適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞或其祖細(xì)胞、以及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新型黑素細(xì)胞和成黑色素細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)黑素細(xì)胞和成黑色素細(xì)胞的新方法。尤其，本發(fā)明提供新型黑素細(xì)胞，其基因表達(dá)、黑色素含量及酪氨酸酶活性與傳統(tǒng)黑素細(xì)胞不同。跟進(jìn)一步，本發(fā)明提供新型成黑色素細(xì)胞，其基因表達(dá)、黑色素含量、酪氨酸酶活性及蛋白質(zhì)表達(dá)與傳統(tǒng)黑素細(xì)胞不同。此外，本發(fā)明提供通過培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的用于生產(chǎn)黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞的新方法。
【專利說明】適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞或其祖細(xì)胞、以及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞或作為其祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞或作為其祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮內(nèi)黑素細(xì)胞的數(shù)量極少，是角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量的十分之一。根據(jù)傳統(tǒng)的分離方法，黑素細(xì)胞可通過以下方法進(jìn)行分離:通過在皮膚組織上處理分散酶而獲得的表皮層上進(jìn)一步處理酶如胰蛋白酶來獲取獨(dú)立細(xì)胞，然后向所述細(xì)胞提供含有特異性生長(zhǎng)因子或趨化因子的培養(yǎng)基而只讓黑素細(xì)胞存活下來?？紤]到所述黑素細(xì)胞僅存在極少且除了培養(yǎng)基外無他特定的分離方法，直接從活體內(nèi)分離黑素細(xì)胞是毫無效率可言的。因此，與角質(zhì)形成細(xì)胞相比商用黑素細(xì)胞的價(jià)格會(huì)相對(duì)較貴。
[0003]另一方面，從活體中分離出的黑素細(xì)胞具有有限的均勻性和增殖能力。進(jìn)一步，有報(bào)告稱，當(dāng)在體外使用剛從所述表皮層中分離出的黑素細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞對(duì)UVB等的刺激毫無反應(yīng)，又或與黑色素合成相關(guān)的基因的表達(dá)會(huì)有下降。為了解決上述問題，使用的方法有，如對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的共同培養(yǎng)處理UVB、或?qū)为?dú)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞處理UVB之后提供該培養(yǎng)基給黑素細(xì)胞。
[0004]有必要研發(fā)用于分離黑素細(xì)胞的方法:該方法能夠克服上述用傳統(tǒng)方法分離出來的黑素細(xì)胞所具有的缺點(diǎn)， 從而使其具有良好的均勻性及增殖能力，而且由于所述兩種細(xì)胞的體外特征與其在體內(nèi)時(shí)的特征相似而無需通過共同培養(yǎng)來研究黑素細(xì)胞的功能。
[0005]另一方面，已知黑素細(xì)胞是最終由源自發(fā)育期中的神經(jīng)嵴的黑素干細(xì)胞和作為祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞分化而成。成黑色素細(xì)胞比黑素細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和分化能力，并且具有作為發(fā)育過程中一個(gè)特征，即細(xì)胞遷移(migrat1n)。
[0006]已在小鼠體內(nèi)做了很多從神經(jīng)嵴干細(xì)胞-成黑色素細(xì)胞發(fā)育并分化到黑素細(xì)胞及與上述過程相關(guān)的基因功能的研究，然而經(jīng)通過使用一些分化初期標(biāo)記來分離成黑色素細(xì)胞的試驗(yàn)的結(jié)果，產(chǎn)率少于5%。而且，由于小鼠表皮結(jié)構(gòu)與人不同，而且不存在能夠劃分每個(gè)分化階段的特異性標(biāo)記，因此幾乎沒有關(guān)于識(shí)別在人成體表皮中成黑色素細(xì)胞的存在與否或從皮膚組織中直接分離成黑色素細(xì)胞并培養(yǎng)的方法的報(bào)告。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]技術(shù)問題
本發(fā)明涉及提供一種黑素細(xì)胞，該黑素細(xì)胞由于其良好的均勻性、植入能力及生存能力而具有優(yōu)秀的增殖能力。
[0008]本發(fā)明還涉及提供具有黑色素形成能力的黑素細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明還涉及一種黑素細(xì)胞，該黑素細(xì)胞無需向角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的共同培養(yǎng)中處理UVB或向角質(zhì)形成細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)基處理UVB后將該培養(yǎng)基提供給黑素細(xì)胞等措施而可對(duì)該黑素細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)研究。
[0010]本發(fā)明還涉及提供一種黑素細(xì)胞，該黑素細(xì)胞在與角質(zhì)形成細(xì)胞保持關(guān)系的狀態(tài)下能夠在體外適應(yīng)所述角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明還涉及提供分離的人黑素細(xì)胞及其生產(chǎn)方法。
[0012]本發(fā)明還涉及提供適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的人黑素細(xì)胞及其生產(chǎn)方法。
[0013]技術(shù)方案
在一方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞或作為其祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞的方法，該方法包括:(a)在培養(yǎng)皿的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞；(b)從所述培養(yǎng)基中去除所述角質(zhì)形成細(xì)胞；及((3)從去除所述角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)收集那些附著于所述培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞，并在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基或成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明一方面的方法可以為用于生產(chǎn)黑素細(xì)胞的方法，而且所述黑素細(xì)胞培養(yǎng)基可以為添加有補(bǔ)充物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含必要及非必要氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)，而所述補(bǔ)充物包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)。所述補(bǔ)充物可進(jìn)一步包含二甲基亞諷(DMSO )。
[0015]本發(fā)明一方面 的方法可以為用于生產(chǎn)成黑色素細(xì)胞的方法，而且所述成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基可以為添加有補(bǔ)充物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含必要及非必要氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)，而所述補(bǔ)充物包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和內(nèi)皮素-1。
[0016]本發(fā)明一方面的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞可以為具有選自以下特征中至少一個(gè)特征的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞:(i)作為神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記的P75NTR的表達(dá)水平要比原發(fā)性黑素細(xì)胞低；(ii)在成黑色素細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的BRN2的表達(dá)水平要比原發(fā)性黑素細(xì)胞高；(iii)黑色素含量比原發(fā)性黑素細(xì)胞要高；(iv)酪氨酸酶活性比原發(fā)性黑素細(xì)胞要高；(V)在無12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，p75NTR的表達(dá)水平的增長(zhǎng)量比原發(fā)性黑素細(xì)胞要高；(vi)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，BRN2的表達(dá)水平的增長(zhǎng)量比原發(fā)性黑素細(xì)胞要低；(vii)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平的相對(duì)比率等于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平的比率的約60~160% ； (viii)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的相對(duì)比率等于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的比率的約I~10倍；及(ix)進(jìn)行2小時(shí)次代培養(yǎng)后，附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率要比原發(fā)性黑素細(xì)胞高。[0017]本發(fā)明一方面的成黑色素細(xì)胞可以為適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，選自MITF、DCT、TYRPl、SNAI2, C-KIT和EDNRB中的至少一種成黑色素細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平高于原發(fā)性黑素細(xì)胞。
[0018]有益效果
從一方面，本發(fā)明可提供因具有優(yōu)異的均勻性、植入能力及生存能力而具有優(yōu)秀的增殖能力的黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞。
[0019]從一方面，本發(fā)明可提供具有黑色素形成能力的黑素細(xì)胞。
[0020]從一方面，本發(fā)明可提供一種黑素細(xì)胞，其能夠被單獨(dú)做研究，而且不用進(jìn)行如對(duì)共同培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞上處理UVB或?qū)为?dú)培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞上處理UVB后將所述培養(yǎng)基提供給黑素細(xì)胞的措施。
[0021]從一方面，本發(fā)明可提供能夠維持與角質(zhì)形成細(xì)胞的關(guān)系的同時(shí)適應(yīng)體外的黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞。
[0022]從一方面，本發(fā)明可確保在體外研究黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞的可行性。
[0023]從本發(fā)明的一方面，通過研究黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞的生存、繁殖、分化和再生可發(fā)現(xiàn)皮膚色素沉著如痣、雀斑和老年斑，色素缺乏如白癜風(fēng)(白斑和白化病)或灰發(fā)癥，或癌如黑素瘤。 [0024]從一方面，本發(fā)明可促進(jìn)用于減少黃褐斑和雀斑及抑制黑色素色素沉著的形成的美白化妝品和藥品的發(fā)展。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]結(jié)合所附的附圖，從下面詳細(xì)說明中能更為容易理解上述及其他方面的內(nèi)容、本發(fā)明的示例性實(shí)施例特征和優(yōu)點(diǎn):
