結(jié)直腸和乳腺癌診斷方法中的dna甲基化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般地涉及這樣的核酸分子，對于所述核酸分子之DNA甲基化水平的變化指示贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的核酸分子，對于所述核酸分子之DNA甲基化水平的變化指示大腸或乳腺贅生物(例如腺瘤或腺癌)的發(fā)生和/或進(jìn)展。本發(fā)明的DNA甲基化狀態(tài)可用于一系列應(yīng)用，包括但不限于涉及診斷和/或監(jiān)測結(jié)直腸或乳腺贅生物(例如結(jié)直腸或乳腺腺癌)的那些應(yīng)用。因此，在一個相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及通過篩選一種或更多種核酸分子的DNA甲基化中的調(diào)節(jié)來篩選贅生物的發(fā)生、發(fā)生傾向和/或進(jìn)展的方法。用于本發(fā)明中診斷的核酸分子是來自LOC100526820(隨后命名為CAHM，結(jié)直腸腺癌高甲基化)的序列。
【專利說明】結(jié)直腸和乳腺癌診斷方法中的DNA甲基化
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般地涉及這樣的核酸分子，對于所述核酸分子之DNA甲基化水平的變化指示贅生物(neoplasm)的發(fā)生或發(fā)生傾向。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的核酸分子，對于所述核酸分子之DNA甲基化水平的變化指示大腸或乳腺贅生物(例如腺瘤或腺癌)的發(fā)生和/或進(jìn)展。本發(fā)明的DNA甲基化狀態(tài)可用于一系列應(yīng)用，包括但不限于涉及診斷和/或監(jiān)測結(jié)直腸或乳腺贅生物(例如結(jié)直腸或乳腺腺癌)的那些應(yīng)用。因此，在一個相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及通過篩選一種或更多種核酸分子的DNA甲基化中的調(diào)節(jié)來篩選贅生物發(fā)生、發(fā)生傾向和/或進(jìn)展的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)直腸癌包括結(jié)腸、直腸和闌尾中的癌性生長。全世界每年有655，000例死亡，其是美國第四常見的癌癥形式并且是西方世界癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因。結(jié)直腸癌產(chǎn)生于結(jié)腸中的腺瘤性息肉。這些蘑菇形生長物通常是良性的，但是有一些隨時間發(fā)展為癌癥。局部結(jié)腸癌通常通過結(jié)腸鏡檢查來診斷。限制在結(jié)腸壁內(nèi)的侵襲性癌(--ΜΙ期和II期)可通過外科手術(shù)治愈。如果未經(jīng)治療，則它們擴(kuò)散至局部淋巴結(jié)(III期)，其中多至73%可通過外科手術(shù)和化學(xué)治療來治愈。雖然化學(xué)治療可延長存活，并且在罕見的情況下外科手術(shù)和化學(xué)治療一起使患者得到治愈，但是轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位的癌癥(IV期)通常是不可治愈的(Markowitz 和 Bertagnolli, 2009,N.Engl.J.Med.361 (25):2449-60)。對直腸癌使用輻射。
[0003]乳腺癌是起源于乳腺組織(最常起源于乳管的內(nèi)襯或為所述管供應(yīng)乳汁的小葉)的癌癥類型。起源于導(dǎo)管的癌癥稱為導(dǎo)管癌，而起源于小葉的那些癌癥稱為小葉癌。雖然絕大多數(shù)情況發(fā)生在女性中，但是也可發(fā)生男性乳腺癌。
[0004]在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌在女性中占據(jù)所有癌癥的22.9 %，并且在女性中比在男性中常見100倍，但是男性由于診斷延遲而傾向于具有更不良的后果。乳腺癌的預(yù)后和存活率根據(jù)患者的癌癥類型、分期、治療和地理位置變化很大。西方世界的存活率較高；例如，在英格蘭診斷有乳腺癌的10名婦女中有多于8名(84%)存活至少5年。但是，在發(fā)展中國家中，存活率要差得多。
[0005]許多癌癥之前是腺瘤。腺瘤是上皮來源的良性腫瘤或贅生物，其來源于腺組織或者表現(xiàn)出明確限定的腺結(jié)構(gòu)。一些腺瘤顯示出可識別的組織元件，如纖維組織(纖維腺瘤)和上皮結(jié)構(gòu)，而其他腺瘤例如支氣管腺瘤產(chǎn)生可引起臨床綜合征的活性化合物。
[0006]腺瘤可發(fā)展變?yōu)榍忠u性腫瘤，則稱為腺癌。因此，腺癌定義為起源于腺結(jié)構(gòu)(其是身體許多器官的構(gòu)成部分)的惡性上皮腫瘤。術(shù)語腺癌也適用于顯示出腺生長模式的腫瘤。這些腫瘤可根據(jù)它們產(chǎn)生的物質(zhì)被亞分類為例如黏液分泌性腺癌和漿液性腺癌，或者根據(jù)其細(xì)胞微觀排列成的模式亞分類為例如乳頭狀腺癌和濾泡狀腺癌。這些癌可以是實體的或囊性的(囊腺癌)。每種器官可產(chǎn)生表現(xiàn)出多種組織學(xué)類型的腫瘤，例如卵巢可產(chǎn)生黏液腺癌和囊腺癌。[0007]不同器官中的腺瘤表現(xiàn)得不同。一般來說，存在于腺瘤內(nèi)的癌(即，發(fā)生在良性病變內(nèi)的癌癥灶)的總體幾率為約5%。但是，這與腺瘤的大小有關(guān)。例如，在大腸(具體為結(jié)腸和直腸)中，在小于I厘米的腺瘤中發(fā)生腺瘤內(nèi)癌癥十分罕見。這種發(fā)生在大于4厘米并且顯示出某些組織病理學(xué)改變(如絨毛改變或高等級非典型性增生(dysplasia))的腺瘤中估計為40%至50%。具有更高程度異型增生的腺瘤具有更高的癌發(fā)病率。在任意給定的結(jié)直腸腺瘤中，器官中現(xiàn)在存在癌癥或?qū)戆l(fā)生癌癥的預(yù)測指標(biāo)包括大小(尤其是大于9_)、由管狀形態(tài)改變?yōu)榻q毛形態(tài)的程度、高等級異型增生的存在以及描述為“鋸齒狀(serrated)腺瘤”的形態(tài)變化。在任意給定的個體中，另一些特征(年齡增加、結(jié)直腸腺瘤或癌的家族性發(fā)生、男性或腺瘤多樣性)預(yù)測了器官中癌癥未來提高的風(fēng)險——所謂的癌癥風(fēng)險因素。除了腺瘤的存在及其大小之外，這些因素都不是客觀定義的，并且除數(shù)目和大小之外的所有那些因素具有觀察者誤差并且具有對于所涉特征之精確定義的混亂。因為這些因素可能難以評估和定義，其值作為癌癥現(xiàn)在或?qū)盹L(fēng)險的預(yù)測指標(biāo)是不精確的。
[0008]一旦形成了散發(fā)性腺瘤之后，新腺瘤發(fā)生的機會在26個月內(nèi)為約30%。
[0009]結(jié)直腸癌的癥狀取決于腫瘤在腸中的位置以及其是否已轉(zhuǎn)移。遺憾的是，許多癥狀也可出現(xiàn)在其他疾病中，因此癥狀可能不是結(jié)直腸癌的決定性診斷。
[0010]如果腫瘤更接近于肛門，則局部癥狀的可能性更大?？沙霈F(xiàn)排便習(xí)慣(bowelhabit)改變(在不存在另一種原因的情況下的新發(fā)便秘或腹瀉)、排便不盡的感覺和糞便直徑減小。里急后重(tenesmus)和糞便形狀改變均是直腸癌的特征。下胃腸道出血(包括糞便中排出鮮紅色血液)可指示結(jié)直腸癌，正如黏液的存在提高可指示的一樣。黑糞癥(melena)(具有焦油狀外觀的黑色糞便)通常在上消化道出血(例如，來自十二指腸潰瘍)中發(fā)生，但是有時也在結(jié) 直腸癌中遇到(當(dāng)疾病位于大腸開端時)。
[0011]大得足以充滿整個腸腔的腫瘤可導(dǎo)致腸梗阻。這種情況的特征在于便秘、腹痛、腹脹和嘔吐。這偶爾會導(dǎo)致梗阻和膨脹的腸穿孔并導(dǎo)致腹膜炎。
[0012]當(dāng)結(jié)直腸癌變?yōu)楦砥跁r，將發(fā)生該疾病的某些局部效應(yīng)。大的腫瘤更可能基于腹部感覺而被注意到，并且其可在體檢時被醫(yī)生注意到。該疾病可侵襲其他器官，并且可導(dǎo)致尿道或陰道排出物中有血液或空氣。
[0013]如果腫瘤導(dǎo)致了慢性潛隱性出血，則可發(fā)生缺鐵性貧血。這可感覺到疲乏、心悸并且觀察到面色蒼白(pallor)。結(jié)直腸癌還可導(dǎo)致體重減輕，這一般由食欲降低引起。
[0014]更不尋常的全身癥狀是不明原因發(fā)熱和數(shù)種副腫瘤綜合征(paraneoplasticsyndrome)之一。最常見的副腫瘤綜合征是血栓形成，通常為深靜脈血栓形成。
[0015]結(jié)直腸癌最常擴(kuò)散至肝。雖然這可能會被忽視，但是肝中大的沉積物可導(dǎo)致黃疸和腹痛(由于被膜拉伸)。如果腫瘤沉積物阻塞了膽管，則黃疸可伴隨有膽道阻塞(例如淺色糞便)的其他特征。
[0016]結(jié)直腸癌的發(fā)生可需要很多年，并且結(jié)直腸癌的早期診斷極大地改善了預(yù)后。對實施結(jié)直腸癌篩選方法作出的即便適度的努力也可導(dǎo)致癌癥死亡的下降。盡管如此，結(jié)直腸癌篩選率仍然很低。因此，對處于風(fēng)險提高的個體推薦進(jìn)行疾病篩選。目前有多種不同測試可用于該目的:
[0017].肓腸指檢:醫(yī)生將經(jīng)潤滑的帶有手套的手指插入直腸中以感覺異常區(qū)。雖然其僅檢測大得足以在直腸遠(yuǎn)部中感覺到的腫瘤，但是可用作初步篩選測試。[0018].大便潛血測試(Faecal occult blood test):糞便中血液的測試。兩種類型的測試可用于檢測糞便中的潛血，即基于愈創(chuàng)木脂(guaiac)的測試(化學(xué)測試)和免疫化學(xué)測試。免疫化學(xué)測試的敏感性優(yōu)于化學(xué)測試的敏感性并且沒有不可接受的特異性降低(ffeitzel JN(Decemberl999).“Genetic cancer risk assessment.Putting it alltogether”.Cancer86 (11 增刊):2483-92)。
[0019].內(nèi)窺鏡檢查:
[0020]O乙狀結(jié)腸鏡檢杳:將光探頭(Iitprobe)(乙狀結(jié)腸鏡)插入直腸和降結(jié)腸中以檢查息肉和其他異常。
[0021]O結(jié)腸鏡檢杳:將光探頭(稱為結(jié)腸鏡)插入直腸和整個結(jié)腸中以尋找息肉和可由癌癥造成的其他異常。結(jié)腸鏡檢查的優(yōu)點在于如果在所述方法期間發(fā)現(xiàn)息肉，則可立即將其移除。還可對組織進(jìn)行活檢。
[0022]?雙.對比_貝灌腸(double contrast barium enema, DCBE):首先，采取i寸夜準(zhǔn)備Pj凈化結(jié)腸。施用含有硫酸鋇的灌腸劑，然后將空氣吹入結(jié)腸中，使其膨脹。結(jié)果是在結(jié)腸的內(nèi)襯上形成基于X射線膠片可視的鋇薄膜?？赏ㄟ^該方式檢測癌癥或癌前期息肉。該技術(shù)可能漏掉(較不常見的)扁平息肉(flat polyp)。
[0023].虛擬結(jié)腸鏡檢杳代替具有專門計算機斷層掃描的雙對比鋇灌腸(上述)中的X射線膠片，并且需要專門的工作站軟件用于放射科醫(yī)師解釋。該技術(shù)在對息肉的敏感性方面接近結(jié)腸鏡檢 查。但是，發(fā)現(xiàn)的任何息肉仍必須通過標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸鏡檢查移除。
[0024].標(biāo)準(zhǔn)計算機軸向斷層掃描是可用于確定癌癥擴(kuò)散程度的X射線基礎(chǔ)，但是其敏感性不足以用于篩選。因其他原因進(jìn)行的CAT掃描中發(fā)現(xiàn)一些癌癥。
[0025].血液測試:測量患者血液中某些蛋白質(zhì)的升高水平可給出腫瘤負(fù)荷的指示。特別地,血液中高水平的癌胚抗原(carcinoembroynic antigen,CEA)可指示腺癌的轉(zhuǎn)移。這些測試經(jīng)常是假陽性或假陰性的，不推薦用于篩選，并且其可用于評估疾病復(fù)發(fā)。CA19-9和CA242生物標(biāo)志物可指示e-選擇素相關(guān)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，幫助追蹤治療進(jìn)展，并且評估疾病復(fù)發(fā)。最近，用于在血漿中檢測隔蛋白(Septin)9基因甲基化序列的測定也變得可用于輔助診斷結(jié)直腸癌。
[0026].lH電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomoRraphy, PET)是將放射性糖注入患者中的3維掃描技術(shù)，在具有高代謝活性的組織中收集糖，并通過測量來自糖的輻射發(fā)射形成圖像。因為癌細(xì)胞通常具有非常高的代謝速率，所以這可用于區(qū)分良性和惡性腫瘤。PET不用于篩選并且在結(jié)直腸癌病例的常規(guī)病情檢查(workup)中(尚)未具有位置。
[0027].全身PET成像是用于檢測復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌的最準(zhǔn)確診斷測試，并且是區(qū)分可切除疾病與不可切除疾病的合算的方法。每當(dāng)主要管理決策有賴于腫瘤存在和程度的準(zhǔn)確評價時，需要進(jìn)行PET掃描。
[0028].糞便DNA測試是篩選結(jié)直腸癌的新興技術(shù)。惡變前腺瘤和癌癥使DNA標(biāo)志物從其細(xì)胞中排出，其在消化過程期間不降解并且在糞便中保持穩(wěn)定。捕獲，然后進(jìn)行PCR使DNA擴(kuò)增至可檢測水平用于測定。
[0029].高的C-反應(yīng)蛋白水平作為風(fēng)險標(biāo)志物
[0030](http://www.sciencedaily.com/reIeases/2010/04/100419150831, htm)。
[0031]盡管存在這些測試，但是診斷仍然成問題。大多數(shù)更敏感的測試是非常侵入性和昂貴的，因此患者很少被患者采用。因此，仍然需要開發(fā)更簡單且信息性更大的診斷方案或者能夠在更可能已患腺瘤或癌的人中引導(dǎo)結(jié)腸鏡檢查的診斷輔助手段。簡單且準(zhǔn)確的篩選測試將使得能夠建立可更廣泛地應(yīng)用的篩選系統(tǒng)。類似地，對于乳腺癌，如果在早期診斷出癌癥，則預(yù)后顯著更好，這通常難以可靠地實現(xiàn)，因為除了 BRCA基因測試作為侵略性癌癥亞組的預(yù)后指標(biāo)之外，仍然主要依賴于乳房X線檢查(mammogram)和自身檢查來鑒定腫瘤，所述兩種技術(shù)對于可靠檢測非常早期的癌癥都是不足夠敏感的。
[0032]在本發(fā)明之前的工作中，已確定了 L0C100526820(特別是L0C100526820的兩個特定區(qū)域)的甲基化改變指示大腸贅生物(例如腺瘤和腺癌)的發(fā)生。另外，鑒定變?yōu)楦呒谆奶禺愋曰蚪MDNA胞嘧啶核苷酸使得能夠開發(fā)非常簡單和特異的擴(kuò)增反應(yīng)用于診斷情況下的常規(guī)使用。
[0033]發(fā)明概述
[0034]貫穿本說明書和所附權(quán)利要求書，除非上下文另有需要，否則詞語“包括”及其變體“包含”和“含有”將理解為意指包括所陳述的整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組，但是不排除任何其他的整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。
[0035]本文中使用的術(shù)語“來源于”應(yīng)認(rèn)為指示特定的整數(shù)或整數(shù)組起源于所指定物種，但是不一定直接由所指定來源獲得。此外，除非上下文另有明確規(guī)定，否則本文中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。
[0036]除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所普遍理解的相同含義。
[0037]本說明書包括本文在文獻(xiàn)目錄之后示出的使用程序Patentln3.5版準(zhǔn)備的核苷酸序列信息。在序列表中，通過數(shù)字指示符〈210〉然后是序列標(biāo)識符(例如，〈210>1、〈210>2等)來確定每個核苷酸序列。數(shù)字指示符字段〈211〉、〈212〉和〈213〉提供的信息分別指示序列(DNA等)的長度、類型以及每條序列的來源生物。本說明書所提及的核苷酸序列由指示符SEQ ID NO:然后是序列標(biāo)識符(例如，SEQ ID NO:USEQ ID NO:2等)來確定。本說明書所涉及的序列標(biāo)識符與序列表中數(shù)字指示符字段〈400〉后面是序列標(biāo)識符(例如，〈400>1、〈400>2等)提供的信息相關(guān)聯(lián)。即，本說明書中詳述的SEQ ID NO:1與序列表中指不為〈400>1的序列相關(guān)。
