與Cry1Ab組合的DIG3殺蟲晶體蛋白的用途
【專利摘要】本發(fā)明包括用于控制歐洲玉米螟的方法和植物，所述植物包含Cry1Ab殺蟲蛋白和DIG-3殺蟲蛋白以延遲或阻止昆蟲形成抗性。
【專利說明】與CryIAb組合的DIG3殺蟲晶體蛋白的用途
[0001]發(fā)明背景
[0002]人類種植玉米(corn)以供食物和能量應(yīng)用。人類還種植許多其它作物，包括大豆和棉花。昆蟲食用并損害植物，并且由此削弱這些人類努力。每年花費(fèi)數(shù)十億美元來控制昆蟲有害物，并且它們?cè)斐傻膿p害損失額外的數(shù)十億。合成的有機(jī)化學(xué)殺蟲劑已經(jīng)是用于控制昆蟲有害物的主要工具，但是生物學(xué)殺蟲劑，諸如自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)衍生的殺蟲蛋白(insecticidal protein)已經(jīng)在一些領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。經(jīng)由用Bt殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)化生成昆蟲抗性植物的能力已經(jīng)使現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)生革命，而且提高殺蟲蛋白及其基因的重要性和價(jià)值。
[0003]已經(jīng)使用幾種Bt蛋白來創(chuàng)建至今已經(jīng)成功登記并商業(yè)化的昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物。這些包括玉米中的CryIAb、CryIAc、CryIF和Cry3Bb、棉花中的CrylAc和Cry2Ab、和馬鈴薯中的Cry3A。
[0004]除了在2種蛋白質(zhì)的組合殺蟲譜是期望的(例如，玉米中的CrylAb和Cry3Bb組合以分別提供對(duì)鱗翅目害蟲和根蟲的抗性)或蛋白質(zhì)的獨(dú)立作用使它們可用作用于延遲易感昆蟲群中抗性形成的工具(例如，棉花中的CrylAc和Cry2Ab組合以提供煙草蚜蟲的抗性管理)的情況中外，表達(dá)這些蛋白質(zhì)的商業(yè)產(chǎn)品表達(dá)單一蛋白質(zhì)。SMARTSTAX是一種摻入幾種Cry蛋白的商業(yè)產(chǎn)品。還可見US20090313717.S.專利申請(qǐng)公開文本N0.2008/0311096,其涉及Cry2蛋白加Vip3Aa、CrylF,或CrylA,用于控制谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)或棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)。W02009132850 涉及 CrylF 或CrylA 和 Vip3Aa,用于控制草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)。US2008 0311096 部分涉及CrylAb,用于控制CrylF抗性歐洲玉米螟(European corn borer) (ECB.;玉米螟蛾(Ostrinia nubilalis (Hiibner)))。美國專利申請(qǐng)公開文本 N0.2010/0269223 涉及 DIG-3。
[0005]昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物的快速且普遍的采用已經(jīng)引起如下的憂慮，即害蟲(pest)群體會(huì)形成對(duì)由這些植物生成的殺蟲蛋白的抗性。已經(jīng)提示了保留基于Bt的昆蟲抗性性狀的效用的幾種策略，其包括與避難所(refuge)組合以及與不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高劑量的蛋白質(zhì)(McGaughey等(1998)，“B.t.ResistanceManagement,，’Nature Biotechnol.16:144-146)。
[0006]為了在昆蟲抗性管理(IRM)疊加(stack)中使用而選定的蛋白質(zhì)需要獨(dú)立地施加其殺蟲效果， 使得對(duì)一種蛋白質(zhì)形成的抗性未賦予對(duì)第二種蛋白質(zhì)的抗性(即，沒有對(duì)蛋白質(zhì)的交叉抗性)。如果例如在對(duì)“蛋白質(zhì)A”的抗性方面選定的害蟲群對(duì)“蛋白質(zhì)B”敏感，那么會(huì)推斷沒有交叉抗性，并且蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B的組合會(huì)有效延遲對(duì)單獨(dú)的蛋白質(zhì)A的抗性。
[0007]在沒有抗性昆蟲群的情況中，可以基于假設(shè)與作用機(jī)制和交叉抗性潛力相關(guān)的其它特征做出評(píng)估。已經(jīng)提示了受體介導(dǎo)的結(jié)合在鑒定有可能不展現(xiàn)出交叉抗性的殺蟲蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。此方法中固有的交叉抗性缺乏的關(guān)鍵預(yù)測物(predictor)是殺蟲蛋白在敏感的昆蟲物種中不競爭受體。