圖1為展示了剛分離培養(yǎng)細(xì)胞層后在培養(yǎng)皿底部上所剩的細(xì)胞(A)、生長(zhǎng)于黑素細(xì)胞培養(yǎng)基上的培養(yǎng)皿底部上所剩的細(xì)胞(B)、以及將(B)細(xì)胞進(jìn)行次代培養(yǎng)后高密度生長(zhǎng)的黑素細(xì)胞(C)的照片；
圖2和圖3為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，如從角質(zhì)形成細(xì)胞中分離出來的黑素細(xì)胞(適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，KaMC)的特異性基因(A、B)和角質(zhì)形成細(xì)胞的特異性基因(C)的表達(dá)模式與角質(zhì)形成細(xì)胞做對(duì)比的圖表；
圖4為對(duì)比原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC)和KaMC的基因表達(dá)模式的圖表；
圖5為對(duì)比PMC與KaMC的團(tuán)塊顏色的照片㈧及對(duì)比其酪氨酸酶活性的圖表(B)；
圖6為根據(jù)PMA的有無分別展示了 PMC和KaMC的表達(dá)差異的圖表(A、B)；
圖7為根據(jù)PMA的有無展示了 PMC和KaMC中p75NTR和BRN2的表達(dá)差異的圖表及展示了團(tuán)塊顏色變化的照片(E)；
圖8為對(duì)比PMC和KaMC的初期植入能力的照片(A)及對(duì)比其細(xì)胞增殖能力的圖表(B);圖9為展示了剛分離培養(yǎng)細(xì)胞層后在培養(yǎng)皿底部上所剩的細(xì)胞(A)、生長(zhǎng)于PMA-黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)皿底部上所剩的細(xì)胞(B)、以及將(B)細(xì)胞進(jìn)行次代培養(yǎng)后在PMA+黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的黑素細(xì)胞(C)的照片(比例尺，250 μ m)；
圖10為根據(jù)PMA的有無對(duì)比每個(gè)細(xì)胞中各基因的表達(dá)水平的圖表；
圖11為對(duì)比培養(yǎng)于PMA-培養(yǎng)基內(nèi)的KaMB和培養(yǎng)于PMA+培養(yǎng)基內(nèi)的KaMC的團(tuán)塊顏色的照片(A)、比較上述細(xì)胞的酪氨酸酶活性的圖表(B)、對(duì)比上述細(xì)胞的細(xì)胞遷移率的照片(C)及對(duì)比在上述細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的照片(D)；
圖12為在PMA-培養(yǎng)基或PMA+培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞的照片(A)、展示了隨著時(shí)間的每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量的圖表(B)及對(duì)比通過BrdU標(biāo)記的每個(gè)細(xì)胞的增值能力的圖表(C)(比例尺，250 μ m) '及
圖13為在PM-培養(yǎng)基或PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)長(zhǎng)時(shí)間后的各細(xì)胞狀態(tài)的照片(比例尺，250 μm)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面將具體說明本發(fā)明。
[0027]在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC)”是指從活體中直接分離出來的黑素細(xì)胞。
[0028]在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞(KaMB)”是指在體外通過培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞來獲得的成黑色素細(xì)胞。
[0029]在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞(KaMC)”是指在體外通過培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞來獲得的黑素細(xì)胞，其具有原發(fā)性黑素細(xì)胞的基本特征，同時(shí)具有至少一種不同特征。
[0030]這里所用的術(shù)語(yǔ)“角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基，其可以為本領(lǐng)域中所 知的任一種培養(yǎng)基。例如，所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基可以為含有牛垂體提取物(ΒΡΕ)、人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、牛胰島素、氫化可的松及慶大霉素和兩性霉素-B (GA-1000)的培養(yǎng)基。進(jìn)一步，除了上述成分外，其還可以為進(jìn)一步含有腎上腺素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的培養(yǎng)基。所述能夠在市面上可獲得的培養(yǎng)基的例子有KGM?(Cat.N0.CC-3001 ；Lonza), KGM ? BulletKit ? (Cat.N0.CC-3111 ；Lonza)、KGM ? 2 BulletKit ? (Cat.N0.CC-3107 ；Lonza)和 KGM-Gold ? BulletKit ? (Cat.N0.192060 ;Lonza)。
[0031]這里所用的“黑素細(xì)胞培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)黑素細(xì)胞的培養(yǎng)基，其可以為本領(lǐng)域中所知的任一種培養(yǎng)基。例如，其可以為黑色素形成培養(yǎng)基，其中含有必要及非必要氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述黑素細(xì)胞培養(yǎng)基可以為添加有含對(duì)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子、激素及組織提取物的補(bǔ)充物的培養(yǎng)基，以接種人黑素細(xì)胞并使之長(zhǎng)時(shí)間增殖。例如，所述補(bǔ)充物可包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素，氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)。所述補(bǔ)充物可進(jìn)一步包含二甲基亞砜(DMSO)。
[0032]所述補(bǔ)充物的例子可以為人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(HMGS，cat.# S-002-5, CascadeB1logies)。市面上可見的添加有HMGS的用于黑素細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子有M254培養(yǎng)基(Cascade B1logies)。
[0033]這里所用的“成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)成黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)基，其可以為本領(lǐng)域中所知的任一種培養(yǎng)基。例如，其可以為成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基，其中包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基可以為添加有含對(duì)成黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子、激素及組織提取物的補(bǔ)充物的培養(yǎng)基，以覆蓋人成黑色素細(xì)胞并使之增殖長(zhǎng)時(shí)間。例如，所述補(bǔ)充物可包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素，氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和內(nèi)皮素-1。
[0034]所述補(bǔ)充物可以為無PMA人成黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物-2 (PMA-Free HMGS_2，cat.# S-016-5, Cascade B1logies)。市面上可見的添加有HMGS-2的用于成黑色素細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子可以為M254培養(yǎng)基(Cascade B1logies)。
[0035]這里所用的術(shù)語(yǔ)“含PMA培養(yǎng)基”是指包含12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)的培養(yǎng)基，其能夠幫助往黑素細(xì)胞的分化。
[0036]這里所用的術(shù)語(yǔ)“鈣培養(yǎng)基”是指加入鈣的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基。例如，其可以為加入濃度約為1.0~1.6 mM或1.2~1.4 mM的CaCl2到角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的鈣培養(yǎng)基。
[0037]這里所用的術(shù)語(yǔ)“無12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)人成黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中不含PMA，但包含內(nèi)皮素-1。市面上可見的培養(yǎng)基的例子有添加有無 PMA HMGS-2 (Cascade B1logies, Cat.N0.: S_016_5)的 M254 培養(yǎng)基。
[0038]這里所用的術(shù)語(yǔ)“p75NTR”是指作為神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記的低親和性神經(jīng)素營(yíng)養(yǎng)因子受體，其保藏編號(hào)為 ACCESS1N N0.NM_002507、VERS1N: ΝΜ_002507.3、G1: 295842401。
[0039]這里所用的術(shù)語(yǔ) “BRN2”是指在成黑色素細(xì)胞中表達(dá)的智人POU 3級(jí)同源框2(P0U3F2)的 mRNA。其保藏編號(hào)為 ACCESS1N N0.NM_005604, VERS1N: ΝΜ_005604.2、G1:51702520。
[0040]這里所用的術(shù)語(yǔ)“EDNRB”是指人內(nèi)皮素受體B型(ΝΜ_001122659.2)基因，其位于Chr.13: 78469616 - 78492966。
[0041]這里所用的術(shù)語(yǔ)“C-KIT”是指人v-kit Hardy-Zuckerman 4貓科肉瘤病毒致癌基因同源物(NM_001093772.1)基因，其位于 Chr.4:55524095 - 55606881。
[0042]這里所用的術(shù)語(yǔ)“SNAI2”是指人蝸牛同源物2 (ΝΜ_003068.4)，其位于Chr.8:49830236 - 49833988。
[0043]這里所用的術(shù)語(yǔ)“MITF”是指人眼球關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子(ΝΜ_198158.2)，其位于Chr.3:69788586 - 70017488。
[0044]這里所用的術(shù)語(yǔ)“DCT”是指人多巴色素異構(gòu)酶，其位于Chr.13: 95091835 -95131936。
[0045]這里所用的術(shù)語(yǔ)“TYRP1”是指人酪氨酸酶相關(guān)蛋白I (ΝΜ_000550.2)，其位于Chr.9: 12693386 - 12710266。
[0046]這里所用的術(shù)語(yǔ)“ 12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(ΡΜΑ)”是指能夠誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化的物質(zhì)。
