可溶性多肽的制作方法【專利摘要】本發(fā)明一般地涉及表現(xiàn)出高穩(wěn)定性和溶解度的多肽(例如抗體分子)。特別地，本發(fā)明涉及包含在還原性或細胞內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出可溶性表達和折疊之成對VL和VH結(jié)構(gòu)域的多肽。本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的多核苷酸，涉及所述多肽或多核苷酸的文庫，以及涉及在研究、診斷和治療應(yīng)用中使用所述多肽的方法?！緦＠f明】可溶性多肽【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明一般地涉及表現(xiàn)出高穩(wěn)定性和溶解度的多肽(例如抗體分子)。特別地，本發(fā)明涉及包含在還原性或細胞內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出可溶性表達和折疊的成對\和Vh結(jié)構(gòu)域的多肽。本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的多核苷酸，涉及所述多肽或多核苷酸的文庫，以及涉及在研究、診斷和治療應(yīng)用中使用所述多肽的方法。例如所述多肽可用于篩選方法以鑒定與特定靶分子相結(jié)合的多肽?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]脊椎動物抗體譜(antibodyrepertoire)通過對兩種免疫球蛋白(Ig)折疊之異二聚體的祖先基因(ancestralgene)進行復(fù)制和多樣化而形成。由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的多樣性不僅依賴于Ig基因的種系基因(germlinegene)家族,而且來自B細胞和T細胞發(fā)育過程中亞結(jié)構(gòu)域外顯子的體內(nèi)重組以形成在外顯子邊界處具有額外多樣性的眾多獨特的譜系，這發(fā)生于Ig蛋白的表面暴露環(huán)(surface-exposedloop)。這一重組過程稱為V(D)J重組，在兩個可變輕(')外顯子和三個可變重(Vh)外顯子分別重組以形成抗體之輕鏈和重鏈的N端抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后這樣稱呼。然而，由于經(jīng)復(fù)制的基因偏離其祖先配對(ancestralpair)，突變的累積效應(yīng)導(dǎo)致了可變結(jié)構(gòu)域的異二聚體單元之間不那么完美的界面契合(interfacialfit)。選擇壓力不是對任一基因施加,而是對作為整體的家族施加。這樣，最大的多樣性(其對于免疫系統(tǒng)來說是好事)可導(dǎo)致對于個體家族成員來說不那么理想的折疊穩(wěn)定性。此外，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身可具有不同的折疊穩(wěn)定性。由眾多偏離的亞單位形成功能性異二聚體的需要通過在結(jié)構(gòu)域的β_片層之間存在保守二硫鍵來補償。然而，界面可仍然是不穩(wěn)定的契合，需要ER中的折疊檢查點。[0003]通過抗體可變結(jié)構(gòu)域施加的蛋白質(zhì)契合，作為“共有序列”方法的結(jié)果，一些配對具有低折疊穩(wěn)定性并且傾向于在細菌/哺乳動物宿主中較差地表達，以及傾向聚集。此外，在幾乎所有情況下，對于將在'和Vh結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成片層間二硫鍵有總的需要。這就需要對于在細菌宿主(例如大腸桿菌)中表達抗體文庫來說，抗體在細胞的周質(zhì)(具有二硫化物分子伴侶的氧化性空間)中表達，并且經(jīng)常作為\和Vh結(jié)構(gòu)域之間的融合(單鏈抗體；scFv)。然而，輸出至周質(zhì)需要通過內(nèi)膜排泄，這在對于抗體之高表達所期望的水平下飽和，導(dǎo)致遠低于胞質(zhì)表達的產(chǎn)率。[0004]除了在大腸桿菌胞質(zhì)中較便宜地產(chǎn)生scFv抗體的優(yōu)勢之外，能夠在還原性環(huán)境中折疊的抗體支架也將能夠用作哺乳動物胞質(zhì)中的親和試劑。這將能夠擴展抗體作為科學(xué)試劑在胞質(zhì)或細胞核中用于成像或阻斷蛋白質(zhì)功能以及類似地在治療和診斷中的用途。[0005]由于幾乎所有哺乳動物抗體在胞質(zhì)中是不可溶的，一些團隊已經(jīng)尋找折疊形成穩(wěn)定異二聚體的罕見基因組合以用作支架從而構(gòu)建進一步的多樣性。所采用的尋找胞質(zhì)可溶性抗體的方法是對抗體克隆在胞質(zhì)中穩(wěn)定表達的偶然事件的觀察(Tavladoraki等，1999；Vaccaix)等，2006)，其可以形成細胞內(nèi)抗體(“胞內(nèi)抗體”)支架的基礎(chǔ)，或者作為替代地，采用進化方法來使scFv基因向穩(wěn)定性進化,無論體內(nèi)(Martineau等，1998；Visintin等，1999；AufderMaur等，2002;Fisher和DeLisa,2009)或體外(Contreras-Martinez和Delisa,2007JermutusL.,等2001)。此外，已經(jīng)證明單結(jié)構(gòu)域抗體(其中僅單個的、未成對的、可變結(jié)構(gòu)域與靶抗原結(jié)合)在胞質(zhì)中是可溶且穩(wěn)定的。已經(jīng)描述了當在胞質(zhì)中表達兩種駱§它科(camelid)單結(jié)構(gòu)域抗體時,所述抗體是折疊且可溶的(KirchhoferAl.,等，2010；Saerens等，2005)。[0006]用于在細菌胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生細胞內(nèi)抗體的另一策略是使用大腸桿菌突變體，所述大腸桿菌突變體具有將胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)從還原改變?yōu)檠趸耐蛔?。這產(chǎn)生了在大腸桿菌胞質(zhì)中折疊的且部分地和/或完全地氧化的scFv(He等，1995;JuradoP.,等，2002)。[0007]使用酵母雙雜交(Y2H)系統(tǒng)來從scFv文庫體內(nèi)篩選與抗原相結(jié)合之scFv的兩個團隊編譯了用于其可溶性克隆的序列。第一團隊(Tse等，2002)發(fā)現(xiàn)VH3進化枝(clade)與進化枝VLkI和4配對。通過對多種可溶性scFv進行比對，他們編譯了用于可溶性'和Vh基因的共有序列，其幾乎準確地匹配家族VH3和VLκI的MorphosysHuCAL?文庫編譯的家族共有序列(Knappik等，2000)。使用Y2H的第二團隊在W003/097697中報道了其可溶性scFv是與VH3、VHla或VHlb進化枝之成員最密切地相關(guān)的序列，其與VLκI或VLλI或VLA3進化枝最密切相關(guān)的成員相組合。然而，其最優(yōu)的構(gòu)造是與VHlb配對的VLA3。然而，關(guān)鍵要注意的是，沒有一個報道的序列與最接近的同源免疫球蛋白基因之種系序列的翻譯準確地匹配，在整個序列中具有多個突變。推測這是由于這兩個團隊使用預(yù)篩選的噬菌體文庫以在酵母轉(zhuǎn)化的限制步驟之前富集抗原結(jié)合克隆。然而，這意味著在每個基因中，一個或更多個突變可對胞質(zhì)中的scFv折疊賦予穩(wěn)定化作用。[0008]目前為止，還沒有發(fā)表關(guān)于具有準確鑒別對應(yīng)于VL和VH基因之人種系氨基酸序列的細胞內(nèi)抗體的報道。這樣的抗體將會是有利于建造多樣性的支架，因為這允許胞質(zhì)表達的高產(chǎn)率，將以氧化的形式提供較高的穩(wěn)定性，將提供更高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以確保環(huán)多樣性的更大耐受性，以及將包含完全天然的序列，通過產(chǎn)生全抗體來產(chǎn)生較低的患者排斥。[0009]我們在此報道了應(yīng)用先前描述于W02011/075761的蛋白質(zhì)展示方法來篩選人scFv文庫以及分離與人種系序列具有相同骨架區(qū)的可溶性scFv基因。此外，我們證明了顯著的熱穩(wěn)定性和移植到scFv支架上之⑶R3的耐受性。[0010]發(fā)明概沭[0011]在一個方面，本發(fā)明提供了包含多種不同多肽的多肽文庫，其包含:[0012]i)抗體重鏈可變區(qū)(VH)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)(scaffoldregion)具有至少90%同一丨生的支架區(qū)；以及[0013]ii)抗體輕鏈可變區(qū)(')，其包含與以下任一種的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40(如SEQIDNO:18所示)、IGLV1-44(如SEQIDN0:21所示)、IGLV1-47(如SEQIDNO:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3-21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6-57(如SEQIDNO:12所示)；[0014]其中所述Vh和所述Vlj能夠形成抗原結(jié)合位點(antigen-bindingsite);并且[0015]其中至少兩種多肽在所述V1^P/或'可變區(qū)中一個或更多個互補性決定區(qū)(CDR)中存在的氨基酸序列上彼此不同。[0016]優(yōu)選地，所述V1^P/或'可變結(jié)構(gòu)域的一個或更多個CDR中氨基酸的序列是隨機或半隨機的，或來自人抗體。[0017]在另一方面中，本發(fā)明提供了構(gòu)建多肽文庫的方法，所述方法包括制備多種不同的多肽，所述多肽包含:[0018]i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及[0019]ii)抗體輕鏈可變區(qū)(VJ，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40GnSEQIDNO:18所示)、IGLV1-44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1-47(如SEQIDN0:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3_21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6_57(如SEQIDN0:12所示)；其中所述Vh和所述'能夠形成抗原結(jié)合位點；并且[0020]其中至少兩種多肽在所述Vh和/或\可變區(qū)中一個或更多個CDR中存在的氨基酸序列上彼此不同。