增加植物中病毒樣顆粒的產(chǎn)率的制作方法
【專利摘要】提供一種在植物中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法。該方法包括將第一核酸和第二核酸引入該植物或該植物的部分。該第一核酸包含在植物中具有活性并且有效連接到編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白之核苷酸序列的第一調(diào)節(jié)區(qū)。第二核酸包含在植物中具有活性并且有效連接到編碼通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)之核苷酸序列的第二調(diào)節(jié)區(qū)。將該植物或該植物的部分在容許該核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)，從而生產(chǎn)VLP。
【專利說明】增加植物中病毒樣顆粒的產(chǎn)率
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)病毒蛋白。更特別地，本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)并且增加病毒樣顆粒生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒是由正粘病毒科(orthomyxoviridae)的RNA病毒引起。這些病毒有三種類型并且它們引起三個(gè)不同類型的流行性感冒:甲型、乙型與丙型。甲型流感病毒感染哺乳動(dòng)物(人、豬、雪紹、馬)以及鳥類。由于此類型病毒是已造成全世界流行病，因此對于人類是非常重要的。乙型流感病毒(又簡稱為乙型流感)僅感染人類。它偶爾引發(fā)流感的地方性爆發(fā)。丙型流感病毒亦僅感染人類。它們感染大多數(shù)年輕的人類并且鮮少造成嚴(yán)重的疾病。
[0003]疫苗接種通過在感染前誘導(dǎo)對象建立防御而提供對由類似物質(zhì)引起之疾病的保護(hù)。通常，通過使用活的減毒形式或完整的失活形式的感染性物質(zhì)作為免疫原而實(shí)現(xiàn)這一目的。為了避免使用全病毒(例如殺死的或減弱的病毒)作為疫苗的危險(xiǎn)，已將重組病毒蛋白例如亞單位(subunit)實(shí)行為疫苗。肽與亞單位疫苗兩者皆受到一些潛在的限制。由于不正確的折疊或差的抗原呈遞，亞單位疫苗可能表現(xiàn)差的免疫原性。主要問題為確保工程蛋白質(zhì)的構(gòu)型模擬抗原在其自然環(huán)境中之構(gòu)象的困難。必須使用適合的佐劑以及對于肽來說使用載體蛋白來加強(qiáng)免疫應(yīng)答。此外，這些疫苗主要引起體液應(yīng)答，并因此可能無法引起有效的免疫。亞單位疫苗對于可證實(shí)以完整的失活病毒提供保護(hù)的疾病經(jīng)常是無效的。
[0004]病毒樣顆粒(VLP)為納入免疫原性組合物的潛在候選。VLP十分近似于成熟的病毒粒子，但它們不包含病毒的基因組物質(zhì)。因此，VLP本質(zhì)上為不可復(fù)制的，使得將它們作為疫苗施用是安全的。此外，可將VLP改造為在VLP的表面上表達(dá)病毒糖蛋白，這是其最天然的生理構(gòu)型。此外，因?yàn)閂LP類似完整的病毒粒子并且為多價(jià)顆粒結(jié)構(gòu)，所以比起可溶的包膜蛋白抗原，VLP在引發(fā)對糖蛋白的中和抗體上可能是更有效。
[0005]已在植物中(W02009/009876 ；W02009/076778 ；W02010/003225 ；W02010/003235 ；W0201I/03522 ；W02010/148511 ;將其通過參考并入本文)，以及在昆蟲和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中(Noad, R.and Roy, P.,2003, Trends Microbiol11:438-44 ；Neumann et al.,2000，J.Virol.，74，547-551)生產(chǎn) VLP。Latham 與 Galarza (2001，J.Virol.，75，6154-6165)報(bào)道了在以共表達(dá)血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、M1和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中流感VLP的形成。此研究證實(shí)了于真核細(xì)胞中共表達(dá)后流感病毒粒子蛋白的自組裝，以及需要 Ml 基質(zhì)蛋白供 VLP 產(chǎn)生。然而，Gomez-Puertas et al.(1999, J.Gen.Virol,80，1635-1645)亦顯示M2的過表達(dá)完全阻斷CAT RNA傳輸至MDCK培養(yǎng)物。
[0006] M2作用為離子通道蛋白并且已顯示當(dāng)過表達(dá)此蛋白質(zhì)時(shí)，共表達(dá)的HA之胞內(nèi)運(yùn)輸被抑制，以及血細(xì)胞凝集素(HA)在細(xì)胞膜的累積減少75-80% (Sakaguchi et al.，1996 ;Henkel&WeiSZ，1998)。此外，通過過表達(dá)M2，病毒膜蛋白在細(xì)胞膜的累積降低，因而產(chǎn)生的功能性VLP數(shù)目急劇降低。[0007]M2蛋白于甲型流感感染的細(xì)胞之細(xì)胞表面豐富地表達(dá)(Lamb et al.(1985)Cell，40,627至633)。亦在病毒顆粒本身的膜發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)，但量少得多，每病毒粒子14至68分子的 M2 (Zebedee and Lamb (1988) J.Virol.62, 2762 至 72)。通過在位置 50 之半胱氨酸上添加棕櫚酸，M2蛋白被翻譯后修飾(Sugrue et al.(1990) Virologyl79, 51至56)。
[0008]M2蛋白為由兩個(gè)二硫鍵連接的二聚體構(gòu)成的同型四聚體，其通過非共價(jià)相互作用保持在一起(Sugrue 與Hay (1991) Virologyl80,617至624)。通過定點(diǎn)誘變(site-directedmutagenesis), Holsinger 與 Lamb, (1991) Virologyl83, 32 至 43,證實(shí)于第 17 以及第 19 位的半胱氨酸殘基涉及二硫鍵橋形成。僅有位于第17位的半胱氨酸存在于所有分析的病毒中。在半胱氨酸19亦存在的病毒株中，不清楚第二個(gè)二硫鍵橋是否在相同二聚體(已通過Cysl7-Cysl7連接)中形成還是伴隨其它二聚體形成。
[0009]Smith 等人(美國專利申請書 2010/0143393)以及 Song 等人(Plos0NE20116 (I):el4538)描述含有流感M2蛋白的疫苗與VLP。VLP包含至少病毒核心蛋白，例如Ml。所述核心蛋白驅(qū)動(dòng)出芽以及顆粒從昆蟲宿主細(xì)胞中釋放。
[0010]Szecsi et al.(Virology Journal, 2006, 3:70)在衍生自鼠類白血病病毒(MLV)的復(fù)制缺陷型核心顆粒上組裝VLP。此經(jīng)改造的流感VLP系衍生自:瞬時(shí)共表達(dá)細(xì)胞表面(HA、NA、M2)以及內(nèi)部病毒組分(Gag、GFP標(biāo)記基因組)并且錨定于其表面HA、HA和NA或M2、或者所有三種衍生自H7N1或H5N1病毒的蛋白質(zhì)。根據(jù)Szecsi et al.，在FIu-VLP生產(chǎn)期間M2的表達(dá)不影 響HA或NA合并至病毒顆粒上(Szecsi et al.中的第2頁，右欄，第二段)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)病毒蛋白。更特別地，本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)以及增加病毒樣顆粒生產(chǎn)。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)為提供增加植物中病毒樣顆粒生產(chǎn)的改良方法。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，提供了在植物中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法(A)，其包括
[0014]a)將第一核酸引入至植物或植物的部分，所述第一核酸包含在植物中具有活性且有效連接至編碼結(jié)構(gòu)病毒蛋白之核苷酸序列的第一調(diào)節(jié)區(qū)，
[0015]b)將第二核酸引入，所述第二核酸包含在植物中具有活性且有效連接至編碼通道蛋白之核苷酸序列的第二調(diào)節(jié)區(qū)，
[0016]c)在容許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物或植物的部分，從而生產(chǎn)VLP。
[0017]在植物中具有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)和在植物中具有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)可以是相同或不同的。
[0018]上述方法㈧中的通道蛋白可為質(zhì)子通道蛋白。該質(zhì)子通道蛋白可選自M2或BM2。此外，質(zhì)子通道蛋白可包含質(zhì)子通道特征序列HXXXW。M2蛋白可為從流感A/波多黎各(Puerto Rico) /8/1934 (SEQ ID NO:14)或從流感A/新喀里多尼亞(NewCaledonia)/20/1999 (SEQ ID NO:11)獲得之 M2 蛋白。