[0038]本發(fā)明的一個方面涉及一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834097-163834982限定的DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，并且其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0039]在另一個方面中，提供了一種在人中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834097-163834982限定的DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，并且其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0040]本發(fā)明的又一個方面涉及一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，所述DNA 區(qū)域選自由 Hgl9 坐標(biāo) Chr6:163834295-163834500 或 Chr6:163834621-163834906 限定的DNA區(qū)域之一或二者，其中這些DNA區(qū)域之一或二者較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0041]在再一個方面中，提供了一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，所述DNA區(qū)域選自由 Hgl9 坐標(biāo) Chr6:163834393-163834519 或 Chr6:163834393-163834455 限定的DNA區(qū)域之一或二者，其中這些DNA區(qū)域之一或二者較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0042]在本發(fā)明的再一個方面中，提供了一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估一個或更多個選自以下的胞嘧啶殘基或相反DNA鏈上第n+1位處對應(yīng)的胞嘧啶的甲基化:
[0043]Chr6:163834330 Chr6:163834332 Chr6:163834357
[0044]Chr6:163834373 Chr6:163834384 Chr6:163834390
[0045]Chr6:163834392 Chr6:163834406 Chr6:163834412
[0046]Chr6:163834419 Chr6:163834443 Chr6:163834448
[0047]Chr6:163834452 Chr6:163834464 Chr6:163834483
[0048]Chr6:163834653 Chr6:163834660 Chr6:163834672
[0049]Chr6:16383467 5 Chr6:163834678 Chr6:163834681
[0050]Chr6:163834815 Chr6:163834824 Chr6:163834835
[0051]Chr6:163834840 Chr6:163834853 Chr6:163834855
[0052]Chr6:163834858 Chr6:163834863 Chr6:163834869
[0053]Chr6:163834872
[0054]其中相對于對照樣品中對應(yīng)殘基的甲基化水平，一個或更多個所述殘基較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0055]在另一個方面中，使用包括以下步驟的方法確定本發(fā)明DNA區(qū)域中提高的甲基化:
[0056](i)在足以誘導(dǎo)誘變的條件下用使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理來源于生物樣品的DNA ；
[0057](ii)使用設(shè)計成擴(kuò)增由SEQ IDNO:1、2、3或4之一限定的DNA區(qū)域的引物擴(kuò)增步驟⑴的DNA ；
[0058](iii)對步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，以確定相對于來自對照樣品的DNA中的對應(yīng)突變殘基，來自所述測試樣品的DNA中未經(jīng)歷突變的一個或更多個胞嘧啶殘基的存在。
[0059]在另一個方面中，用亞硫酸氫鹽或等效試劑誘導(dǎo)所述誘變并且非甲基化胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。
[0060]本發(fā)明的另一個方面涉及一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hg 19坐標(biāo)Chr6:163834295-163834500限定的DNA區(qū)域的表達(dá)水平，并且其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域較低的表達(dá)水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0061]本發(fā)明的另一個方面提供了用于測定生物樣品的診斷試劑盒，其包含用于檢測本發(fā)明標(biāo)志物的一種或更多種物質(zhì)以及可用于幫助所述物質(zhì)進(jìn)行檢測的試劑。還可包含另一些裝置，例如以接收生物樣品。所述物質(zhì)可以是任意合適的檢測分子。
[0062]在一個實施方案中，所述試劑盒包含對應(yīng)于SERQ IDNO:5、6、7、8、9、10、11或12的一種或更多種核酸分子或者基本上相似的核酸分子。如上文詳述的，這些序列可用作評估由測試樣品擴(kuò)增的產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)(對照)。
[0063]在另一個實施方案中，所述試劑盒包含一個或更多個擴(kuò)增引物組(primer set),所述引物組對應(yīng)于如下序列:
[0064](i) SEQ ID NO:13和14或者基本上相似的序列；
[0065](ii) SEQ IDNO: 13、14和15或者基本上相似的序列；
[0066](iii) SEQ ID NO:18和19或者基本上相似的序列；
[0067](iv) SEQ ID NO:20和21或者基本上相似的序列。
[0068]附圖簡述
[0069]圖1:指示了甲基化位置的SEQ ID NO:1。
[0070]紅色線:在10個結(jié)直腸癌標(biāo)本中測量的甲基化比例 [0071]藍(lán)色線:在10個正常結(jié)腸標(biāo)本中測量的甲基化比例
[0072]圖2:指示了甲基化位置的SEQ ID NO:2。
[0073]紅色線:在10個結(jié)直腸癌標(biāo)本中測量的甲基化比例
[0074]藍(lán)色線:在10個正常結(jié)腸標(biāo)本中測量的甲基化比例
[0075]圖3描繪了 SEQ ID NO:1和2序列以及L0C100526820的染色體位置編號。
[0076]發(fā)明詳述
[0077]本發(fā)明部分基于闡明表征大腸和乳腺贅生物的DNA甲基化狀態(tài)來進(jìn)行預(yù)測。該發(fā)現(xiàn)現(xiàn)已幫助開發(fā)了基于相對于對照水平L0C100526520DNA區(qū)域提高的甲基化來篩選大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向的常規(guī)方法。根據(jù)本發(fā)明，已確定該DNA區(qū)域受到調(diào)節(jié)，關(guān)于其甲基化水平的差異性改變的調(diào)節(jié)，取決于所討論細(xì)胞是否是贅生性的。應(yīng)理解，所討論的DNA區(qū)域通過參照其名稱及其染色體坐標(biāo)二者在本文中進(jìn)行了描述。就列出對應(yīng)于DNA區(qū)域的染色體坐標(biāo)來說，其與2009年2月推出的人基因組數(shù)據(jù)庫Hg 19版本(本文稱為“Hg 19坐標(biāo)”)相一致。
[0078]因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834097-163834982限定的DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，并且其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0079]提及“大腸”應(yīng)理解為提及來源于大腸的八個解剖學(xué)區(qū)域之一的細(xì)胞，所述區(qū)域開始于回腸的末端區(qū)域之后，這些區(qū)域是:
[0080]⑴盲腸；
[0081](ii)升結(jié)腸；
[0082](iii)橫結(jié)腸；
[0083](iv)降結(jié)腸；
[0084](V)乙狀結(jié)腸；
[0085](vi)直腸；
[0086](vii)脾曲；和[0087](viii)肝曲。
[0088]本發(fā)明不受限于任何一種理論或作用模式，哺乳動物乳腺是隨年齡、月經(jīng)周期和生殖狀況變化的結(jié)構(gòu)上動態(tài)的器官。其是表現(xiàn)出分泌腺泡的分枝狀管泡狀腺，所述分泌腺泡通過內(nèi)小葉分組并流入小葉內(nèi)導(dǎo)管中，進(jìn)而流入小葉間導(dǎo)管中。小葉組織成15至20個葉，其各自注入隔開的輸乳管道中并從那里注入輸乳管中。小葉內(nèi)基質(zhì)由小葉上皮組分周圍具有激素敏感性纖維母細(xì)胞區(qū)帶的疏松結(jié)締組織組成。這些被認(rèn)為在形態(tài)發(fā)生和分化期間參與上皮/基底膜/基質(zhì)誘導(dǎo)性相互作用。乳腺在個體的多個生命周期階段期間經(jīng)歷獨特的分化和增殖發(fā)育。因此，應(yīng)理解，提及乳腺是提及包括其發(fā)育的任何階段(青春期前、青春期、產(chǎn)前、產(chǎn)后/哺乳和絕經(jīng)后階段)中的乳腺的細(xì)胞。在這一點上，還應(yīng)理解，任何給定的細(xì)胞群體僅可瞬時存在于乳腺中，例如為了有助于哺乳在妊娠期間生成的那些細(xì)胞群體。
[0089]提及“贅生物”應(yīng)理解為提及包含贅生性細(xì)胞的病變、腫瘤或其他包封或未包封腫塊或其他生長形式?！百樕约?xì)胞”應(yīng)理解為提及表現(xiàn)出異常生長的細(xì)胞。術(shù)語“生長”應(yīng)以其最廣意義理解并且包括提及增殖。在這一點上，異常細(xì)胞生長的一個實例是細(xì)胞的不受控增殖。另一個實例是細(xì)胞中的凋亡失敗，從而延長了其通常的壽命。贅生性細(xì)胞可以是良性細(xì)胞或惡性細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，對象腫瘤是腺瘤或腺癌。本發(fā)明不受限于任何一種理論或作用模式，腺瘤一般是上皮起源的良性腫瘤，其來源于上皮組織或表現(xiàn)出清晰界定的上皮結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可具有腺外觀。在腺瘤中可包含惡性細(xì)胞群體，例如隨著良性腺瘤或良性贅生性病變進(jìn)展發(fā)生惡性腺癌。
[0090]優(yōu)選地，所述贅生性細(xì)胞是腺瘤或腺癌，并且甚至更優(yōu)選是結(jié)直腸或乳腺腺瘤或腺癌。 [0091]提及“DNA區(qū)域”應(yīng)理解為提及基因組DNA的特定部分。參照一組染色體坐標(biāo)來說明這些DNA區(qū)域，這些坐標(biāo)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。如上文所詳述的，本文所述DNA區(qū)域的染色體坐標(biāo)對應(yīng)于基因組的Hgl9版本。一般來說，常規(guī)地可參照基因的染色體位置鑒定基因，通過染色體位置可常規(guī)地得到其序列。還應(yīng)理解，提及DNA區(qū)域Chr6:163834097-163834982與在本文中提及名稱L0C100526820是可互換的。SEQ ID NO:17中提供了該基因座的886個核苷酸反向鏈序列。
[0092]本文中公開了落入該基因座的另一些DNA區(qū)域。這些DNA區(qū)域如下:
[0093](i)Chr6:163834295-163834500，其核苷酸序列為:
[0094]atctgtaaaa atgttgactt ctgcttttca gactacgcgc acagcctctt tatttcctactgcggcttca ttccctcacg gaacactgac gccatcgcga aggaagcatt tcgagcacga ctgacgctccccttattatt tgctaagccg ctgcgctcgg gtctggctac gatttgcttt cagaataacg ggaaggtgcaacaaga(SEQ ID NO:1)；
[0095](ii)Chr6:163834621-163834906，其核苷酸序列為:
[0096]gccgtgctgc tttccagcct ctcagcaaat cacgaacacc gaaagaagcc acggcggcgacgggaggggc gtcgcgcgtg cttccctcgg cgacaaagcg ggagccgggc gcgccggccg agggcgcccggcgcagagtc ccgcagaggc ggacgccgcg gcacgcgcct cgaaaagcct caaactctta tcctcggctctcccgcccca cctccgcccc gcagccaaga cccgcgccgt ggcgggcccg acggccaagg aaagcccaccagccctccgc accgtg(SEQ ID NO:2)；[0097](iii)Chr6:163834393-163834455，其核苷酸序列為:
[0098]gaaggaagcatttcgagcacgactgacgctccccttattatttgctaagccgctgcgctcggg(SEQ IDNO:3)；
[0099](iv)Chr6:163834393-163834519，其核苷酸序列為:
[0100]gaaggaagcatttcgagcacgactgacgctccccttattatttgctaagccgctgcgctcgggtctggctacgatttgctttcagaataacgggaaggtgcaacaagatcgcttccctagaggcgcg(SEQ ID NO:4).[0101]SEQIDN0:1和2表示L0C100526820基因座中的兩個不同區(qū)域。SEQ ID NO:3和4表示SEQ ID NO:1中的兩個區(qū)域，并且SEQ ID NO:3區(qū)域?qū)嶋H上落入較長的SEQ ID NO:4區(qū)域。下文中更詳細(xì)地討論了所有的這些區(qū)域。
[0102]提及每一個以上詳述的DNA區(qū)域，應(yīng)理解為提及分子的所有形式及其片段或變體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，已知一些DNA區(qū)域在個體之間表現(xiàn)出等位基因變異或單核苷酸多態(tài)性。SNP包括不同大小的簡單序列重復(fù)(例如二核苷酸和三核苷酸重復(fù))的插入和缺失。變體包括來自相同區(qū)域的享有至少90%、95%、98%、99%序列同一性(即相對于本文所述DNA區(qū)域具有一個或更多個缺失、添加、替換、逆序序列等)的核酸序列。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明延伸至這樣的變體，盡管事實上在個體之間可存在真實核酸序列之間很小的遺傳變異，其在目前的診斷應(yīng)用方面也實現(xiàn)相同結(jié)果。因此，應(yīng)理解本發(fā)明延伸至由任意其他突變、多態(tài)性變異或等位基因變異產(chǎn)生的DNA的所有形式。
[0103]應(yīng)理解，是測試對象的“個體”可以為任意人或非人哺乳動物。非人哺乳動物的實例包括靈長類、家畜動物(如馬、牛、綿羊、豬、驢)、實驗室測試動物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、寵物(如狗、貓)和俘獲的野生動物(如鹿、狐貍)。優(yōu)選地，哺乳動物是人。
[0104]根據(jù)該實施方案，提供了一種在人中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834097-163834982限定的DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0105]本發(fā)明不受限于任何一種理論或作用模式，雖然測量L0C100526820的甲基化水平可診斷大腸腫瘤或乳腺病癥，但是已確定L0C100526820中的兩個不同區(qū)域在這一點上是特別有用的，因為這些區(qū)域包含在大腸和乳腺贅生物(例如結(jié)直腸癌)中頻繁高甲基化的高密度CpG 二核苷酸。
[0106]因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，所述DNA區(qū)域選自由Hgl9坐標(biāo)Chr6: 163834295-163834500或Chr6:163834621-163834906限定的區(qū)域之一或二者，其中這些DNA區(qū)域之一或二者較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0107]在又一個實施方案中，作為分析對象的DNA區(qū)域是落入SEQ ID N0:1區(qū)域的 Chr6: 163834393-163834519 (SEQ ID NO:4)或者落入 SEQ ID NO:4 區(qū)域的 Chr6:163834393-163834455 (SEQ ID NO:3)。在一個特定的實施方案中，已開發(fā)了基于PCR的測定并且適用于這兩種更小的DNA區(qū)域的情況中。下文中更詳細(xì)地討論了這些。