[0021]在另一方面中，本發(fā)明提供了包含多種不同多核苷酸的多核苷酸文庫，[0022]其中每種多核苷酸編碼多肽，所述多肽包含:[0023]i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及[0024]ii)抗體輕鏈可變區(qū)(VJ，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40GnSEQIDNO:18所示)、IGLV1-44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1-47(如SEQIDN0:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27`所示)、IGLV3_21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6_57(如SEQIDNO:12所示)；[0025]其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點；并且[0026]其中至少兩種多核苷酸彼此的不同在于編碼下述多肽:所述多肽在所述Vh和/或Vl可變區(qū)中包含一個或更多個不同的⑶R。[0027]優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼的所述Vh和/或\可變結(jié)構(gòu)域的一個或更多個CDR中的氨基酸序列是隨機或半隨機的，或者來自人抗體。[0028]在另一方面中，本發(fā)明提供了構(gòu)建多核苷酸文庫的方法，所述方法包括制備編碼多肽的多種不同多核苷酸，所述多肽包含:[0029]i)抗體重鏈可變區(qū)(VH)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及[0030]ii)抗體輕鏈可變區(qū)(VJ，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40GnSEQIDNO:18所示)、IGLV1-44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1-47(如SEQIDN0:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3_21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6_57(如SEQIDNO:12所示)；[0031]其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點；并且[0032]其中至少兩種多核苷酸彼此的不同在于編碼下述多肽:所述多肽在所述Vh和/或Vl可變區(qū)中包含一個或更多個不同⑶R的多肽。[0033]在另一方面中，本發(fā)明提供分離的和/或重組的多肽，所述多肽包含:[0034]i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及[0035]ii)抗體輕鏈可變區(qū)(VJ，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40GnSEQIDNO:18所示)、IGLV1-44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1-47(如SEQIDN0:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3_21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6_57(如SEQIDNO:12所示)；[0036]其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點。[0037]所述\優(yōu)選地包含與如SEQIDN06所示IGLV3-1的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)。[0038]優(yōu)選地，所述多肽是可變片段(Fv)，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)、四抗體(tetrabody)或更高階的(higherorder)多肽復(fù)合物。更優(yōu)選地，所述多肽是scFv并且所述Vh和\通過肽接頭連接在一起。[0039]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽中V1^P/或'可變區(qū)的支架區(qū)與任一給定序列的支架區(qū)具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。[0040]本發(fā)明的多肽優(yōu)選地在還原性條件下可溶。此外，本發(fā)明的多肽優(yōu)選地在還原性條件下產(chǎn)生時可溶并且能夠穩(wěn)定地形成抗原結(jié)合位點。[0041]在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽與化合物綴合。所述化合物可以選自:放射性同位素、可檢測的標簽、治療性化合物、膠體、毒素、核酸、肽、蛋白質(zhì)、提高所述多肽在對象中之半衰期的化合物、及其混合物。[0042]在另一方面中，本發(fā)明提供了分離的或外源的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的多肽或其重鏈或輕鏈可變區(qū)之多肽。[0043]在另一方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明之多核苷酸的載體(vector)。[0044]在另一方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明之多肽、本發(fā)明之多核苷酸或本發(fā)明之載體的宿主細胞。[0045]在另一方面中，本發(fā)明提供了用于篩選與靶分子相結(jié)合之多肽的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多肽與靶分子相接觸，并且確定所述多肽是否與所述靶分子相結(jié)合。在這樣的一些方法中，優(yōu)選如果編碼所述多肽的多核苷酸在宿主細胞中或在無細胞表達系統(tǒng)中表達以產(chǎn)生所述多肽。當在細胞內(nèi)表達所述多肽時,這種表達可發(fā)生在宿主細胞(例如細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物)的胞質(zhì)和/或周質(zhì)(periplasm)中。[0046]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞是細菌細胞并且所述方法包括:[0047]a)培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明多肽之多核苷酸的細菌細胞，從而產(chǎn)生所述多肽，[0048]b)透化所述細菌細胞，其中所述多核苷酸和所述多肽保留在經(jīng)透化細菌細胞內(nèi)，[0049]c)將經(jīng)透化的細菌細胞與靶分子相接觸，從而使所述靶分子擴散到所述經(jīng)透化的細菌細胞中，以及[0050]d)確定本發(fā)明的多肽是否與所述靶分子相結(jié)合。[0051]本發(fā)明的篩選方法可以使用本文中所描述的任意多肽進行。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法包括篩選本發(fā)明的文庫。這樣，所述篩選方法可包括表達本發(fā)明的多肽或多核苷酸文庫以及在這些文庫中鑒定與靶分子相結(jié)合的多肽。優(yōu)選地，這樣的篩選方法在還原性條件下進行。例如，這樣的方法可以在宿主細胞中進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，這樣的方法在宿主細胞的胞質(zhì)中進行。優(yōu)選地，所述宿主細胞是細菌細胞，例如革蘭氏陰性細菌細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細菌是大腸桿菌細胞。[0052]在另一方面中，本發(fā)明提供包含多種宿主細胞的宿主細胞文庫，所述宿主細胞包含本發(fā)明的多肽，其中至少一種宿主細胞包含這樣的多肽，其與文庫中另一種宿主細胞中存在的多肽在Vh和/或'可變結(jié)構(gòu)域中一個或更多個CDR中存在的氨基酸序列不同。在本發(fā)明的宿主細胞文庫中的一種或更多種宿主細胞可以包含一種或更多種編碼本發(fā)明之多肽的多核苷酸。例如，在所述宿主細胞文庫中的宿主細胞可以含有一種編碼Vh的多核苷酸和另一種編碼\的多核苷酸。[0053]在另一方面中，本發(fā)明提供組合物，其包含本發(fā)明之多肽、多核苷酸和/或載體、以及可藥用載劑(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。[0054]在另一方面中，本發(fā)明提供試劑盒(kit)，其包含本發(fā)明之多肽、本發(fā)明之多核苷酸和/或本發(fā)明、以及能夠透化細菌細胞的試劑(agent)。[0055]在另一方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明之多肽在治療或診斷應(yīng)用中的用途。[0056]如將是顯而易見的那樣，根據(jù)情況作適當變動后，本發(fā)明的一個方面中優(yōu)選的特性和特征可適用于本發(fā)明的任何其他方面。[0057]貫穿本說明書的詞“包括”或變體例如“包含”或“含有”將被理解為意指包括所陳述的要素、整數(shù)或步驟或者要素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟或者要素、整數(shù)或步驟的組。[0058]在下文中通過以下非限制性實施例并參照附圖的方式描述本發(fā)明。[0059]附圖簡沭[0060]圖1示出良好表達的可溶性scFv克隆的典型外觀(1A，以及插圖)，以及良好表達但不可溶性scFv克隆(1B，以及插圖)。