[0019]本發(fā)明亦提供如上所述的方法(A)，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白包含三聚化結(jié)構(gòu)域。此外，編碼該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列包含嵌合核苷酸序列，其依序編碼抗原性病毒蛋白或其片段、流感跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾。該病毒結(jié)構(gòu)蛋白可包含流感HA蛋白質(zhì)。此外流感HA蛋白中的一個(gè)或更多個(gè)蛋白水解環(huán)可被缺失。
[0020]本發(fā)明提供如上所述之方法(A)，其中編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可選自BHA、C，HA、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 與 H16。例如，編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可為乙型HA或H3。編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可為例如來自流感 B/ 布里斯班(Brisbane)/60/2008> B/ 馬來西亞(Malaysia)/2506/2004 或 B/ 威斯康辛(Wisconsin)/1/2010的HA，或來自流感A/珀斯(Perth)/16/2009或A/維多利亞(Victoria)/361/2011的H3。此外，編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列具有與SEQ ID NO:23、
28、43、46、51、57或61的至少70%序列同一性。病毒結(jié)構(gòu)蛋白的序列亦可包含SEQ ID NO:25、30、41、48、54、58 或 64 的序列。
[0021]本發(fā)明亦包括如上所述之方法(A)，其中所述第一核酸序列包含與一個(gè)或多于一個(gè)的豇豆花葉病毒屬(comovirus)增強(qiáng)子、編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列以及一個(gè)或多于一個(gè)的雙生病毒(geminivirus)擴(kuò)增元件有效連接的第一調(diào)節(jié)區(qū)，以及將編碼雙生病毒復(fù)制酶的第三核酸引入所述植物或所述植物的部分。所述一個(gè)或多于一個(gè)的豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子可為豇豆花葉病毒屬UTR，例如，豇豆花葉病毒超翻譯(CPMV-HT)UTR，(例如CPMV-HT5’和/或3’UTR)。所述一個(gè)或多于一個(gè)的雙生病毒擴(kuò)增元件可選自豆黃矮病毒(Bean Yellow Dwarf ViruS)長基因間區(qū)域(BeanYellow Dwarf Virus longintergenic region, BeYDV LI R)以及 BeYDV 短基因間區(qū)域(Bean Yellow Dwarf Virusshort intergenic region, BeYDVSIR)。此外,編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可為乙型HA或H3，例如，編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:23、28、43、46、51、57或61至少70%的序列同一性。病毒結(jié)構(gòu)蛋白的序列亦可包含SEQ ID NO:25、30、41、48、54、58或64的序列。
[0022]如上所述的方法(方法A)亦可涉及引入例如HcPio或pl9的編碼沉默性阻遏蛋白(suppressor ofsilencing)的另一核酸序列。
[0023]本發(fā)明亦包括如上所述的方法(A)，其中在引入步驟中(步驟a)，核酸在植物中瞬時(shí)表達(dá)。作為替代地，在引入步驟中(步驟a)，核酸于植物中穩(wěn)定地表達(dá)。
[0024]如上所述的方法(A)可進(jìn)一步包括步驟:
[0025]d)收獲所述植物并純化VLP。
[0026]本發(fā)明亦包括如上所述的方法(A)，其中所述VLP不包含病毒基質(zhì)或核心蛋白。
[0027]本發(fā)明提供由如上所述之方法(A)生產(chǎn)的VLP。所述VLP可進(jìn)一步包含一種或多于一種的衍生自植物的脂質(zhì)。該VLP亦可以不包含通道蛋白為特征。此外，VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白可為HAO蛋白。包含VLP的一種或更多種病毒蛋白可包含植物特異性的N-聚糖或經(jīng)修飾的N-聚糖。本發(fā)明亦提供使用該VLP制備的多克隆抗體。
[0028]本發(fā)明包括用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的含有有效劑量的如上所述的VLP以及藥學(xué)上可接受之載體的組合物。
[0029] 本發(fā)明亦包括在對象中對流感病毒感染誘導(dǎo)免疫的方法，其包含將如上所述之VLP施用于對象?？蓪LP經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用于對象。
[0030]本發(fā)明亦提供包含由上述之方法(A)所生產(chǎn)的VLP的植物物質(zhì)。所述植物物質(zhì)可用于在對象中誘導(dǎo)對流感病毒感染的免疫。該植物物質(zhì)亦可被混合作為食物增補(bǔ)劑(foodsupplement)。[0031]本發(fā)明亦提供生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)之方法(B)，其包括
[0032]a)提供植物或植物的部分，其包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含在植物中具有活性且有效連接到編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白之核苷酸序列的第一調(diào)節(jié)區(qū)，至所述植物或植物的部分中，所述第二核酸包含在植物中具有活性且有效連接到編碼通道蛋白之核苷酸序列的第二調(diào)節(jié)區(qū)。
[0033]b)在容許核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物或所述植物的部分，從而生產(chǎn)VLP。
[0034]在植物中具有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)和在植物中具有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)可以是相同或不同的。
[0035]上述方法(B)中的通道蛋白可為質(zhì)子通道蛋白。所述質(zhì)子通道蛋白可選自M2或BM2。此外，質(zhì)子通道蛋白可包含質(zhì)子通道特征序列HXXXW。
[0036]本發(fā)明亦提供如上所述的方法(B)，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白包含三聚化結(jié)構(gòu)域(trimerization domain)。此外,編碼該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列包含嵌合核苷酸序列，其依序編碼抗原性病毒蛋白或其片段、流感跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾。該病毒結(jié)構(gòu)蛋白可包含流感HA蛋白。此外流感HA蛋白中的一個(gè)或更多個(gè)蛋白水解環(huán)可被缺失。
[0037]本發(fā)明提供如上所述之方法(B)，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可選自 B HA、C，HA、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 與 H16。例如，編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可為乙型HA或H3。編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可為例如來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010的HA，或來自流感A/珀斯/16/ 2009或A/維多利亞/361/2011的H3。
[0038]本發(fā)明亦包括如上所述之方法(B)，其中所述第一核酸序列包含與一個(gè)或多于一個(gè)的豇豆花葉病毒屬(comovirus)增強(qiáng)子、編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列以及一個(gè)或多于一個(gè)的雙生病毒(geminivirus)擴(kuò)增元件有效連接的第一調(diào)節(jié)區(qū)，以及將編碼雙生病毒復(fù)制酶的第三核酸引入所述植物或所述植物的部分。一個(gè)或多于一個(gè)的豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子可為豇豆花葉病毒屬UTR，例如，豇豆花葉病毒超翻譯(CPMV-HT) UTR (如CPMV-HT5’和/或3’UTR)。此外，一個(gè)或多于一個(gè)的雙生病毒擴(kuò)增元件可選自豆黃矮病毒(Bean YellowDwarf ViruS)長基因間區(qū)域(BeYDVLIR)以及BeYDV短基因間區(qū)域(BeYDV SIR)。
[0039]如上所述的方法(方法B)亦可涉及引入編碼沉默性阻遏蛋白(例如HcPiX)或pl9)的另一核酸序列。