[0008]在兩種Bt毒素競爭昆蟲中的相同受體的情況中，則若所述受體在所述昆蟲中突變，使得毒素之一不再結(jié)合所述受體，并且如此針對(duì)昆蟲不再是殺蟲性的，則情況可能是昆蟲也會(huì)對(duì)第二種毒素(其競爭性結(jié)合相同受體)有抗性。也就是說，昆蟲與這兩種Bt毒素有交叉抗性。然而，若兩種毒素結(jié)合兩種不同受體，則這可以是如下的指示，即昆蟲不會(huì)對(duì)那兩種毒素同時(shí)有抗性。
[0009]其它Cry毒素列于官方B.t.命名委員會(huì)的站點(diǎn)(Crickmore等；lifesc1.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有幾乎 60 個(gè)“Cry”毒素大類(Cryl_Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。許多數(shù)字組各自具有大寫字母亞組，而大寫字母亞組具有小寫字母亞-亞組。(例如，Cryl具有A-L,而CrylA具有a_i)。
[0010]發(fā)明概述[0011]本發(fā)明部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即DIG-3和CrylAb不競爭對(duì)歐洲玉米螟(ECB ；玉米螟蛾)腸細(xì)胞膜制備物中的位點(diǎn)的結(jié)合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借本公開內(nèi)容的益處會(huì)認(rèn)可，生成這兩種蛋白質(zhì)(包括全長蛋白質(zhì)的殺蟲部分)的植物可以用于延遲或阻止對(duì)單獨(dú)的這些殺蟲蛋白之任一種的抗性的形成。玉米是依照本發(fā)明使用的優(yōu)選植物。ECB是主題毒素對(duì)的優(yōu)選靶昆蟲。
[0012]如此，本發(fā)明部分涉及與DIG-3蛋白組合的CrylAb蛋白的用途。生成這兩種蛋白質(zhì)的植物(和種植有此類植物的土地面積(acreage))包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0013]本發(fā)明還部分涉及三種(或更多種)毒素的三重疊加(triple stack)或“錐體(pyramid) ”,其中CrylAb和DIG-3是基礎(chǔ)對(duì)。在一些優(yōu)選的錐體實(shí)施方案中，選定的毒素的組合提供三種針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。一些優(yōu)選的“三種作用位點(diǎn)”錐體組合包括主題蛋白質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)加CrylF作為靶向ECB的第三種蛋白質(zhì)。(從US2008 0311096知道CrylAb針對(duì)CrylFa抗性ECB是有效的)。例如，依照本發(fā)明，這種具體的三重疊加會(huì)有利地且令人驚訝地提供三種針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。這可以幫助降低或消除避難所土地面積的需要。
[0014]雖然本發(fā)明在本文中以毒素的基礎(chǔ)對(duì)CrylAb和DIG-3 (其一起作為對(duì)或者在三種或更多種毒素的“錐體”中在玉米中提供針對(duì)ECB的昆蟲抗性)公開，但是應(yīng)當(dāng)理解與CrylAb和DIG-3的其它組合也可以依照本發(fā)明使用，優(yōu)選在玉米中使用。
[0015]附圖簡述
[0016]圖1顯示了來自玉米螟蛾的BBMV中的125I CrylAb (0.5nM)的百分比特異性結(jié)合對(duì)未標(biāo)記的同源CrylAb (.)和異源DIG_3( )的競爭。CrylAb的同源競爭的置換曲線產(chǎn)生S形(sigmoidal)形狀曲線，在約0.5nM CrylAb顯示50%放射性配體置換。DIG-3在IOOnM或更低的濃度(在測定法中比125I CrylAb的濃度高200倍)沒有將125I CrylAb的任何結(jié)合置換出其結(jié)合位點(diǎn)。僅在300nM，我們確實(shí)觀察到DIG-3對(duì)125I CrylAb結(jié)合的約25%置換。這些結(jié)果顯示了 DIG-3沒有有效競爭CrylAb對(duì)位于來自玉米螟蛾的BBMV中的受體位點(diǎn)的結(jié)合。
[0017]序列簡述
[0018]SEQ ID NO:1 是全長 CrylAb 例示蛋白。(MR818)
[0019]SEQ ID勵(lì):2是全長016_3例示蛋白。
[0020]發(fā)明詳述
[0021]本發(fā)明部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylAb和DIG-3不彼此競爭歐洲玉米螟(ECB ;玉米螟蛾)或秋季粘蟲(fall armyworm) (FAW ;草地夜蛾)的腸中的結(jié)合位點(diǎn)。如此，CrylAb蛋白可以與DIG-3蛋白組合使用，優(yōu)選在轉(zhuǎn)基因玉米中，以延遲或阻止ECB形成對(duì)單獨(dú)的這些蛋白質(zhì)之任一種的抗性。主題蛋白質(zhì)對(duì)可以有效保護(hù)植物(諸如玉米植物)免于Cry抗性ECB的損傷。也就是說，本發(fā)明的一種用途是保護(hù)玉米和其它經(jīng)濟(jì)上重要的植物物種免于能形成對(duì)CrylAb或DIG-3的抗性的ECB群體引起的損傷和產(chǎn)量損失。