[0061]圖2示出所選擇的與VL基因IGLV3-1、IGLV3-21和IGLV6-57具有高度相似性(similarity)或總同一性(totalidentity)的可溶性克隆的多重比對(multiplealignment)。[0062]圖3展示出兩個克隆(一個IGLV3-1和一個IGLV3-21)在提高的溫度下表達的行為。[0063]圖4展示出當在25°C下于大腸桿菌胞質(zhì)溶膠中表達時IGLV3-1克隆溶解性。scFv::127::FLAG融合蛋白完整地在可溶性(S)級分中。[0064]圖5展示出具有用Jl或J2替換λJ區(qū)之初始克隆(#8.93)的熱穩(wěn)定性行為。[0065]圖6Α展示出具有多樣化IGLV3-1⑶R3的4個獨立克隆的溶解性和高表達。[0066]圖6Β展示出具有多樣化IGHV3-23⑶R3克隆之完整群體的樣品。[0067]圖7舉例說明在本文中描述的優(yōu)選可變區(qū)中的示例性CDR(用粗體和/或下劃線表不)。[0068]圖8舉例說明編碼具有可變⑶R3區(qū)之IGLV3-1:JGHV3-23支架的多核苷酸序列以及響應(yīng)的經(jīng)翻譯氨基酸序列的實例。CDR用下劃線和粗體表示。肽接頭序列用斜體表示。[0069]圖9示出SNAP配體標記的IGLV3-1::1GHV3_23scFv文庫，展示出可溶性文庫成員的高頻率。[0070]圖10示出通過RED篩選分離結(jié)合mAG的scFv?？寺?4對于mAG結(jié)合是陽性的。克隆25是陰性的。[0071]圖11舉例說明具有通過RED篩選分離之完整a-mAGscFv的IGLV3-1::IGHV3-23scFV支架，其作為存在于可溶性級分(S)中的C-端His6FLAG融合蛋白而克隆，且在不可溶性級分(P)中沒有蛋白質(zhì)。使用a-FLAG單克隆抗體進行檢測。[0072]圖12示出與IMACNi瓊脂糖結(jié)合的a-mAGscFvHis6FLAG對mAG的結(jié)合。[0073]圖13展示出a-mAGscFv與mAG相互作用的特異性(通過從大腸桿菌裂解物“拉下(pull-down)”未經(jīng)純化的mAG)。a-mAGscFvHis6FLAG與IMACN1-瓊脂糖樹脂相結(jié)合，添加在總大腸桿菌細胞裂解物中的mAG(泳道6和7)導(dǎo)致具有mAG預(yù)期大小(約26KD)之蛋白質(zhì)的結(jié)合。[0074]圖14示出來自使用封裝裂解缺陷型噬菌體展示gpD::a-mAGscFv融合蛋白的“摻雜的(doped)”mAG文庫篩選的FACS階段的抓屏(screen-grab)(上圖)。含有經(jīng)封裝噬菌體的mAG陽性細胞在右側(cè)門(gate)中。使用RED方法誘導(dǎo)從FACS篩選回收的噬菌體用于復(fù)制和gpD::a-mAG表達以及用mAG標記(下圖)。[0075]序列表要點[0076]SEQIDNO:1_編碼IGHV3-23的多核苷酸序列(NCBIRef.NT_026437.12)。[0077]SEQIDNO:2_編碼IGHV3-23的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0078]SEQIDNO:3-1GHV3_23的氨基酸序列[0079]SEQIDNO:4_編碼IGLV3-1的多核苷酸序列(NCBIRef.NT_011520.12)。[0080]SEQIDNO:5_編碼IGLV3-1的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0081]SEQIDNO:6-1GLV3_l的氨基酸序列[0082]SEQIDNO-J-編碼IGLV3-21的多核苷酸序列(NCBIRef.NT_011520.12)。[0083]SEQIDNO:8_編碼IGLV3-21的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0084]SEQIDNO:9_IGLy3_21的氨基酸序列[0085]SEQIDNO:10_編碼IGLV6-57的多核苷酸序列(NCBI參考:NW_001838745.1)。[0086]SEQIDNO:11_編碼IGLV6-57的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0087]SEQIDNO:12-1GLV6-57的氨基酸序列[0088]SEQIDNO:13_編碼IGLV1-51的多核苷酸序列(NCBI參考序列:ΝΤ_011520.12)[0089]SEQIDNO:14_編碼IGLV1-51的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0090]SEQIDNO:15-1GLV1_51的氨基酸序列[0091]SEQIDNO:16_編碼IGLV1-40的多核苷酸序列(NCBI參考序列:ΝΤ_011520.12)[0092]SEQIDNO:17_編碼IGLV1-40的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0093]SEQIDNO:18-1GLV1-40的氨基酸序列[0094]SEQIDNO:19_編碼IGLV1-44的多核苷酸序列(NCBI參考序列:ΝΤ_011520.12)。[0095]SEQIDNO:20_編碼IGLV1-44的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0096]SEQIDNO:21-1GLV1_44的氨基酸序列[0097]SEQIDNO:22_編碼IGLV1-47的多核苷酸序列(NCBI參考序列:ΝΤ_011520.12)[0098]SEQIDNO:23_編碼IGLV1-47的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0099]SEQIDNO:24-1GLVl_47的氨基酸序列[0100]SEQIDNO:25-編碼IGLV3-19的多核苷酸序列(NCBI參考序列:ΝΤ_011520.12)[0101]SEQIDNO:26_編碼IGLV3-19的多核苷酸序列，排除內(nèi)含子。[0102]SEQIDNO:27-1GLV3-19的氨基酸序列[0103]SEQIDNO:28_優(yōu)選的肽接頭[0104]SEQIDNO:29_CDR變體序列[0105]SEQIDNO:30_作為替代的CDR變體序列[0106]SEQIDNO:31_引物HVKlFl[0107]SEQIDNO:32_引物HVK1F2[0108]SEQIDNO:33_引物HVK2F[0109]SEQIDNO:34_引物HVK3F[0110]SEQIDNO:35_引物HVK4F[0111]SEQIDNO:36-引物HVK5F[0112]SEQIDNO:37-引物HVK6F[0113]SEQIDNO:38_引物HVKCLR[0114]SEQIDNO:39_引物HVLlFl[0115]SEQIDNO:40-引物HVL1F2[0116]SEQIDNO:41_引物HVL2F[0117]SEQIDNO:42-引物HVL3F1[0118]SEQIDNO:43_引物HVL3F2[0119]SEQIDNO:44~引物HVL4F1[0120]SEQIDNO:45_引物HVL4F2[0121]SEQIDNO:46_引物HVL5F[0122]SEQIDNO:47~引物HVL6F[0123]SEQIDN0:48_引物HVL7/8F[0124]SEQIDN0:49_引物HVL9/IOF[0125]SEQIDNO:50_引物01115HVLCLR[0126]SEQIDNO:51-引物01116HVLCLR2[0127]SEQIDNO:52~引物HVK12F1[0128]SEQIDNO:53_引物HVK12F2[0129]SEQIDNO:54_引物HVK22F[0130]SEQIDNO:55_引物HVK32F[0131]SEQIDNO:56_引物HVK42F[0132]SEQIDNO:57~引物HVK52F[0133]SEQIDNO:58_引物HVK62F[0134]SEQIDNO:59~引物HVKCL2R[0135]SEQIDNO:60_引物HVL12F1[0136]SEQIDNO:61_引物HVL12F2[0137]SEQIDNO:62~引物HVL22F[0138]SEQIDNO:63-引物HVL32F1[0139]SEQIDNO:64-引物HVL32F2[0140]SEQIDNO:65-引物HVL42F1[0141]SEQIDNO:66-引物HVL42F2[0142]SEQIDNO:67-引物HVL52F[0143]SEQIDNO:68-引物HVL62F[0144]SEQID勵:69_引物訊^7/82F[0145]SEQID勵:70_引物訊^9/102F[0146]SEQIDNO:71-引物HVLCL2R[0147]SEQIDNO:72_λJ區(qū)Jl[0148]SEQIDNO:73_λJ區(qū)J2[0149]SEQIDNO:74_λJ區(qū)J3[0150]SEQIDN0:75_AJgJ4[0151]SEQIDNO:76_λJ區(qū)J5[0152]SEQIDNO:77_λJ區(qū)J6[0153]SEQIDNO:78_λJ區(qū)J7[0154]SEQIDNO:79-雜合J區(qū)序列[0155]SEQIDNO:80_PCR引物[0156]SEQIDNO:81-翻譯的序列[0157]SEQIDNO:82_PCR引物[0158]SEQIDNO:83-翻譯的序列[0159]SEQIDNO:84-編碼具有可變CDR3區(qū)之IGLV3-1::1GHV3_23支架的多核苷酸序列[0160]SEQIDNO:85_由SEQIDNO:84之多核苷酸編碼的氨基酸序列[0161]SEQIDNO:86_模板CDR3序列[0162]SEQIDNO:87_作為替代的模板CDR3序列[0163]SEQIDNO:88-1GLV3_l的骨架序列和IGHV3-23的J區(qū)[0164]SEQIDNO:89_間插序列[0165]SEQIDN0:90_簡并引物I[0166]SEQIDN0:91_簡并引物2[0167]SEQIDNO:92_CDR3環(huán)LI[0168]SEQIDNO:93_CDR3環(huán)Hl[0169]SEQIDNO:94_CDR3環(huán)L2[0170]SEQIDNO:95-CDR3環(huán)H2[0171]SEQIDNO:96-CDR3環(huán)L3[0172]SEQIDNO:97_CDR3環(huán)H3[0173]SEQIDNO:98_CDR3環(huán)L4[0174]SEQIDNO:99_CDR3環(huán)H4[0175]SEQIDNO:100-CDR3環(huán)L5[0176]SEQIDNO:101-CDR3環(huán)H5[0177]SEQIDNO:102-CDR3環(huán)L6[0178]SEQIDNO:103-CDR3環(huán)H6[0179]SEQIDNO:104-CDR3環(huán)L8[0180]SEQIDNO:105-CDR3環(huán)H8[0181]SEQIDNO:106-CDR3環(huán)L9[0182]SEQIDNO:107-CDR3環(huán)H9[0183]SEQIDNO:108-CDR3環(huán)LlO[0184]SEQIDNO:109-CDR3環(huán)HlO[0185]SEQIDNO:1IOiAG-BioHis6蛋白[0186]SEQIDNO:lll-Ant1-mAG_BioHis6scFv序列[0187]SEQIDNO:112-gpD::a-mAGscFv融合構(gòu)建體多核苷酸序列[0188]SEQIDNO:113-gpD::a-mAGscFv融合蛋白序列[0189]SEQIDNO:114-野生型人IGLV3-1`[0190]SEQIDNO:115-可溶性克隆8.93[0191]SEQIDNO:116-可溶性克隆8.184[0192]SEQIDNO:117-可溶性克隆8.174[0193]SEQIDNO:118-可溶性人IGLV3-21克隆8.186[0194]SEQIDNO:119-可溶性人IGLV3-21克隆8.39[0195]SEQIDNO:120-野生型人IGLV3-21[0196]SEQIDNO:121-可溶性人IGLV3-21克隆9.19[0197]SEQIDNO:122~野生型人IGLV6-57[0198]SEQIDNO:123_可溶性克隆16.26[0199]SEQIDNO:124-可溶性克隆16.1[0200]SEQIDNO:125~可溶性克隆16.121[0201]發(fā)明詳沭[0202]一般技術(shù)和定義[0203]除非另外特別地定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)當采用與本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】(例如，在蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)中)普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。[0204]除非另有說明，在本發(fā)明中使用的重組蛋白質(zhì)、細胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準操作。這樣的技術(shù)通過例如以下來源的文獻描述和闡明:J.Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984)；J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress(2001)；R.Scopes,ProteinPurification-PrincipalsandPractice,第3版，Springer(1994);Τ.A.Brown(編輯)，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,卷I和2,IRLPress(1991);D.M.Glover和B.D.Hames(編輯)，DNACloning:APracticalApproach,卷1-4,IRLPress(1995和1996);以及EM.Ausubel等(編輯)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-1nterscience(1988,包括到目前為止所有的更新)；EdHarlow和DavidLane(編輯)，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988);以及J.E.Coligan等(編輯),CurrentProtocolsinImmunology,Johnffiley&Sons(包括到目前為止所有的更新)。[0205]術(shù)語“多肽”、“蛋白質(zhì)”、“肽”在本文中通?？苫Q使用。本文中使用的術(shù)語“外源性多肽”是指由外源性多核苷酸編碼的多肽。本文中使用的術(shù)語“外源性多核苷酸”是指多核苷酸序列對于其所引入的細胞來說是外來的，或者序列與其所引入的細胞中的序列是同源的，但是處于宿主細胞核酸中通常不出現(xiàn)所述多核苷酸的位置。[0206]本文中使用的術(shù)語“抗體”、“抗體分子”包括多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、雙抗體、三抗體、多抗體(multibody)、異綴合(heteroconjugate)抗體、嵌合抗體(包括完整分子及其片段，例如Fab、F(ab')2、Fv和scFv以及其他抗體樣分子)。技術(shù)人員將會知曉，抗體通常被認為是包含由多個多肽鏈構(gòu)成之可變區(qū)(例如輕鏈可變區(qū)(')和重鏈可變區(qū)(Vh))的蛋白質(zhì)?？贵w還可以包含恒定結(jié)構(gòu)域，其可以設(shè)置成恒定區(qū)或恒定片段或可結(jié)晶片段(fragmentcrystallisable,Fe)?？贵w可以與一個或幾個密切相關(guān)的抗原特異性地結(jié)合。全長抗體通常包含共價連接的兩個重鏈(約50至70kD)和兩個輕鏈(各約23kD)。輕鏈通常包含可變區(qū)和恒定結(jié)構(gòu)域，并且在哺乳動物中是κ輕鏈或λ輕鏈。重鏈通常包含可變區(qū)和通過鉸鏈區(qū)與另外的恒定結(jié)構(gòu)域相連的一個或兩個恒定結(jié)構(gòu)域。哺乳動物的重鏈是下列類型之一:α、δ、ε、y或μ。每個輕鏈還與重鏈之一共價相連。例如，兩個重鏈以及重鏈與輕鏈可以通過鏈間二硫鍵和/或通過非共價相互作用連在一起。鏈間二硫鍵(如果存在)的數(shù)目可根據(jù)抗體的不同類型而變化。每個鏈具有N端可變區(qū)(Vh或'，其中每個長度為約110個氨基酸)以及在C端的一個或更多個恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(長Q，其長度為約110個氨基酸)經(jīng)常與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(Ch，其長度為約330至340個氨基酸)對齊并且通過二硫鍵與其鍵合。輕鏈可變區(qū)經(jīng)常與重鏈可變區(qū)對齊?？贵w重鏈可以包含2個或更多個另外的Ch結(jié)構(gòu)域(例如Ch2、Ch3等)并且可包含可在ChI和Cm恒定結(jié)構(gòu)域之間確認的鉸鏈區(qū)。抗體可以是任意類型(例如，IgG,IgE,IgM,IgD,IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Igk,和IgA2)或亞類。優(yōu)選地，所述抗體是鼠(小鼠或大鼠)抗體或靈長類(優(yōu)選人)抗體。術(shù)語“抗體”還包括人源化抗體、靈長化(primatized)抗體、人抗體和嵌合抗體。[0207]本文中使用的術(shù)語“可變區(qū)”是指如本文中所定義之抗體的輕鏈和重鏈的一部分，其包含CDR(即，CDR1、CDR2和CDR3)和骨架區(qū)(frameworkregion,FR)的氨基酸序列。Vh是指重鏈的可變區(qū)。'是指輕鏈的可變區(qū)。[0208]本文中使用的術(shù)語“支架區(qū)”是指除了CDR殘基之外的所有可變區(qū)殘基。[0209]本文中使用的術(shù)語“骨架區(qū)”(FR)將被理解為意指除了⑶R殘基之外的可變區(qū)殘基的連續(xù)序列。這樣，所有FR—起構(gòu)成“支架區(qū)”。天然抗體的每個可變區(qū)通常具有四個FR，確定為FRl、FR2、FR3和FR4。如果CDR是根據(jù)Kabat定義的，示例性輕鏈FR(LCFR)殘基定位于約殘基I至23(LCFRl)、35至49(LCFR2)、57至88(LCFR3)和98至107(LCFR4)。注意λLCFRl不包含殘基10，其包含于κLCFR1。示例性重鏈FR(HCFR)殘基定位于約殘基I至30(HCFRl)、36至49(HCFR2)、66至94(HCFR3)和103至113(HCFR4)。[0210]本文中使用的術(shù)語“互補性決定區(qū)”(⑶R，即⑶R1、⑶R2和⑶R3或高變區(qū))是指免疫球蛋白可變區(qū)的氨基酸殘基，其存在對于抗原結(jié)合是必要的。每個可變區(qū)通常具有被確定為⑶RlXDR2和⑶R3的三個⑶R區(qū)。每個⑶R可以包含來自如由Kabat(1987和/或1991)定義的“互補性決定區(qū)”的氨基酸殘基。例如，在重鏈可變區(qū)中，⑶RHl在殘基31至35之間，⑶RH2在殘基50至65之間并且⑶RH3在殘基95至102之間。在輕鏈中，⑶RLl在殘基24至34之間，⑶RL2在殘基50至56之間并且⑶RL3在殘基89至97之間。這些⑶R還可包含大量插入，例如Kabat(1987和/或1991)中所述。[0211]本文中使用的術(shù)語“恒定區(qū)”(CR或可結(jié)晶片段或Fe)是指抗體的一部分，其包含至少一個恒定結(jié)構(gòu)域并且其通常(盡管不是必須)被糖基化并且其與一個或更多個受體和/或補體級聯(lián)的組分(例如賦予效應(yīng)子功能)相結(jié)合。重鏈恒定區(qū)可選自以下五種亞型中的任一種:α、δ、ε、gamma或μ。此外，多種亞類(例如重鏈的IgG亞類)的重鏈負責(zé)不同的效應(yīng)子功能，并且因此通過選擇期望的重鏈恒定區(qū)，可產(chǎn)生具有期望效應(yīng)子功能的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的重鏈恒定區(qū)是YI(IgGl)、Y2(IgG2)和Y3(IgG3)0[0212]“恒定結(jié)構(gòu)域”是抗體中的結(jié)構(gòu)域，其序列在相同類型(例如，IgG或IgM或IgE)的抗體中高度相似?？贵w的恒定區(qū)通常包含多個恒定結(jié)構(gòu)域，例如Υ、α和δ重鏈的恒定區(qū)包含三個恒定結(jié)構(gòu)域并且Υ、α和δ重鏈的Fe包含兩個恒定結(jié)構(gòu)域。μ和ε重鏈的恒定區(qū)包含四個恒定結(jié)構(gòu)域并且Fe區(qū)包含兩個恒定結(jié)構(gòu)域。[0213]本文中使用的術(shù)語“Fv”應(yīng)當被理解為任意蛋白質(zhì)，無論包含多種多肽還是單一多肽，其中'和合并形成具有抗原結(jié)合位點(即能夠特異性地與抗原相結(jié)合)的復(fù)合物。