)施例
[0121]實(shí)施例1:由從流感恢復(fù)之患者的血.液分離PMBC
[0122]恢復(fù)患者組由確認(rèn)新流感感染后2-4周的患者志愿者組成。這些志愿者被證實(shí)在其血液中沒有流感病毒(HlNl)并且具有針對(duì)新流感病毒的抗體。在機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(IRB)的批準(zhǔn)下進(jìn)行這項(xiàng)研究。這個(gè)患者組具有以下特性:(I)這些患者沒有針對(duì)季節(jié)性流感進(jìn)行疫苗接種，(2)這些患者的其他感染性病毒(即HBsAg)為陰性，并對(duì)抗HCV抗體和抗HIV抗體為陰性，(3)患者的血漿中流感病毒HlNl亞型的RT-PCR為陰性，(4)患者的血清在對(duì)甲型流感病毒HlNl亞型單體HA (HlNl)的ELISA測(cè)定中表現(xiàn)出1:160或更高的滴度。從志愿者采集約100mL的全血，并且使用Lymphoprep?(Axis-Shield,挪威，1114545)從所采集的血液分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。分離的PBMC用磷酸緩沖鹽水洗滌三次，以2X IO7個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于KM banker II冷凍培養(yǎng)基(Cosmobio，日本，K0J-16092010)中，并存儲(chǔ)在液氣te中。
[0123]實(shí)施例2:單克隆抗體的初步篩選
[0124]使用由Jin等(Jin A.等，2009.NatMed.15，1088-1092)描述的方法篩選分泌抗原特異性抗體的B細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將實(shí)施例1中分離的PBMC以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度加入到準(zhǔn)備的微陣列芯片的各孔中。由預(yù)包被的抗人IgG抗體證實(shí)從單個(gè)細(xì)胞分泌的抗體。使用標(biāo)記的HA抗原檢查篩選的抗體分泌細(xì)胞是否分泌的HA結(jié)合抗體。來自個(gè)體抗體分泌細(xì)胞的抗體的重鏈和輕鏈基因的完整序列通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲得。將獲得的重鏈和輕鏈DNA插入到pcDNA3.1(+)表達(dá)載體(Invitrogen，美國(guó)，V790-20)中以制備產(chǎn)生各抗體重鏈和輕鏈的表達(dá)載體。將制備的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。然后，使用來源于經(jīng)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的抗體，通過在以下實(shí)施例3中描述的HA-ELISA方法初步篩選了 82種結(jié)合HA的抗體。本文中，初步篩選了顯示與HA反應(yīng)的所有抗體而未系列稀釋抗體樣品。
[0125]實(shí)施例3:確認(rèn)單克隆抗體結(jié)合HA的能力
[0126]為了從82種初步篩選的抗體中二次篩選以高親和力結(jié)合H3N2流感病毒HA的單克隆抗體，使用三聚體HA和單體HA的亞基(HAl)進(jìn)行HA-ELISA。從Sino Biological Inc.(中國(guó))購(gòu)買了來自甲型流感病毒的重組單體HAl亞基(11056-V08H1)。購(gòu)買的HAl亞基由包含C末端的聚組氨酸殘 基的HA的N末端片段(Metl-Arg345)組成，并且來源于經(jīng)感染的人細(xì)胞。重組三聚體HA(FR_61)由IRR(流感試劑資源(InfluenzaReagentResource),美國(guó))提供。三聚體HA包含C末端的凝血酶切割位點(diǎn)，三聚化結(jié)構(gòu)域(折疊子(foldon))和六組氨酸殘基，并且是使用桿狀病毒系統(tǒng)產(chǎn)生的。
[0127]通過使用HA和抗體的ELISA來測(cè)量抗體與HA抗原的反應(yīng)性。具體而言，首先將50 μ I三聚體HA抗原(250納克/毫升)吸附到96孔微滴定板(Nunc，丹麥，449824)的各孔上。該板用含有1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽水(Teknova，美國(guó)，D5120)封閉，然后將3倍系列稀釋的抗體樣品(起始濃度為I μ g/ml)加入到該板的每個(gè)孔中。接著將板在室溫孵育I小時(shí)，然后用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人Y抗體(Zymed，美國(guó)，62.8420)處理。在室溫下孵育I小時(shí)后，將板用四甲基聯(lián)苯胺(TMB ;Sigma-Aldrich，美國(guó)，T0440)孵育，并通過加入IN HCl停止孵育。使用讀板器(Spectramax plus384,Molecular Device)測(cè)量在 450/570nm 的吸光度，并且使用 Graphpad prism程序(GraphPad Software Inc.美國(guó))將抗原-抗體反應(yīng)性以圖的形式表示。
[0128]大多數(shù)抗體不結(jié)合H3N2 的 HA，但如圖1 所示，CT129、CT135、CT147、CT149、CT164和CT166抗體顯示高結(jié)合親和力。特別地，這些抗體的確容易結(jié)合三聚體HA，但不結(jié)合HAl亞基。這表明，所篩選的抗體不結(jié)合先前已知的HAl表位，而具有僅結(jié)合HAl和HA2區(qū)段之間的邊界或者結(jié)合HA2或者結(jié)合具有正常構(gòu)型之HA的能力。
[0129]基于在圖1中顯示的結(jié)果，從82種初步篩選的抗體中，二次選擇了顯示對(duì)H3N2流感病毒之三聚體HA有高結(jié)合親和力的6種抗體(CT129、CT135、CT147、CT149、CT164和CT166抗體)。為了增加二次選擇的抗體的表達(dá)水平，以以下方式將這些抗體基因從pcDNA載體再克隆到MarEx表達(dá)載體(由Celltrion, Inc.構(gòu)建并享有專利)中。在再克隆之后，使用含有抗體基因的MarEx表達(dá)載體產(chǎn)生微量中和測(cè)試(MN測(cè)試)和凝血抑制測(cè)試(HI測(cè)試)所需的抗體。
[0130]使用限制性酶NheI和PmeI處理含有六個(gè)經(jīng)二次選擇抗體的各重鏈基因和輕鏈基因的初始pcDNA載體以獲得重鏈基因和輕鏈基因。將得到的重鏈基因和輕鏈基因分別插入到被相同限制性酶處理過的PCT145載體和pCT147載體中。pCT145和pCT147載體由Celltrion公司構(gòu)建，以分別克隆各抗體的重鏈和輕鏈(圖2)。然后，為了構(gòu)建含有重鏈轉(zhuǎn)錄單元(啟動(dòng)子-重鏈基因-聚腺苷酸)以及輕鏈轉(zhuǎn)錄單元(啟動(dòng)子-輕鏈基因-聚腺苷酸)的表達(dá)載體，將含有重鏈基因的PCT145載體用限制性酶PacI和AscI處理以獲得重鏈轉(zhuǎn)錄單元，之后用相同的限制性酶處理含有輕鏈基因的PCT147載體，然后將重鏈轉(zhuǎn)錄單元插入其中。然后，使用限制性酶篩選含有重鏈轉(zhuǎn)錄單元和輕鏈轉(zhuǎn)錄單元二者的載體(圖3)。使用 Endofree 質(zhì)粒大提試劑盒(Endofree plasmid maxi kit) (QIAGEN,德國(guó)，12362)提取經(jīng)篩選的載體，并且分析部分經(jīng)提取DNA樣品的核苷酸序列，從而確定抗體的核苷酸序列。