[0022]如此，本發(fā)明教導(dǎo)了包含CrylAb和DIG-3的昆蟲抗性管理(IRM)疊加以阻止或減輕ECB對(duì)這些蛋白質(zhì)之任一種或兩者形成抗性。
[0023]此外，雖然本文中公開的本發(fā)明教導(dǎo)了用于預(yù)防ECB對(duì)這些蛋白質(zhì)之任一種或兩者的抗性的包含CrylAb和DIG-3的IRM疊加，在本文中公開的發(fā)明的范圍內(nèi)的是，可以單獨(dú)或組合改編CrylA和DIG-3之一或兩者，以阻止FAW對(duì)這些蛋白質(zhì)之任一種或兩者的抗性。
[0024]本發(fā)明提供了用于控制鱗翅目害蟲的組合物，其包含生成含有CrylAb核心毒素的蛋白質(zhì)和含有DIG-3核心毒素的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
[0025]本發(fā)明進(jìn)一步包含經(jīng)轉(zhuǎn)化以生成CrylAb殺蟲蛋白和DIG-3殺蟲蛋白兩者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞。優(yōu)選地，主題多核苷酸在遺傳構(gòu)建體中在非蘇云金芽孢桿菌啟動(dòng)子的控制下。主題多核苷酸可以包含實(shí)現(xiàn)植物中表達(dá)增強(qiáng)的密碼子選擇。
[0026]另外，意圖本發(fā)明提供一種控制鱗翅目害蟲的方法，包括使所述害蟲或所述害蟲的環(huán)境與有效量的組合物接觸，所述組合物含有CrylAb殺蟲蛋白，并且進(jìn)一步含有含DIG-3殺蟲蛋白。
[0027]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括玉米植物及此類植物的種子，所述玉米包含編碼含DIG-3核心毒素的蛋白質(zhì)的植物表達(dá)型基因和編碼含CrylAb核心毒素的蛋白質(zhì)的植物表達(dá)型基因。
[0028]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案包含玉米植物及此類植物的種子，其中編碼DIG-3殺蟲蛋白的植物表達(dá)型基因和編碼CrylAb殺蟲蛋白的植物表達(dá)型基因已經(jīng)漸滲入所述玉米植物中。
[0029]如實(shí)施例中描述的，使用DIG-3和經(jīng)放射性標(biāo)記的CrylAb蛋白的競爭性受體結(jié)合研究顯示了 DIG-3蛋白不競爭與CrylAb結(jié)合的ECB組織中的結(jié)合。這些結(jié)果還指示CrylAb和DIG-3蛋白的組合可以是一種減輕ECB群體中對(duì)這些蛋白質(zhì)中任一項(xiàng)形成抗性的有效手段。如此，部分基于本文中描述的數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)高劑量的DIG-3與CrylAb的共生成(疊加)可以用于IRM疊加以控制ECB。
[0030]可以將其它蛋白質(zhì)添加到此對(duì)。例如，本發(fā)明還部分涉及三重疊加或三種(或更多種)毒素的“錐體”，其中CrylAb和DIG-3是基礎(chǔ)對(duì)。在一些優(yōu)選的錐體實(shí)施方案中，選擇的毒素具有三種不同的(separate)針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。一些優(yōu)選的“三種作用位點(diǎn)”錐體組合包括主題蛋白質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)加CrylFa作為靶向ECB的第三種蛋白質(zhì)。依照本發(fā)明，這些具體的三種疊加會(huì)有利地且令人驚訝地提供三種針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。這可以幫助降低或消除避難所土地面積的需要?！安煌饔梦稽c(diǎn)”意指任何給定的蛋白質(zhì)彼此不引起交叉抗性。
[0031]如此，一種部署選項(xiàng)是與第三種毒素/基因組合使用主題蛋白質(zhì)對(duì)，并且使用此三重疊加來減輕ECB中形成對(duì)這些毒素之任一種的抗性。因而，本發(fā)明還部分涉及三種(或更多種)毒素的三重疊加或“錐體(pyramid)”。在一些優(yōu)選的錐體實(shí)施方案中，選定的毒素具有針對(duì)ECB的三種不同作用位點(diǎn)。
[0032]本發(fā)明的部署選項(xiàng)中包括的會(huì)是在ECB可以(或已知)形成抗性群體的作物種植區(qū)中使用主題蛋白質(zhì)中的兩種、三種或更多種蛋白質(zhì)。
[0033]例如，CrylFa在Herculex?和SmartStax?產(chǎn)品中部署。主題基因?qū)?CrylAb和DIG-3)會(huì)組合到例如CrylFa產(chǎn)品諸如Herculex?和/或SmartStax?中。因而，主題蛋白質(zhì)對(duì)在降低對(duì)這些和其它蛋白質(zhì)的選擇壓力中可以是有意義的。如此，可以對(duì)玉米在三種基因組合中使用主題蛋白質(zhì)對(duì)。