Vh和'可以以單一多肽鏈或以不同多肽鏈形成抗原結(jié)合位點。此外本發(fā)明的Fv(以及本發(fā)明的任意多肽)可以具有多個抗原結(jié)合位點，所述多個抗原結(jié)合位點可以或不可以與相同的抗原結(jié)合。術(shù)語“Fv”應(yīng)當理解為包括直接衍生于抗體的片段以及對應(yīng)于使用重組方式產(chǎn)生的此類片段的蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述Vh不與重鏈恒定區(qū)(Ch)I相連和/或所述'不與輕鏈恒定區(qū)(CJ相連。含有多肽或蛋白質(zhì)的示例性Fv包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、雙抗體、三抗體、四抗體、或更高階的復(fù)合物，或者與恒定區(qū)或其結(jié)構(gòu)域(例如Ch2或Ch3結(jié)構(gòu)域)相連的上述任一種?！癋ab片段”由抗體的單價抗原結(jié)合片段組成，并且可以例如通過用木瓜蛋白酶消化整個抗體以產(chǎn)生完整輕鏈和重鏈的一部分組成的片段來產(chǎn)生或者可以通過重組方式產(chǎn)生。可以例如通過用胃蛋白酶處理整個免疫球蛋白，隨后還原以產(chǎn)生由完整輕鏈和重鏈的一部分組成的分子來獲得抗體的“Fab'片段”。以這種方式處理每個抗體獲得的兩個Fab'片段。Fab'片段也可通過重組方式產(chǎn)生?？贵w的“F(ab')2片段”由兩個Fab'片段通過兩個二硫鍵連在一起形成的二聚體組成，并且通過用胃蛋白酶處理整個抗體分子獲得，無需后續(xù)的還原?！癋ab2”片段是重組片段，其包含使用例如亮氨酸拉鏈或Ch3結(jié)構(gòu)域連接的兩個Fab片段。[0214]“單鏈Fv”或“scFv”是含有免疫球蛋白之可變區(qū)片段(Fv)的重組分子，其中輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)通過合適的柔性多肽接頭共價連接。下文提供了落入該術(shù)語范圍內(nèi)的含有多肽之示例性Fv的詳細討論。[0215]本文中使用的術(shù)語“抗原結(jié)合位點”應(yīng)當被理解為意指由能夠與抗原特異性結(jié)合的多肽形成的結(jié)構(gòu)?？乖Y(jié)合位點不需要是連續(xù)的氨基酸，甚至不需要是在單一多肽鏈中。例如，由兩條不同多肽鏈產(chǎn)生的Fv中，抗原結(jié)合位點由一些列與抗原相互作用的\和Vh之區(qū)域構(gòu)成，并且其通常(但不總是)在每個可變區(qū)的一個或更多個CDR中。[0216]本文中被命名為⑶R和FR的任意氨基酸位置根據(jù)Kabat(1987和1991)定義。技術(shù)人員將能夠容易地在本發(fā)明的進行中使用其他編號系統(tǒng)，例如Chothia和Lesk(1987和/或1989)和/或Al-Lazikani等(1997)的高變換編號系統(tǒng)。[0217]技術(shù)人員將會知曉，“二硫鍵”是通過巰基偶聯(lián)形成的共價鍵。所述鍵也被成為SS-鍵或二硫橋(disulfidebridge)。在多肽中，二硫鍵通常發(fā)生在兩個半胱氨酸殘基的巰基之間。[0218]技術(shù)人員還將會知曉，術(shù)語“非還原性條件”包括足以使蛋白質(zhì)中的巰基(-SH)基團氧化的條件，例如容許二硫鍵形成。因此，術(shù)語“還原性條件”包括不足以使蛋白質(zhì)中的巰基(-SH)基團氧化的條件，例如不容許二硫鍵形成。[0219]本文中使用的術(shù)語“抗原”應(yīng)當被理解為意指主要針對其可使抗體應(yīng)答出現(xiàn)的任意的物質(zhì)組合物。示例性抗原包括蛋白質(zhì)、肽、多肽、碳水化合物、磷酸基團、磷光體肽(phosphor-peptide)或多肽,糖基化肽或肽等。[0220]本文中對可變區(qū)及其一部分、免疫球蛋白、抗體及其片段的描述和定義可以進一步通過Kabat(1987和/或1991)、Bork等(1994)和/或Chothia和Lesk(1987和1989)或Al-Lazikani等(1997)中的討論來闡明，。[0221]本文中使用的術(shù)語“綴合”、“綴合的”或其變化形式廣泛地用于指可用于本文中公開的方法中的化合物與其他試劑之間任意形式的共價鍵或非共價鍵締合。[0222]術(shù)語“和/或”(例如“X和/或Y”)應(yīng)當被理解為意指“X和Y”或“X或Y”并且應(yīng)當對兩種含義或?qū)x之一提供清楚的支持。[0223]本文中使用的術(shù)語“約”是指指定值`+/-5%的范圍。[0224]如將通過以下描述理解的，本發(fā)明人應(yīng)用了蛋白質(zhì)展示方法以鑒別可在細胞的胞質(zhì)中以可溶性形式表達并且展示出出乎意料水平的可溶性、熱穩(wěn)定性、以及對CDR多樣化之耐受的多肽(例如抗體)。本發(fā)明人進一步證明，僅使用抗體可變結(jié)構(gòu)域之骨架區(qū)中的種系序列，人免疫球蛋白譜(immunoglobulinrepertoire)具有用于胞質(zhì)可溶性和穩(wěn)定性的潛力。[0225]保留封裝展TK(RetainedEncapsulatedDisplay,RED):[0226]本發(fā)明人已經(jīng)鑒別了可以在細胞的胞質(zhì)中以可溶性形式表達并且使用保留封裝展示(RED)的方法展示出出乎意料水平的可溶性、熱穩(wěn)定性、以及對CDR多樣化之耐受的多肽。RED是用于革蘭氏陰性細菌的蛋白質(zhì)展示平臺，這描述于W02011/075761(其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在RED中待展示的蛋白質(zhì)在細胞的周質(zhì)或胞質(zhì)中表達。然后用去污劑或有機溶劑透化細胞膜，同時完整的留下細胞壁。展示蛋白質(zhì)通過細胞壁被保留，通過與蛋白質(zhì)融合將其分子量提高至高于細胞壁的孔隙率限制(例如與四聚體單體融合)，或者通過與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合(所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與DNA、細胞壁自身或這二者結(jié)合)。通過在經(jīng)透化細胞的細胞壁內(nèi)共保留質(zhì)粒和基因組DNA提供對于展示系統(tǒng)所需的表型-基因型連鎖。[0227]多狀:[0228]人抗體譜含有功能性和假基因可變區(qū)(由Lefranc總結(jié)，2000)。這些可以作為外顯子從非免疫譜系中基因組DNA或者從免疫細胞(其已經(jīng)經(jīng)歷了V(D)J重排)來源的mRNA克隆，以準備可以用于表達抗體的遺傳構(gòu)建體。在這樣的過程期間，輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域可以作為單體scFv或以形成二價或更高價的排列被克隆。還可以從可變結(jié)構(gòu)域的下游克隆恒定區(qū)以產(chǎn)生Fab或全長抗體。[0229]在所有形式中，為了獲得正確折疊并且在抗體的產(chǎn)生期間維持穩(wěn)定性和可溶性，編碼抗體的遺傳構(gòu)建體必須幾乎總是在使得結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵可以在β片層之間形成的條件下(即在非還原性條件下)表達。這樣，在哺乳動物中，抗體插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體用于分泌或膜插入。如果在細菌宿主(例如大腸桿菌)中表達，其必須引導(dǎo)至二硫鍵伴侶DsbA、B和C存在的周質(zhì)空間。如果抗體在非氧化性環(huán)境中(例如在細胞的胞質(zhì)中)，穩(wěn)定化二硫鍵的缺乏導(dǎo)致錯誤折疊和降解，或者如果在大腸桿菌胞質(zhì)中以高水平表達，作為亞細胞包涵體(inclusionbody)而聚集。[0230]本發(fā)明人已經(jīng)鑒別了包含抗體可變區(qū)支架的多肽，其甚至在多肽于非氧化(還原)性環(huán)境中表達時能夠形成抗原結(jié)合位點。[0231]因此，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的多肽，所述多肽包含通過肽接頭與免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域之\λ1、3或6家族的抗體輕鏈可變區(qū)(')相連的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域之Vh3家族的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點。[0232]本發(fā)明的多肽可以以任意已知形式的抗體或抗體片段來提供。因而，本發(fā)明的多肽可以是:(i)抗體；(ii)單一結(jié)構(gòu)域抗體；(iii)單鏈Fv(scFv)；(iv)雙抗體、三抗體、四抗體；(V)融合蛋白，其包含(ii)-(iv)中任一種和抗體的Fe結(jié)構(gòu)域或其結(jié)構(gòu)域；(vi)融合蛋白，其包含(ii)-(iv)中任一種和能夠與免疫效應(yīng)細胞或任意其他已知形式的抗體相結(jié)合的蛋白質(zhì)。[0233]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是Fv。例如，本發(fā)明的多肽優(yōu)選地是Fab片段、Fab'片段、Fiab1)片段、scFv、雙抗體、三抗體、四抗體或更高階的多肽復(fù)合物。[0234]最優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是scFv。scFv包含在單多肽鏈中的VdP'區(qū)。優(yōu)選地，所述多肽鏈還在V1^P'之間還包含多肽接頭，其使得SCFv能夠形成期望的用于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)(即，用于所述單多肽鏈的Vh和'彼此相互締合以形成抗原結(jié)合位點)。這與本發(fā)明的雙抗體或更高階的多聚物截然不同，其中來自不同多肽鏈的可變區(qū)彼此相互締合或結(jié)合。所述肽接頭可以包含12個或更多個氨基酸殘基。例如，所述肽接頭可以包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個氨基酸或更多個。