[0047]黑素細(xì)胞為一種能夠生產(chǎn)保護(hù)性黑色素的細(xì)胞，其具有形態(tài)上的樹突并與基底細(xì)胞以約1:4~1:10比例存在于表皮基底層中。每個(gè)黑素細(xì)胞會(huì)通過樹突與構(gòu)成基底層或棘層的36個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞(色素沉著單元)接觸。黑色素具有從UV保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核的功能。因此，我們所知道的是具有少量黑色素的人容易得皮膚癌。人種間沒有黑素細(xì)胞數(shù)量的差異，然而人種間會(huì)存在黑素體的數(shù)量和大小、黑化程度、黑素體的分布和在角質(zhì)形成細(xì)胞中因降解而積累下的黑色素量的差異。因此，皮膚顏色由這些因素而決定。已知，對(duì)黑色素合成重要的酪氨酸酶的數(shù)量和黑素細(xì)胞的數(shù)量會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降。黑素細(xì)胞是在發(fā)育過程中來源于神經(jīng)嵴的細(xì)胞，而且從黑素細(xì)胞干細(xì)胞和作為其祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞分化而成能夠合成并釋放黑色素的黑素細(xì)胞。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，用于生產(chǎn)適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞或作為其祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞的方法，其包括:(a)在培養(yǎng)皿中的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞；(b)從所述培養(yǎng)基中除去所述角質(zhì)形成細(xì)胞?’及Ce)收集來自所述培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基中的角質(zhì)形成細(xì)胞已被除去)的、附著在所述培養(yǎng)皿底部上的細(xì)胞，然后在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基或成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所收集的細(xì)胞。
[0049]步驟(a)的角質(zhì)形成細(xì)胞可以為人角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0050]所述人角質(zhì)形成細(xì)胞可以為源自人體的任一種角質(zhì)形成細(xì)胞。除了從人體中直接分離出來或分離后進(jìn)行培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞之外，還可以使用源自其他細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞。從市面上可見的人角質(zhì)形成細(xì)胞的例子可以為由Lonza提供的NHEK-Neo混合(新生兒正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，混合:Cat.N0.00192906，組織采集編號(hào):P867，白種人)、NHEK- Neo (Cat.N0.00192907，組織采集編號(hào):20647，白種人)、NHEK-Adult (Cat.N0.00192627、組織采集編號(hào):21155，白種人)、NHEK-Neo (Cat.N0.00192907，組織采集編號(hào):18080，黑種人)。為了維持角質(zhì)形成細(xì)胞附著于基底膜上進(jìn)行增殖的特征，優(yōu)選地可用約0.1~0.2%明膠或約I~10Pg/ml膠原蛋白I型涂敷培養(yǎng)皿。所述細(xì)胞可培養(yǎng)在約35~37°C、5~10%C02的孵化器內(nèi)，等到達(dá)約70~80%密度時(shí)進(jìn)行次代培養(yǎng)。
[0051]所述步驟(b)可包括:(i)在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入鈣，形成鈣培養(yǎng)基，將被培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞在所述鈣培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；(ii)去除鈣培養(yǎng)基，清洗所述細(xì)胞，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基更換所述培養(yǎng)基并再次代培養(yǎng)所述細(xì)胞；(iii)去除所述培養(yǎng)基，清洗所述細(xì)胞，然后孵化所 述細(xì)胞；及(iv)通過向孵化細(xì)胞中加入緩沖液或角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基來分離出片狀角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0052]步驟(a)中，當(dāng)在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)果使培養(yǎng)皿上所培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到約80~100%融合率時(shí)，會(huì)從步驟(a)移到步驟(b)。優(yōu)選地，此時(shí)間點(diǎn)為當(dāng)培養(yǎng)所述細(xì)胞時(shí)融合率達(dá)到約90~100%。在此時(shí)間點(diǎn)通過將所述培養(yǎng)基更換為鈣培養(yǎng)基，可刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，從而誘導(dǎo)形成片狀。
[0053]步驟(b)中的(i)可以為，在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入鈣，形成鈣培養(yǎng)基，將角質(zhì)形成細(xì)胞在所述鈣培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)2~6天。所述培養(yǎng)可進(jìn)行約2~3天。培養(yǎng)以上時(shí)間可幫助所述角質(zhì)形成細(xì)胞的有效分化，如能夠幫助形成培養(yǎng)表皮細(xì)胞層。所述鈣培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)還可以在約35~37°C、約5~10%C02的孵化器內(nèi)進(jìn)行。
[0054]步驟(ii)可以為通過用緩沖液或角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基清洗在鈣培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，從而去除鈣，然后在其中再加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基。所述緩沖液不受特別限制，例如其可以為磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)和/或Hank’ s緩沖鹽溶液(HBSS，pH
7.4)。所述細(xì)胞還可以為用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基清洗幾次的細(xì)胞，而不是用緩沖液進(jìn)行清洗。所述清洗的細(xì)胞可再次在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)約3~7天。
[0055]在步驟(iii)中，當(dāng)新更換的培養(yǎng)基的顏色不再有變化時(shí)可去除所述培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可在上述約3~7天的再次代培養(yǎng)期間內(nèi)進(jìn)行去除。待去除完所述培養(yǎng)基后，用緩沖液清洗所述細(xì)胞，然后進(jìn)行孵化。用于清洗的所述緩沖液可以為，如PBS。所述孵化可通過用蓋子蓋住所清洗的細(xì)胞來進(jìn)行，然后在孵化器內(nèi)保存約5~10分鐘。通過孵化上述時(shí)間，所述角質(zhì)形成細(xì)胞可容易地被分離成受培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層。
[0056]在步驟(iv)中，在所述孵化細(xì)胞中再次加入緩沖液或角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基的過程中，所述受培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層可自動(dòng)分離成片狀。所述緩沖液可以為，例如PBS。
[0057]在步驟(C)可以為，在步驟(b)中去除所述角質(zhì)形成細(xì)胞后，收集附著于培養(yǎng)皿底部上的細(xì)胞，然后在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基或成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0058]在步驟(C)中，待去除完受培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層后，用PBS清洗所述培養(yǎng)皿幾次，然后用accutase(Millipore ; Cat.N0., SCR005)處理約3~10分鐘。通過離心分離沉淀所分離的細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移到普通的培養(yǎng)皿或用明膠，如0.1%明膠進(jìn)行涂敷的培養(yǎng)皿上。從此開始，可用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細(xì)胞。所述黑素細(xì)胞培養(yǎng)基可以為添加有補(bǔ)充物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)，其中所述補(bǔ)充物包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、二甲基亞砜、肝素、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)。例如，其可以為添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(HMGS; Cascase B1logy ；Cat.N0.: S-002-5)的 M254 (Cascade B1logies,Cat.N0.: M-254-500)培養(yǎng)基。當(dāng)所述細(xì)胞密度達(dá)到約70~90%，可對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行次代培養(yǎng)。
[0059]在步驟(C)中，待去除完受培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層后，用PBS清洗所述培養(yǎng)皿幾次，然后用accutase (Millipore ； Cat.N0., SCR005)處理約3~10分鐘。通過離心分離沉淀所分離的細(xì)胞后，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到普通的培養(yǎng)皿或用明膠，如0.1%明膠進(jìn)行涂敷的培養(yǎng)皿上。從此開始，可用成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細(xì)胞。所述成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基可以為添加有補(bǔ)充物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和 無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)，其中所述補(bǔ)充物包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和內(nèi)皮素-1。例如，其可以為添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物-2 (HMGS-2，無 PMA ；Cascase B1logy ；Cat.N0.: S-016-5)的 M254 (Cascade B1logies, Cat.N0.:M-254-500)培養(yǎng)基。當(dāng)所述細(xì)胞密度達(dá)到約70~90%，可對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行次代培養(yǎng)。
[0060]或者，在步驟(c)中，去除完受培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層后，用PBS清洗所述培養(yǎng)皿，然后在其中立即加入添加有HMGS-2的M254培養(yǎng)基并再次進(jìn)行培養(yǎng)，然后當(dāng)所述細(xì)胞密度達(dá)到約70~90%時(shí)將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，然后可對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