[0034]如上文討論的，也可以依照本發(fā)明添加別的毒素/基因。例如，對(duì)于與CrylBe —起使用CrylAb以靶向ECB，見TO2011/084631。對(duì)于與Cry2Aa —起使用CrylAb以靶向ECB，見TO2011/075590。如此，CrylBe和/或Cry2Aa可以在與主題蛋白質(zhì)對(duì)的多重蛋白質(zhì)疊加中使用(任選地與CrylFa —起)。
[0035]本發(fā)明的范圍內(nèi)包括生成蛋白質(zhì)的任何主題組合的植物(和種植有此類植物的土地面積)。還可以添加其它毒素/基因，但是上文所討論的特定疊加有利地且令人驚訝地提供針對(duì)ECB的多個(gè)作用位點(diǎn)。這可以有助于降低或消除對(duì)避難所土地面積的需要。如此，本發(fā)明內(nèi)包括如此種植有超過10英畝的田地。
[0036]也可以使用GENBANK來獲得本文中討論的任何基因和蛋白質(zhì)的序列。也可以使用專利。例如，美國專利N0.5，188，960和美國專利N0.5，827，514描述了 CrylFa核心毒素，其含有適合于用于實(shí)施本發(fā)明的蛋白質(zhì)。美國專利N0.6，218，188描述了植物優(yōu)化的DNA序列，其編碼適合于用于本發(fā)明的含有CryIFa核心毒素的蛋白質(zhì)。
[0037]也可以靶向與 ECB相關(guān)的昆蟲。這些可以包括莖螟(stem borer)和/或莖鉆孔昆蟲(stalk-boring insect)。西南玉米螟(southwestern corn borer)(巨座玉米螟(Diatraea grandiosella):亞目異角類(Heterocera)的)是一個(gè)例子。甘鹿螟也是Diatraea物種(小鹿桿草螟(Diatraea saccharalis))?？梢允褂帽景l(fā)明中描述的蛋白質(zhì)組合靶向目標(biāo)昆蟲的幼蟲階段。成年鱗翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜為食，并且是傳粉的重要實(shí)現(xiàn)物(effector)。幾乎所有鱗翅目幼蟲，即毛蟲以植物為食，并且許多是嚴(yán)重的害蟲。毛蟲在葉上或內(nèi)部進(jìn)食或者以植物的根或莖為食，對(duì)植物剝奪營養(yǎng)物，而且經(jīng)常破壞植物的物理支持結(jié)構(gòu)。另外，毛蟲以果實(shí)、織物、和貯存的谷物和面粉為食，毀壞出售的這些產(chǎn)品或者嚴(yán)重降低其價(jià)值。
[0038]本發(fā)明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某個(gè)點(diǎn)處，蛋白質(zhì)具有向異源原毒素(protoxin)序列的過渡。Bt毒素的N端殺蟲活性的毒素部分稱為“核心”毒素。自核心毒素區(qū)段至異源原毒素區(qū)段的過渡可以大致在毒素/原毒素連接處發(fā)生或者，在備選中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游發(fā)生向異源原毒素部分的過渡。
[0039]通常，全長三域B.t.Cry蛋白是約130kDa至150kDa。CrylAb是一個(gè)例子。DIG-3也是三域毒素，大小約142kDa。
[0040]舉例而言，本發(fā)明的一個(gè)嵌合毒素是CrylAb的完整核心毒素部分(約氨基酸I至601)和/或異源原毒素(C端的約602個(gè)氨基酸)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，Bt毒素(即使在某個(gè)種類諸如CrylB內(nèi))在長度和核心毒素部分向原毒素部分過渡的精確位置上能以一定程度有所變化。通常，全長Cry毒素的長度是約1150至約1200個(gè)氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的過渡通常會(huì)在全長毒素的約50%-約60%發(fā)生。本發(fā)明的嵌合毒素會(huì)包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此,嵌合毒素會(huì)包含Cryl蛋白的全長的至少約50%。這通常會(huì)是至少約590個(gè)氨基酸(并且可以包括約600-650個(gè)殘基)。關(guān)于原毒素部分，整段的CrylAb原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。
[0042]基因和毒素。依照本發(fā)明有用的基因和毒素不僅包括公開的全長序列，而且還包括保留本文中明確例示的毒素的特征性殺蟲(pesticidal)活性的這些序列、變體、突變體、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，術(shù)語基因的“變體”或“變異”指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，術(shù)語“等同毒素”指與要求保護(hù)的毒素具有相同或基本上相同的針對(duì)靶害蟲的生物學(xué)活性的毒素。