優(yōu)選地，所述肽接頭包含超過12個氨基酸殘基，且(Gly4Ser)3(即GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:28))是用于scFv的更偏好的接頭之一。另一些合適的多肽在本領(lǐng)域中是已知的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包含免疫球蛋白可變區(qū)之Vh3家族的Vh的支架區(qū)和/或免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域之'λ1、3或6家族的\的支架區(qū)。這樣，本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包含本文中公開的任意可變區(qū)的所有氨基酸殘基，不包括CDR殘基。CDR殘基可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地鑒定，參考Kabat(1987和/或1991)、Bork等(1994)和/或Chothia和Lesk(1987和1989)或Al-Lazikani等(1997)中的討論。這樣本發(fā)明的多肽可包含本文中公開的任意可變區(qū)的所有FR。所述多肽還可以包含一個或更多個本文中公開的可變區(qū)之⑶R。所述多肽還可以包含一個或更多個未在本文中公開的可變區(qū)中存在的CDR。因此，一個或更多個來自不同來源的CDR可以插入到本文中公開的可變區(qū)的支架區(qū)。這種可能性的進一步討論包含于下文中。[0235]在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的scFv包含通過肽接頭與免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域之'λ1、3或6家族的八相連接的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域之Vh3家族的Vh的支架區(qū)。在更優(yōu)選的一些實施方案中，本發(fā)明的scFv包含IGHV3-23的支架區(qū)和IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV3-1、IGLV3-19、IGLV3-21和IGLV6-57中任一種的支架區(qū)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的scFv包含IGHV3-23的支架區(qū)和IGLV3-1的支架區(qū)。[0236]本發(fā)明的多肽可以用其與參考序列的百分比同一性來定義。這一百分比同一性可以通過本領(lǐng)域中已知的任意合適的方法計算。用于比較經(jīng)比對序列的數(shù)種算法是已知的，并且可以用于確定本發(fā)明之多肽與參考序列的百分比同一性。例如，氨基酸和多核苷酸序列可以手動比較或通過利用基于計算機的序列比較和鑒定工具進行比較，其使用例如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul等，1993)的算法；還參見www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),比對的Clustal方法(HigginsandSharp,1989)等，其中用于每個特定序列比較的合適的參數(shù)可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的方式來選擇。[0237]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是分離的和/或重組的多肽。本文中使用的術(shù)語“分離的”或“純化的”旨在意指這樣的多肽，其通常已經(jīng)從脂質(zhì)、核酸、其他多肽和肽、以及在其天然狀態(tài)中與其相關(guān)的污染分子分離。優(yōu)選地，所述分離的多肽至少60%沒有、優(yōu)選地至少75%沒有、以及更優(yōu)選地至少90%沒有與其天然相關(guān)的組分。[0238]在多肽的上下文中，術(shù)語“重組”是指這樣的多肽，當通過細胞或在無細胞表達系統(tǒng)中產(chǎn)生時，所述多肽與天然狀態(tài)相比具有改變的量或改變的速率。在一個實施方案中，所述細胞是不天然產(chǎn)生所述多肽的細胞。然而，所述細胞可以是包含非內(nèi)源性基因(其導(dǎo)致改變的，優(yōu)選提高量的待產(chǎn)生之肽)的細胞。如本文中所描述的重組多肽包括未從轉(zhuǎn)基因(重組)細胞或無細胞表達系統(tǒng)(所述多肽在其中產(chǎn)生)的其他組分分離的多肽，并且在這樣的細胞或無細胞體系中產(chǎn)生的多肽隨后被純化以除去至少一些其他組分。[0239]本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包含來自鼠(小鼠或大鼠)抗體或靈長類(優(yōu)選人)抗體的氨基酸序列。因此在本發(fā)明的多肽中包含的可變區(qū)和/或支架區(qū)可以是鼠(小鼠或大鼠)或靈長類(優(yōu)選人)可變區(qū)和/或支架區(qū)。[0240]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是可溶性的。用于確定多肽之可溶性的方法是本領(lǐng)域中公知的，例如J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rd版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress(2001)中的描述。多肽如果(例如)不能從經(jīng)裂解的和/或經(jīng)透化的細胞級分中通過物理分離(例如通過離心)分離，則所述多肽可以被確定為是可溶性的。此外，如果本發(fā)明的多肽在細胞的胞質(zhì)中不形成包涵體，則所述多肽可以被確定是可溶性的。因此，如果當多肽在宿主細胞中表達時，所述多肽保留在通過任何合適的機械、去污劑和/或酶方法裂解宿主細胞后產(chǎn)生的可溶性級分中，則所述多肽可以被認為是可溶性的。合適的機械方法包括例如使用聲處理。合適的去污劑方法包括例如使用η-辛基-β-D-硫代葡糖苷(8TGP)。合適的酶方法包括例如使用溶菌酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽可在細胞裂解物的可溶性級分中保留的水平為至少25%，例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、或至少95%。[0241]本發(fā)明的多肽優(yōu)選地能夠穩(wěn)定地形成抗原結(jié)合位點。因此，所述多肽優(yōu)選地能夠在足以允許檢測多肽抗原復(fù)合物的水平上與靶抗原相結(jié)合。這樣的檢測可以在合適的實驗條件下進行，例如在溫度為至少5°C、至少10°C、至少15°C、至少20°C、至少25°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少45°C或至少50°C。[0242]綴合物[0243]本發(fā)明的多肽可以使用本領(lǐng)域中已知的任意方法與一個或更多種化合物綴合。多肽可以與之綴合的化合物實例選自:放射性同位素、可檢測的標簽、治療性化合物、膠體、毒素、核酸、肽、蛋白質(zhì)、提高所述多肽在對象中之半衰期的化合物及其混合物。示例性治療劑包括但不限于抗血管發(fā)生劑(ant1-angiogenicagent)、抗新血管形成劑(ant1-neovascularization)和/或其他血管形成劑(vascularizationagent)、抗增殖劑、促凋亡劑、化療劑或治療性核酸。[0244]毒素包括對細胞有害的(例如殺死細胞)任意試劑。多這些類藥物的描述是本領(lǐng)域中已知的，并且其作用的機理參見Goodman等，Goodman和Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第8版，MacmillanPublishingC0.,1990。與制備免疫球蛋白-免疫毒素綴合物相關(guān)的另一些技術(shù)在例如Vitetta(1993)和US5,194，594中提供。示例性毒素包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(alfa-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白質(zhì)、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(Phytolacaamericana)蛋白質(zhì)(PAP1、PAPII和PAP-S),苦瓜(momordicacharantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制因子、多花白樹毒蛋白(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酹霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢霉烯類(tricothecenes)。參見例如W093/21232。[0245]用于形成包含本發(fā)明之多肽的免疫綴合物的合適的化療劑包括:auristatin和美登素(maytansine)、泰素(taxol)、細胞松弛素B(cytochalasinB)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙錠、吐根堿(emetine)、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮(Ι-de-hydrotestosterone)、糖`皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素、抗代謝物類(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、羥基脲、天冬酰胺酶、吉西他濱、克拉屈濱)、烷化劑(例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、達卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼)、絲裂霉素C、順鉬和其他鉬衍生物例如卡鉬)、抗生素類(例如更生霉素(以前稱為放線菌素)、博來霉素、柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)、多柔比星、伊達比星、光神霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素(plicamycin)、氨茴霉素(AMC))。