[0040]本發(fā)明亦包括如上所述的方法(B)，其中在引入步驟中(步驟a)，核酸為在植物中瞬時(shí)表達(dá)。作為替代地，在引入步驟中(步驟a)，核酸于植物中穩(wěn)定地表達(dá)。
[0041]如上所述的方法(B)可進(jìn)一步包括步驟:
[0042]d)收獲所述植物并純化VLP。
[0043]本發(fā)明亦包括如上所述的方法(B)，其中所述VLP不包含病毒基質(zhì)或核心蛋白。
[0044]本發(fā)明提供由如上所述之方法(B)生產(chǎn)的VLP。所述VLP可進(jìn)一步包含一種或多于一種衍生自植物的脂質(zhì)。該VLP亦可以不包含通道蛋白為特征。此外，VLP的病毒結(jié)構(gòu)蛋白可為HAO蛋白。包含VLP的一種或更多種病毒蛋白可包含植物特異性的N-聚糖或經(jīng)修飾的N-聚糖。本發(fā)明亦提供使用該VLP制備的多克隆抗體。
[0045]本發(fā)明包括用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的含有有效劑量的如上所述VLP以及藥學(xué)上可接受之載體的組合物。[0046]本發(fā)明亦包括在對象中誘導(dǎo)對流感病毒感染之免疫的方法，其包含將如剛才所描述之VLP施用于對象?？蓪LP以經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用于對象。
[0047]本發(fā)明亦提供含有由上述之方法(B)所生產(chǎn)的VLP之植物物質(zhì)。所述植物物質(zhì)可用于在對象中誘導(dǎo)對流感病毒感染的免疫。該植物物質(zhì)亦可被混合作為食物增補(bǔ)劑。
[0048]本發(fā)明提供包含SEQ ID NO:41 (來自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失之蛋白水解環(huán)的roiSP/HA)之氨基酸序列的多肽，以及編碼SEQ ID NO:41的多肽之核酸序列。該核酸序列可包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列。本發(fā)明提供包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列之多肽的VLP。此VLP可進(jìn)一步包含衍生自植物的一種或多于一種的脂質(zhì)。此VLP亦可以不包含通道蛋白為特征。此VLP可包含植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾的N-聚糖。本發(fā)明提供包含有效劑量之包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列、用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的VLP以及藥學(xué)上可接受的載體之組合物。本發(fā)明亦包括誘導(dǎo)對象中對流感病毒感染之免疫的方法，其包含將含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列之VLP施用于對象?？蓪LP以經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。本發(fā)明亦提供包含含有SEQ ID N0:41的氨基酸序列之VLP的植物物質(zhì)?？蓪⒅参镂镔|(zhì)用于誘導(dǎo)對象中對流感病毒感染的免疫。該植物物質(zhì)亦可被混合作為食物增補(bǔ)劑。
[0049]通過共表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)，觀察到病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及VLP的產(chǎn)率增加。已知HA經(jīng)歷pH依賴性構(gòu)象變化。不希望被理論所約束地，于成熟與遷移作用期間，HA生產(chǎn)細(xì)胞之高爾基體(Golgi apparatus)內(nèi)的pH可能影響HA折疊，影響HA的穩(wěn)定性以及增加降解，或其組合。通過共表達(dá)通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)和HA，高爾基體內(nèi)的pH可增加，并且造成穩(wěn)定增加、降解減少或其組合，而增加HA產(chǎn)率。
[0050]本發(fā)明的上述概要不一定描述了本發(fā)明的所有特征。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]本發(fā)明的這些與其它特征將參考附圖由下列描述而變得更明顯，其中:
[0052]圖1A 顯示引物 IF-H5A-1-05.sl+3c(SEQ ID NO:2)。圖1B 顯示引物 IF_H5dTm.r(SEQ ID NO:3)。圖1C顯示構(gòu)建體1191的示意圖。圖1D顯示構(gòu)建體1191 (SEQ ID N04)。圖1E顯示表達(dá)盒(expression cassette)編號489 (SEQ ID N05)。圖1F顯示來自流感A/印度尼西亞(Indoneisa)/5/2005 (HSNl)的H5氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。圖1G顯示編碼來自流感A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1)的H5之核酸苷酸序列(SEQ ID NO:42)。
[0053]圖 2A顯示引物 IF-S1-M1+M2ANC.c(SEQ ID NO:7)。圖 2B 顯示引物 IF-S1-4-M2ANC.r(SEQ ID NO:8) ?圖2C顯示合成M2基因的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號DQ508860連接至715-982之ntl-26相對應(yīng))(SEQ ID NO:9)。圖2D顯示由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子之表達(dá)盒編號1261。將來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999的M2 (HlNl)加下劃線(SEQID NO: 10)。圖2E顯示來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999 (HlNl)的M2氨基酸序列(SEQID NO:11)。
[0054] 圖3A顯示合成的M2基因的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號EF467824的nt26-51連接nt740-1007相對應(yīng))(SEQ ID N0:12)。圖3B顯示由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子之表達(dá)盒編號859。將來自流感A/波多黎各/8/1934 (HlNl)之M2加下劃線(SEQ IDN0:13)。圖3C顯示來自流感A/波多黎各/8/1934 (HlNl)之M2的氨基酸序列(SEQ ID NO:
14)。
[0055]圖 4A 顯示引物 IF-H1A-C-09.s2+4c (SEQ ID NO:15)。圖 4B 顯示引物 IF-H1A-C-09.sl-4r(SEQ ID NO: 16)。圖4C顯示合成的Hl基因的核苷酸序列(GenBank登錄號FJ966974)(SEQ ID NO:17)。圖4D顯示構(gòu)建體1192的示意圖。示意圖上注有用于質(zhì)粒線性化的SacII與StuI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。圖4E顯示構(gòu)建體1192，由左至右t-DNA邊界(加下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默性抑制子表達(dá)盒之2X35S/CPMV-HT/roiSP/N0S(SEQ ID NO:18)。圖4F顯示由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子之表達(dá)盒編號484。將來自流感A/加利福尼亞(California)/7/2009 (HlNl)的 TOISP/H1 加下劃線(SEQ ID NO:19) ? 圖 4G 顯示來自流感A/加利福尼亞/7/2009 (HlNl)的HHSP-Hl的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。
[0056]圖5A 顯示引物 IF-S2+S4-H3Per.c (SEQ ID NO:21)。圖 5B 顯示引物IF-Sla4-H3Per.r(SEQ ID NO:22)。圖5C顯示合成的H3基因的核苷酸序列(與來自GenBank 登錄號 GQ293081 的 nt26_1726 相對應(yīng))(SEQ ID NO:23)。圖顯示由 2X35S 啟動(dòng)子至NOS終止子之表達(dá)盒編號1019。將來自流感A/珀斯/16/2009 (H3N2)的HHSP/H3加下劃線(SEQ ID NO:24) ?圖5E顯示來自流感A/珀斯/16/2009 (H3N2)的HHSP/H3氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。