[0061]本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞可以為具有選自以下特征中的至少一個(gè)特征的黑素細(xì)胞:(i )作為神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記的P75NTR的表達(dá)水平要比原發(fā)性黑素細(xì)胞低；(ii)在成黑色素細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的BRN2的表達(dá)水平要比原發(fā)性黑素細(xì)胞高；(iii)黑色素含量比原發(fā)性黑素細(xì)胞要高；(iv)酪氨酸酶活性比原發(fā)性黑素細(xì)胞要高；(V)在無12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)得到提高的P75NTR的表達(dá)水平要比原發(fā)性黑素細(xì)胞高；(vi)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)得到提高的BRN2的表達(dá)水平要比原發(fā)性黑素細(xì)胞低；(vii)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平與在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平的相對(duì)比率等于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平與在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平的比率的約60~160% ； (viii )在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平與在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的相對(duì)比率等于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平與在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的比率的約I~10倍；及(^)進(jìn)行2小時(shí)的次代培養(yǎng)后附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率要比原發(fā)性黑素細(xì)胞高。
[0062](i)的p75NTR的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞低約1/10倍。進(jìn)一步，(i)的P75NTR的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞低約1/20、1/30、1/40、1/50、1/60或1/70倍。進(jìn)一步，(i)的P75NTR的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞低約1/10~1/1000倍。進(jìn)一步，(i)的P75NTR的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞低約1/20~1/500、1/30~1/280、1/40~1/190或1/50~1/140倍。由于表達(dá)水平上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0063](ii)的BRN2的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約5倍。進(jìn)一步，(ii)的BRN2的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約10或15倍。進(jìn)一步，(ii)的BRN2的表達(dá)水平可比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約5~50、10~40、15~30或16~20倍。由于在表達(dá)水平上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0064](iii)的黑色素含量比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約2倍或以上。進(jìn)一步，(iii)的黑色素含量比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約3或4倍。進(jìn)一步，(iii)的黑色素含量比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約2~10、3~5、或3~4倍。 由于在含量上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0065]在37°C下孵化約120分鐘時(shí)，(iv)的酪氨酸酶活性可比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約2倍或以上、4倍或以上或者8倍或以上。進(jìn)一步，其比原發(fā)性黑素細(xì)胞高約2~32倍、4~16倍或6~10倍。由于在活性上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0066](V)的表達(dá)水平可以為原發(fā)性黑素細(xì)胞表達(dá)水平的2倍或以上。進(jìn)一步，(V)的表達(dá)水平可以為原發(fā)性黑素表達(dá)水平的約18、3~10或4~8倍。由于在表達(dá)水平上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0067](vi)的表達(dá)水平可以為原發(fā)性黑素細(xì)胞表達(dá)水平的約9/10~1/10倍。進(jìn)一步，(vi)的表達(dá)水平可以為原發(fā)性黑素表達(dá)水平的約7/10~3/10倍。由于在表達(dá)水平上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0068]在(vii)的表達(dá)水平中，在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的p75NTR表達(dá)水平與在含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的p75NTR表達(dá)水平的相對(duì)比率可以為在含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的p75NTR表達(dá)水平與在含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的p75NTR表達(dá)水平的比率的約60~160%、80~140%或90~130%。由于在表達(dá)水平上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0069]在(vi i i )的表達(dá)水平中，在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平與在含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的相對(duì)比率等于在含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平與在含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的比率的約I~10、2~8、3~7或4~6。由于在表達(dá)水平上的這種差異，可最大化本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的使用角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的特征，如相比原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的均勻性和增殖能力并即使沒有角質(zhì)形成細(xì)胞也能夠繼續(xù)形成黑色素的能力。
[0070](ix)進(jìn)行約2小時(shí)的次代培養(yǎng)后附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率可以為約80%或以上。(ix)進(jìn)行約2小時(shí)的次代培養(yǎng)后附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率可以為約90%或以上。(ix)進(jìn)行約2小時(shí)的次代培養(yǎng)后附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率可以為約95%或以上。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞可源自角質(zhì)形成細(xì)胞。特別地，其可源自人角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0071]本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞可以為通過上述任一種方法生產(chǎn)的細(xì)胞。
[0072]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu) 選實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞將根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2011年9月14日保存到作為國(guó)際保藏單位的韓國(guó)典型菌種保藏中心(KCTC)，其保藏編號(hào)為 KCTC 12015BP。
[0073]本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的從培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中分離出來的成黑色素細(xì)胞可以為適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，選自MITF、DCT、TYRPl、SNAI2、C-KIT和EDNRB中至少一種成黑色素細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平高于原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞。
[0074]在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述成黑色素細(xì)胞的特征在于，選自MITF和DCT中的至少一種成黑色素細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平比原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞高約2倍或以上、3倍或以上、4倍或以上或5倍或以上。這種高表達(dá)水平可以是區(qū)分本說明中所描述的成黑色素細(xì)胞與原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞(KaMC)的區(qū)別特征。
[0075]進(jìn)一步，在一個(gè)實(shí)施例中，所述成黑色素細(xì)胞可以為具有選自相比所述適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞高的BRN2蛋白表達(dá)水平和低的TYR蛋白表達(dá)水平中至少一種特征的細(xì)胞。
[0076]在另一實(shí)施例中，所述成黑色素細(xì)胞可以為當(dāng)在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)約9天時(shí)的細(xì)胞數(shù)量比原始細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)約20倍或以上、25倍或以上、30倍或以上或者35倍或以上的細(xì)胞。這種高細(xì)胞增殖率可以是區(qū)分本說明中所描述的成黑色素細(xì)胞與原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞（KaMC)的區(qū)別特征。
[0077]進(jìn)一步，在另一實(shí)施例中，所述成黑色素細(xì)胞可以為即使在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基 內(nèi)進(jìn)行次代培養(yǎng)約6次或以上、7次或以上、8次或以上或者9次或以上也能繼續(xù)生長(zhǎng)的細(xì) 胞。這種能夠維持長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞增殖能力的特征可以是區(qū)分本說明中所描述的成黑色素細(xì) 胞與原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞（KaMC)的區(qū)別特征。