[0108] 根據(jù)該實施方案，提供了一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，所述DNA區(qū)域選自由 Hgl9 坐標(biāo) Chr6:163834393-163834519 或 Chr6:163834393-163834455 限定的區(qū)域之一或二者，其中這些DNA區(qū)域之一或二者較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0109]在另一個實施方案中，所述贅生性細(xì)胞是腺瘤或腺癌，并且甚至更優(yōu)選是結(jié)直腸或乳腺腺瘤或腺癌。
[0110]本發(fā)明不受限于任何一種理論或作用模式，DNA甲基化在細(xì)菌、植物和動物中是普遍的。DNA甲基化是DNA的化學(xué)修飾類型，其在細(xì)胞分裂循環(huán)中是穩(wěn)定的，但是不涉及生物體基本DNA序列的改變。染色質(zhì)和DNA修飾是表觀遺傳學(xué)的兩個重要特征并且在細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用，允許細(xì)胞穩(wěn)定維持不同的特征(盡管包含相同的基因組物質(zhì))。在真核生物體中，DNA甲基化僅發(fā)生在胞嘧啶嘧啶環(huán)的5號碳上。在哺乳動物中，DNA甲基化大多數(shù)發(fā)生在CpG 二核苷酸的胞嘧啶的5號碳上。CpG 二核苷酸構(gòu)成約I %的人基因組。
[0111]所有CpG的70%至80%是甲基化的。CpG可集中成簇，稱為“CpG島”，其存在于多種基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)中并且經(jīng)常是非甲基化的。在許多疾病過程(如癌癥)中，基因啟動子和/或CpG島獲得異常高甲基化，這與遺傳性轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)。DNA甲基化可通過兩種方式影響基因的轉(zhuǎn)錄。首先，DNA甲基化可自身物理地阻礙轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)與基因結(jié)合，從而阻斷轉(zhuǎn)錄。第二，甲基化DNA可與稱為甲基CpG結(jié)合域蛋白(Methyl-CpG-binding domain protein,MBD)的蛋白質(zhì)結(jié)合。然后，MBD蛋白將另外的蛋白質(zhì)募集至基因座，例如組蛋白脫乙酰酶和可修飾組蛋白的其他染色質(zhì)重構(gòu)蛋白，從而形成緊湊的失活染色質(zhì)，稱為沉默染色質(zhì)。DNA甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的這種聯(lián)系是非常重要的。特別地，甲基CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)與Rett綜合征有關(guān)并且甲基CpG結(jié)合域蛋白2(MBD2)介導(dǎo)癌癥中高甲基化基因的轉(zhuǎn)錄沉默。
[0112]在人中，DNA甲基化過程通過三種酶進(jìn)行——DNA甲基轉(zhuǎn)移酶l、3a和3b(DNMTl、DNMT3a、DNMT3b)。認(rèn)為DNMT3a和DNMT3b是從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，其在發(fā)育早期建立DNA甲基化模式。DNMTl是建議的維持甲基轉(zhuǎn)移酶，其負(fù)責(zé)在DNA復(fù)制期間將DNA甲基化模式拷貝至子鏈。DNMT3L是與其他DNMT3同源但是沒有催化活性的蛋白質(zhì)。相反地，DNMT3L通過提高其結(jié)合DNA的能力并刺激其活性以有助于從頭甲基轉(zhuǎn)移酶。最后，DNMT2已被鑒定為“神秘的”DNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源物，其包含所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共有的所有10種序列模體；但是，DNMT2不能使DNA甲基化，而是表現(xiàn)為使小RNA甲基化。
[0113]因此，“甲基化狀態(tài)”應(yīng)理解為提及DNA區(qū)域中一個特定核苷酸或多個核苷酸中甲基化的存在、不存在和/或量。特定DNA序列(例如，本文所述的DNA區(qū)域)的甲基化狀態(tài)可指示序列中每個堿基的甲基化狀態(tài)，或者可指示序列中堿基對(例如，胞嘧啶)子集的甲基化狀態(tài)或者一個或更多個特異性限制酶識別序列的甲基化狀態(tài)，或者可指示關(guān)于序列中局部甲基化密度的信息而不提供序列中甲基化發(fā)生位置的精確信息。甲基化狀態(tài)可任選地由“甲基化值”表示或指示。例如，可通過對在用甲基化依賴性限制酶進(jìn)行限制消化后存在的完整DNA的量進(jìn)行定量來產(chǎn)生甲基化值。在該實例中，如果使用定量PCR定量DNA中的特定序列，則約等于模擬處理對照的模板DNA量指示序列不是高度甲基化的，而遠(yuǎn)小于模擬處理樣品中發(fā)生的模板量指示序列中甲基化DNA的存在。因此，值(即，甲基化值)，例如來自上述實例的值，代表甲基化狀態(tài)，并由此可用作甲基化狀態(tài)的定量指標(biāo)。當(dāng)期望對樣品中序列的甲基化狀態(tài)與閾值進(jìn)行比較時，這是特別有用的。[0114]本發(fā)明的方法基于比較生物樣品特定DNA區(qū)域的甲基化水平與這些DNA區(qū)域的對照甲基化水平。“對照水平”是“正常水平”，其是對應(yīng)的非贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者非贅生性細(xì)胞群體或者另一種可分離DNA用于測定的生物樣品(例如血漿)中DNA區(qū)域的甲基化水平。
[0115]可使用來源于作為測試對象的相同個體的非贅生性組織來測定正常(或“非贅生性”)甲基化水平。但是，應(yīng)理解，這對于所涉及個體的侵入性相當(dāng)大，因此可能更便于相對于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果分析測試結(jié)果，所述標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果反映出得自于除所討論患者之外的個體的個體結(jié)果或總體結(jié)果。事實上，這后一種分析形式是分析的優(yōu)選方法，因為其使得能夠設(shè)計需要收集和分析單一生物樣品(目的測試樣品)的試劑盒。提供正常甲基化水平的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意合適的方法來計算。例如，可根據(jù)本發(fā)明基因的甲基化水平來評估正常組織的群體，從而提供分析所有將來的測試樣品的標(biāo)準(zhǔn)值或值范圍。還應(yīng)理解，正常水平可由特定群體的對象確定，并且用于來源于所述群體的測試樣品。因此，可確定對應(yīng)于在諸如年齡、性別、種族或健康狀態(tài)的特征方面不同的群體的標(biāo)準(zhǔn)值或范圍的數(shù)值。所述“正常水平”可以是離散水平或水平的范圍。相對于正常水平，對象基因的甲基化水平提高指示組織是贅生性的。
[0116]術(shù)語“甲基化”應(yīng)視為意指存在通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用添加至核酸(例如基因組DNA)區(qū)域中的一個或多個胞嘧啶堿基的甲基。如本文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于確定核酸甲基化的水平或程度的多種方法。
[0117]“較高的水平”意指與對照樣品相比，所診斷對象中甲基化CpG 二核苷酸的較高數(shù)目，即，在特定CpG位點處甲基化的DNA分子的比例較高或者在所述對象中具有較高數(shù)目的不同的甲基化CpG位點。應(yīng)理解，術(shù)語“增強的”和“提高的”可與術(shù)語“較高的”可互換使用。本發(fā)明不受限于認(rèn)為在對象中診斷為贅生物的甲基化殘基的精確數(shù)目，原因是患者對象之間會發(fā)生一些變化。 本發(fā)明還不受限于甲基化殘基的定位。然而，已鑒定了在大腸贅生物(特別是腺瘤和良性贅生性病變)情況下經(jīng)歷高甲基化的特定胞嘧啶殘基的數(shù)目。這些胞嘧啶殘基定位至由SEQ ID NO:1和2限定的L0C100526820區(qū)域。因此，在一個實施方案中，可采用這樣的篩選方法，其具體涉及評估這些殘基的一個或更多個或者相反鏈上第n+1位處對應(yīng)的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。
[0118]根據(jù)該實施方案，提供了一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估一個或更多個選自以下的胞嘧啶殘基或相反DNA鏈上第n+1位處對應(yīng)的胞嘧啶的甲基化狀態(tài):
[0119]Chr6:163834330 Chr6:163834332 Chr6:163834357
[0120]Chr6:163834373 Chr6:163834384 Chr6:163834390
[0121]Chr6:163834392 Chr6:163834406 Chr6:163834412
[0122]Chr6:163834419 Chr6:163834443 Chr6:163834448
[0123]Chr6:163834452 Chr6:163834464 Chr6:163834483
[0124]Chr6:163834653 Chr6:163834660 Chr6:163834672
[0125]Chr6:163834675 Chr6:163834678 Chr6:163834681
[0126]Chr6:163834815 Chr6:163834824 Chr6:163834835
[0127]Chr6:163834840 Chr6:163834853 Chr6:163834855[0128]Chr6:163834858 Chr6:163834863 Chr6:163834869
[0129]Chr6:163834872
[0130]其中相對于對照樣品中對應(yīng)殘基的甲基化水平，一個或更多個所述殘基較高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0131 ] 參照圖3描繪的SEQ ID NO:1和2序列對這些染色體6位置進(jìn)行編號。
[0132]本發(fā)明不受限于任何一種理論或作用模式，贅生物的形成既涉及基因變化(點突變、缺失、基因擴(kuò)增或排列)，也涉及一系列表觀遺傳變化，包括特異性基因座位上的DNA甲基化和改變的組蛋白修飾。這些變化中最普遍的特征是CpG島基因啟動子的高甲基化。如更早之前詳述的，這樣的高甲基化通常與基因表達(dá)沉默有關(guān)。在許多情況下，認(rèn)為這種甲基化相關(guān)基因沉默在贅生物形成中發(fā)揮著重要作用，例如通過使腫瘤抑制基因(如pl6或Rb)或DNA修復(fù)基因(如MLHl或MGMT)沉默來發(fā)揮作用。
[0133]用于分析DNA甲基化的全基因組技術(shù)被越來越多地用于鑒定不同細(xì)胞類型或疾病狀態(tài)(包括癌癥)中DNA甲基化的變化，并且不同的生物化學(xué)和信息途徑被用于鑒定DNA甲基化變化的交疊集(Robinson等Epigenomics2:587-98 (2010))。在本發(fā)明的情況下，亞硫酸氫鹽標(biāo)記技術(shù)用于產(chǎn)生DNA的分開的甲基化和非甲基化級分，其基礎(chǔ)是其在MspI (CCGG)或TagI (TCGA)限制酶位點中的CpG位點處的甲基化狀態(tài)。
[0134]可對任意合適的生物樣品執(zhí)行本發(fā)明的檢測方法。為此，提及“生物樣品”應(yīng)理解為提及來源于動物的生物材料的任意樣品，例如但不限于細(xì)胞材料、生物流體(如血液)、糞便、組織活檢標(biāo)本、外科手術(shù)標(biāo)本或引入動物體內(nèi)并隨后移除的流體(例如，從灌腸洗液中重新獲得的溶液)。根 據(jù)本發(fā)明方法測試的生物樣品可直接測試或者可能在測試之前需要一些形式的處理。例如，活檢或外科手術(shù)樣品可能在測試之前需要均化，或者其可能需要切片以原位測試各個基因的定性表達(dá)水平?；蛘撸?xì)胞樣品可能在測試之前需要透化。此外，就生物樣品不是液體形式(如果需要測試這樣的形式)來說，其可能需要添加試劑(例如緩沖劑)以使樣品流通。
[0135]就生物樣品中存在目的DNA區(qū)域來說，可直接測試生物樣品，否則可在測試之前分離生物樣品中存在的全部或一些核酸。在另一個實例中，可在分析之前將樣品部分純化或富集。例如，就生物樣品包含各種各樣的細(xì)胞群體來說，可期望富集特定目的的亞群體。在測試之前處理靶細(xì)胞群體或從其來源的分子(例如，使肝病毒失活)在本發(fā)明的范圍中。還應(yīng)理解，可新鮮收獲生物樣品，或者可在測試之前將其存儲(例如冷凍)或者在測試之前對其進(jìn)行處理(例如，通過進(jìn)行培養(yǎng))。
[0136]選擇最適合于根據(jù)本文所述方法進(jìn)行測試的樣品類型將取決于情況的性質(zhì)。優(yōu)選地，所述樣品是糞便(糞)樣品、灌腸洗液、外科手術(shù)切除、組織活檢或血液樣品(例如，全血、血清或血衆(zhòng))。
[0137]更優(yōu)選地，所述生物樣品是血液樣品、活檢樣品或糞便樣品。
[0138]如上文中詳述的，本發(fā)明被設(shè)計成篩選位于大腸或乳腺中的贅生性細(xì)胞或細(xì)胞群體。因此，提及“細(xì)胞或細(xì)胞群體”應(yīng)理解為提及單個細(xì)胞或細(xì)胞的組。所述細(xì)胞的組可以是細(xì)胞的擴(kuò)散群體、細(xì)胞懸液、細(xì)胞的包封群體或表現(xiàn)為組織形式的細(xì)胞群體。
[0139]提及贅生物(如腺瘤或腺癌)的“發(fā)生”，應(yīng)理解為提及表現(xiàn)出異型增生的個體的一個或更多個細(xì)胞。在這一點上，腺瘤或腺癌可發(fā)育良好，因為形成了發(fā)育異常細(xì)胞塊?；蛘?，腺瘤或腺癌可處于極早期，因為在診斷時僅發(fā)生了相對很少的異常細(xì)胞分裂。本發(fā)明還延伸至評估個體形成贅生物(如腺瘤或腺癌)的傾向。本發(fā)明不受限于任何方式，改變的甲基化水平可指示個體發(fā)生贅生物(例如，進(jìn)一步發(fā)生腺瘤或腺癌或者另一種腺瘤或腺癌)的傾向。
[0140]雖然優(yōu)選方法是評估甲基化水平用于診斷贅生物形成或其傾向，但是在某些情況下可期望檢測到所述甲基化水平的逆向變化，例如，以監(jiān)測涉及調(diào)節(jié)贅生物病癥(如腺瘤或腺癌發(fā)生)的治療性或預(yù)防性治療的有效性。例如，甲基化水平提高指示個體患有以腺瘤或腺癌發(fā)生為特征的病癥，在治療性治療方案開始之后篩選甲基化水平的降低可用于指示贅生性細(xì)胞的成功清除。在另一個實例中，可使用該方法來測試腫瘤切除邊緣中的組織，以確定是否移除了腫瘤的全部邊 緣。
[0141]因此，本方法可用于疾病風(fēng)險的診斷、預(yù)后、分類、預(yù)測，疾病復(fù)發(fā)的檢測以及多種贅生物類型的治療選擇?？蓹z測到任意進(jìn)展分期中的癌癥，例如，原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌和復(fù)發(fā)癌。
[0142]本發(fā)明提供了這樣的方法，其用于確定哺乳動物(例如，人)是否具有大腸或乳腺贅生物，提取自哺乳動物的生物樣品是否包含贅生性細(xì)胞或來源于贅生性細(xì)胞的DNA，估計哺乳動物發(fā)生贅生物的風(fēng)險或可能性，監(jiān)測抗癌治療的效力，或者為患癌癥的哺乳動物選擇適當(dāng)?shù)目拱┲委?。這樣的方法基于確定贅生性細(xì)胞在本文所述DNA區(qū)域中具有不同于正常細(xì)胞的甲基化狀態(tài)。因此，通過確定細(xì)胞在本文所述DNA區(qū)域中是否包含差異性甲基化的序列，可確定細(xì)胞是否是贅生性的。
[0143]本發(fā)明的方法可用于評價已知具有或懷疑具有贅生物的個體或者用作常規(guī)臨床測試，即，在不一定懷疑具有贅生物的個體中?？蛇M(jìn)行另外的診斷測定以確定個體中贅生物的狀態(tài)并且確定贅生物的類型。例如，如果血液測試結(jié)果指示存在贅生物，則可必需進(jìn)行另外的篩選以確定贅生物的起源是乳腺還是大腸。
[0144]此外，本發(fā)明方法可用于評估治療過程的效力。例如，可通過在患癌癥的哺乳動物中隨時間監(jiān)測本文所述序列的DNA甲基化來評估抗癌治療的效力。例如，與在治療前或在治療早期提取自哺乳動物的樣品中的水平相比，在治療后提取自哺乳動物的生物樣品中本發(fā)明診斷序列中任意一種的甲基化降低或缺少，指示有效的治療。
[0145]因此，本發(fā)明方法可用作一次性測試，或者用作認(rèn)為具有贅生物風(fēng)險的那些個體的監(jiān)測手段(monitor)，或者用作涉及抑制或以其他方式減慢贅生物發(fā)生的治療性或預(yù)防性治療方案有效性的監(jiān)測手段。在這些情況下，繪制任何一種或更多種類別生物樣品中甲基化水平的調(diào)節(jié)是個體狀態(tài)或者目前使用的治療性或預(yù)防性方案有效性的有價值的指標(biāo)。因此，應(yīng)理解本發(fā)明方法延伸至相對于甲基化正常水平(如前文定義)或者相對于由個體的生物樣品確定的一個或更多個早期甲基化水平，監(jiān)測所述個體中甲基化水平的提高或降低。