[0057]圖 6A 顯示引物 IF-S2+S4-B Bris.c (SEQ ID NO:26)。圖 6B 顯示引物 IF_Sla4_BBris.r (SEQ ID NO:27)。圖6C顯示合成的HA B布里斯班基因的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號FJ7668 40的nt34_1791相對應(yīng))(SEQ ID NO:28)。圖6D顯示表達(dá)盒編號1029由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子之核苷酸序列。將來自流感B/布里斯班/60/2008的roiSP/HA加下劃線。(SEQ ID NO:29)。圖6E顯示來自流感B/布里斯班/60/2008的I3DISP/HA的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。圖6F顯示構(gòu)建體1194的示意圖。示意圖上注有用于質(zhì)粒線性化的SacII與StuI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。圖6G顯示構(gòu)建體1194，從左至右t_DNA邊界(加下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默性抑制子表達(dá)盒的2X35S/CPMV-HT/PDISP/N0S 至 BeYDV+復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)(SEQ ID NO:31)。圖 6H顯示由 BeYDv 左 LIR至 BeYDv右LIR的表達(dá)盒編號1008。將來自流感B/布里斯班/60/2008的TOISP/HA加下劃線(SEQID NO:32)。
[0058]圖 7A顯示引物 dTmH51-B Bris.r (SEQ ID NO:33)。圖 7B 顯示引物B Bris-dTmH51.c (SEQ ID NO:34)。圖 7C 顯示引物 IF-SlaS4_dTmH5L r (SEQ ID NO:35)。圖 7D 顯示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表達(dá)盒編號1009。將PDISP/HA B布里斯班/H5Indo TMCT加下劃線(SEQ ID N0:36)。圖7E顯示TOISP/HA B布里斯班/H5Indo TMCT的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。
[0059]圖 8A 顯示引物 1039+1059.r (SEQ ID NO:38)。圖 8B 顯示引物 1039+1059.c (SEQID N0:39)。圖8C顯示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表達(dá)盒編號1059。將來自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解環(huán)的roiSP/HA加下劃線(SEQ ID NO:40)。圖8D顯示來自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解環(huán)的TOISP/HA之氨基酸序列(SEQ ID NO:41)。圖8E顯示來自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解環(huán)的TOISP/HA之核苷酸序列(SEQ ID NO:43)。[0060]圖9顯示構(gòu)建體編號1008的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號1008引導(dǎo)來自流感株B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表達(dá)。此構(gòu)建體包含用于DNA擴(kuò)增的BeYDV衍生元件。
[0061]圖10顯示構(gòu)建體編號1009的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號1009引導(dǎo)來自流感株B/布里斯班/60/2008的嵌合HA之表達(dá)，其中跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾以來自流感A/印度尼西亞/05/2005之H5的那些所取代。此構(gòu)建體包含用于DNA擴(kuò)增的BeYDV衍生元件。
[0062]圖11顯示構(gòu)建體編號1029的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號1029引導(dǎo)來自流感株B/布里斯班/60/2008的野生型HA的表達(dá)。
[0063]圖12顯示構(gòu)建體編號1059的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號1059引導(dǎo)來自流感株B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解環(huán)之突變型HA的表達(dá)。此構(gòu)建體包含用于DNA擴(kuò)增的BeYDV衍生元件。
[0064]圖13顯示構(gòu)建體編號1019的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號1019引導(dǎo)來自流感株A/珀斯/16/2009 (H3N2)的野生型H3的表達(dá)。
[0065]圖14顯示構(gòu)建體編號484的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號484引導(dǎo)來自流感株A/加利福尼亞/07/2009 (HlNl)的野生型Hl的表達(dá)。
[0066]圖15顯示構(gòu)建 體編號489的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號489引導(dǎo)來自流感株A/印度尼西亞/05/2005 (H5N1)的野生型H5的表達(dá)。
[0067]圖16顯示構(gòu)建體編號1261的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號1261引導(dǎo)來自流感株A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)的野生型M2的表達(dá)。
[0068]圖17顯示構(gòu)建體編號859的質(zhì)粒圖譜。構(gòu)建體編號859引導(dǎo)來自流感株A/波多黎各/8/34 (HlNl)的野生型M2的表達(dá)。
[0069]圖18顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。將來自B/布里斯班/60/2008的HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共表達(dá)?！癈+”:陽性對照，來自澳大利亞藥物管理局(Therapeutic GoodsAdministration)之半純化的B/布里斯班/60/2008病毒；“c 一”:陰性對照,模擬滲透植物；“ 1008”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表達(dá)；“1008+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA與M2的共表達(dá)；“ 1009+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/布里斯班/60/2008的嵌合HA與M2的共表達(dá)；“ 1029”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)不存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表達(dá)；“1029+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)不存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2之共表達(dá)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的比。
[0070]圖19顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。道“C+”:陽性對照，來自澳大利亞藥物管理局之半純化A/威斯康辛/15/2009 (H3N2)病毒；“C_”，陰性對照，模擬滲透植物；“1019”:來自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型 HA 的表達(dá)1019+1261”:來自 A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的比。
[0071]圖20顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。道“C+”:陽性對照，來自NIBSC病毒之半純化A/加利福尼亞/7/2009 (HlNl) NYMC X_179A(NIBSC 碼 09/146) ;“C_”，陰性對照，模擬滲透的植物;“484”:來自A/加利福尼亞/7/2009 (HlNl)之野生型HA的表達(dá)；“484+1261”:來自A/加利福尼亞/7/2009 (HlNl)之野生型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的比。
[0072]圖21顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。道“C+”:陽性對照,來自Immune Technology Corporation(產(chǎn)品編號IT-003-052p)之A/印度尼西亞/05/2005的純化重組H5 ;“C_”，陰性對照，模擬滲透的植物；“489”，來自A/印度尼西亞/5/05(Η5Ν1)之野生型HA之表達(dá)；“489+1261 ”:來自A/印度尼西亞/5/05 (H5N1)之野生型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)。