[0131]然后，將經(jīng)提取抗體的DNA轉(zhuǎn)染到F2N細(xì)胞系(由Celltrion，Inc.，韓國(guó)制備)的懸浮培養(yǎng)物中，從而制備產(chǎn)生單克隆抗體的瞬時(shí)細(xì)胞系。以下面的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用陽(yáng)離子聚合物FreeStyle? Max (Invitrogen, USA, 16447-100)按照制造商的說明書進(jìn)行細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，將培養(yǎng)在EX-CELL293無(wú)血清培養(yǎng)基(Sigma，LIK，14571C ;下文中稱作“EX-CELL293培養(yǎng)基”)中的F2N細(xì)胞離心，并以I X IO6細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度懸浮在經(jīng)改良EX-CELL293培養(yǎng)基(Sigma，LIK,65237 ;定制)中，將80ml的細(xì)胞懸浮液接種到250ml Elrlenmeyer瓶中，或?qū)?00ml的細(xì)胞懸浮液接種到I升Elrlenmeyer瓶中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在接種了 80ml的細(xì)胞懸浮液的情況下，使用OptiPRO SFM II培養(yǎng)基將100 μ g的單克隆抗體編碼DNA和100 μ I的FreeStyle? Max試劑各自稀釋至1.6ml的體積，隨后輕柔攪拌。在接種了 200ml的細(xì)胞懸浮液的情況下，使用OptiPRO SFM II培養(yǎng)基將250 μ g的DNA和250 μ I的FreeStyle? Max試劑各自稀釋至4ml的體積，隨后輕柔攪拌。在攪拌過程之后，立即將含有稀釋其中的FreeStyle? Max試劑的溶液與含有稀釋其中的DNA的溶液混合，并且將混合的溶液在室溫孵育19分鐘。在室溫孵育19分鐘期間，用新鮮的經(jīng)改良EX-CELL293培養(yǎng)基將接種的F2N細(xì)胞稀釋到0.8 X IO6個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞濃度。孵育19分鐘后，處理并且用含有DNA和FreeStyle? Max試劑的經(jīng)混合溶液轉(zhuǎn)染F2N細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后一天，將相同量的EX-CELL293培養(yǎng)基添加到經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其隨后被孵育7-8天，從而產(chǎn)生單克隆抗體。
[0132]實(shí)施例4:針對(duì)病毒的體外中和活性的檢測(cè)
[0133]使在HA-ELISA中篩選的6種抗體進(jìn)行微量中和(MN)測(cè)試以檢測(cè)其針對(duì)多種流感病毒的中和活性。
[0134]實(shí)施例4-1 =MDCK細(xì)胞系的培養(yǎng)和病毒濃度的確定
[0135]作為Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞系，使用了倫敦系(MDCK-L)。使用含有10%FBS (Atlas Biologicals，美國(guó)，F(xiàn)0500A)、1X 青霉素 / 鏈霉素(Gibco，美國(guó)，15140) )，25mMHEPES (Gibco，美國(guó)，15630)和 2mML_ 谷氨酸(Gibco，美國(guó)，25030)的 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó)，11965)在5% CO2加濕的孵育箱中于37°C培養(yǎng)MDCK細(xì)胞系。[0136]通過基于細(xì)胞的ELISA方法定量病毒濃度以確定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5(i)。按以下方式進(jìn)行病毒濃度的確定。首先，用病毒稀釋液[DMEM(Gibco，美國(guó))，3%BSA(Gibco，美國(guó)，15260)，IX 青霉素 / 鏈霉素(Gibco, USA)和 25mM HEPES (Gibco，美國(guó))]將病毒儲(chǔ)液以10倍系列稀釋，并且將100 μ I的經(jīng)稀釋病毒添加到96孔板的各個(gè)孔中。使用不含病毒的病毒稀釋液作為陰性對(duì)照。然后通過胰蛋白酶處理從培養(yǎng)孵育箱中分離被培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系，隨后用MDCK培養(yǎng)基處理以中和胰蛋白酶。然后，將細(xì)胞沉淀用磷酸緩沖鹽水洗滌兩次，然后用病毒稀釋液稀釋至5 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。將3-4μ g/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))添加到含有病毒的96孔板中，然后，立即向該板的各孔添加100 μ IMDCK細(xì)胞系并在5% CO2加濕的孵育箱中于37°C孵育20小時(shí)。孵育的板用磷酸緩沖鹽水洗滌一次，然后將200 μ I冷丙酮:磷酸緩沖鹽水(PBS) (80:20)的混合溶液添加到該板的各孔中。接著，將細(xì)胞固定8分鐘，并將板在室溫干燥20分鐘。該板的各孔用200 μ I磷酸緩沖鹽水洗滌兩次。用含有1% BSA的磷酸緩沖鹽水(0.1%吐溫20)將生物素化的抗核蛋白(NP)單克隆抗體(Milipore，美國(guó)，MAB8257B)稀釋2000倍，將100 μ I的稀釋液加到板的各個(gè)孔中并在室溫下孵育I小時(shí)。將板用磷酸緩沖鹽永(200 μ I/孔)洗滌三次，然后將100 μ I鏈霉親和素-HRP綴合抗體(在含有I % BSA的磷酸緩沖鹽水中)的20000倍稀釋液添加到板的各個(gè)孔中，并在室壓下孵育I小時(shí)。用磷酸緩沖鹽水洗滌板4次后，向板的各個(gè)孔加入100 μ I的OPD溶液(Sigma，美國(guó)，P8287)，將板在室溫下顯色10分鐘并用3M HCl (50 μ I/孔)處理以終止顯色，其后測(cè)量各孔的0D.。基于測(cè)量的0D.，使用Reed&Muench (The American 1938)的方法計(jì)算 TCID50。
[0137]實(shí)施例4-2:MN測(cè)定
[0138]將每種抗體用病毒稀 釋液稀釋至濃度為10μ g/ml。從這一起始濃度，將抗體稀釋液用病毒稀釋液系列稀釋兩倍，并且將50 μ I的每種稀釋液添加到96孔板的各個(gè)孔中。而且，以對(duì)應(yīng)于IOOTCID5q的濃度向板的各個(gè)孔添加50 μ I病毒，并且在5% CO2加濕的孵育箱中于37°C孵育I小時(shí)。然后，將3-4 μ g/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美國(guó)，T1426)添加到各個(gè)孔中，向各個(gè)孔添加100 μ I的經(jīng)處理MDCK細(xì)胞，隨后在5% CO2加濕的孵育箱中于37°C孵育20小時(shí)。孵育20小時(shí)后,根據(jù)與在實(shí)施例4-1中描述的病毒定量方法相同的方法進(jìn)行MN測(cè)定，從而測(cè)定各個(gè)孔的OD49tl值。顯示OD49tl值高于僅引入細(xì)胞之孔的孔被確定為感染病毒。對(duì)于未檢測(cè)到病毒抗原的各抗體的OD49tl值，抗體的最低濃度(μ g/ml)在下表1中顯示，并且抗體的較低濃度意味著針對(duì)病毒的中和活性較高。