[0146]用于檢測贅生物的方法可包括檢測一種或更多種其他的癌癥相關(guān)多核苷酸或多肽序列。因此，通過本發(fā)明方法檢測甲基化可單獨使用或與用于贅生物診斷或預(yù)后的其他篩選方法組合使用。
[0147]用于檢測DNA甲基化的任何方法都可用于本發(fā)明的方法。多種方法可用于檢測原始組織樣品中或患者樣品(如血液、尿、糞便或唾液)中特異性基因座處差異性甲基化的DNA (綜述于 Kristensen 和 Hansen, Clin Chem.55: 1471-83, 2009 ；Ammerpohl 等.BiochimBiophys Acta.1790:847-62,2009 ；Shames 等.Cancer Lett.251: 187-98,2007 ；Clark等.Nat Protoc.1:2353-64, 2006中)。為了分析靶基因中DNA甲基化的比例或程度，通常用亞硫酸氫鈉處理DNA并使用將獨立擴(kuò)增甲基化狀態(tài)DNA的引物和PCR條件擴(kuò)增目的區(qū)域。然后可通過測序(包括焦磷酸測序、限制酶消化(COBR))或通過解鏈曲線分析來評估總體擴(kuò)增子或各個CpG位點的甲基化?；蛘?，可使用用于在特定CpG位點上分析甲基化的基于連接的方法。檢測由腫瘤釋放到體液中的異常甲基化DNA發(fā)展為癌癥診斷的手段。本文中，在高甲基化序列的情況下，必需使用允許從非甲基化的正常細(xì)胞DNA背景中選擇性擴(kuò)增甲基化DNA序列的敏感方法。基于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的這些方法包括例如，甲基化選擇性PCR(MSP) ,Heavymethyl PCRoHeadloop PCR和 Helper 依賴性鏈反應(yīng)(PCT/AU2008/001475)。
[0148]簡言之，在一些實施方案中，用于檢測甲基化的方法包括隨機剪切或隨機片段化基因組DNA，用甲基化依賴性或甲基化敏感性限制酶切割DNA隨后選擇性鑒定和/或分析切割的DNA和未切割的DNA。選擇性鑒定可包括例如分離切割的DNA與未切割的DNA (例如，通過大小)以及定量被切割或未被切割的目的序列。參見，例如美國專利N0.7，186,512。或者，所述方法可包括在限制酶消化之后擴(kuò)增完整DNA，從而僅擴(kuò)增在擴(kuò)增區(qū)域中未被限制酶切割的DNA。參見例如美國專利申請序列號10/971，986、11/071，013和10/971,339。在一些實施方案中，可使用基因特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘?，可將適配體添加到隨機片段化DNA的末端中，可用甲基化依賴性或甲基化敏感性限制酶消化所述DNA。可使用與適配體序列雜交的引物擴(kuò)增完整的DNA。在這種情況下，可進(jìn)行第二步以確定DNA擴(kuò)增合并物中特異性基因的存在、不存在或量。在一些實施方案中，使用實時定量PCR擴(kuò)增DNA。
[0149]在一些實施方案中，所述方法包括在基因組DNA群體中定量靶序列的平均甲基化密度。在一些實施方案中，所述方法包括在允許基因座中潛在限制酶切割位點的至少一些拷貝保持不被切割的條件下，使基因組DNA與甲基化依賴性限制酶或甲基化敏感性限制酶相接觸；定量基因座的完整拷貝；以及比較擴(kuò)增產(chǎn)物的量與表示對照DNA甲基化量的對照值，從而與對照DNA的甲基化密度相比定量基因座中的平均甲基化密度。
[0150]可通過以下方法來測定DNA基因座甲基化的量:提供包含所述基因座的基因組DNA的樣品，用限制酶(其是甲基化敏感性或甲基化依賴性的)切割DNA，然后定量完整DNA的量或在目的DNA基因座處切割DNA的量。完整或切割DNA的量取決于包含所述基因座的基因組DNA的初始量，所述基因座中甲基化的量，以及所述基因座中基因組DNA中甲基化的核苷酸的數(shù)目(即，分?jǐn)?shù))。可通過比較完整DNA或切割DNA的量與表示相似處理DNA樣品中完整DNA或切割DNA的量的對照值來確定DNA基因座中甲基化的量。對照值可表示甲基化核苷酸的已知或預(yù)測數(shù)目?；蛘?，對照值可表示另一個細(xì)胞(例如，正常、非患病)細(xì)胞中的相同基因座或第二基因座的完整或切割DNA的量。
[0151]通過在允許基因座中潛在限制酶切割位點的至少一些拷貝保持不被切割的條件下使用至少一種甲基化敏感性或甲基化依賴性限制酶，并隨后定量剩余的完整拷貝并比較該量與對照，可確定基因座的平均甲基化密度。甲基化敏感性酶是如果其識別位點是非甲基化的則切割DNA的酶，而甲基化依賴性酶如果其識別位點是甲基化的則切割DNA。如果在允許基因座中潛在限制酶切割位點的至少一些拷貝保持不被切割的條件下，使甲基化敏感性限制酶與DNA基因座拷貝相接觸，則剩余的完整DNA將與甲基化密度成正比，并因此可與對照比較以確定樣品中基因座的相對甲基化密度。相似地，如果在允許基因座中潛在限制酶切割位點的至少一些拷貝保持不被切割的條件下，使甲基化依賴性限制酶與DNA基因座拷貝相接觸，則剩余的完整DNA將與甲基化密度成反比，并因此可與對照比較以確定樣品中基因座的相對甲基化密度。例如，美國專利申請序列號10/971，986中公開了這樣的測定。
[0152]用于以上方法的試劑盒可包含例如一種或更多種甲基化依賴性限制酶、甲基化敏感性限制酶、擴(kuò)增(例如，PCR)試劑、探針和/或引物。
[0153]定量擴(kuò)增方法(例如，定量PCR或定量線性擴(kuò)增)可用于在限制酶消化后定量擴(kuò)增側(cè)翼是擴(kuò)增引物的基因座中完整DNA的量。例如美國專利N0.6，180，349,6, 033，854和 5，972, 602 中，以及例如 Gibson 等，Genome Research6:995-1001 (1996) ；DeGraves,等，Biotechniques34(I):106-10,112-5(2003) ;Deiman B,等，Mol.Biotechnol.20(2):163-79(2002)中公開了定量擴(kuò)增的方法?？伞皩崟r”監(jiān)測擴(kuò)增。
[0154]用于檢測DNA甲基化的另外的方法可包括在用亞硫酸氫鹽處理DNA之前和之后進(jìn)行基因組測序。參見例如 Frommer 等，Proc.Nat 1.Acad.Sc1.USA89:1827-1831 (1992)。當(dāng)使亞硫酸氫鈉與DNA接觸時，非甲基化胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶未被修飾。
[0155]在一些實施方案中，使用由亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的限制酶消化來檢測 DNA 甲基化。參見例如 SadriMtornsby，Nucl.Acids Res.24:5058-5059(1996)；Xiong&Laird, Nucleic Acids Res.25:2532-2534(1997)。
[0156]在一些實施方案 中，甲基化特異性PCR( “MSP”)反應(yīng)單獨或與其他方法組合用于檢測DNA甲基化。MSP測定通過亞硫酸氫鈉對DNA進(jìn)行最初修飾，將所有非甲基化而沒有甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并且隨后用相對于非甲基化DNA特異于甲基化DNA的引物進(jìn)行擴(kuò)增。參見，Herman 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826，(1996);美國專利N0.5，786，146。
[0157]在一些實施方案中，MethyLight測定單獨或與其他方法組合用于檢測DNA甲基化(參見 Eads 等，Cancer Res.59:2302-2306(1999))。簡言之，在 MethyLight 過程中，在亞硫酸氫鈉反應(yīng)中使基因組DNA轉(zhuǎn)化(亞硫酸氫鹽方法將非甲基化胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)。然后使用與CpG 二核苷酸雜交的PCR引物進(jìn)行目的DNA序列的擴(kuò)增。通過使用僅與由甲基化DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的序列雜交(或者僅與非甲基化序列雜交)的引物，擴(kuò)增可指示其中引物雜交的序列的甲基化狀態(tài)。此外，可用與由甲基化(或非甲基化)DNA亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)生的序列特異性結(jié)合的探針來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。如果需要的話，可使用引物和探針二者來檢測甲基化狀態(tài)。因此，用于MethyLight的試劑盒可包含亞硫酸氫鈉，以及區(qū)分已用亞硫酸氫鹽處理的甲基化DNA與非甲基化DNA的引物或可檢測標(biāo)記的探針(包括但不限于Taqman或分子信標(biāo)探針(molecular beacon probe))。另一些試劑盒組分可包括例如DNA擴(kuò)張所必需的試劑，包括但不限于PCR緩沖液、脫氧核苷酸、以及熱穩(wěn)定的聚合酶。
[0158]在一些實施方案中，Ms-SnuPE(甲基化敏感性單核苷酸引物延伸)反應(yīng)單獨或與其他方法組合用于檢測DNA甲基化(參見，Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res.25:2529-2531 (1997))。Ms-SnuPE技術(shù)是用于評估特定CpG位點上甲基化差異的定量方法，其基礎(chǔ)是對DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理,然后進(jìn)行單核苷酸引物延伸(Gonzalgo & Jones,見上)。簡言之，使基因組DNA與亞硫酸氫鈉反應(yīng)以將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而不改變5-甲基胞嘧啶。然后使用特異于經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA的PCR引物進(jìn)行期望靶序列的擴(kuò)增，分離所得產(chǎn)物并將其用作在目的CpG位點上進(jìn)行甲基化分析的模板。
[0159]用于Ms-SnuPE分析的典型試劑(例如，如可在典型的基于Ms-SnuPE的試劑盒中發(fā)現(xiàn)的)可包括但不限于:用于特異性基因(或經(jīng)甲基化改變的DNA序列或CpG島)的PCR引物、優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸、凝膠提取試劑盒、陽性對照引物、用于特異性基因的Ms-SNuPE?引物、反應(yīng)緩沖液(用于Ms-SNuPE反應(yīng)的反應(yīng)緩沖液)、以及帶可檢測標(biāo)記的核苷酸。另外，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變試劑可包括=DNA變性緩沖液、磺化緩沖液、DNA回收試劑或試劑盒(例如,沉淀、超濾、親和柱)、去磺化緩沖液、和DNA回收組分。
[0160]另外的甲基化檢測方法包括但不限于甲基化CpG島擴(kuò)增(參見，Toyota等，Cancer Res.59:2307-12 (1999))，例如美國專利申請 2005/0069879 ；Rein 等.NucleicAcids Res.26(10):2255-64(1998) ;01ek 等 Nat.Genet.17 (3):275-6(1997);以及 PCT 公開W000/70090中描述的那些，Headloop PCT和Helper依賴性鏈反應(yīng)。
[0161]以下提供了關(guān)于這些一般描述方法中的幾種的更詳細(xì)信息:
[0162](a)探針或引物設(shè)計和/或產(chǎn)生
[0163]本文所述的用于診斷贅生物的幾種方法使用一種或更多種探針和/或引物。本領(lǐng)域已知并且例如在Dieffenbach and Dveksler (編)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)中描述了用于設(shè)計用于例如PCR或雜交的探針和/或引物 的方法。此外，多種軟件包是公開可用于設(shè)計用于多種測定的最佳探針和/或引物，例如，可得自于 Center for Genome Research, Cambridge, Mass.，USA 的 Primer3。
[0164]清楚地，應(yīng)在探針或引物設(shè)計期間考慮其潛在用途。例如，如果要產(chǎn)生用于在甲基化特異性PCR或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)測定的探針或引物，則3’末端(或在LCR情況下的5’末端)的核苷酸應(yīng)優(yōu)選對應(yīng)于核酸中的甲基化核苷酸。
[0165]對可用于檢測與贅生物相關(guān)的序列的探針和/或引物進(jìn)行評估，例如以確定不形成發(fā)夾，自引發(fā)(self-prime)或形成引物二聚體(例如，與用于檢測測定的另一種探針或引物形成引物二聚體)的那些。此外，常常評估探針或引物(或者其序列)以確定其由靶核酸中變性的溫度(即，探針或引物的解鏈溫度，或Tm)。用于估計Tm的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且描述于例如 Santa Lucia，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 95:1460-1465,1995或Breslauer 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 83:3746-3750,1986。
[0166]用于產(chǎn)生/合成本發(fā)明探針或引物的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，Gait (編)(In:01igonucleotide Synthesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984)中描述了寡核苷酸合成。例如，可通過生物合成(例如，通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化核酸)或通過化學(xué)合成獲得探針或引物。對于短序列(多至約100個核苷酸)，化學(xué)合成是優(yōu)選的。
[0167]對于較長序列，可使用分子生物學(xué)所采用的標(biāo)準(zhǔn)復(fù)制方法，例如，如Messing，Methods Enzymol，101，20-78，1983所述使用用于單鏈DNA的M13。用于寡核苷酸合成的另一些方法包括例如磷酸三酯和磷酸二酯法(Narang等.Meth.Enzymol68:90,1979),在支持物上合成(Beaucage 等.Tetrahedron Letters22: 1859-1862,1981),以及氨基憐酸酯技術(shù)(Caruthers, M.H.等，“Methods in Enzymology, ” 第 154 卷，第 287-314 頁(1988)),以及“Synthesis and Applications of DNA and RNA,，’S.A.Narang編，Academic Press,New York,1987和本文所列參考文獻(xiàn)中描述的其他方法。如例如Nielsen等，J.Chem.Soc.PerkinTrans.，1:3423,1997 ；Singh and Wengel, Chem.Commun.1247,1998 所述合成包含鎖定核酸(locked nucleic acid, LNA)的探針。并且，如例如 Egholm 等，Am.Chem.Soc.,114:1895,1992 ；Egholm 等，Nature, 365:566，1993 和 Orum 等，Nucl.Acids Res.，21:5332，1993 所述合成包含肽核酸(peptide-nucleic acid, PNA)的探針。
[0168](b)DNA的甲基化敏感性內(nèi)切核酸酶消化
[0169]在一個實例中，使用包括以下步驟的方法測定樣品中提高的甲基化:在足以使核酸被消化的條件下用一定量的甲基化敏感性限制性內(nèi)切核酸酶處理核酸，然后檢測所產(chǎn)生的片段。示例性甲基化敏感性內(nèi)切核酸酶包括例如HhaI或Hpall。優(yōu)選地，測定包括用與所采用的甲基化敏感性酶具有相同特異性的甲基化不敏感酶消化的內(nèi)對照。例如，甲基化不敏感酶MspI是甲基化敏感性酶HpaII的同裂酶。
[0170]雜交測定方式
[0171 ] 在一個實例中，通過使探針或引物與未經(jīng)消化的核酸選擇性雜交來檢測核酸的消化?；蛘?，使探針與經(jīng)消化或未經(jīng)消化的核酸二者均選擇性雜交但是有助于區(qū)分兩種形式，例如通過電泳區(qū)分。用于實現(xiàn)與雜交探針選擇性雜交的合適檢測方法包括例如，Southern或其他核酸雜交(Kawai 等，Mol.Cell.Biol.14, 7421-7427,1994 ；Gonzalgo 等，CancerRes.57,594-599, 1997)。