[0073]圖22A顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析?！?008”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA的表達(dá)；“ 1008+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)；“ 1059”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA的表達(dá)；“ 1059+1261 ”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)。分析來自三個(gè)不同滲透之植物(A、B與C)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的比。圖22B顯示提取自HA生產(chǎn)植物的粗蛋白質(zhì)的血細(xì)胞凝集能力之比較。
[0074]圖23顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。圖23A:“1059”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/布里斯班/60/2008的突變 型HA的表達(dá)；“ 1059+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)?！?1059+859”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA與來自A/波多黎各/8/34之M2的共表達(dá)。分析來自三不同滲透之植物(A、B與C)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的比。圖23B 1019”:來自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA的表達(dá)；“ 1019+1261”:來自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共表達(dá)；“1019+859”:來自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA與來自A/波多黎各/8/34之M2的共表達(dá)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agribacterium)培養(yǎng)物的比。
[0075]圖24顯示來自幾株流感的HA的序列比對。以箭頭指出前體HAO的切割位點(diǎn)。
[0076]圖25A 顯示引物 IF-H3V36111.S2+4c (SEQ ID NO:44)。圖 25B 顯示引物IF-H3V36111.sl-4r(SEQ ID NO:45)。圖25C顯示合成的H3基因之核苷酸序列(與來自GISAID 分離號 EPI ISL101506 之 HA 序列的 nt25 至 1725 相對應(yīng))(SEQ ID NO:46)。圖 25D顯示由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子的表達(dá)盒編號1391之核苷酸序列。將來自流感A/維多利亞/361/2011 (H3N2)的PDISP/H3加下劃線(SEQ ID NO:47)。圖25E顯示來自流感A/維多利亞/361/2011 (H3N2)的PDISP-H3的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。圖25F顯示構(gòu)建體1391的不意圖。
[0077]圖 26A 顯示引物 IF-HAB110.Sl+3c(SEQ ID NO:49)。圖 26B 顯示引物 IF-HABl 10.sl-4r (SEQ ID NO:50)。圖26C顯示合成的HA B威斯康辛(GenBank登錄號JN993010)之核苷酸序列(SEQ ID NO:51)。圖26D顯示構(gòu)建體193的示意圖。圖26E顯示構(gòu)建體193，由左至右t-DNA邊界(加下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默性抑制子表達(dá)盒的2X35S/CPMV-HT/N0S至BeYDV(m) +復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)(SEQ ID NO:52)。圖26F顯示表達(dá)盒編號1462由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子的核苷酸序列。將來自流感B/威斯康辛/1/2010的HA加下劃線(SEQ ID N0:53)。圖26G顯示來自流感B/威斯康辛/1/2010的HA之氨基酸序列(SEQID NO:54)。圖26H顯示構(gòu)建體1462的示意圖。
[0078]圖 27A顯示引物HABl 10 (PrL-).r (SEQ ID NO:55)。圖 27B顯示引物HABllO (PrL-).c (SEQ ID NO:56)。圖27C顯示表達(dá)盒編號1467由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子的核苷酸序列。將具有缺失的蛋白水解環(huán)的來自流感B/威斯康辛/1/2010之HA加下劃線(SEQ ID NO:57)。圖27D顯示具有缺失的蛋白水解環(huán)的流感B/威斯康辛/1/2010之氨基酸序列(SEQID NO:58)。圖27E顯示構(gòu)建體1467的示意圖。
[0079]圖 28A 顯示引物 IF-HB-M-04.s2+4c (SEQ ID NO:59)。圖 28B 顯示引物 IF-HB-M-04.sl-4r(SEQ ID NO:60)。圖28C顯示合成的HA B馬來西亞的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號EU124275的nt31_1743相對應(yīng))，其具有被加下劃線的T759C與C888G突變(SEQ IDNO:61)。圖28D顯示構(gòu)建體194的示意圖，示意圖上注有用于質(zhì)粒線性化的SacII與StuI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。圖28E顯示構(gòu)建體194由左至右t-DNA邊界(加下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素沉默性抑制子表達(dá)盒的2X35S/CPMV-HT/N0S至BeYDV (m) +復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)(SEQ ID NO:62)。圖28F顯示表達(dá)盒編號1631由2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子的核苷酸序列。將來自流感B/馬來西亞/2506/2004的roiSP-HA加下劃線(SEQ ID NO:63)。圖28G顯示來自流感B/馬來西亞/2506/2004的I3DISP-HA氨基酸序列(SEQ ID NO:64)。圖28H顯示構(gòu)建體1631的示意圖。
[0080]圖29顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。將來自B/馬來西亞/2506/2004的HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共表達(dá)。于每道加二十微克的蛋白質(zhì)提取物?！癈+”:陽性對照，來自英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)品暨控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)的半純化B/馬來西亞/2506/2004病毒；“1631”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/馬來西亞/2506/2004的野生型HA之表達(dá)；“ 1631+1261 ”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/馬來西亞/2506/2004的野生型HA與M2之共表達(dá)。比例表示用于共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的比。
[0081] 圖30A顯不在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。將來自B/威斯康辛/1/2010的HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共表達(dá)。于每道加十微克的蛋白質(zhì)提取物。“C+”:陽性對照，來自英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)品暨控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)的半純化B/威斯康辛/1/2010病毒；“ 1462”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/威斯康辛/1/2010的野生型HA之表達(dá)；“1467”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，來自B/威斯康辛/1/2010的突變型HA之表達(dá)；“ 1462+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，將來自B/威斯康辛/1/2010的野生型HA與M2共表達(dá)；“ 1467+1261”:在擴(kuò)增元件(BeYDV)存在下，將來自B/威斯康辛/1/2010的突變型HA與M2共表達(dá)。比例表示用于表達(dá)與共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之每一農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的光密度。圖30B顯示提取自轉(zhuǎn)化有AGL1/1462、AGL1/1467、AGL1/1462+AGL1/1261以及AGL1/1467+AGL1/1261的植物之粗蛋白的血細(xì)胞凝集能力的比較。