[0246]合適的血管發(fā)生抑制劑(抗血管發(fā)生劑)的實例包括但不限于:尿激酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(例如馬立馬司他(marimastat)、新伐司他(neovastat)、BAYl2-9566、AG3340、BMS-275291和類似藥劑)、內(nèi)皮細胞遷移和增殖的抑制劑(例如TNP-470、角藍胺(squalamine)、2甲氧基雌二醇、康普瑞汀(combretastatins)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、血管抑素、青霉胺、SCH66336(Schering-PloughCorp,Madison,NJ)、R115777(JanssenPharmaceutica,Inc,Titusville,NJ)和類似藥劑)、血管發(fā)生性生長因子拮抗劑(例如ZD6474、SU6668、針對血管發(fā)生劑的抗體和/或其受體(例如VEGF、bFGF和血管生成素-1)、沙立度胺、沙立度胺類似物(例如CC5013)、Sugen5416、SU5402、抗血管發(fā)生核酶(例如angiozyme)、干擾素α(例如干擾素a2a)、蘇拉明(suramin)和類似藥劑)、VEGF-R激酶抑制劑和其他抗血管發(fā)生的酪氨酸激酶抑制劑(例如SU011248)、內(nèi)皮細胞特異性整合素/生存信號的抑制劑(如vitaxin和類似藥劑)、銅拮抗劑/螯合劑(如四硫鑰酸鹽(tetrathiomolybdate)、卡托普利和類似藥劑)、羧胺三唑(carboxyamido-triazole,CAI)、ABT-627、CMlOl、白介素-12(IL-12)、IM862.PNU145156E以及抑制血管發(fā)生的核苷酸分子(例如反義-VEGF-cDNA、編碼血管抑素的cDNA、編碼p53的cDNA和編碼缺陷型VEGF受體-2的cDNA)和類似藥劑。血管發(fā)生、新血管形成和/或其他血管形成之抑制劑的另一些實例是抗血管發(fā)生的肝素衍生物和相關(guān)分子(例如，肝素酶IIlQieperinaseIII))、替莫唑胺、NK4、巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、環(huán)氧合酶-2抑制劑、低氧誘導(dǎo)因子I的抑制劑、抗血管發(fā)生的大豆異黃酮類、奧替普拉(oltipraz)、煙曲霉素及其類似物、生長抑素類似物、多硫酸戍聚糖(pentosanpolysulfate)、替可加蘭鈉(tecogalansodium)、達肝素(dalteparin)、腫瘤抑素(tumstatin)、血小板反應(yīng)蛋白(trombospondin)、NM-3、卡貝塔汀(combrestatin)、血管能抑素(canstatin)、阿瓦斯汀(avastatin)、針對其他相關(guān)祀標的抗體(例如抗α-V/β-3整合素和抗高分子激肽原(kininostatin)mAb)和類似藥劑。[0247]在一個實例中，如本文所描述的根據(jù)任意實施方案的多肽與其他多肽綴合或連接，所述其他多肽包括本發(fā)明的其他多肽或者包含免疫球蛋白可變區(qū)的多肽，例如免疫球蛋白或從其衍生的多肽(例如，如本文中所述的多肽)。不排除其他蛋白質(zhì)。另外的蛋白質(zhì)對技術(shù)人員來說將是顯而易見的，包括例如免疫調(diào)節(jié)劑或延長半衰期的蛋白質(zhì)或多肽或者與血清白蛋白相結(jié)合的其他蛋白質(zhì)等。[0248]示例性的免疫調(diào)節(jié)劑包括細胞因子和趨化因子。術(shù)語“細胞因子”是從一個細胞群釋放的、在另一細胞發(fā)揮作用的、作為細胞間介質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽的通用術(shù)語。細胞因子的實例包括淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子中包括生長激素，例如人生長激素、N-甲硫氨?；松L激素、和牛生長激素；甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)、肝生長因子；前列腺素、成纖維細胞生長因子、催乳素、胎盤催乳激素、OB蛋白、腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β,繆勒氏抑制物質(zhì)(mullerian-1nhibitingsubstance)、促性腺激素相關(guān)肽、抑制素(inhibin)、激活蛋白(activin)、血管內(nèi)皮生長因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神經(jīng)生長因子例如NGF-B、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β、胰島素樣生長因子-1或胰島素樣生長因子-11、促紅細胞生成素(EPO)、骨誘導(dǎo)因子、干擾素如干擾素-α、干擾素-β或干擾素-Y;集落刺激因子(CSF)例如巨噬細胞-CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞-CSF(G-CSF)，白介素(IL)例如IL-UIL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6,IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1UIL-12,IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和LIF。[0249]趨化因子通常作為化學(xué)引誘物來將免疫效應(yīng)細胞募集至趨化因子表達的部位。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIPl-a或MIPl-β。技術(shù)人員將意識到已知某些細胞因子具有化學(xué)引誘作用并且可以歸類為術(shù)語趨化因子。[0250]示例性血清白蛋白結(jié)合肽或蛋白質(zhì)描述于US20060228364或US20080260757。[0251]多種放射性核素可用于放射性綴合蛋白的產(chǎn)生。實例包括但不限于低能量輻射原子核(例如適合用于診斷目的)，例如13C、15N、2H、1251、1231、"Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、mIn等。優(yōu)選地，放射性核素是發(fā)射Y、光子或正電子的放射性核素，具有半衰期適合于在施用和定位至成像部位之間的時間流逝之后允許放射性或檢測。本發(fā)明還涵蓋高能量放射性核(例如用于治療目的)，例如125K131Ki23KmIrK1c15RK153SnK67Ciu67GaJ66HcK177Liu186Re和188Re0這些同位素通常產(chǎn)生具有短的路徑長度的高能量α-或β-粒子。這樣的放射性核素殺死與其非?？拷募毎?，例如綴合物已經(jīng)附著或者進入的腫瘤細胞。它們對未定位的細胞影響很小的或沒有影響并且基本上沒有免疫原性。或者，高能量同位素可以通過其他穩(wěn)定同位素的熱輻射產(chǎn)生，例如在硼中子俘獲治療中(Guan等，1998)。[0252]在另一個實施方案中，所述多肽與用于在細胞中預(yù)靶標的“受體”(例如鏈霉親和素)綴合，其中綴合物施用于患者，隨后通過使用清除劑從循環(huán)移除未結(jié)合的綴合物并且隨后施用與治療劑(例如放射性核素)綴合的“配體”(例如親和素)。[0253]本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以被修飾以含有另外的非蛋白質(zhì)部分，其在本領(lǐng)域中是已知的并且可容易地獲得。優(yōu)選地，適合用于蛋白質(zhì)之衍生的部分是水溶聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)(dioxolane)、聚-1，3，6-三,:烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(無論是均聚物或隨機共聚物)、以及聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(PPG)均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油、P0G)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的穩(wěn)定性可以在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢。[0254]聚合物分子通常特征為具有例如約2個至約1000個或約2個至約300個重復(fù)單JLiο[0255]例如，水可溶性聚合物(包括但不限于PEG、聚(氧化乙烯)(PEO)、聚氧乙烯(POE)、聚乙烯醇、羥乙基纖維素或葡聚糖)通常與蛋白質(zhì)綴合以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或尺寸等。[0256]PEG、PE0或POE是指環(huán)氧乙烷的寡聚物或聚合物。在聚乙二醇的情況中，這些寡聚物或聚合物通過例如環(huán)氧乙烷的陰離子開環(huán)聚合產(chǎn)生，這是與通過氫氧根離子在環(huán)氧化物環(huán)上的親核攻擊。用于蛋白質(zhì)修飾的PEG之更加有用的形式之一是單甲氧基PEG(mPEG)。[0257]用于與本發(fā)明的多肽綴合的特別優(yōu)選的化合物列在表1中。[0258]表1:用于綴合的優(yōu)選化合物[0259]【權(quán)利要求】1.包含多種不同多肽的多肽文庫，所述多肽包含:i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及ii)抗體輕鏈可變區(qū)(')，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40(如SEQIDNO:18所示)、IGLV1_44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1_47(如SEQIDNO:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3-21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6-57(如SEQIDNO:12所示)；其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點；并且其中所述多肽的至少兩種在所述％和/或'可變區(qū)中一個或更多個互補性決定區(qū)(OTR)中存在的氨基酸序列上彼此不同。