[0139]表1:使用經(jīng)篩選抗體和多種類型的H3N2病毒進(jìn)行的微暈中和測(cè)定(MN測(cè)定)的盤
[0140]
【權(quán)利要求】
1.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子來源于從甲型流感病毒感染恢復(fù)的患者的血液中所存在的B細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，其中所述甲型流感病毒是選自以下的任一種:H1、H3、H5、H7和H9亞型。
4.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含輕鏈多肽序列: 輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ IDNO:1、7、13和15所示多肽序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ ID NO:2、8和16所示多肽序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:3或9所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)。
5.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活 性的結(jié)合分子，其包含以下重鏈多肽序列: 重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:4或10所示多肽序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:5、11、14和17所示多肽序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ IDNO:6或12所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)。
6.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈和重鏈多肽序列: 輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ IDNO:1、7、13和15所示多肽序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ ID NO:2、8和16所示多肽序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:3或9所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)；以及 重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:4或10所示多肽序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:5、11、14和17所示多肽序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ IDNO:6或12所示多肽序列的任一種⑶R3區(qū)。
7.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含選自以下多肽序列的任一種多肽序列: 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:I所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO: 2所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:3所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:4所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:5所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:6所示CDR3 區(qū)； 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:7所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:8所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:9所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:10 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:11 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:12所示CDR3區(qū)； 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:13所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:8所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:9所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù)Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:10 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:14 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:6 所示⑶R3區(qū)；以及 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:15所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:16所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:9所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù) Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:10 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:17 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:12所示CDR3區(qū)。
8.權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:37所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:38所示多肽序列。