[0082]圖31顯示在以農(nóng)桿菌浸潤之本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表達(dá)之蛋白質(zhì)印跡分析。將來自H3/維多利-亞/361/2011的HA與來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共表達(dá)。于每道加二十微克的蛋白質(zhì)提取物?！癈+”:陽性對照，來自澳大利亞藥物管理局之半純化H3/威斯康辛/15/2009病毒；“1391”:來自H3/維多利亞/361/2011的野生型HA之表達(dá)；“1391+1261”:來自H3/維多利亞/361/2011的野生型HA與M2之共表達(dá)。比例表示用于表達(dá)與共表達(dá)實(shí)驗(yàn)之每一農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的光密度。
【具體實(shí)施方式】
[0083]以下描述為優(yōu)選的實(shí)施方案。
[0084]本發(fā)明涉及病毒樣顆粒(VLP)以及在植物中生產(chǎn)和增加VLP產(chǎn)率與生產(chǎn)的方法。
[0085]本發(fā)明部分地提供在植物中或植物的部分中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法。該方法涉及引入第一核酸和第二核酸至植物。第一核酸包含在植物或植物的部分中具有活性且有效連接到編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白之核苷酸序列的第一調(diào)節(jié)區(qū)。第二核酸包含在植物中具有活性且有效連接到編碼通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)之核苷酸序列的第二調(diào)節(jié)區(qū)。第一調(diào)節(jié)區(qū)和第二調(diào)節(jié)區(qū)可以是相同或不同的。將植物或植物的部分在容許核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)，從而生產(chǎn)VLP。如有需要，可將植物或植物的部分收獲并且純化VLP。優(yōu)選地，VLP不包含Ml、病毒基質(zhì)或核心蛋白。本發(fā)明亦提供以此方法生產(chǎn)的VLP。VLP可包含衍生自植物的一種或多于 一種的脂質(zhì)。可將VLP用于制備用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的包含有效劑量之VLP以及藥學(xué)上可接受之載體的組合物。
[0086]本發(fā)明亦提供包含通過表達(dá)以上所述第一和第二核酸而生產(chǎn)的VLP之植物物質(zhì)?？蓪⒅参镂镔|(zhì)用以誘導(dǎo)對象中對流感病毒感染的免疫。該植物物質(zhì)亦可被混合作為食物增補(bǔ)劑。
[0087]本發(fā)明之VLP亦可通過如下方式而生產(chǎn):提供包含如上定義之第一核酸和第二核酸的植物以及植物的部分，并且將植物或植物的部分于容許所述第一和第二核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)，從而生產(chǎn)VLP。VLP可包含衍生自植物的一種或多于一種的脂質(zhì)?？蓪LP用以制備用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的包含有效劑量之VLP以及藥學(xué)上可接受之載體的組合物。本發(fā)明亦提供包含通過表達(dá)第一和第二核酸而生產(chǎn)的VLP之植物物質(zhì)?？蓪⒅参镂镔|(zhì)用以誘導(dǎo)對象對流感病毒感染之免疫。該植物物質(zhì)亦可被混合作為食物增補(bǔ)劑。
[0088]本發(fā)明之VLP包含一種或更多種的病毒蛋白質(zhì)。例如但不視為限制性的，所述一種或更多種病毒蛋白質(zhì)可以是病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如流感血細(xì)胞凝集素(HA))或通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白，像是例如M2)。所述HA可是任何HA，例如H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 或如 W02009/009876 ；W02009/076778 ；W02010/003225 ；W02010/003235 ；W02011/03522中所描述的乙型HA，將其通過參考并入本文)。
[0089]如以下更詳細(xì)地描述，可通過將編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸與編碼通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)的第二核酸共表達(dá)而在植物中生產(chǎn)VLP?？蓪⒌谝慌c第二核酸在相同步驟引入至植物，或它們可相繼地引入至植物。第一與第二核酸可以瞬時(shí)的方式或以穩(wěn)定的方式引入植物。此外，可用例如但不限于質(zhì)子通道蛋白的通道蛋白質(zhì)(第二核酸)轉(zhuǎn)化表達(dá)編碼病毒蛋白質(zhì)之第一核酸的植物，以使第一和第二核酸兩者在植物中共表達(dá)。作為替代地，可用編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸轉(zhuǎn)化表達(dá)通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)(第二核酸)的植物，以使第一和第二核酸兩者在植物中共表達(dá)。此外，可將表達(dá)編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸的第一植物與表現(xiàn)編碼通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)之第二核酸的第二植物雜交，以生產(chǎn)共表達(dá)分別編碼病毒蛋白質(zhì)與通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)的第一和第二核酸的子代植物。
[0090]本發(fā)明亦提供增加在植物中的病毒蛋白質(zhì)表達(dá)和產(chǎn)率的方法，其通過共表達(dá)編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸和編碼通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)的第二核酸?？蓪⒌谝慌c第二核酸在相同步驟引入植物中，或可將它們相繼地引入植物中。第一與第二核酸可以瞬時(shí)的方式或以穩(wěn)定的方式引入植物中。此外，可用例如但不限于質(zhì)子通道蛋白的通道蛋白(第二核酸)轉(zhuǎn)化表達(dá)編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸的植物，以使第一和第二核酸兩者在植物中共表達(dá)。作為替代地，可用編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸轉(zhuǎn)化表達(dá)通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)(第二核酸)的植物，以使第一和第二核酸兩者在植物中共表達(dá)。此外，可將表達(dá)編碼病毒蛋白質(zhì)的第一核酸之第一植物與表達(dá)編碼通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)之第二核酸的第二植物雜交，以生產(chǎn)共表達(dá)分別編碼病毒蛋白質(zhì)與通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)之第一與第二核酸的子代植物。
[0091]通道蛋白
[0092]“通道蛋白” 是指能夠形成跨越磷脂膜之通道的蛋白質(zhì)，其容許離子和/或小分子通過膜。通道蛋白對于離子和/或小分子的尺寸和/或電荷可具選擇性。通道蛋白的非限制性實(shí)例為改變膜對低分子量化合物之通透性的非特異性通道蛋白，以及像是例如氯通道、鉀通道、鈉通道、鈣通道以及質(zhì)子通道的離子通道蛋白。
[0093]“質(zhì)子通道蛋白”是指能夠形成跨越磷脂雙層之質(zhì)子選擇性通道的蛋白質(zhì)。質(zhì)子通道蛋白可以為具有疏水結(jié)構(gòu)域在側(cè)面之跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域的單通膜蛋白(single passmembrane protein)。質(zhì)子通道的TM結(jié)構(gòu)域可包含序列HXXXW(SEQ ID N0.1)。