[0043]如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, ^N.Crickmore, D.R.Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J.Van Rie, D.Lereclus, J.Baum 和 D.H.Dean.Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998)第 62 卷:807-813,邊界代表約 95%(例如 CrylAb)、78%(CrylA和CrylB)、和45%(Cryl和Vip3)序列同一性。這些截留也可以僅僅應(yīng)用于核心毒素。
[0044]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，可以經(jīng)由幾種手段鑒定并獲得編碼活性毒素的基因?？梢宰员２赜谂囵B(yǎng)物保藏所的分離物獲得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通過使用基因合成儀以合成方式構(gòu)建這些基因或其部分或變體?？梢允褂糜糜谏牲c(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來容易地構(gòu)建基因的變異。還有，可以使用商品化的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶依照標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)程來生成這些基因的片段。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變自這些基因的末端系統(tǒng)性剪斷核苷酸。也可以使用多種限制酶來獲得編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌竵碇苯荧@得這些蛋白質(zhì)毒素的活性片段。
[0045]保留例示的毒素的殺蟲活性的片段和等同物會(huì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還有，由于遺傳密碼的冗余，多種不同DNA序列可以編碼本文中公開的氨基酸序列。完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)內(nèi)的是創(chuàng)建編碼相同的，或基本上相同的毒素的這些備選DNA序列。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有沒有實(shí)質(zhì)性影響殺蟲活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。編碼保留殺蟲活性的蛋白質(zhì)的基因的片段也包括在此定義中。
[0046]用于鑒定依照本發(fā)明有用的編碼毒素的基因和基因部分的又一種方法是經(jīng)由使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測的核苷酸序列。這些序列憑借合適的標(biāo)記物可以是可檢出的或者可以以固有熒光生成，如記載于國際申請(qǐng)N0.W093/16094的。如本領(lǐng)域中公知的，若探針分子和核酸樣品通過形成兩種分子間強(qiáng)烈的鍵來雜交，則可以合理地假設(shè)探針和樣品具有實(shí)質(zhì)的同源性。優(yōu)選地，通過本領(lǐng)域中公知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，如記載于例如 Kel ler, G.H.，Μ.M.Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y.,第169-170頁的。鹽濃度和溫度組合的一些例子如下(以嚴(yán)格性升高的次序):2X SSPE或SSC于室溫；1X SSPE 或 SSC 于 42°C ；0.1X SSPE 或 SSC 于 42°C ；0.1X SSPE 或 SSC 于 65°C。探針的檢測提供了一種用于以已知的方式測定雜交是否已經(jīng)發(fā)生的手段。此類探針分析提供一種用于鑒定本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法?？梢允褂肈NA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)程來合成依照本發(fā)明作為探針使用的核苷酸區(qū)段。也可以使用這些核苷酸序列作為PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。
[0047]變體毒素。已經(jīng)在本文中明確例示本發(fā)明的某些毒素。因?yàn)檫@些毒素僅是本發(fā)明的毒素例示性的，所以應(yīng)當(dāng)容易顯而易見的是，本發(fā)明包括具有例示毒素的相同或相似殺蟲活性的變體或等同毒素(和編碼等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素與例示的毒素會(huì)具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常會(huì)大于75%,優(yōu)選大于90%,且最優(yōu)選大于95%。氨基酸同源性在毒素中負(fù)責(zé)生物學(xué)活性或者牽涉決定最終負(fù)責(zé)生物學(xué)活性的三維構(gòu)型的至關(guān)重要的區(qū)域中會(huì)是最高的。在這點(diǎn)上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若這些取代在對(duì)于活性不是至關(guān)重要的區(qū)域中或者是不影響分子的三維構(gòu)型的保守氨基酸取代，則可以是預(yù)期的。例如，氨基酸可以放入以下種類:非極性、不帶電荷的極性、堿性、和酸性。其中的一類氨基酸用相同類型的另一種氨基酸替換的保守取代落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要取代不實(shí)質(zhì)性改變化合物的生物學(xué)活性。下文是屬于每類的氨基酸的例子的列表。