9.權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:39所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:40所示多肽序列。
10.權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO -Al所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:42所示多肽序列。
11.權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQ ID NO:43所示多肽序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:44所示多肽序列。
12.權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有針對(duì)選自以下任一種的中和活性:甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亞型。
13.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈多核苷酸序列: 輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ IDNO:18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:19、25和35所示多核苷酸序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:20或26所示多核苷酸序列的任一種CDR3區(qū)。
14.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含以下重鏈多核苷酸序列: 重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:21、27和31所示多核苷酸序列的任一種CDRl區(qū)、選自 SEQ ID NO:22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:23,29和33所示多核苷酸序列的任一種CDR3區(qū)。
15.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含以下輕鏈和重鏈多核苷酸序列: 輕鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ IDNO:18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一種⑶Rl區(qū)、選自SEQ ID NO:19、25和35所示多核苷酸序列的任一種⑶R2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:20或26所示多核苷酸序列的任一種CDR3區(qū)；以及 重鏈，其包含根據(jù)Kabat方法確定的選自SEQ ID NO:21、27和31所示多核苷酸序列的任一種CDRl區(qū)、選自SEQ ID NO:22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一種CDR2區(qū)，以及選自SEQ ID NO:23,29和33所示多核苷酸序列的任一種CDR3區(qū)。
16.具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子，其包含選自以下多核苷酸序列的任一種多核苷酸序列: 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:18所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:19所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:20所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù) Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:21 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:22 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:23所示CDR3區(qū)； 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:24所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:25所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:26所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù) Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:27 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:28 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:29所示CDR3區(qū)； 由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:30所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:25所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:26所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù) Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:31 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:32 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:33所示⑶R3區(qū)；以及由以下輕鏈和重鏈構(gòu)成的結(jié)合分子，所述輕鏈包含根據(jù)Kabat方法確定的SEQ ID NO:34所示CDRl區(qū)，SEQ ID NO:35所示CDR2區(qū)和SEQ ID NO:26所示CDR3區(qū)；所述重鏈包含根據(jù) Kabat 方法確定的 SEQ ID NO:31 所示 CDRl 區(qū)，SEQ ID NO:36 所示 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:29所示CDR3區(qū)。
17.權(quán)利要求16所述的分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQID NO:45所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:46所示多核苷酸序列。
18.權(quán)利要求16所述的分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQID NO:47所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:48所示多核苷酸序列。