[0094]在HAO的切割之后，HA于內(nèi)體(endosome)的pH( < pH6.0)經(jīng)歷不可逆的構(gòu)象改變變得對PH敏感，。前體HAO的構(gòu)象于低pH時(shí)為穩(wěn)定的，但經(jīng)切割的HA1-HA2形式為亞穩(wěn)定的(Bullough PA et.al., 1994, Nature.Vol371:37-43)。對于在不同 HA 中誘導(dǎo)構(gòu)象改變之pH閾值的研究中，顯示對于B株此閾值約為pH5.8-5.9，然而對于甲型HA為更酸(pH5.1M 5.3) (Beyer WEP et al，1986，Archives Virol，vol90:173)。在植物生物量提取期間(介于PH5-6)，HA1-HA2的構(gòu)象改變亦可能伴隨乙型HA發(fā)生。
[0095]不希望被理論所約束地，包含HA的細(xì)胞區(qū)室(包括高爾基體)之pH因而可能對HA的折疊、穩(wěn)定性和/或蛋白水解是重要的。質(zhì)子通道蛋白，像是例如流感M2以及BM2蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞區(qū)室中的pH。例如，M2通過緩沖在流感病毒復(fù)制的晚期與早期兩者細(xì)胞內(nèi)區(qū)室以調(diào)節(jié)膜融合的電位。在新細(xì)胞的感染早期、于病毒顆粒的胞吞攝取之后，M2質(zhì)子通道活性的活化導(dǎo)致脫殼過程期間病毒粒子內(nèi)部的酸化。在感染晚期的病毒產(chǎn)生期間，M2在轉(zhuǎn)運(yùn)通過反式高爾基網(wǎng)(trans-Golgi network)期間作用以升高pH,并且避免低pH誘導(dǎo)之共同運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)(例如在流感情況中的HA)的去活化作用。通過共表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和例如但不限于質(zhì)子通道蛋白的通道蛋白，觀察到病毒結(jié)構(gòu)蛋白與VLP的增加產(chǎn)率。已知HA經(jīng)歷pH依賴性的構(gòu)象改變。不希望被理論所約束地，HA生產(chǎn)細(xì)胞之高爾基體內(nèi)的pH于成熟與遷移期間可能影響HA折疊、影響HA的穩(wěn)定性與增加HA降解或其組合。通過共表達(dá)例如但不限于質(zhì)子通道蛋白的通道蛋白和HA，可提高高爾基體內(nèi)的pH，并且造成HA和/或VLP穩(wěn)定性的增加，降解的減少或其組合，并且增加其表達(dá)水平與產(chǎn)率。
[0096]當(dāng)與表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白而沒有共表達(dá)通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)之植物相比較時(shí)，觀察到通過在植物中共表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)使得病毒結(jié)構(gòu)蛋白和/或VLP的產(chǎn)率增加產(chǎn)率。
[0097]此外，當(dāng)與未共表達(dá)通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)的HA蛋白相比較時(shí)，通過在植物中共表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如HA)和通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)，HA蛋白可能表現(xiàn)如由更強(qiáng)的血細(xì)胞凝集作用能力所顯示的增加的活性。關(guān)于活性的增加，指的是當(dāng)與在通道蛋白(例如但不限于質(zhì)子通道蛋白)不存在下產(chǎn)生的相同HA蛋白之活性相比較，使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)所確定的血細(xì)胞凝集作用能力增加約2%至約100%，或任何介于其間之量，例如，由大約10%至大約50%或介于其間的任何值，例如大約2、5、
8、10、12、15、18、20、22、24、25、26、28、30、32、34、35、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、
55、56、58、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%。
[0098]如本文中所使用的，術(shù)語“M2”、“M2蛋白”、“M2序列”以及“M2結(jié)構(gòu)域”意指由根據(jù)或存在于任何天然發(fā)生或人工產(chǎn)生的流感病毒株或分離株所分離之M2蛋白序列的全部或部分。因此，術(shù)語M2等等包括通過病毒生命周期期間的突變產(chǎn)生或?qū)x擇性壓力(例如，藥物治療、宿主細(xì)胞向性或感染性的擴(kuò)增等等)反應(yīng)而產(chǎn)生的天然M2序列變體，以及重組地或合成地產(chǎn)生之M2序列?？墒褂玫耐ǖ赖鞍字畬?shí)例包括但不限于列舉于表1的那些質(zhì)子通道蛋白?？膳c本發(fā)明使用的序列之非限制性的實(shí)例包括來自A/波多黎各/8/1934的M2以及來自A/新喀里多尼亞/20/1999的M2。示范性的M2蛋白由SEQ ID N0:11或14中顯示之氨基酸序列所組成。
[0099]如本文中所使用的，術(shù)語“BM2”、“BM2蛋白”、“BM2序列”以及“BM2結(jié)構(gòu)域”意指由
根據(jù)或存在于任何自然發(fā)生或人工產(chǎn)生的流感病毒株或分離株分離之BM2蛋白序列的所有或部分。因此，術(shù)語BM2等等包括在病毒生命周期期間由突變產(chǎn)生或?qū)x擇性壓力(例如，藥物治療、宿主細(xì)胞向性或感染性的擴(kuò)增等等)反應(yīng)而產(chǎn)生的天然BM2序列變體，以及重組地或合成地產(chǎn)生之BM2序列。可被使用的通道蛋白之實(shí)例包括但不限于那些列舉于表2之質(zhì)子通道蛋白。
[0100]額外的示范性質(zhì)子通道蛋白序列由表1與表2所顯示之保藏于GenBank登錄號下的序列組成。
[0101] 表1:M2質(zhì)子通道蛋白氨基酸序列的登錄號
【權(quán)利要求】
1.一種在植物中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括 a)將第一核酸引入所述植物或所述植物的部分，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性且有效連接到編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白之核苷酸序列的第一調(diào)節(jié)區(qū)， b)將第二核酸引入，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性且有效連接到編碼通道蛋白之核苷酸序列的第二調(diào)節(jié)區(qū)， c)將所述植物或所述植物的部分于容許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)，從而生產(chǎn)VLP。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述通道蛋白為質(zhì)子通道蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述質(zhì)子通道蛋白選自M2或BM2。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述質(zhì)子通道蛋白包含質(zhì)子通道特征序列HXXXW。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白包含三聚化結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列編碼流感HA蛋白。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述流感HA蛋白的一個(gè)或更多個(gè)蛋白水解環(huán)已被缺失。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷酸序列編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白為選自下列的流感結(jié)構(gòu)蛋白:B HA、C、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷酸序列編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白為流感BHA或流感H3。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述流感BHA來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述流感BHA蛋白的一個(gè)或更多個(gè)蛋白水解環(huán)已被缺失。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述流感H3來自流感A/珀斯/16/2009或來自流感A/維多利亞/361/2011。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列與選自SEQID NO:28、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:61的序列具有至少70%序列同一性。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白之序列為如SEQID NO: 30, SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:64中至少之一所示的。