[0078]本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞可源自角質(zhì)形成細(xì)胞。 特別地，其可源自人角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0079]本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞可以為通過上述任 一種方法生產(chǎn)的細(xì)胞。
[0080]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞將根據(jù)布達(dá)佩 斯條約在2012年7月24日保存到作為國(guó)際保藏單位的韓國(guó)典型菌種保藏中心（KCTC)，其 保藏編號(hào)為KCTC 12250BP。
[0081]現(xiàn)在將詳細(xì)說明實(shí)施例(和實(shí)驗(yàn))。以下實(shí)施例(和實(shí)驗(yàn)）僅用于說明經(jīng)為目的，不 會(huì)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0082]1.適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的生產(chǎn) (a)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的步驟
作為人角質(zhì)形成細(xì)胞(正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞)，使用由Lonza提供的NHEK-Neo混合 (新生兒正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，混合：Cat. No. 00192906)。作為用來培養(yǎng)所述人角質(zhì) 形成細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，使用KGM-Gold?BulletKitTM(Cat. No. 192060 ;Lonza)。 為了維持角質(zhì)形成細(xì)胞的附著于基底膜上并進(jìn)行增殖的特征，使用用10 Ug/ml膠原蛋白 I型涂敷的培養(yǎng)皿。在37°C、5% C02的孵化器內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)胞，當(dāng)所述細(xì)胞密度達(dá)到約70% 時(shí)進(jìn)行次代培養(yǎng)。為了誘導(dǎo)所述角質(zhì)形成干細(xì)胞形成受培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層，使用KGM-2 BulletKit (Cat. No. CC-3107 ;Lonza)及 0. 1% 明膠涂層。
[0083](b)去除角質(zhì)形成細(xì)胞的步驟
為了從所述培養(yǎng)皿以片狀培養(yǎng)表皮細(xì)胞層去除所述角質(zhì)形成細(xì)胞，使用在角質(zhì)形成細(xì) 胞培養(yǎng)基內(nèi)最終加入高濃度鈣如1. 2 mM CaCl2的鈣培養(yǎng)基。在所述富含鈣的培養(yǎng)基內(nèi)的培 養(yǎng)還能在相同的37°C、5% C02的孵化器進(jìn)行。當(dāng)所述角質(zhì)形成細(xì)胞被培養(yǎng)至所述細(xì)胞能夠 覆蓋所述培養(yǎng)皿底部時(shí)(約90%融合率)，用富含鈣培養(yǎng)基更換所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，然 后培養(yǎng)3天。用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7. 4)清洗所述所培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞3次以去除高 濃度鈣，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基更換所述培養(yǎng)基，然后將所述細(xì)胞再次代培養(yǎng)4天。在此期 間，當(dāng)新更換的培養(yǎng)基的顏色不再有變化時(shí)去除所述培養(yǎng)基，用PBS清洗所述細(xì)胞2次，合 起蓋子，然后在所述孵化器內(nèi)保存5分鐘。在重新加入PBS的過程中，所培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層 自動(dòng)分離出來。剛?cè)コ晁囵B(yǎng)的表皮細(xì)胞層后，在所述培養(yǎng)皿底部仍剩有細(xì)胞。
[0084]用顯微鏡觀察所述留有的細(xì)胞，其照片請(qǐng)見圖1 (A)。如圖1 (A)所示，與角質(zhì)形 成細(xì)胞不同，所述細(xì)胞具有較長(zhǎng)形狀。
[0085](c)從去除角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)物中收集附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)的去除所培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層后，用PBS清洗所述培養(yǎng)皿2次，然后用accutase(Millipore ；Cat.N0.，SCR005)處理5分鐘。通過離心分離使所分離的細(xì)胞沉淀，然后將其轉(zhuǎn)移到用0.1%明膠涂敷的培養(yǎng)皿上。從此開始，使用添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(HMGS ；Cascase B1logy ；Cat.N0.: S-002-5)的M254 (Cascade B1logies,Cat.N0.: M-254-500)培養(yǎng)基。結(jié)果，用顯微鏡觀察所培養(yǎng)細(xì)胞，其照片請(qǐng)見圖1 (B)。如圖1 (B)所示，所述細(xì)胞具有雙極形狀。
[0086]當(dāng)所述細(xì)胞密度達(dá)到約80%，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行次代培養(yǎng)。用顯微鏡觀察所次代培養(yǎng)的細(xì)胞，其照片請(qǐng)見圖1 (C)。如圖1 (C)所示，從角質(zhì)形成細(xì)胞分離出來的黑素細(xì)胞可進(jìn)行次代培養(yǎng)，而且具有良好的增殖能力。
[0087]2.從角質(zhì)形成細(xì)胞生產(chǎn)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞(KaMC)的特征說明 作為與所述KaMC作對(duì)比的原發(fā)性黑素細(xì)胞，使用由Lonza提供的NHEM-Neo (新生兒正
常人黑素細(xì)胞，Cat.N0.cc-2504)。
[0088]( I) qPCR 分析
用PBS分別清洗所分離的KaMC ；由Lonza提供的角質(zhì)形成細(xì)胞(正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞)(KC)NHEK-Neo混合(新生兒正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，混合:Cat.N0.00192906)；和原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC),而后通過使用試劑盒(miRNeasy mini kit, Qiagen, Cat.N0.217004)從中分離出總RNA。然后通過使用RT-PCR試劑盒(SuperScript III First-StrandSynthesis System for RT-PCR, Invitrogen, Cat.N0.18080-051)合成 cDNA。通過使用與基因特異性結(jié)合的引物 (TaqMan? Gene Express1n Assays, Applied B1systems)和 SYBR(TaqMan? Universal PCR Master Mix, Applied B1systems; Cat.N0., 4304437)以所合成的cDNA為模板來測(cè)量作為所述黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記的S0X10、PAX3、MITF, TYR、TYRPl、DCT、PMEL和NESTIN的mRNA表達(dá)變化。
[0089]其結(jié)果在圖2中展示。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)所述KaMC與所述角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)相比表達(dá)更多的黑水細(xì)胞特異性基因。
[0090]另一方面，測(cè)定作為所述黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記的S0X10的mRNA表達(dá)變化。其結(jié)果在圖3 (B)中展示。如圖3 (B)所示，發(fā)現(xiàn)所述KaMC與所述角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)相比表達(dá)更多的作為黑素細(xì)胞特異性基因的S0X10，是后者的9百萬倍。
[0091]另一方面，測(cè)量作為角質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)記的ITGA6、TP63和keratinl4 (KRT14)的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所述KaMC的表達(dá)與所述角質(zhì)形成細(xì)胞(KC) (FIG.3 (C))相比就有顯著的減少。
[0092]進(jìn)一步，當(dāng)與所述原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC)相比，發(fā)現(xiàn)所有的黑素細(xì)胞特異性基因的表達(dá)水平?jīng)]有差別(圖4 (A))，然而作為神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記的p75NTR在所述PMC中出現(xiàn)過度表達(dá)(圖4 (B))，而且以在成黑色素細(xì)胞中表達(dá)而所知的BRN2在KaMC中的表達(dá)相對(duì)會(huì)多。
[0093](2)酪氨酸酶活性分析
去除所述培養(yǎng)基后，用PBS清洗所述細(xì)胞2次，然后在其中加入裂解液(Sigma)以收集所述細(xì)胞。在4°C下?lián)u晃I小時(shí)的過程中提取所述細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，然后通過離心分離(1300 rpm,，15分鐘)使細(xì)胞團(tuán)塊與提取物相互分離。
[0094]圖5 (A)為分離黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的PMC和KaMC后拍攝的團(tuán)塊照片。如圖5 (A)所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞(KaMC)比所述原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC)包含更多的黑色素。所述兩者細(xì)胞都來源于白種人。因此，黑色素含量的差異顯著。
[0095]另一方面，將所分離的提取物移至新的E-tube，然后用BCA(二喹啉甲酸)(Pierce，Cat.N0.:23227)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。在96孔板內(nèi)的40 μ g蛋白質(zhì)中加入裂解液至最終容量變?yōu)?00 μ 1，然后在其中加入100 μ I L-多巴(Sigma，Cat.N0.D-9628，0.1 M磷酸緩沖液中含2 mg/ml，過濾)，并在37°C下反應(yīng)各種時(shí)間段(15、30、60、120分鐘)。在各反應(yīng)時(shí)間段之后，通過使用微孔板檢測(cè)儀測(cè)量490 nm處的吸光度。
[0096]其結(jié)果在圖5 (B)中展示。如圖5 (B)所示，隨著孵化時(shí)間的增加，所述KaMC的酪氨酸酶活性也慢慢增加，待孵化120分鐘后，所述KaMC的酪氨酸酶活性比所述PMC高出約8倍。
[0097](3)對(duì)PMA反應(yīng)性的分析
為了確認(rèn)能夠誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化的PM的效果，使用用來進(jìn)行次代培養(yǎng)的添加有無PMA HMGS-2 (Cascade B1logies, Cat.N0.: S-016-5)的 M-254 培養(yǎng)基(PMA-)。其結(jié)果與從在添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(HMGS ；Cascase B1logy ；Cat.N0.: S-002-5)的M254(Cascade B1logies, Cat.N0.: M-254-500)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞中所得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比(PMA+)。其結(jié)果在圖6和圖7中展示。