[0172]基于包含探針的核酸雙鏈體的解鏈溫度(Tm)確定合適的雜交條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗為每種探針確定最佳的雜交反應(yīng)反應(yīng)，但是也可使用一些總則。優(yōu)選地，在低或中等嚴(yán)格度下進(jìn)行采用短寡核苷酸探針的雜交。在富含GC的探針或引物或者較長探針或引物的情況下，高嚴(yán)格度雜交和/或洗滌是優(yōu)選的。高嚴(yán)格度在本文中定義為，在約ο.1倍SSC緩沖液和/或約0.1 % (w/v) SDS或較低鹽濃度下，和/或在至少65°C的溫度下，或者等價條件下進(jìn)行雜交和/或洗滌。本文提及特定的嚴(yán)格水平包括使用除本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的SSC之外的洗滌/雜交溶液的等價條件。
[0173]根據(jù)本實例，測試樣品和陰性對照樣品所產(chǎn)生片段的差異指示對象具有贅生物。相似地，在其中對照樣品包含來自腫瘤、癌組織或癌細(xì)胞或癌前期細(xì)胞的數(shù)據(jù)的情況下，測試樣品與對照樣品之間的相似性(盡管未必是絕對同一性)指示陽性診斷(即，癌癥)。
[0174]擴(kuò)增測定方式
[0175]在一個替代實例中，使用擴(kuò)增系統(tǒng)檢測通過限制酶產(chǎn)生的片段，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、反向聚合酶鏈反應(yīng)(iPCR)、原位PCR(Singer-Sam等，Nucl.Acids Res.18:687，1990)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)或環(huán)狀探針技術(shù)。
[0176] PCR的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且例如通過McPherson等，PCR:A PracticalApproach, (series eds, D.Rickwood and B.D.Hames), IRL Press Limited, Oxford, ppl-253,1991 和 Dieffenbach (編)and Dveksler (編)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbour Laboratories,NY, 1995)進(jìn)行了描述，其內(nèi)容各自通過引用整體并入本文。一般來說，對于PCR，使兩種非互補核酸引物分子(包含長度至少約18個核苷酸，并且更優(yōu)選長度為至少20至30個核苷酸)與核酸模板分子在其各自的退火位點上雜交，并且通過酶擴(kuò)增介入退火位點的模板的特異性核酸分子拷貝。可例如使用電泳和用結(jié)合核酸的可檢測標(biāo)志物進(jìn)行檢測來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物?；蛘撸每蓹z測標(biāo)志物(例如，熒光團(tuán))標(biāo)記一種或更多種寡核苷酸，并且使用例如 lightcycler (Perkin Elmer, Wellesley, Mass.，USA ；RocheApplied Science, Indianapolis, IN, USA)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。[0177]鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacement amplification, SDA)使用寡核苷酸引物、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切核酸酶來擴(kuò)增靶序列。使寡核苷酸與靶核酸雜交并使用聚合酶來產(chǎn)生介入引物退火位點的區(qū)域的拷貝。然后用在所拷貝核酸開始處特異性識別序列的內(nèi)切核酸酶使所拷貝核酸和靶核酸的雙鏈體產(chǎn)生切口。DNA聚合酶識別切口的DNA并產(chǎn)生靶區(qū)域的另一份拷貝，同時置換先前生成的核酸。SDA的優(yōu)點在于其以等溫方式發(fā)生，從而有助于高通量自動化分析。
[0178]循環(huán)探針技術(shù)使用包含能夠與靶序列雜交的DNA-RNA-DNA的嵌合合成引物。在與靶序列雜交后，所形成的RNA-DNA雙鏈體是RnaseH的靶標(biāo)，從而切割引物。然后例如使用質(zhì)譜或電泳檢測所切割的引物。
[0179]對于甲基化敏感性內(nèi)切核酸酶識別位點側(cè)翼或鄰近其的引物，優(yōu)選這樣的引物僅位于贅生物中高甲基化的那些位點側(cè)翼，以確保產(chǎn)生診斷擴(kuò)增產(chǎn)物。在這一點上，僅當(dāng)限制性位點未被切割時(即，當(dāng)其是甲基化的時)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物指示目的CpG 二核苷酸是甲基化的。
[0180]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，擴(kuò)增產(chǎn)物的精確長度根據(jù)引物之間的距離而不同。清楚地，該分析形式可用于確定多個CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)，前提是每個二核苷酸都在甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶位點中。在這些方法中，一種或更多種引物可標(biāo)記有可檢測標(biāo)志物以有助于快速檢測擴(kuò)增核酸，例如熒光標(biāo)記(例如，Cy5或Cy3)或放射同位素(例如，32P)。
[0181]一般使用例如非變性瓊脂糖凝膠電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜、液相色譜(例如，HPLC或dHPLC)或毛細(xì)管電泳(例如，MALD1-T0F)來分析擴(kuò)增引物。對于本文所述的所有測定方 式，高通量檢測方法，例如基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間(MALD1-T0F)、電噴霧離子化(ESI)、質(zhì)譜(包括串聯(lián)質(zhì)譜，如LC MS/MS)、生物傳感器技術(shù)、易消失的(evanscent)光學(xué)纖維技術(shù)或DNA芯片技術(shù)(例如W098/49557 ；W096/17958 ；Fodor等，Science767-773，1991 ;美國專利 N0.5，143，854 和美國專利 N0.5，837，832，其內(nèi)容全部通過引用并入本文)是尤其優(yōu)選的。或者，可使用如本文和/或例如美國專利N0.6，174，670中所述的解鏈曲線分析方法來連續(xù)地監(jiān)測核酸的擴(kuò)增。
[0182](C)其他測定方式
[0183]在一個替代實例中，通過進(jìn)行包括以下步驟的方法來確定樣品中提高的甲基化:在足以使核酸被消化的條件下用一定量的DNA酶I處理包含核酸的染色質(zhì)，然后檢測所產(chǎn)生的片段。該測定方式基于這樣的理解:與非高甲基化DNA相比包含甲基化DNA(如高甲基化DNA)的染色質(zhì)具有更緊湊的構(gòu)造，因此其對DNA酶I的內(nèi)切核酸酶消化更不敏感。
[0184]根據(jù)該方法，與非甲基化DNA相比甲基化DNA的DNA酶I消化產(chǎn)生了不同長度的DNA片段。例如，使用之前描述的測定檢測這些不同的DNA片段?；蛘撸褂没旧先缋鏕regory 和 Feil Nucleic Acids Res.,27, e32i_e32iv，1999 所述的 PCR-SSCP 檢測 DNA 片段。為了使PCR-SSCP適用于本發(fā)明，使用位于核酸中一個或更多個CpG 二核苷酸側(cè)翼或包含它們的擴(kuò)增引物來擴(kuò)增經(jīng)DNA酶I生成的片段，所述擴(kuò)增引物在贅生物樣品中對DNA酶I消化具有抗性但是在健康/正常對照或健康/正常測試樣品中對DNA酶I消化沒有抗性。在這種情況下，使用DNA酶I產(chǎn)生特異性核酸片段診斷贅生物，因為DNA沒有被有效降解。相反地，通過DNA酶I作用使來自健康/正常對象樣品的模板DNA降解，因此，擴(kuò)增不能產(chǎn)生離散的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR-SSCP的替代方法，例如PCR-dHPLC，在本領(lǐng)域中是已知的并且本發(fā)明將其考慮在內(nèi)。
[0185](d)非甲基化DNA的選擇性誘變
[0186]在一種替代方法中，使用包括以下步驟的方法確定樣品中提高的甲基化:在足有誘導(dǎo)誘變的條件下用一定量使CpG 二核苷酸中的非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理核酸。
[0187]優(yōu)選的化合物使胞嘧啶突變成尿嘧啶或胸苷，例如亞硫酸氫鹽，如亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀(Frommer 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89,1827-1831,1992)。已知對 DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理以區(qū)分甲基化胞嘧啶殘基與非甲基化胞嘧啶殘基，其通過使不受甲基化保護(hù)的胞嘧啶殘基(包括不在CpG 二核苷酸內(nèi)或者定位在CpG 二核苷酸內(nèi)未經(jīng)歷甲基化的胞嘧啶殘基)突變來實現(xiàn)。
[0188]基于序列的檢測
[0189]在一個實例中，通過對突變DNA進(jìn)行測序確定一個或更多個突變核苷酸的存在或者突變序列的數(shù)目。一種分析形式包括使用本文所述的擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR)擴(kuò)增突變核酸。然后直接對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，或者將其克隆并對所克隆產(chǎn)物進(jìn)行測序。用于對DNA進(jìn)行測序的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括例如雙脫氧鏈末端終止法或馬克薩姆-吉爾伯特(Maxam-Gilbert)法(參見，Sambrook 等,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第
2版，CSHP, New Yorkl989)或 Zyskind 等，Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad.Press,1988))。
[0190]因為用化合物例 如亞硫酸氫鹽處理核酸導(dǎo)致了非甲基化胞嘧啶被突變?yōu)槟蜞奏?從而在擴(kuò)增過程之后突變?yōu)樾剀?，所以對序列進(jìn)行分析確定了甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，通過對對照樣品或未經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的樣品或目的區(qū)域的已知核苷酸序列與處理樣品進(jìn)行比較，有助于檢測核苷酸序列之間的差異。與對照或未處理樣品相比，處理樣品中胞嘧啶位點上檢測到的任意胸腺嘧啶殘基可認(rèn)為是由因亞硫酸氫鹽處理引起的突變造成。例如，F(xiàn)rommer 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1827-1831,1992or Clark 等，Nucl.Acids Res.22 =2990-2997,1994中描述了使用對經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的核酸進(jìn)行測序來檢測甲基化的方法。
[0191]在另一種方法中，使用焦磷酸測序(例如，如Uhlmann等，Electrophoresis, 23:4072-4079，2002所述)檢測經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的樣品中突變或未突變核苷酸的存在?；旧?，該方法是實時測序的形式，其使用與鄰近或接近甲基化胞嘧啶位點的位點雜交的引物。在使引物與模板雜交之后，在DNA聚合酶存在下，根據(jù)預(yù)定分配順序單獨添加四種修飾脫氧核苷酸三磷酸的每一種。僅合并了所添加的與經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的樣品互補的核苷酸并且釋放無機焦磷酸鹽(PPi)。然后PPi驅(qū)動反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測的光水平。這樣的方法允許測定鄰近引物雜交位點的特異性核苷酸的同一性。
[0192]固相焦磷酸測序的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且例如在Landegren等，GenomeRes.,8(8):769-776,1998中進(jìn)行了綜述。這樣的方法使得能夠進(jìn)行多個CpG 二核苷酸的甲基化檢測。
[0193]用于確定經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的核苷酸的序列的一種相關(guān)方法是甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(Me-SnuPE)或 SnaPmeth。例如，Gonzalgo 和 Jones Nucl.Acids Res.,25:2529-2531 或 Uhlmann 等，Electrophoresis，23:4072-4079,2002 中描述了合適方法。使用與核酸中鄰近甲基化胞嘧啶位點的區(qū)域雜交的寡核苷酸。然后將該寡核苷酸與聚合酶和游離核苷酸二磷酸或二脫氧核苷酸三磷酸(其對應(yīng)于在亞硫酸氫鹽處理后在該位點上發(fā)生的可能堿基之一或任一種(即，胸腺嘧啶或胞嘧啶))一起用于引物延伸方案。優(yōu)選地，核苷酸二磷酸標(biāo)記有可檢測標(biāo)志物(例如，熒光團(tuán))。在引物延伸之后，將未結(jié)合的標(biāo)記核苷酸二磷酸移除(例如使用體積排阻色譜或電泳)或水解(使用例如堿性磷酸酶)，并檢測標(biāo)記核苷酸至寡核苷酸中的合并，指示存在于所述位點上的堿基。
[0194]清楚地，本發(fā)明包括另一些高通量測序方法。這樣的方法包括例如，固相微測序(如例如Southern等，Genomics, 13:1008-1017,1992所述)或用FRET進(jìn)行微測序(如例如 Chen 和 Kwok, Nucleic Acids Res.25:347-353,1997 所述)。
[0195]基于限制性內(nèi)切核酸酶的測定方式
[0196]在一種方法中，使用聯(lián)合亞硫酸氫鹽的限制酶分析(combined bisulfiterestriction analysis, COBRA)檢測未突變序列的存在，基本上如Xiong和Laird, Nucl.Acids Res.,25:2532_2534，2001所述。該方法研究了在用使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物(如亞硫酸氫鹽)處理之后甲基化核酸與非甲基化核酸之間的限制酶識別位點的差異。
[0197]在亞硫酸氫鹽處理之后，使用本文所述的擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR)擴(kuò)增包含一個或更多個CpG 二核苷酸的目的區(qū)域，所述CpG 二核苷酸是甲基化的并且包含在限制性內(nèi)切核酸酶識別序列中。然后在足以使切割發(fā)生的條件下使擴(kuò)增產(chǎn)物與在CpG 二核苷酸位點上切割的限制酶接觸一段 時間?？蛇x擇限制性位點以指示甲基化的存在或不存在。例如，限制性內(nèi)切核酸酶TaqI切割序列TCGA，在亞硫酸氫鹽處理非甲基化核酸后序列為TTGA，并因此不被切割。然后使用本領(lǐng)域已知的檢測方法(例如，電泳和/或質(zhì)譜)檢測經(jīng)消化和/或未經(jīng)消化的核酸。核酸的切割或未切割指示對象中的癌癥。清楚地，該方法可用于陽性讀出(read-out)或陰性讀出系統(tǒng)用于診斷癌癥。
[0198]陽性讀出測定方式
[0199]在一個實施方案中，本發(fā)明的測定方式包括其中經(jīng)例如亞硫酸氫鹽處理的樣品的DNA被檢測為陽性信號的陽性讀出系統(tǒng)。優(yōu)選地，檢測不到或僅能微弱地檢測到來自健康或正常對照對象的非高甲基化DNA。
[0200]在一個優(yōu)選實施方案中，使用包括以下步驟的方法確定對象樣品中提高的甲基化:
[0201](i)在足以誘導(dǎo)誘變的條件下用一定量的使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理核酸，從而產(chǎn)生突變核酸；
[0202](ii)使核酸與探針或引物在使其與未突變核酸的選擇性雜交發(fā)生的條件下雜交，所述探針或引物包含與包含甲基化胞嘧啶殘基的序列互補的核苷酸序列；
[0203](iii)檢測選擇性雜交。
[0204]在本文中，術(shù)語“選擇性雜交”意指與探針或引物與突變序列的雜交相比，相同探針或引物與對應(yīng)的未突變核酸以較高頻率或速率發(fā)生，或者具有較高的最大反應(yīng)速度。優(yōu)選地，在所用反應(yīng)條件下，探針或引物不與攜帶突變的非甲基化序列雜交。
