新型酰胺酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于制造作為醫(yī)藥品等的合成原料及中間體有用的化合物即光學(xué)活性托品酸的方法。本發(fā)明提供一種具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的新型的多肽、編碼該多肽的DNA、含有該DNA的載體、利用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體、以及利用它們的光學(xué)活性羧酸酰胺及光學(xué)活性羧酸的制造方法。
【專利說(shuō)明】新型酰胺酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的新型的多肽、編碼該多肽的DNA、含有該DNA的載體、利用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體、以及利用它們的光學(xué)活性羧酸酰胺及光學(xué)活性羧酸的制造方法。
【背景技術(shù)】[0002]光學(xué)活性托品酸為作為具有生理活性的生物堿或醫(yī)藥品等的合成原料及中間體有用的化合物。以往，關(guān)于獲得光學(xué)活性托品酸的方法，已知有使外消旋體托品酸與熒光素酶、ATP、2價(jià)金屬離子及CoA反應(yīng)進(jìn)行光學(xué)拆分的方法(專利文獻(xiàn)I)、使用南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶B (CAL-B)將外消旋體托品酸丁酯光學(xué)拆分的方法(非專利文獻(xiàn)I)、使用源自產(chǎn)酸克雷伯式菌(Klebsiella oxytoca)的酯酶將外消旋體托品酸酯光學(xué)拆分的方法(非專利文獻(xiàn)2)，未知通過(guò)將外消旋體托品酸酰胺不對(duì)稱水解來(lái)獲得光學(xué)活性托品酸的方法。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0004]專利文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)第2007-29017
[0006]非專利文獻(xiàn)
[0007]非專利文獻(xiàn)1:Tetrahedron:Asymmetryl6:2005, 3892-3896
[0008]非專利文獻(xiàn)2:Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic57,158-163(2009)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明所要解決的問(wèn)題
[0010]本發(fā)明的課題在于提供一種用于制造作為醫(yī)藥品等的合成原料及中間體有用的化合物即光學(xué)活性托品酸的方法。
[0011]用于解決問(wèn)題的方法
[0012]本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果，通過(guò)本發(fā)明人等從土壤中分離的KNK AM38株中分離精制能夠?qū)⑼庀w托品酸酰胺選擇性地水解為(R)的酰胺酶，獲得編碼其的DNA。另外，由使用獲得的DNA制造的富含酰胺酶的轉(zhuǎn)化體確認(rèn)了進(jìn)行高立體選擇性的托品酸酰胺的水解反應(yīng)。進(jìn)而，使用基于上述的源自KNK AM38株的DNA的堿基序列及與該堿基序列同一性高的已知的堿基序列設(shè)計(jì)的引物，以其它的土壤分離菌3株(KNKAM40株、KNK AMlOll株、KNK AM250株)的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果，可以獲得編碼具有與KNK AM38株所具有的水解活性同等活性的酰胺酶的DNA。獲得的4個(gè)DNA的堿基序列未在以DDBJ為代表的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄，確認(rèn)為新序列。本發(fā)明是基于這種見(jiàn)解而完成的。
[0013]本發(fā)明包含以下的發(fā)明。[0014][1] 一種多肽，其為以下(a)~(C)中的任一種:
[0015](a)由序列編號(hào)1、3、5、或7所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；
[0016](b)由序列編號(hào)1、3、5、或7所示的氨基酸序列中缺失、插入、置換和/或附加了 I個(gè)或者多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽；
[0017](c)由與序列編號(hào)1、3、5、或7所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽。
[0018][2] 一種DNA，其編碼[I]所述的多肽。
[0019][3] 一種DNA，其為以下(d)~(g)中的任一種:
[0020](d)由序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列構(gòu)成的DNA ；
[0021](e)由與序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列具有80%以上的序列同一性的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽的DNA;
[0022](f)與由與序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下雜交，且編碼具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽的 DNA ；
[0023](g)由序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列中缺失、插入、置換和/或附加了 I個(gè)或者多個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽的DNA ；
[0024][4] 一種載體，其含有[2]或[3]所述的DNA。
[0025][5] 一種轉(zhuǎn)化體，其通過(guò)[4]所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到。
[0026][6]根據(jù)[5]所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0027][7] 一種[I]所述的多肽的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[5]或[6]所述的轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中收集已表達(dá)的多肽。
[0028][8] 一種光學(xué)活性羧酸和/或光學(xué)活性羧酸酰胺的制造方法，其包含使[I]所述的多肽、或[5]或者[6]所述的轉(zhuǎn)化體與下述式⑴所示的羧酸酰胺的對(duì)映體混合物作用，生成下述式(II)所示的(R)體或⑶體的羧酸和/或下述式(III)所示的⑶體或(R)體的羧酸酰胺。
[0029][化學(xué)式1]
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種多肽，其為以下(a)~(C)中的任一種: (a)由序列編號(hào)1、3、5、或7所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽； (b)由序列編號(hào)1、3、5、或7所示的氨基酸序列中缺失、插入、置換和/或附加了I個(gè)或者多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、且具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽； (c)由與序列編號(hào)1、3、5、或7所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽。
2.—種DNA，其編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
3.—種DNA,其為以下(d)~(g)中的任一種: (d)由序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列構(gòu)成的DNA； (e)由與序列編號(hào)2、4、6、或8所不的喊基序列具有80%以上的序列同一性的喊基序列構(gòu)成、且編碼具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽的DNA; (f)與由與序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下雜交、且編碼具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽的DNA ； (g)由序列編號(hào)2、4、6、或8所示的堿基序列中缺失、插入、置換和/或附加了I個(gè)或者多個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成、且編碼具有將外消旋體托品酸酰胺選擇性地水解為(R)體的活性的多肽的DNA。
4.一種載體,其含有權(quán)利要求2或3所述的DNA。
5.一種轉(zhuǎn)化體,其通過(guò)權(quán)利要求4所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
7.—種權(quán)利要求1所述的多肽的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中收集已表達(dá)的多肽。
8.一種光學(xué)活性羧酸和/或光學(xué)活性羧酸酰胺的制造方法，其包括: 使權(quán)利要求1所述的多肽、或權(quán)利要求5或者6所述的轉(zhuǎn)化體與下述式(I)所示的羧酸酰胺的對(duì)映體混合物作用，生成下述式(II)所示的(R)體或⑶體的羧酸和/或下述式(III)所示的(S)體或(R)體的羧酸酰胺，
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK103842505SQ201280048185
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】野尻增俊, 金丸博幸, 西聰子, 川野茂, 八十原良彥 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化