[0098]當(dāng)加入以能夠去分化所分化的黑素細(xì)胞而聞名的、含內(nèi)皮素的PMA-培養(yǎng)基時(shí)，所述PMC和所述KaMC內(nèi)的黑素細(xì)胞特異性基因的表達(dá)水平間沒多少差異(圖6 (A和B))，然而在PMA-培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，所述KaMC內(nèi)的p75NTR的表達(dá)水平和所述PMC內(nèi)的BRN2的表達(dá)水平與在所述PMA+ 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果相比有大幅提高(圖7 (C和D))。特別地，在所述PMA-培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的KaMC內(nèi)的p75NTR的表達(dá)水平對(duì)于在所述PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的KaMC內(nèi)的p75NTR的表達(dá)水平的比率增長(zhǎng)至與在所述PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的PMC內(nèi)的p75NTR的表達(dá)水平對(duì)于KaMC內(nèi)的p75NTR的表達(dá)水平的比率(圖4 (B))相似的水平(圖
7(O)0進(jìn)一步，在所述PMA-培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的PMC內(nèi)的BRN2的表達(dá)水平對(duì)于在所述PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的PMC內(nèi)的BRN2的表達(dá)水平的比率增長(zhǎng)至與在所述PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的KaMC內(nèi)的BRN2的表達(dá)水平對(duì)于PMC內(nèi)的BRN2的表達(dá)水平的比率(圖4 (C))相似的水平(圖 7 (D))。
[0099]此外，在所述PMA-培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述KaMC團(tuán)塊的顏色也在變淺(圖7(E))。這指明，所述KaMC比PMC能夠形成更多的黑色素，而這種黑色素的形成可根據(jù)所述能夠誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化的PMA存在與否來受到控制的。
[0100]簡(jiǎn)言之，期待通過控制P75NTR和BRN2的表達(dá)來誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的分化和去分化，并且通過這種方法還可控制黑色素的形成。
[0101](4)初始植入能力和生存能力、及細(xì)胞增殖能力的對(duì)比
為了在次代培養(yǎng)初期確認(rèn)植入能力和生存能力，在相同條件下進(jìn)行2小時(shí)次代培養(yǎng)后觀察所述細(xì)胞的狀態(tài)。優(yōu)選地，將所述KaMC和PMC轉(zhuǎn)移至涂敷0.1%明膠的培養(yǎng)皿上，然后37°C下在添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(HMGS; Cascase B1logy ；Cat.N0.: S-002-5)的M254 (Cascade B1logies, Cat.N0.: M-254-500)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行2小時(shí)培養(yǎng)。其結(jié)果在圖
8(A)中展示。如圖8 (A)所示，發(fā)現(xiàn)對(duì)于所述KaMC而言，在2個(gè)小時(shí)內(nèi)95%或以上的細(xì)胞附著于培養(yǎng)皿底部上，進(jìn)行形成延伸的樹突形狀，然而對(duì)于所述PMC而言，所述細(xì)胞附著不好，在相同時(shí)段內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞在漂浮。在圖8 (A)中，箭頭指向的是漂浮的細(xì)胞。
[0102]另一方面，為了確認(rèn)植入能力、生存能力及細(xì)胞增殖能力，使用通過利用BrdU(Roche, Cat.N0.: 11647229001)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。通過利用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所述PMC與KaMC的平板接種細(xì)胞數(shù)(3 X 14)相同。盡管如此，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行平板接種后第一天的BrdU作標(biāo)記的PMC的數(shù)量比所述KaMC變得更低(圖
8(B))。在倍增時(shí)間上無多少差異。因此，如圖1 (C)所示的KaMC的良好的增殖能力能夠表明在次代培養(yǎng)過程中具有優(yōu)異的植入能力和存活能力且正在增殖及有能力增殖的細(xì)胞有很多。
[0103]3.適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞(KaMB)的生產(chǎn) (a)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的步驟
用與I (a)中描述的相同方法來培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0104](b)去除角質(zhì)形成細(xì)胞的步驟
用與I (a)中描述的相同方法分離出片狀角質(zhì)形成細(xì)胞。結(jié)果，在培養(yǎng)皿底部仍剩有一些細(xì)胞。
[0105]用顯微鏡觀察所剩細(xì)胞，其照片在圖9 (A)中展示。如圖9 (A)所示，與所述角質(zhì)形成細(xì)胞不同，所述細(xì)胞具有較長(zhǎng)形狀。 [0106](C)從去除角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)物中收集附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)的步驟
去除所培養(yǎng)的表皮細(xì)胞層后，用PBS清洗所述培養(yǎng)皿2次，然后用accutase(Millipore ；Cat.N0., SCR005)處理5分鐘。通過離心分離使所分離的細(xì)胞沉淀，然后將其移至新的培養(yǎng)皿上。從此開始，使用添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物-2 (HMGS-2，無PMA ;Cascase B1logy ；Cat.N0.: S-016-5)的M254 (Cascade B1logies,Cat.N0.: M-254-500)培養(yǎng)基。結(jié)果，用顯微鏡觀察所培養(yǎng)的細(xì)胞，其照片請(qǐng)見圖9 (B)。當(dāng)所述細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行次代培養(yǎng)。在添加有用于誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化的代表性物質(zhì)PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(M254/HMGS)內(nèi)培養(yǎng)圖9 (B)的細(xì)胞時(shí)，其示出雙極形狀(圖9 (C))。
[0107]4.通過培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞生產(chǎn)適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞(KaMB)的特征說明
用于與所述KaMB作對(duì)比的原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC)可使用由Lonza提供的NHEM-Neo(新生兒正常人黑素細(xì)胞，Cat.N0.cc-2504)。進(jìn)一步，還制備與所述KaMB作對(duì)比的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞(KaMC)。除了在添加有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(HMGS ；CascaseB1logy ；Cat.N0.: S-002-5)的 M254 (Cascade B1logies, Cat.N0.: M-254-500)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)在步驟(C)中所分離的細(xì)胞之外，用與所述KaMB相同的方法獲得KaMC。進(jìn)一步，分別在PMA+培養(yǎng)基和PM-培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0108](l)qPCR 分析
用PBS分別清洗所分離的KaMB、KaMC和原發(fā)性黑素細(xì)胞(PMC)，而后通過使用試劑盒(miRNeasy mini kit, Qiagen, Cat.N0.217004)從中分離出總 RNA。然后通過使用 RT-PCR試劑盒(Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen, Cat.N0.18080-051)合成cDNA。通過使用與基因特異性結(jié)合的引物(TaqMan? Gene Express1nAssays, Applied B1systems)和 SYBR (TaqMan? Universal PCR Master Mix, AppliedB1systems; Cat.N0., 4304437)以所合成的cDNA為模板來測(cè)量作為所述成黑色素細(xì)胞/黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記的 NOTCHl、S0X10、PAX3、EDNRB, c_KIT、SNAI2, MITF, DCT、TYRPl、TYR 和PMEL的mRNA表達(dá)的變化。
[0109]其結(jié)果在圖10中展示。如圖10所示，發(fā)現(xiàn)作為所述KaMB的RT-qPCR結(jié)果，其比在所述PMA-或PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的PMC及在所述PMA+培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的KaMC能夠表達(dá)更多的成黑色素細(xì)胞標(biāo)記，如EDNRB、c-KIT、SNAI2、MITF、DCT和TYRPl。
[0110](2)酪氨酸酶活性分析
去除所述培養(yǎng)基后，用PBS清洗所述細(xì)胞2次，然后在其中加入裂解液(Sigma)以收集所述細(xì)胞。在4°C下?lián)u晃I小時(shí)的過程中提取所述細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，然后通過離心分離(1300 rpm,，15分鐘)使細(xì)胞團(tuán)塊與提取物相互分離。
[0111]圖11 (A)為分離出在沒有能夠誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化的物質(zhì)PMA的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的KaMB和源自在含PMA的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的KaMB的KaMC后拍攝的團(tuán)塊的照片。從中可見，所述KaMB可分化成黑素細(xì)胞，該黑素細(xì)胞在有PMA的條件下可形成黑色素。
[0112]另一方面，將所分離的提取物移至新的E-tube，然后用BCA(二喹啉甲酸)(Pierce，Cat.N0.:23227)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。在96孔板內(nèi)的40 μ g蛋白質(zhì)中加入裂解液至最終容量成100 μ 1，然后在其中加入100 μ I L-多巴(Sigma，Cat.N0.D-9628，0.1 M磷酸緩沖液中含2 mg/ml，過濾)，并在37°C下反應(yīng)各種時(shí)間段(15、30、60、120分鐘)。在各反應(yīng)時(shí)間段之后，通過使用微孔板檢測(cè)儀測(cè)量490 nm處的吸光度。