[0205]在一個實施方案中，使用Southern、斑點印跡、狹縫印跡或其他核酸雜交方法來檢測雜交(Kawai 等，Mol.Cell.Biol.14:7421-7427,1994 ；Gonzalgo 等，Cancer Res.57,594-599，1997)。經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶结樳x擇，這樣的測定方式一般在上文中進(jìn)行了描述并且加上必要變更適用于目前描述的選擇性誘變途徑。
[0206]優(yōu)選地，采用連接酶鏈反應(yīng)方式來區(qū)分突變核酸與未突變核酸。連接酶鏈反應(yīng)(描述于EP320，308和美國專利N0.4，883，750中)使用至少兩種退火至靶核酸的寡核苷酸探針，以這種方式使得它們在靶核酸上并列。在連接酶鏈反應(yīng)測定中，在其中診斷探針仍然基本上僅與靶核酸結(jié)合的條件下，使靶核酸與與所述靶序列診斷部分互補的第一探針(診斷探針)(例如，包含一個或更多個甲基化CpG 二核苷酸的核酸)雜交，并且與與毗鄰診斷部分的核苷酸序列互補的第二探針(毗鄰探針)雜交。診斷探針和毗鄰探針可具有不同長度和/或具有不同的解鏈溫度，使得可調(diào)節(jié)雜交的嚴(yán)格度以允許其與靶標(biāo)選擇性雜交，其中具有較高解鏈溫度的探針在較高嚴(yán)格度下雜交并且在洗滌后移除未結(jié)合和/或未選擇性結(jié)合的探針，具有較低解鏈溫度的其他探針在較低嚴(yán)格度下雜交。然后使診斷探針與毗鄰探針共價連接(例如，使用T4DNA連接酶連接)，以從而產(chǎn)生與靶序列互補的較大的靶探針，并且通過修改雜交嚴(yán)格度移除未連接的探針。在這一點上，與已連接的探針相比，未連接的探針將在較低嚴(yán)格度雜交條件下選擇性雜交。因此，可將雜交的嚴(yán)格度提高至至少高達(dá)用于雜交較長探針的嚴(yán)格度的嚴(yán)格度，并優(yōu)選在更高的嚴(yán)格度下進(jìn)行，因為連接后由較短探針貢獻(xiàn)的長度提聞。
[0207]在另一個實例中，標(biāo)記探針之一或二者使得可通過以下方法來測試靶序列的存在或不存在:解鏈靶標(biāo)-探針雙鏈體，洗脫分離探針并測試標(biāo)記。當(dāng)兩種探針均被標(biāo)記時，使用不同配體以允許區(qū)分連接的和未連接的探針，在所述情況下，相同洗脫級分中兩種標(biāo)記的存在確定了連接事件。如果祀核酸與固體基質(zhì)結(jié)合，例如在Southern雜交、狹縫印跡、斑點印跡或微芯片測定方式中，可直接確定診斷探針和Btt鄰探針二者的存在。
[0208]甲基化特異性微陣列(MSO)也可用于區(qū)分突變序列與未突變序列。例如，Adorian等，Nucl.Acids Res.,30:e21,2002中描述了合適的方法。MSO使用已經(jīng)經(jīng)使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物(例如，亞硫酸氫鹽)處理的核酸作為模板，用于進(jìn)行擴(kuò)增突變核酸和未突變核酸二者的擴(kuò)增反應(yīng)。用包含可檢測標(biāo)記(例如，熒光團(tuán)，如Cy3或Cy5)的至少一種引物進(jìn)行擴(kuò)增。
[0209]為了產(chǎn)生用于檢測突變核酸的微陣列，將寡核苷酸優(yōu)選地以一定冗余度點到例如載玻載片上(例如，如Golub等，Science，286:531-537，1999所述)。優(yōu)選地，對于所分析的每種CpG 二核苷酸,使用兩種不同的寡核苷酸。每種寡核苷酸包含序列N2_16CGN2_16或N2_16TGN2_16 (其中N是鄰近目的CpG 二核苷酸或與其并列的核苷酸的數(shù)目)，其反映出CpG 二核苷酸的甲基化或非甲基化狀態(tài)。
[0210]然后在能夠檢測單一核苷酸差異的條件下使帶標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與微陣列上的寡核苷酸雜交。在洗滌以移除未結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物之后，使用例如微陣列掃描器檢測雜交。該方法不僅允許確定大量CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)，而且還是半定量的，能夠確定所分析的每種CpG 二核苷酸中的甲基化程度。因為在單一樣品中可能具有某程度的甲基化異質(zhì)性，所以這樣的定量可幫助診斷癌癥。
[0211]基于擴(kuò)增的測定方式
[0212]在一個替代實例中，使用擴(kuò)增系統(tǒng)來檢測雜交。在甲基化特異性PCR方式(MSP ；Herman 等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826,1992)中，使用包括擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的方法檢測雜交。因此，通過使用在中等和/或高嚴(yán)格條件下特異性退火至未突變序列的一種或更多種探針或引物，僅使用包含甲基化核苷酸的樣品產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物。Cottrell 等，Nucl.Acids Res.32:elO, 2004 (HeavyMethyl PCR) ;Rand 等 Nucl.AcidsRes.33:el27,2005(Headloop PCR) ;Rand 等，Epigeneticsl:94_100，2006 (亞硫酸氫鹽差異變性PCR)和PCT/AU07/000389 (末端特異性PCR)提供了用于從經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的混合物中選擇性擴(kuò)增甲基化組分或非甲基化組分的替代測定。
[0213]可使用本文描述的任一種擴(kuò)增測定方式，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、反向聚合酶鏈反應(yīng)(iPCR)、原位 PCR (Singer-Sam 等，Nucl.Acids Res.18:687，1990)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)或環(huán)狀探針技術(shù)。已開發(fā)了 PCR技術(shù)用以檢測基因突變(Kuppuswamy 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:1143-1147,1991)和定量等位基因特異性表達(dá)(Szabo 和 Mann, Genes Dev.9:3097-3108,1995 以及 Singer-Sam 等，PCR Methods 增刊.1:160-163，1992)。這樣的技術(shù)使用內(nèi)引物，其退火至經(jīng)PCR生成的模板并且在待測定的單核苷酸5’立即終止。這樣的方式容易與上文所述的連接酶鏈反應(yīng)相組合。使用實時定量測定方式也是有用的。經(jīng)過適當(dāng)引物的選擇，這樣的測定方式一般在上文中進(jìn)行了描述并且加上必要變更適用于目前描述的選擇性誘變途徑。
[0214]本發(fā)明還考慮了甲基化特異性解鏈曲線分析(基本上如Worm等,Clin.Chem.,47:1183-1189，2001所述)。該方法使用經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的甲基化核酸或非甲基化核酸產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物中解鏈溫度的差異?；旧?，在與雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料(例如，SYBRGreen I)存在下進(jìn)行經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的樣品的無差別擴(kuò)增。通過提高擴(kuò)增產(chǎn)物的溫度同時監(jiān)測熒光性，確定了擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈性質(zhì)，并因此確定了其序列。熒光性的降低反映出擴(kuò)增產(chǎn)物中的至少一個結(jié)構(gòu)域解鏈。熒光性降低的溫度指示擴(kuò)增核酸的核苷酸序列，從而允許確定一個或更多個CpG 二核苷酸位點上的核苷酸。因為使用本發(fā)明擴(kuò)增了核酸的序列。
[0215]本發(fā)明還包括使用實時定量形式的PCR,例如TaqMan(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，88，7276-7280，1991 ；Lee 等，Nucleic Acid Res.21,3761-3766,1993)以進(jìn)行該實施方案。例如，Eads等,Nucl.Acids Res.28:E32, 2000的MethylLight方法使用經(jīng)修改的TaqMan測定來檢測CpG 二核苷酸的甲基化。基本上，該方法包括用亞硫酸氫鹽處理核酸樣品，以及使用擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR)擴(kuò)增包含在贅生性細(xì)胞中甲基化并且在對照樣品中非甲基化的一個或更多個CpG 二核苷酸的核酸。在三種寡核苷酸(目的區(qū)域側(cè)翼的正向和反向引物以及在兩個引物之間與一個或更多個甲基化CpG 二核苷酸雜交的探針)存在下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。探針雙標(biāo)記有5’熒光報道基因和3’淬滅劑(或者反之亦然)。當(dāng)探針是完整的時，淬滅劑染料由于其相近性而吸收報道基因的熒光。在退火至PCR產(chǎn)物之后，通過5，至3，外切核酸酶活性(例如，Taq DNA聚合酶的5，至3，外切核酸酶活性)切割探針。該切割將報道基因從淬滅劑中釋放出來，從而導(dǎo)致提高的熒光信號，其可用于估計最初的模板甲基化水平。通過使用與未突變核酸(即，甲基化核酸)選擇性雜交的探針或引物，確定了甲基化水平，例如，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。 [0216]或者，除了使用需要切割的標(biāo)記探針之后,還使用諸如Molecular Beacon.TM.的探針(參見，例如Mhlanga和Malmberg，Methods25:463-471，2001)。分子信標(biāo)是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈核酸分子。環(huán)結(jié)構(gòu)與在贅生性樣品中甲基化而在對照樣品中非甲基化的一個或更多個CpG 二核苷酸周圍的區(qū)域互補。莖結(jié)構(gòu)通過使在探針(環(huán))兩側(cè)的彼此互補的兩條“臂”退火而形成。使熒光部分與一條臂結(jié)合，并且使當(dāng)分子信標(biāo)沒有與靶序列結(jié)合時抑制任何可檢測熒光的淬滅部分與另一條臂結(jié)合。在使環(huán)區(qū)域與其靶核酸結(jié)合之后，分離臂并且熒光是可檢測的。但是，即使是單一堿基錯配也顯著改變樣品中檢測到的熒光水平。因此，通過檢測到的熒光水平來確定特定堿基的存在或不存在。這樣的測定有助于檢測核酸中的一個或更多個未突變位點(即，甲基化核苷酸)。
[0217]熒光標(biāo)記的鎖定核酸(LNA)分子或熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)-核酸(PNA)分子可用于檢測核苷酸差異(例如，如 Simeonov 和 Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30 (17):1_5,2002所述)。LNA和PNA分子以高親和力與核酸(特別是DNA)結(jié)合。在LNA或PNA探針與靶核酸雜交后，與所述探針綴合的熒光團(tuán)(特別是羅丹明或六氯熒光素)發(fā)出水平顯著更高的熒光。但是，即使發(fā)生單一核苷酸錯配時，熒光提高的水平也不提高至相同水平。因此，樣品中檢測到的熒光度指示LNA或PNA探針與靶序列之間錯配的存在，例如，甲基化CpG二核苷酸中存在突變胞嘧啶的情況。優(yōu)選地，使用熒光標(biāo)記的LNA或PNA技術(shù)來檢測之前已使用例如本領(lǐng)域已知和/或本文描述的擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸中的至少單個堿基變化。
[0218]如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，LNA或PNA檢測技術(shù)通過將LNA或PNA探針固定至固體支持物而便于高通量檢測一種或更多種標(biāo)志物，如Orum等，Clin.Chem.45:1898-1905，1999 所述。
[0219]或者，使用實時測定例如所謂的HeavyMethyl測定(Cottrell等，Nucl.AcidsRes.32:el0,2004)來確定測試樣品中核酸甲基化的存在或水平。基本上，該方法使用一種或更多種不可延伸的核酸(例如寡核苷酸)阻斷劑，其以甲基化特異性方式與經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的核酸結(jié)合(即，在中等至高嚴(yán)格條件下阻斷劑與未突變DNA特異性結(jié)合)。使用可任選地具有甲基化特異性但是位于一種或更多種阻斷劑側(cè)翼的一種或更多種引物來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在非甲基化核酸(即，未突變DNA)存在下，阻斷劑結(jié)合并且沒有產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。使用基本上如之前所述的TaqMan測定，確定樣品中核酸的甲基化水平。
[0220]用于在用使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理后檢測甲基化核酸的另一些基于擴(kuò)增的方法包括例如甲基化特異性單鏈構(gòu)象分析(MS-SSCA) (Bianco等，Hum.Mutat.，14:289-293，1999)、甲基化特異性變性梯度凝膠電泳(MS-DGGE) (Abrams和Stanton, Meth ods Enzymol.,212:71-74,1992)和甲基化特異性變性高效液相色譜(MS-DHPLC) (Deng 等，Chin.J.Cancer Res.，12:171-191，2000)。這些方法的每一種均使用基于核酸序列和/或二級結(jié)構(gòu)用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中核酸差異的不同技術(shù)。本發(fā)明清楚地考慮了這樣的方法。
[0221]關(guān)于其他基于擴(kuò)增的測定方式，使用多種方法來分析擴(kuò)增產(chǎn)物，包括凝膠電泳、凝膠過濾、質(zhì)譜，并且在標(biāo)記引物的情況下，通過鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物中的標(biāo)記來分析。在一個替代實施方案中，基本上如 Sadri 和 Hornsby, Nucl.Acids Res.24:5058-5059,1996 以及 Xiong和Laird，Nucl.Acids Res.25，2532-2534，1997所述對由經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制酶消化，以分析所形成的產(chǎn)物。
[0222] 也可采用高通量檢測方法，例如，基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間(MALD1-T0F)、電噴霧離子化(ESI)、質(zhì)譜(包括串聯(lián)質(zhì)譜，如LCMS/MS)、生物傳感器技術(shù)、易消失的光學(xué)纖維技術(shù)或DNA芯片技術(shù)。[0223]關(guān)于本文所述的利用雜交和/或擴(kuò)增檢測系統(tǒng)的另一些測定方式，特別考慮了如本文所述的這些方法與基于選擇性誘變的測定的組合。在一個實例中，通過進(jìn)行包括以下步驟的方法來檢測提高的甲基化:
[0224](i)在足以誘導(dǎo)誘變的條件下用一定量的使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理核酸，從而產(chǎn)生突變核酸；
[0225](ii)在使得與未突變核酸的雜交發(fā)生的條件下，使核酸與兩種非重疊且非互補引物雜交，所述引物各自包含與DNA中包含甲基化胞嘧啶殘基的序列互補的核苷酸序列；
[0226](iii)擴(kuò)增介入雜交引物的核酸，從而產(chǎn)生由包含引物序列的序列組成的DNA片段；
[0227](iv)在使得與未突變核酸的雜交發(fā)生的條件下，使擴(kuò)增的DNA片段與探針雜交，所述探針包含對應(yīng)于包含甲基化胞嘧啶殘基的序列或與其互補的核苷酸序列；以及
[0228](V)檢測雜交。
[0229]陰性讀出測定
[0230]在另一個實例中，測定方式包括這樣的陰性讀出系統(tǒng)，其中來自健康/正常對照樣品的DNA降低的甲基化被檢測為陽性信號，并且優(yōu)選地，檢測不到或僅微弱地檢測到來自贅生性樣品的甲基化DNA。
[0231]在一個優(yōu)選實 施方案中，使用包括以下步驟的方法確定降低的甲基化:
[0232](i)在足以誘導(dǎo)誘變的條件下用一定量使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理核酸，從而產(chǎn)生突變核酸；