[0048]表1:四類氨基酸內(nèi)的氨基酸的例子
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含編碼CrylAb殺蟲蛋白的cryIAb多核苷酸，和編碼DIG-3殺蟲蛋白的DIG-3多核苷酸，其中所述DIG-3多核苷酸于42°C在IX SSC中與編碼SEQ IDNO:2核心毒素的多核苷酸的互補(bǔ)物雜交。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步包含編碼第三殺蟲蛋白的DNA，優(yōu)選地，所述第三殺蟲蛋白選自下組:CrylFa、CrylBeJP Cry2Aa。
3.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步包含編碼第四殺蟲蛋白的DNA，優(yōu)選地，所述第四殺蟲蛋白選自下組:CrylBe和Cry2Aa,其中所述第三殺蟲蛋白是CrylFa蛋白。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的植物的種子。
5.包含非Bt避難所植物和權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多個(gè)植物的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40%。
6.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30%。
7.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20%。
8.權(quán)利要求5 的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10%。
9.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5% ο
10.權(quán)利要求5的植物田地,其中所述避難所植物在塊或條中(inblocks or strips)。
11.種子混合物，其包含來自非Bt避難所植物的避難所種子和權(quán)利要求4的多個(gè)種子，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于40%。
12.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于 30%ο
13.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于 20%ο
14.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于 10% O
15.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占所述混合物中的所有種子的小于5% ο
16.—種管理昆蟲形成對(duì)Cry蛋白的抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的植物田地。
17.權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的田地，其中所述植物占地超過10英畝。
18.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物選自下組:玉米、大豆、和棉花。
19.權(quán)利要求18的植物，其中所述植物是玉米植物。
20.一種非全能的植物細(xì)胞，其包含編碼CrylAb殺蟲蛋白的cryIAb多核苷酸，和編碼DIG-3殺蟲蛋白的DIG-3多核苷酸，其中所述DIG-3多核苷酸于42°C在IX SSC中與編碼SEQ ID N0:2核心毒素的多核苷酸的互補(bǔ)物雜交。
21.一種控制玉米螟昆蟲的方法，其中所述方法包括使所述昆蟲或所述昆蟲的環(huán)境與有效量的組合物接觸，所述組合物含有CrylAb殺蟲蛋白，并且進(jìn)一步含有DIG-3殺蟲蛋白。
22.權(quán)利要求22的方法，其中所述組合物是多個(gè)植物細(xì)胞。
23.一種生成權(quán)利要求22的組合物的方法，其中所述方法包括再生所述細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103841821SQ201280049141
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】S.L.伯頓, T.米德, K.納瓦, J.J.希茨, N.P.斯托爾, A.T.伍斯利 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司