19.權(quán)利要求16所述的分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQID NO:49所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:50所示多核苷酸序列。
20.權(quán)利要求16所述的分子，其中所述結(jié)合分子由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述輕鏈包含SEQID NO:51所示多核苷酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:52所示多核苷酸序列。
21.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有針對(duì)選自以下任一種的中和活性:甲型流感病毒Hl、H3、H5、H7和H9亞型。
22.權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是抗體。
23.權(quán)利要求22所述的結(jié)合分子，其中所述抗體分子是Fab片段、Fv片段、雙抗體、嵌合抗體、人源化抗體或 人抗體。
24.分離的核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
25.表達(dá)載體，其具有插入所述表達(dá)載體中的權(quán)利要求24所述的分離的核酸分子。
26.產(chǎn)生具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系包含轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體。
27.權(quán)利要求26所述的細(xì)胞系，其中所述宿主細(xì)胞選自:CHO細(xì)胞、F2N細(xì)胞、BHK細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、NSO細(xì)胞和HEK293細(xì)胞。
28.從感染甲型流感病毒的患者篩選具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟: 1)從感染甲型流感病毒的患者中篩選出其血液為甲型流感病毒陰性的患者； 2)從步驟I)篩選出的所述患者收集血液； 3)從步驟2)收集的所述患者血液分離B細(xì)胞； 4)從步驟3)分離的B細(xì)胞中篩選出產(chǎn)生結(jié)合血凝素(HA)之結(jié)合分子的B細(xì)胞； 5)從步驟4)篩選出的B細(xì)胞提取RNA； 6)從步驟5)提取的RNA擴(kuò)增結(jié)合分子基因； 7)將步驟6)擴(kuò)增的基因克隆到表達(dá)載體中； 8)將步驟7)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中； 9)從源自步驟8)所制備經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合分子中篩選結(jié)合HA的結(jié)合分子； 10)制備并培養(yǎng)用于所篩選出的結(jié)合分子的細(xì)胞系； 11)從步驟10)的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化結(jié)合甲型流感病毒HA的結(jié)合分子； 12)再確認(rèn)步驟11)中純化的結(jié)合分子是否具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性；以及. 13)對(duì)步驟12)中經(jīng)確認(rèn)具有針對(duì)甲型流感病毒的中和活性的結(jié)合分子進(jìn)行再篩選。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述結(jié)合分子是抗體。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述抗體是Fab片段、Fv片段、雙抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
31.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述甲型流感病毒選自:!11、!13、冊(cè)、!17和!19亞型。
32.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
33.用于預(yù)防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
34.用于診斷甲型流感病毒的組合物，所述組合物包含綴合物，所述綴合物包含與根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子連接的標(biāo)簽。
35.權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述標(biāo)簽是選自以下的任一種:酶、螢光素酶、放射性同位素和毒素。
36.用于治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向患有所述疾病的對(duì)象施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述甲型流感病毒選自出1、!13、冊(cè)、!17和!19亞型。
38.用于預(yù)防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康母鶕?jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子。
39.權(quán)利要求38所述所述的方法，其中所述甲型流感病毒選自:H1、H3、H5、H7和H9亞型。
40.用于診斷患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步驟: . 1)將樣品與根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子相接觸；以及. 2)檢測(cè)所述結(jié)合分子與所述樣品之間的反應(yīng)。
41.用于診斷患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步驟:. 1)將樣品與權(quán)利要求34所述的組合物相接觸；以及 2)檢測(cè)步驟I)中的所述樣品與所述組合物之間的反應(yīng)。.
42.權(quán)利要求40或41的方法，其中所述甲型流感病毒選自:H1、H3、H5、H7和H9亞型。
43.用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，其包含: . 1)根據(jù)權(quán)利要求1、4至7和13至16中任一項(xiàng)所述的具有針對(duì)甲型流感病毒之中和活性的結(jié)合分子；以及. 2)容器。
44.用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，其包含: . 1)根據(jù)權(quán)利要求34所述的用于診斷甲型流感病毒的組合物；以及 . 2)容器。
45.權(quán)利要求43或44所述的試劑盒，其中所述甲型流感病毒選自:H1、H3、H5、H7和H9亞型。
【文檔編號(hào)】C12N15/13GK104011077SQ201280047234
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】張宸在, 權(quán)起圣, 李癸淑, 李炫周, 全在原, 全晃槿, 張珉碩 申請(qǐng)人:賽特瑞恩股份有限公司