[0233](ii)在使得與突變核酸的雜交發(fā)生的條件下使核酸與探針或引物雜交，所述探針或引物包含與包含突變胞嘧啶殘基的序列互補的核苷酸序列；以及
[0234](iii)檢測選擇性雜交。
[0235]在這些實例的一個實施方案中，所述胞嘧啶殘基在CpG 二核苷酸內(nèi)或在CpG島內(nèi)。
[0236]在本文中，術(shù)語“選擇性雜交”意指與探針或引物與非突變序列的雜交相比，相同探針或引物與對應(yīng)突變核酸的雜交以較高頻率或速率發(fā)生，或者具有較高的最大反應(yīng)速度。優(yōu)選地，探針或引物在所用反應(yīng)條件下不與甲基化序列(或未突變序列)雜交。
[0237]基于雜交的測定方式
[0238]在一個實施方案中，使用Southern、斑點印跡、狹縫印跡或其他核酸雜交方法來檢測雜交(Kawai 等，Mol.Cell.Biol.14:7421-7427,1994 ；Gonzalgo 等，Cancer Res.57,594-599，1997)。經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶结樳x擇，這樣的測定方式一般在上文中進(jìn)行了描述并且加上必要變更適用于目前描述的選擇性誘變途徑。優(yōu)選地，采用連接酶鏈反應(yīng)方式來區(qū)分未突變核酸與突變核酸。在這一方面中，測定需求和條件如上文所述地用于陽性讀出測定的一樣并且加上必要的變更適用于本方式。但是，探針的選擇不同。對于陰性讀出測定，選擇一種或更多種與突變序列而不是未突變序列選擇性雜交的探針。
[0239]優(yōu)選地，連接酶鏈反應(yīng)探針具有3’端和/或5’端序列，其包含在健康對照樣品中非甲基化而在癌癥中高甲基化的CpG 二核苷酸，使得診斷探針和毗鄰探針能夠僅在CpG 二核苷酸的胞嘧啶突變成胸苷(例如，在非甲基化胞嘧啶殘基的情況下)時連接。
[0240]如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，上述MSO方法便于進(jìn)行陽性和/或陰性讀出測定之一或二者。這是因為所述測定檢測突變序列和未突變序列二者，從而有助于確定甲基化水平。但是，本發(fā)明考慮了僅檢測甲基化序列或非甲基化序列的測定。
[0241]基于擴(kuò)增的測定方式
[0242]在一個替代實例中，使用用于陽性讀出測定的如上文所述的任意擴(kuò)增測定方式使用擴(kuò)增系統(tǒng)來檢測雜交，即使使用與突變核酸選擇性雜交的引物(和探針(適用時))也是如此。
[0243]為了使之前描述的HeavyMethyl測定適用于陰性讀出方式，以甲基化特異性方式與經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的核酸結(jié)合的阻斷劑在中等至高嚴(yán)格條件下與突變DNA特異性結(jié)合。使用可任選地具有甲基化特異性但是位于一種或更多種阻斷劑側(cè)翼的一種或更多種引物來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在甲基化核酸(即，突變DNA)存在下，阻斷劑結(jié)合并且沒有產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
[0244]在一個實例中，通過進(jìn)行包括以下步驟的方法來檢測正常/健康對照對象中降低的甲基化:
[0245](i)在足以誘導(dǎo)誘變的條件下用一定量的使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理核酸，從而產(chǎn)生突變核酸；
[0246](ii)在使得與未突變核酸的雜交發(fā)生的條件下，使核酸與兩種非重疊且非互補引物雜交，所述引物各自包含與DNA中包含突變胞嘧啶殘基的序列互補的核苷酸序列；
[0247](iii)擴(kuò)增介入雜交引物的核酸，從而產(chǎn)生由包含引物序列的序列組成的DNA片段；
[0248](iv)在使得與突變核酸的雜交發(fā)生的條件下，使擴(kuò)增的DNA片段與探針雜交，所述探針包含對應(yīng)于包含突變胞嘧啶殘基的序列或與其互補的核苷酸序列；以及
[0249](V)檢測雜交。
[0250]如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，陰性讀出測定優(yōu)選地包括合適的對照樣品，以確保陰性結(jié)果是由甲基化核酸而非反應(yīng)失敗造成的。
[0251]在一個特定的實施方案中，使用包括以下步驟的方法來確定本發(fā)明DNA區(qū)域中提聞的甲基化:
[0252](i)在足以誘導(dǎo)誘變的條件下用使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物處理來源于生物樣品的DNA ；
[0253](ii)使用設(shè)計成擴(kuò)增由SEQ IDNO:1、2、3或4之一限定的DNA區(qū)域的引物擴(kuò)增步驟⑴的DNA ；
[0254](iii)對步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，以相對于來自對照樣品的DNA中對應(yīng)的突變殘基，鑒定來自所述測試樣品的樣品中未經(jīng)歷突變的一個或更多個胞嘧啶殘基的存在。
[0255]在另一個實施方案中，用亞硫酸氫鹽或等價試劑誘導(dǎo)所述誘變并且非甲基化的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。這些尿嘧啶殘基在擴(kuò)增步驟期間轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。
[0256]根據(jù)上文描述的檢測方法，在一個實施方案中，其中分析的DNA區(qū)域是SEQ ID NO:I區(qū)域或基本上相似的區(qū)域，分離自非贅生性對照的已經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:5。而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向的對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:6。
[0257]根據(jù)該特定的實施方案，所利用的引物對應(yīng)于SEQ ID NO:18和19或者與其基本上相似。
[0258]在又一個實施方案中，其中分析的DNA區(qū)域是SEQ ID NO:2區(qū)域或基本上類似的區(qū)域，分離自非贅生性對照的已經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:7。而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向的對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:8。
[0259]根據(jù)該特定的實施方案，所利用的引物對應(yīng)于SEQ ID NO:20和21或者與其基本上相似。
[0260]在再一個實施方案中，其中分析的DNA區(qū)域是SEQ ID NO:3區(qū)域或基本上類似的區(qū)域，分離自非贅生性對照的已經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:9，而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向的對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:10o
[0261]根據(jù)該特定的實施方案，所利用的引物對應(yīng)于SEQ ID NO:13和14或與其基本上相似。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在引物是甲基化特異性引物時，其將有效地擴(kuò)增未突變的SEQID NO:10分子，但是將非常無效地擴(kuò)增經(jīng)歷非甲基化胞嘧啶突變的SEQ ID NO:9分子。相同事件分別與SEQ ID NO: 11和12有關(guān)，在以下進(jìn)行討論。
[0262]在又一個實施方案中，其中分析的DNA區(qū)域是SEQ ID NO:4區(qū)域或基本上類似的區(qū)域，分離自非贅生性對照的已經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:11。而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向的對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:12ο
[0263]根據(jù)該特定 的實施方案，所利用的引物對應(yīng)于SEQ IDNO:13、14和15。
[0264]如前文中詳述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，關(guān)于甲基化胞嘧啶殘基的數(shù)目在患者樣品之間可發(fā)生變化。因此，在上文所述實施方案的上下文中，應(yīng)理解，因為等位基因/多態(tài)性變化或者經(jīng)歷高甲基化的胞嘧啶殘基的實際數(shù)目的差異，擴(kuò)增之后獲得的序列可與本文所提供的序列略微不同。因此，應(yīng)理解這些實施方案以延伸至表現(xiàn)出此類變化的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將很好地評估DNA序列，與確定其是否是本發(fā)明DNA區(qū)域的天然變化形式。
[0265]本發(fā)明還提供了用于使用本文所述方法檢測和/或定量本發(fā)明診斷序列或者其表達(dá)或甲基化的試劑盒。
[0266]對于用于檢測甲基化的試劑盒，本發(fā)明試劑盒可包含至少一種與至少一種本發(fā)明診斷序列雜交的多核苷酸以及用于至少一種用于檢測基因甲基化的試劑。用于檢測甲基化的試劑包括例如亞硫酸氫鈉、設(shè)計成與序列(本發(fā)明生物標(biāo)志物序列的產(chǎn)物)雜交(如果生物標(biāo)志物序列是非甲基化的(例如，包含至少一個C —U轉(zhuǎn)化)的話)的多核苷酸、和/或甲基化敏感性或甲基化依賴性限制酶。所述試劑盒還可包含對照的天然或合成DNA序列，其代表序列的甲基化或非甲基化形式，例如以上在SEQ ID NO:5至12中所公開的那些序列。所述試劑盒可提供適合用于測定的測定裝置形式的固體支持物。所述試劑盒可還包含可檢測標(biāo)記，其與試劑盒中的多核苷酸(例如，探針)可操作地連接?？捎糜跍y定性能的另一些材料也可包含在所述試劑盒內(nèi)，包括測試管、移液吸管等。所述試劑盒還可包含將一種或更多種這些試劑用于本文所述測定的任意一種的書面說明。
[0267]如前文詳述的，高甲基化與轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)。因此，除了這些基因提高的甲基化水平提供篩選大腸或乳腺贅生物之傾向或發(fā)生的基礎(chǔ)之外，這些基因的表達(dá)水平下調(diào)在診斷上也是有價值的。根據(jù)本發(fā)明的該方面，提及基因“表達(dá)產(chǎn)物’’或“基因表達(dá)’’是提及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(如初級RNA或mRNA)或翻譯產(chǎn)物如蛋白質(zhì)。在這一點上，可通過篩選所產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物水平(即，RNA或蛋白質(zhì))的變化，基因相關(guān)染色質(zhì)蛋白質(zhì)的變化(例如，氨基酸位數(shù)9或27的賴氨酸上組蛋白H3甲基化的存在(抑制修飾))或者起下調(diào)表達(dá)作用的DNA自身的變化(例如，DNA甲基化的變化)來評估基因表達(dá)水平的變化。
[0268]因此，本發(fā)明的另一個方面涉及一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834295-163834500限定的DNA區(qū)域的表達(dá)水平，其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域較低的表達(dá)水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
[0269]本發(fā)明該方面的方法基于比較該贅生物標(biāo)志物的水平與該標(biāo)志物的對照水平。“對照水平”可以為“正常水平”，其是由對應(yīng)的非贅生性大腸細(xì)胞或細(xì)胞群體表達(dá)的標(biāo)志物水平。
[0270]如前文詳述的，可使用來源于是測試對象的相同個體的組織來測定正常(或“非贅生性”)水平。但是，應(yīng)理解，這對于所涉及個體的侵入性相當(dāng)大，因此可能更便于相對于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果分析測試結(jié)果，所述標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果反映出得自于除所討論患者之外的個體的個體結(jié)果或總體結(jié)果。
[0271]優(yōu)選地，所述對照水平是非贅生性水平。
[0272]如前文所詳述的，本發(fā)明設(shè)計成篩選位于大腸或乳腺中的贅生性細(xì)胞或細(xì)胞群體。因此，提及“細(xì)胞或細(xì)胞群體”應(yīng)理解為提及個體細(xì)胞或細(xì)胞的組。所述細(xì)胞的組可以是細(xì)胞的擴(kuò)散群體、細(xì)胞懸液、細(xì)胞的包封群體或采取組織形式的細(xì)胞群體。 [0273]提及“表達(dá)”應(yīng)理解為提及核酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。提及“RNA”應(yīng)理解為包括提及任意形式的RNA，如初級RNA或mRNA或非轉(zhuǎn)錄RNA (例如，miRNA等)。本發(fā)明不以任何方式限制，導(dǎo)致RNA合成提高或降低的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)也可與該RNA轉(zhuǎn)錄物(如mRNA)產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的翻譯相關(guān)。因此，本發(fā)明還延伸至涉及篩選標(biāo)志物蛋白質(zhì)產(chǎn)物的調(diào)節(jié)水平或類型作為細(xì)胞或細(xì)胞群體贅生性狀態(tài)指標(biāo)的檢測方法。雖然一種方法是篩選mRNA轉(zhuǎn)錄物和/或?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但是應(yīng)理解本發(fā)明不限于這一點，而是延伸至篩選任意其他類型的表達(dá)產(chǎn)物，例如初級RNA轉(zhuǎn)錄物。
[0274]關(guān)于用于下調(diào)DNA區(qū)域表達(dá)的篩選，本領(lǐng)域技術(shù)人員還公知的是，DNA水平可檢測的變化指示基因表達(dá)活性的變化，從而指示表達(dá)產(chǎn)物水平的變化。這些的變化包括但不限于DNA甲基化的變化。因此，本文提及“篩選表達(dá)水平”和比較這些“表達(dá)水平”與對照“表達(dá)水平”應(yīng)理解為提及評估關(guān)于轉(zhuǎn)錄的DNA因素，例如基因/DNA甲基化類型。在前文已部分詳細(xì)描述了這些。
[0275]本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化指示基因表達(dá)的變化。基因表達(dá)的沉默常常與染色質(zhì)蛋白質(zhì)的修飾相關(guān)，組蛋白H3的9位和27位之一或二者上的賴氨酸甲基化是充分研究的實例，并且通過使組蛋白H3的賴氨酸9乙酰化來標(biāo)記活性染色質(zhì)。因此，基因序列與攜帶抑制性或活性修飾的染色質(zhì)的關(guān)系可用于評估基因的表達(dá)水平。
[0276]提及“核酸分子”應(yīng)理解為提及脫氧核糖核酸分子和核糖核酸分子二者及其片段。因此，本發(fā)明延伸至直接篩選生物樣品中的mRNA水平或者篩選反轉(zhuǎn)錄自目的mRNA群體的互補eDNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員很好地設(shè)計了涉及篩選DNA或RNA的方法。如以上詳述的，本發(fā)明方法還延伸至篩選從對象mRNA或基因組DNA自身翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0277]雖然優(yōu)選方法是檢測贅生性標(biāo)志物的表達(dá)產(chǎn)物或DNA變化用于診斷贅生物發(fā)生或其傾向，在某些情況下可期望檢測到所述甲基化水平的逆向變化，例如，以監(jiān)測調(diào)節(jié)贅生性病癥(如腺瘤或腺癌發(fā)生)。在降低的對象標(biāo)志物表達(dá)指示個體患有以腺瘤或腺癌發(fā)生為特征的病癥的情況下，例如，在治療性方案開始后篩選該標(biāo)志物水平的提高可用于指示對象個體病癥的逆轉(zhuǎn)或其他改善形式。因此，本發(fā)明方法可用作認(rèn)為具有贅生物發(fā)生風(fēng)險的那些個體的一次性測試或持續(xù)監(jiān)測方法，或者用作涉及抑制或減慢贅生物發(fā)展的治療性或預(yù)防性治療有效性的監(jiān)測方法。