2.權(quán)利要求1所述的文庫，其中在所述V1^P/或'可變結(jié)構(gòu)域的一個或更多個CDR中的氨基酸序列是隨機或半隨機的或者來自人抗體。3.構(gòu)建多肽文庫的方法，所述方法包括制備多種不同的多肽，所述多肽包含:i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及ii)抗體輕鏈可變區(qū)(')，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40(如SEQIDNO:18所示)、IGLV1_44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1_47(如SEQIDNO:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3-21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6-57(如SEQIDNO:12所示)；其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點；并且其中所述多肽的至少兩種在所述Vh和/或\可變區(qū)中一個或更多個CDR中存在的氨基酸序列上彼此不同。4.多核苷酸文庫，其包含多種不同的多核苷酸，其中每種多核苷酸編碼多肽，所述多肽包含:i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及ii)抗體輕鏈可變區(qū)(')，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40(如SEQIDNO:18所示)、IGLV1_44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1_47(如SEQIDNO:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3-21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6-57(如SEQIDNO:12所示)；其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點；并且其中所述多核苷酸的至少兩種彼此的不同在于編碼下述多肽:所述多肽在所述Vh和/或\可變區(qū)中包含一個或更多個不同的CDR。5.權(quán)利要求4所述的文庫，其中所述多核苷酸編碼的所述Vh和/或\可變結(jié)構(gòu)域的一個或更多個CDR中的氨基酸序列是隨機或半隨機的或者來自人抗體。6.構(gòu)建多核苷酸文庫的方法，所述方法包括制備編碼多肽的多種不同多核苷酸，所述多肽包含:i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及ii)抗體輕鏈可變區(qū)(')，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40(如SEQIDNO:18所示)、IGLV1_44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1_47(如SEQIDNO:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3-21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6-57(如SEQIDNO:12所示)；其中所述Vh和所述\能夠形成抗原結(jié)合位點；并且其中所述多核苷酸的至少兩種彼此的不同在于編碼下述多肽:所述多肽在所述Vh和/或\可變區(qū)中包含一個或更多個不同的CDR。7.分離的和/或重組的多肽，所述多肽包含:i)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含與如SEQIDNO:3所示IGHV3-23的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)；以及ii)抗體輕鏈可變區(qū)(')，其包含與以下任一種支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū):IGLVl-40(如SEQIDNO:18所示)、IGLV1_44(如SEQIDNO:21所示)、IGLV1_47(如SEQIDNO:24所示)、IGLV1-51(如SEQIDNO:15所示)、IGLV3-1(如SEQIDNO:6所示)、IGLV3-19(如SEQIDNO:27所示)、IGLV3-21(如SEQIDNO:9所示)、IGLV6-57(如SEQIDNO:12所示)；其中所述Vh和所述'能夠形成抗原結(jié)合位點。8.權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述\包含與如SEQIDN0.6所示IGLV3-1的支架區(qū)具有至少90%同一性的支架區(qū)。9.權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的多肽，其是可變片段(Fv)。10.權(quán)利要求7至9中任一項所述的多肽，其是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、雙抗體、三抗體、四抗體或更高階的多肽復(fù)合物。`11.權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述多肽是SCFv并且所述Vh和所述'通過肽接頭連接在一起。12.權(quán)利要求7至11中任一項所述的多肽，其中所述Vh和/或\可變區(qū)的支架區(qū)與任一給定序列的支架區(qū)具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。13.權(quán)利要求7至12中任一項所述的多肽，其在還原性條件下可溶。14.權(quán)利要求7至13中任一項所述的多肽，當在還原性條件下產(chǎn)生時所述多肽可溶并且能夠穩(wěn)定地形成抗原結(jié)合位點。15.權(quán)利要求7至14中任一項所述的多肽，其與化合物綴合。16.權(quán)利要求15所述的多肽，其中所述化合物選自:放射性同位素、可檢測的標簽、治療性化合物、膠體、毒素、核酸、肽、蛋白質(zhì)、提高所述多肽在對象中之半衰期的化合物、及其混合物。17.分離的和/或外源的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽或其重鏈或輕鏈可變區(qū)。18.載體,其包含權(quán)利要求17所述的多核苷酸。19.宿主細胞,其包含權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽、權(quán)利要求17所述的多核苷酸或權(quán)利要求18所述的載體。20.篩選與靶分子相結(jié)合之多肽的方法，所述方法包括將權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽或權(quán)利要求1、2、4和5中任一項所述的文庫與靶分子相接觸，以及確定權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽是否與所述靶分子相結(jié)合。21.權(quán)利要求20所述的方法，其中編碼權(quán)利要求7至16中任一項所述之多肽的多核苷酸在宿主細胞中或在無細胞表達系統(tǒng)中表達以產(chǎn)生權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述多核苷酸在宿主細胞的胞質(zhì)和/或周質(zhì)中表達。23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述宿主細胞是細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述宿主細胞是細菌細胞，并且所述方法包括:a)培養(yǎng)包含編碼權(quán)利要求7至16中任一項所述多肽之多核苷酸的細菌細胞，從而產(chǎn)生所述多肽，b)透化所述細菌細胞，其中所述多核苷酸和所述多肽保留在經(jīng)透化的細菌細胞內(nèi)，c)將所述經(jīng)透化的細菌細胞與靶分子相接觸，從而使所述靶分子擴散到所述經(jīng)透化的細菌細胞中，以及d)確定權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽是否與所述靶分子相結(jié)合。25.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述無細胞表達系統(tǒng)包括核糖體展示系統(tǒng)、mRNA展示系統(tǒng)或順式展示系統(tǒng)。26.宿主細胞文庫，其包含多種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽，其中至少一種宿主細胞包含這樣的多肽，其與文庫中另一宿主細胞中存在的多肽在Vh和/或\可變結(jié)構(gòu)域中一個或更多個CDR中存在的氨基酸序列上不同。27.組合物，其包含權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽、權(quán)利要求17所述的多核苷酸和/或權(quán)利要求18所述的載體，以及可藥用載劑。28.試劑盒，其包含權(quán)利要求7至16中任一項所述的多肽、權(quán)利要求17所述的多核苷酸和/或權(quán)利要求18所述的載體，以及能夠透化細菌細胞的試劑。29.權(quán)利要求7至16中任一項所述多肽在治療或診斷應(yīng)用中的用途?！疚臋n編號】C12N15/13GK103890246SQ201280047892【公開日】2014年6月25日申請日期:2012年8月17日優(yōu)先權(quán)日:2011年8月18日【發(fā)明者】馬修·大衛(wèi)·貝亞斯利,基思·菲利普·尼文,本·羅斯·基費爾申請人:親和生物科學(xué)公司