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列與選自SEQID NO:43和SEQ ID NO:57下劃線部分的序列具有至少70%序列同一性。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白之序列為如SEQID N0:41和SEQ IDNO:58中至少之一所示的。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列與選自SEQIDNO:23和SEQ ID NO:46的序列具有至少70%序列同一1丨生。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白之序列為如SEQIDNO:25和SEQ ID NO:48中至少之一所示的。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一核酸序列包含有效連接一個(gè)或多于一個(gè)豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子的第一調(diào)節(jié)區(qū)、編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的核苷酸序列以及一個(gè)或多于一個(gè)雙生病毒擴(kuò)增元件，并且將編碼雙生病毒復(fù)制酶的第三核酸引入所述植物或所述植物的部分。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述一個(gè)或多于一個(gè)豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子為豇豆花葉病毒屬UTR。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述豇豆花葉病毒屬UTR為豇豆花葉病毒(CPMV)UTR。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述一個(gè)或多于一個(gè)雙生病毒擴(kuò)增元件選自豆黃矮病毒長基因間區(qū)域(BeYDV LIR)和BeYDV短基因間區(qū)域(BeYDV SIR)。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述核苷酸序列編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白為流感BHA或流感H3。
24.權(quán)利要求23的方法， 其中所述流感BHA來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述流感BHA蛋白中的一個(gè)或更多個(gè)蛋白水解環(huán)已被缺失。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述流感H3來自流感A/珀斯/16/2009或來自A/維多利亞 /361/2011。
27.權(quán)利要求19的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列與選自SEQID NO:28、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:61的序列具有至少70%序列同一性。
28.權(quán)利要求19的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白的序列為如SEQID NO: 30、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:64中至少之一所示的。
29.權(quán)利要求19的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列與選自SEQID NO:43和SEQ ID NO:57下劃線部分的序列具有至少70%序列同一性。
30.權(quán)利要求19的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白的序列為如SEQID NO:41和SEQ IDNO:58中至少之一所示的。
31.權(quán)利要求19的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列與選自SEQID NO:23和SEQ ID NO:46的序列具有至少70%序列同一性。
32.權(quán)利要求19的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白的序列為如SEQID NO:25和SEQ IDNO:48中至少之一所示的。
33.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列包含依序編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白或其片段、流感跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾的嵌合核苷酸序列。
34.權(quán)利要求1的方法，其中在所述引入步驟(步驟a)中，所述核酸于植物中瞬時(shí)表達(dá)。
35.權(quán)利要求1的方法，其中在所述引入步驟(步驟a)中，所述核酸于植物中穩(wěn)定表達(dá)。
36.權(quán)利要求1的方法，還包括下述步驟 d)收獲所述植物以及純化所述VLP。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述VLP不包含病毒基質(zhì)或核心蛋白。
38.一種生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括 a)提供植物或植物的部分，其包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性且有效連接到編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白之核苷酸序列的第一調(diào)節(jié)區(qū)，至所述植物或所述植物的部分，以及所述第二核酸包含在所述植物中具有活性且有效連接到編碼通道蛋白之核苷酸序列的第二調(diào)節(jié)區(qū)， b)將所述植物或所述植物的部分于容許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)，從而生產(chǎn)VLP。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述通道蛋白為質(zhì)子通道蛋白。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述質(zhì)子通道蛋白選自M2或BM2。
41.通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的VLP。
42.通過權(quán)利要求38的方法生產(chǎn)的VLP。
43.權(quán)利要求41或42的VLP，其還包含衍生自植物的一種或多于一種脂質(zhì)。
44.權(quán)利要求41或42的VLP，其中所述一種或更多種病毒蛋白質(zhì)包含植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾的N-聚糖。
45.一種組合物，其包含用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效劑量的權(quán)利要求41或42所述的VLP以及藥學(xué)上可接受之載體。
46.一種在對象中誘導(dǎo)對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用權(quán)利要求41或42的VLP。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述VLP以經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用于對象。
48.使用權(quán)利要求41或42所述VLP制備的多克隆抗體。
49.植物物質(zhì)，其包含通過權(quán)利要求1或38的方法生產(chǎn)的VLP。
50.權(quán)利要求49的植物物質(zhì)，其用于在對象中誘導(dǎo)對流感病毒感染的免疫。
51.一種食物增補(bǔ)劑，其包含權(quán)利要求50的植物物質(zhì)。
52.權(quán)利要求1的方法，其還包括引入第三核酸序列，所述第三核酸序列編碼沉默性阻遏蛋白。
53.權(quán)利要求19的方法，其還包括引入第四核酸序列，所述第四核酸序列編碼沉默性阻遏蛋白。
54.權(quán)利要求52或53的方法，其中所述沉默性阻遏蛋白選自HcPro和pl9。
55.權(quán)利要求1或38的方法，其中所述VLP不包含通道蛋白。
56.權(quán)利要求1或38的方法，其中所述病毒結(jié)構(gòu)蛋白為HAO蛋白。
57.權(quán)利要求3的方法，其中所述M2蛋白選自包含流感A/波多黎各/8/1934和流感A/新喀里多尼亞/20/1999的組。
58.一種多肽，其包含選自SEQ ID N0:41和SEQ ID NO:58序列的氨基酸序列。
59.一種核酸序列，其編碼權(quán)利要求58的多肽。
60.權(quán)利要求59的核酸序列，其中所述核酸序列包含選自SEQID N0:43和SEQ ID NO:57下劃線部分之序列的核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/44GK103930435SQ201280047819
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】馬克-安德烈·德奧斯特, 馬農(nóng)·科圖雷, 路易斯-菲利普·韋齊納 申請人:麥迪卡格公司