[0113]其結(jié)果在圖11 (B)中展示。如圖11 (B)所示，隨著孵化時(shí)間的增加，所述KaMC的酪氨酸酶活性與所述KaMB相比會(huì)有增加。
[0114](3)細(xì)胞移動(dòng)性分析
將每種類型的細(xì)胞(5 X 14)接種于涂敷膠原蛋白I型(最終濃度:10 Pg/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)小室(Becton Dickinson, Cat.N0.: 353097，孔徑:8.0 mm)內(nèi)，然后在 24 孔中培養(yǎng) 4 小時(shí)。去除所述培養(yǎng)基后，用甲醇固定所述細(xì)胞5~10分鐘。用蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5分鐘，而后用水清洗若干次，然后在伊紅中浸泡約5分鐘以進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)染色。待用水清洗若干次后，用棉簽從所示小室里面排干多余水分。用刀從所述小室只分離出過濾器，然后將其堆積在載玻片上。結(jié)果請(qǐng)見圖11 (C)。用Transwell確認(rèn)細(xì)胞遷移的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在4小時(shí)內(nèi)所述KaMB與所分化的KaMC相比示出優(yōu)越的遷移性?；诨铙w內(nèi)的成黑色素細(xì)胞在發(fā)育過程中具有細(xì)胞遷移性的特征，可確認(rèn)所述KaMB具有成黑色素細(xì)胞的特征。
[0115]( 4 )蛋白質(zhì)表達(dá)分析
當(dāng)在100-mm培養(yǎng)皿上分別培養(yǎng)所述KaMB和KaMC，而所述細(xì)胞密度達(dá)到約80~90%時(shí)，用PBS清洗所述細(xì)胞。然后在其中加入約100~150 μL裂解液(Sigma)，然后用細(xì)胞刮(SPL Life Sciences)收集所述細(xì)胞。在低溫冰箱(4~8°C)內(nèi)孵化所述細(xì)胞10分鐘，而后離心分離10分鐘。然后，含有各種蛋白質(zhì)的上清液移至新的管內(nèi)，通過使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Thermo Scientific; Cat.N0., 23227)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。電泳15Pg蛋白質(zhì)并移至硝酸纖維素膜上，然后分別用抗體S0X10 (R&D systems, MAB2864)、PAX3 (R&D systems,MAB2457)、BRN2 (ProteinTech Group, 14596-1-AP)、MARTI (Thermo Scientific, MS-716)、TYRP2 (Santa Cruz b1technology, C_9, sc-74439)、TYRPl (Santa Cruz b1technology,H-90, sc-25543)、 TYR (Santa Cruz b1technology, H-109， sc-15341)和 GADPH (SantaCruz b1technology, FL-335, sc-25778)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法。結(jié)果,在所述KaMB中觀察到特異性BRN2表達(dá)(圖11(D)，星號(hào))，發(fā)現(xiàn)在KaMC內(nèi)作為用于形成黑色素的必要蛋白質(zhì)的酪氨酸酶(TYR)的表達(dá)有增長(zhǎng)(圖11 (D)，箭頭)。由于所述BRN2是人成黑色素細(xì)胞的標(biāo)記，可確認(rèn)從所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)中分離出的KaMB是成黑色素細(xì)胞。
[0116](5)對(duì)PMA反應(yīng)性的分析
為了確認(rèn)所述成黑色素細(xì)胞的特征是否來源于單純由培養(yǎng)基變更而引起的去分化，分別在含能夠誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化的物質(zhì)PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基及無PMA成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述原發(fā)性黑素細(xì)胞和KaMB。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述原發(fā)性黑素細(xì)胞在所述含PMA培養(yǎng)基內(nèi)得到適當(dāng)生長(zhǎng)，而在所述無PMA成黑色素培養(yǎng)基內(nèi)幾乎無法生長(zhǎng)(圖12 (A)，第三個(gè)、第四個(gè)面板)。與此相反。分離自角質(zhì)形成細(xì)胞的KaMB在無PMA成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)示出的增殖能力要比在含OMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的增殖能力更好(圖12 (A)，第一個(gè)、第二個(gè)面板)。從該結(jié)果可見，所述KaMB是具有與只在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)得到的去分化細(xì)胞不同的特征的細(xì)胞。
[0117](6)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
分別在24孔板中5孔內(nèi)接種每種類型的細(xì)胞，每孔濃度為3.4 X 14個(gè)細(xì)胞，然后在第
0、3、6、9和12天測(cè)定所述細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述KaMB細(xì)胞示出最好的增殖能力(圖12(B))。
[0118](7)細(xì)胞分裂能力的分析 在96孔板的每孔內(nèi)接種每種細(xì)胞，每孔濃度為I X 14個(gè)細(xì)胞，并培養(yǎng)3天。然后，用細(xì)胞增殖ELISA法、BrdU試劑盒(Roche, Cat.N0.: 11 647 229 001)對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后每隔10、20和30分鐘測(cè)定吸光度。所述BrdU具有能夠附著于進(jìn)行分裂的細(xì)胞的DNA上的特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無PMA成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的KaMB分裂并增殖得最多(圖12(C)。當(dāng)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間(通道9)培養(yǎng)所述KaMB時(shí)無大變化(圖13，第三個(gè)面板)，然而所述原發(fā)性黑素細(xì)胞幾乎無法在這種培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行增殖，并長(zhǎng)時(shí)間(通道6)培養(yǎng)時(shí)還會(huì)在所述細(xì)胞內(nèi)形成很多空泡(圖13，第一個(gè)面板)。即使將所述KaMC和PMC分別培養(yǎng)于含PMA黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，所述KaMC比所述PMC示出更好的增殖能力(圖12 (B、C))。
[0119]從這種測(cè)試結(jié)果可見，分離自所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)中的KaMB在所述PMA-培養(yǎng)基內(nèi)示出最佳增殖能力，能夠特異性地表達(dá)基因標(biāo)記機(jī)成黑色素細(xì)胞的蛋白質(zhì)，而且通過作為能夠誘導(dǎo)分化的物質(zhì)PMA可分化成黑素細(xì)胞。因此，其為成黑色素細(xì)胞。進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)源自從所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來的KaMB的KaMC與原發(fā)想黑素細(xì)胞具有更好的增殖能力。這能夠說明，在角質(zhì)形成細(xì)胞環(huán)境下適應(yīng)體外條件后分離出來的黑素細(xì)胞比直接從皮膚組織中分離出的原發(fā)性黑素細(xì)胞具有更好的增殖能力。
[0120]工業(yè)應(yīng)用性
從一方面，本發(fā)明可提供在維持與角質(zhì)形成細(xì)胞的關(guān)系的同時(shí)能夠適應(yīng)體外的黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞。
[0121]從另一方面，本發(fā)明可確保在體外研究黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞的可行性。
[0122]從本發(fā)明的另一方面，通過研究黑素細(xì)胞或成黑色素細(xì)胞的生存、繁殖、分化和再生而找出如痣、雀斑和年齡斑的皮膚色素沉著、如白癜風(fēng)的色素缺乏(白斑和白化病)或灰發(fā)癥、或者如黑色素瘤的癌癥的起因及治療方法。
[0123]從一方面，本發(fā)明可促進(jìn)用于減少黃褐斑和雀斑及抑制黑色素色素沉著的形成的美白化妝品和藥品的發(fā)展。
【權(quán)利要求】
1.黑素細(xì)胞或作為黑素細(xì)胞的祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞的制備方法，所述黑素細(xì)胞或作為黑素細(xì)胞的祖細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞，所述方法包括以下步驟: Ca)在培養(yǎng)皿內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞； (b)從所述培養(yǎng)基中去除所述角質(zhì)形成細(xì)胞'及 (c)將來自去除了角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基、并附著在培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞收集起來，然后將收集的細(xì)胞在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基或成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法為黑素細(xì)胞的制備方法，其中所述步驟(C)的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基為添加有補(bǔ)充物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含必要及非必要氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)， 其中，所述補(bǔ)充物包含胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法為成黑色素細(xì)胞的制備方法，其中所述步驟(C)的成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基為添加有補(bǔ)充物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含必要及非必要氨基酸、維生素、有機(jī)化合物、微量礦物質(zhì)和無機(jī)鹽，但不包含抗生素、抗真菌劑、激素、生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)， 其中，所述補(bǔ)充物包含 胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛垂體提取物、肝素、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和內(nèi)皮素-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)的角質(zhì)形成細(xì)胞為人角質(zhì)形成細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)包括在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入鈣，形成鈣培養(yǎng)基，將角質(zhì)形成細(xì)胞在所述鈣培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)包括以下步驟: (i )在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入鈣，形成鈣培養(yǎng)基，將被培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞在所述鈣培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)； (ii)去除鈣培養(yǎng)基，清洗所述角質(zhì)形成細(xì)胞，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基替換所述鈣培養(yǎng)基并再次代培養(yǎng)所述角質(zhì)形成細(xì)胞； (iii)去除所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，清洗所述角質(zhì)形成細(xì)胞，然后孵化所述角質(zhì)形成細(xì)胞；及 (iv)從孵化細(xì)胞中分離出片狀角質(zhì)形成細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(iv)包括通過向孵化細(xì)胞中加入緩沖液或角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基來分離出所述片狀角質(zhì)形成細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)為將角質(zhì)形成細(xì)胞在鈣培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)2~6天，所述鈣培養(yǎng)基為在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入鈣而形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括:在步驟(a)中，當(dāng)在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的所述角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)果使在培養(yǎng)皿上所培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80~100%融合率時(shí)，將所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基更換為鈣培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟(ii)中，在所述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)胞3~7天。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的萬法，其特征在于，在步驟（iii)中，當(dāng)所述培養(yǎng)基的顏色不 再有變化時(shí)去除所述培養(yǎng)基。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述孵化進(jìn)行5?10分鐘。
13.—種適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其具有選自以下特征中的至少一個(gè)特征：(i)作為神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記的P75NTR的表達(dá)水平低于原發(fā)性黑素細(xì)胞；(ii)在成黑色素細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的BRN2的表達(dá)水平高于原發(fā)性黑素細(xì)胞；(iii)黑色素含量高于原發(fā)性黑素細(xì)胞；(iv)酪氨酸酶活性高于原發(fā)性黑素細(xì)胞；(v)在無12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，P75NTR的表達(dá)水平的增長(zhǎng) 量高于原發(fā)性黑素細(xì)胞；(vi)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，BRN2的表達(dá)水平的增長(zhǎng)量低于原發(fā)性黑素細(xì)胞；(vii)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的p75NTR表達(dá)水平 相對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的p75NTR表 達(dá)水平的相對(duì)比率等于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的P75NTR 表達(dá)水平相對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的 P75NTR表達(dá)水平的比率的60?160% ；(viii)在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平相 對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水 平的相對(duì)比率等于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞 的BRN2表達(dá)水平相對(duì)于在含PMA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá) 水平的比率的1?10倍；及(ix)進(jìn)行2小時(shí)次代培養(yǎng)后，附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率高于原發(fā)性黑素細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，(i)的 P75NTR的表達(dá)水平與原發(fā)性黑素細(xì)胞相比低1/10倍。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，(ii)的 BRN2的表達(dá)水平與原發(fā)性黑素細(xì)胞相比高5倍或以上。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，（iii)的黑 色素含量高于原發(fā)性黑素細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，在37°C下 孵化120分鐘時(shí)，(iv)的酪氨酸酶活性與原發(fā)性黑素細(xì)胞相比高2倍或以上。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，（v)的表達(dá) 水平可以為所述原發(fā)性黑素細(xì)胞的表達(dá)水平的2倍或以上。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，(vi)的表 達(dá)水平為所述原發(fā)性黑素細(xì)胞的表達(dá)水平的9/10倍或以下。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，在（vii) 中，在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平等于在黑 素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的P75NTR表達(dá)水平的80?120%。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，在（viii) 中，在無PMA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平等于在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的原發(fā)性黑素細(xì)胞的BRN2表達(dá)水平的3~7倍。
22.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，在(ix)中，進(jìn)行2小時(shí)次代培養(yǎng)后，附著于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞的比率為80%或以上。
23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，該黑素細(xì)胞為源自角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，所述角質(zhì)形成細(xì)胞為人角質(zhì)形成細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，該黑素細(xì)胞為通過根據(jù)權(quán)利要求1~12中的任一項(xiàng)所述的方法制備的黑素細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求13所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞，其特征在于，該黑素細(xì)胞的保藏編號(hào)為KCTC 12015BP。
27.一種適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，選自MITF、DCT、TYRPUSNAI2、C-KIT和EDNRB中的至少一種成黑色素細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平高于原發(fā)性黑素細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，選自MITF和DCT中的至少一種成黑色素細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平與原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞相比高2倍或以上。
29.根據(jù)權(quán)利要求 27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，選自MITF和DCT中的至少一種成黑色素細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平與原發(fā)性黑素細(xì)胞或適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞相比高4倍或以上。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其具有選自以下特征中的至少一個(gè)特征:BRN2蛋白表達(dá)水平高于適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞；TYR蛋白表達(dá)水平低于適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，當(dāng)在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)9天時(shí)，所述細(xì)胞數(shù)量與原始細(xì)胞數(shù)量相比增長(zhǎng)25倍或以上。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，當(dāng)在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)9天時(shí)，所述細(xì)胞數(shù)量與原始細(xì)胞數(shù)量相比增長(zhǎng)30倍或以上。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，即使在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行次代培養(yǎng)6次或以上，所述細(xì)胞能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，即使在成黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行次代培養(yǎng)9次或以上，所述細(xì)胞能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，其為源自角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，所述角質(zhì)形成細(xì)胞為人角質(zhì)形成細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，該成黑色素細(xì)胞為通過根據(jù)權(quán)利要求1~12中的任一項(xiàng)所述的方法來生產(chǎn)的成黑色素細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求27所述的適應(yīng)于角質(zhì)形成細(xì)胞的成黑色素細(xì)胞，其特征在于，該成黑色素細(xì)胞的保藏編號(hào)為KCTC 12250BP。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104039953SQ201280048174
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】曺恩敬, 賓范浩, 李泰龍, 韓枝娟, 崔賢貞 申請(qǐng)人:株式會(huì)社愛茉莉太平洋