[0278]評估生物樣品中對象表達(dá)的贅生物標(biāo)志物的手段可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意合適的方法實現(xiàn)。為此，應(yīng)理解，就檢查均勻細(xì)胞群體(例如，腫瘤活檢或富集自均勻初始群體的細(xì)胞群體)或組織切片而言，可利用很多種技術(shù)，例如原位雜交、通過微陣列評估表達(dá)譜、免疫測定等(下文中進(jìn)行更詳細(xì)地描述)，以檢測目的標(biāo)志物的表達(dá)水平的不存在或下調(diào)。但是，就篩選其中發(fā)現(xiàn)了異源群體的均勻細(xì)胞群體或體液(如血液樣品)而言，由于樣品中存在的非贅生性細(xì)胞固有表達(dá)標(biāo)志物，所以檢測不到標(biāo)志物表達(dá)水平的不存在或降低。即，可能檢測不到細(xì)胞亞組表達(dá)水平的降低。在這種情況下，檢測贅生物亞群中本發(fā)明標(biāo)志物表達(dá)水平的降低的更適當(dāng)?shù)臋C制是通過間接手段，例如，檢測表觀遺傳變化。
[0279]檢測基因表達(dá)水平變化的方法(除前文中詳細(xì)描述的甲基化分析之外)，特別是在對象生物樣品未被大量非贅生性細(xì)胞污染的情況下，其包括但不限于:
[0280]⑴體內(nèi)檢測
[0281]可在施用能夠透露腸組織中標(biāo)志物的改變表達(dá)的成像探針或試劑后使用分子成像。分子成像(Moore 等，BBA, 1402:239-249,1988 ；ffeissleder 等，Nature Medicine6:351-355,2000)是分子表達(dá)的體內(nèi)成像，其與目前使用“典型”診斷成像技術(shù)如X射線、計算機斷層掃描(CT)、MR1、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)或內(nèi)窺鏡可視化的宏觀特征相關(guān)。
[0282](ii)通過熒光原位雜交(FISH)檢測細(xì)胞中RNA表達(dá)的下調(diào)，或者通過技術(shù)例如定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(QRTPCR)或競爭性RT-PCR產(chǎn)物的流式細(xì)胞定性來檢測來自細(xì)胞的提取物中 RNA 表達(dá)的下調(diào)(Wedemeyer 等，Clinical Chemistry48:91398-1405, 2002)。
[0283](iii)評估RNA的表達(dá)譜,例如通過陣列技術(shù)評估(Alon等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA:96,6745-6750,1999 年 6 月)。
[0284](iv)測量細(xì)胞提取物中改變的蛋白質(zhì)水平，例如通過免疫測定測量。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種合適方法中的任何一種來進(jìn)行生物樣品中的蛋白質(zhì)性贅生性標(biāo)志物表達(dá)產(chǎn)物。合適方法的實例包括但不限于，抗體篩選組織切片、活檢標(biāo)本或體液樣品。就使用基于抗體的診斷方法而言，可通過多種方式例如Western印跡、ELISA或流式細(xì)胞術(shù)方法確定標(biāo)志物蛋白質(zhì)的存在。當(dāng)然，這些包括單位點和雙位點測定或非競爭性“夾心”測定，以及常規(guī)競爭性結(jié)合測定。這些測定還包括標(biāo)記抗體與靶標(biāo)的直接結(jié)合。
[0285](V)測定細(xì)胞表面上蛋白質(zhì)贅生性標(biāo)志物改變的表達(dá)，例如通過免疫組織化學(xué)測定。
[0286](vi)除以上點(iv)和(V)中詳述的那些之外，基于任意合適的功能測試、酶測試或免疫測試來測定變化的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0287] 按照常規(guī)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定給定方法適用于特定類型生物樣品的適當(dāng)性。
[0288]本發(fā)明的又一個方面涉及分離的核酸分子，其選自:
[0289](i)分離的核酸分子或與其互補的分子或者其片段或衍生物，其包含一種或更多種如SEQ IDNO:5至12中任意一種所示的核苷酸序列，或者在序列長度上具有至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%或更多同一性的核苷酸序列，或者在低嚴(yán)格條件下能夠與所述核酸分子雜交或與其互補的核苷選序列；或者
[0290](ii)分離的核酸分子或者其衍生物或片段，其包含一種或更多種基本上如SEQ IDNO:5至12中任意一種所示的核苷酸序列或者所述分子的片段。
[0291]如上文詳述的，SEQ ID NO:5至12代表在對由SEQ ID NO:1至4定義的DNA區(qū)域進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理和擴(kuò)增后期望獲得的DNA分子的序列。具體地，對來自大腸贅生物的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理不能導(dǎo)致胞嘧啶至尿嘧啶的誘變事件，因為僅非甲基化胞嘧啶殘基經(jīng)歷了突變。在SEQ ID NO:1至4的情況中鑒定了大腸贅生物中經(jīng)歷高甲基化的特定胞嘧啶殘基中的幾個。因此，擴(kuò)增由SEQ ID NO:1、2、3和4限定的DNA區(qū)域，假定所有的相關(guān)胞嘧啶殘基都被高甲基化，將期望導(dǎo)致具有分別基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:6、8、10和12的序列的DNA產(chǎn)物。關(guān)于分離自非贅生性細(xì)胞的DNA (即對照DNA)，期望在亞硫酸氫鹽處理后發(fā)生相關(guān)胞嘧啶殘基的誘變，因為所述殘基是非甲基化的。因此，在該情況下擴(kuò)增由SEQ ID NO:1、2、3和4限定的DNA區(qū)域期望導(dǎo)致分別基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:5、7、9和11的序列的DNA產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，并且如前文詳述的，不同患者之間可發(fā)生高甲基化程度下的變化(關(guān)于其程度和高甲基化胞嘧啶殘基的數(shù)目二者)。然而，盡管事實上每個贅生物樣品不能表現(xiàn)出精確相同的高甲基化類型，但是仍然存在這樣的事實:相對于非贅生樣品，贅生樣品將在由SEQ ID NO :1至4限定的區(qū)域中表現(xiàn)出可檢測的高甲基化。
[0292]從具體選擇以通過胞嘧啶至尿嘧啶誘變方法評估高甲基化，然后擴(kuò)增所討論DNA區(qū)域的觀點來看，由SEQ ID NO:5至12限定的甲基化和非甲基化序列提供了可評估由該診斷方法造成的患者的標(biāo)準(zhǔn)。測試樣品是否表現(xiàn)出高甲基化與由SEQ ID NO:6、8、10和12所表示的完整范圍不相關(guān)。相反地，如果樣品與SEQID NO:5、7、9和11所表示的范圍相比表現(xiàn)出較高水平的高甲基化，則結(jié)果將指示提取樣品的患者被視為具有大腸贅生物。因此，SEQIDNO:5、7、9、11和SEQ IDNO:6、8、10、12變成可分析測試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。針對SEQ IDNO:5、
7、9和11，甲基化的任意提高將是很明顯的并且指示贅生物。比較由SEQ ID NO:6、8、10和12限定的序列的高甲基化程度和類型，提供了與在高甲基化方面?zhèn)€體患者或群體之間可存在的可變性有關(guān)的有用信息。因此，考慮了診斷試劑盒中包含一種或更多種這些標(biāo)準(zhǔn)序列。
[0293]本文中使用的短語“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸；或者指這些中任意一種的片段；指基因組或合成來源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是單鏈的或雙鏈的并且可表示正義鏈或反義鏈；指肽核酸(PNA)或天然或合成來源的DNA樣或RNA樣材料，包括iRNA、核糖核蛋白(例如，iRNP)。所述術(shù)語包括包含天然核苷酸已知類似物的核酸(即，寡核苷酸)。所述術(shù)語還包括具有合成骨架的核酸樣結(jié)構(gòu)，參見，例如 Mata (1997) Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197 ;Strauss_Soukup 等.(1997)Biochemistry36:8692-8698 ；Samstag 等.(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev6:153-156。[0294]為此，應(yīng)理解，本發(fā)明延伸至涉及前文定義核酸分子的反義核酸分子、SiRNA和miRNAo
[0295]本發(fā)明還應(yīng)理解為延伸至涉及前文定義的核酸分子的探針和引物。
[0296]應(yīng)理解，根據(jù)本文所提供的詳細(xì)教導(dǎo)，設(shè)計反義核酸分子及探針和引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)方法的問題。所述反義分子、探針和引物優(yōu)選地特異于其靶分子，但是應(yīng)理解，根據(jù)反義分子、探針或引物的序列和長度可發(fā)生相同的交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)性/混雜性(promiscuity)的水平是否可接受是本領(lǐng)域技術(shù)人員作出的判斷并且將取決于情況的特殊性。一般來說，可通過提高探針或引物的長度來實現(xiàn)特異性提高。優(yōu)選地，所述探針或引物包含至少10、20、30、40或50個核苷酸的核苷酸序列，但是也考慮了使用來源于或涉及上文定義的核苷酸序列的較大分子。該序列可標(biāo)記有能夠給出可鑒定信號的報道分子。
[0297]本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選是分離形式或與載體(如表達(dá)載體)連接?！胺蛛x”意指經(jīng)歷至少一個純化步驟的核酸分子，并且其方便地定義為，例如相對于如通過分子量、序列或其他方便手段測定的其他組分，包含至少約10%對象核酸分子，優(yōu)選至少約20%，更優(yōu)選至少約30%,更更優(yōu)選至少約40%至50%,甚至更優(yōu)選至少約60%至70%,甚至更更優(yōu)選80%至90%或更大的對象核酸分子的組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸分子也可認(rèn)為是生物純的。
[0298]可通過例如克隆和表達(dá)cDNA文庫，通過PCR擴(kuò)增mRNA或基因組DNA等來制備、分離和/或操縱本發(fā)明的核酸。 [0299]可從多種來源中分離，基因工程改造，擴(kuò)增和/或重組表達(dá)或生成本發(fā)明的核酸，無論是RNA、iRNA、反義核酸、cDNA、基因組DNA、載體、病毒還是其雜交體。
[0300]或者，如例如Adams (1983) J.Am.Chem.Soc.105:661 ；Belousov 等.(1997)，見上；Frenkel 等.(1995),見上；Blommers 等.(1994),見上；Narang 等.(1979)Meth.Enzymol.68:90 ；Brown 等.(1979)Meth.Enzymol.68:109 ;Beaucage (1981)Tetra.Lett.22:1859 ;美國專利N0.4，458，066所述，可通過公知的化學(xué)合成技術(shù)在體外合成這些核酸。
[0301]科學(xué)和專利文獻(xiàn)中充分描述了用于操縱核酸的技術(shù)，例如亞克隆、標(biāo)記探針(例如，使用Klenow聚合酶、切口平移、擴(kuò)增進(jìn)行的隨機引物標(biāo)記)、測序、雜交等。
[0302]可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種通用手段中的任意一種來分析和定量核酸、載體、多肽等。這些包括例如分析生物化學(xué)方法，如NMR、分光光度法、放射線照相術(shù)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)和超擴(kuò)散色譜；多種免疫方法，如流體或凝膠沉淀素(precipitin)反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫突光測定、Southern分析、Northern分析、斑點印跡分析、凝膠電泳(例如，SDS-PAGE)、核酸或靶標(biāo)或信號擴(kuò)增方法、放射標(biāo)記、閃爍計數(shù)和親和色譜。
[0303]本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的克隆載體。本發(fā)明的克隆載體可包含病毒顆粒、桿狀病毒、噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、黏粒、福斯質(zhì)粒(fosmid)、細(xì)菌人工染色體、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、惡臭的(foul)痘病毒、偽狂犬病和SV40的衍生物)、Pl基人-工染色體、酵母質(zhì)粒、酵母人工染色體以及特異于特定目的宿主的任意其他載體(如桿菌、曲霉菌和酵母)。本發(fā)明載體可包括染色體、非染色體和合成DNA序列。大量合適的載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且是可商購的。[0304]如果需要，則可使用常規(guī)分子生物學(xué)方法將本發(fā)明核酸克隆到多種載體的任意一種中。例如，美國專利N0.5，426，039描述了用于克隆體外擴(kuò)增核酸的方法。為了幫助克隆擴(kuò)增序列，可將限制酶位點“構(gòu)建成’ ’ PCR引物對。
[0305]本文中使用的術(shù)語“相似性”和“同一性”包括所比較序列在核苷酸水平上的精確同一性。在在核苷酸水平上沒有同一性的情況下，“相似性”包括可編碼不同氨基酸的序列之間的“同一性”差異，但是所述序列在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上彼此相關(guān)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，在同一性而不是相似性水平上進(jìn)行核苷酸序列比較。
[0306]用于描述兩種或更多種多核苷酸之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參照序列”、“比較窗口”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“與……基本上相似”和“與……基本上相同”。“參照序列”是長度為至少12個，但是經(jīng)常是15至18個并且通常是至少25個或更多個單體單元，例如30個單體單元。因為兩種多核苷酸可各自包含(I)兩種多核苷酸之間相似的序列(即，僅完整多核苷酸序列的一部分)，以及
(2)兩種多核苷酸之間不同的序列，所以通常可在“比較窗口”上通過比較兩種多核苷酸序列來進(jìn)行兩種(或更多種)多核苷酸之間的序列比較，以鑒定并比較局部區(qū)域的序列相似性?！氨容^窗口”指與參照序列相比通常為12個相鄰殘基的概念性區(qū)段。比較窗口可包含與參照序列(其不包含添加和缺失)相比約20%或更少的添加或缺失(即，缺口)，用于對兩條序列進(jìn)行最佳比對?？赏ㄟ^計算機實施算法(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包7.0版本，Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison, WI, USA 中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通過觀察和所選的多種方法中任意一種產(chǎn)生的最佳比對(即，導(dǎo)致比較窗口上最高百分比的同源性)，來進(jìn)行用于比對比較窗口的序列最佳比對。還可參照如例如Altschul 等(Nucl.Acids Res.25:3389,1997)所公開的 BLAST 家族的程序?？稍?Ausubel等(“Current Protocols in Molecular Biology^John ffiley&Sons Inc,第 15章，1994-1998)的19.3單元中找到序列分析的詳細(xì)討論。多種其他算法也可用于比較核苷酸序列，例如但不限于 PILEUP、CLUSTALW、SEQUENCHER 或 VectorNTI。
[0307]本文中使用的術(shù)語“序列相似性”和“序列同一性”是指序列在比較窗口上以核苷酸-核苷酸為基礎(chǔ)相同或者功能或結(jié)構(gòu)相似的程度。因此，例如，通過以下方法來計算“序列同一性百分比”:在比較窗口中比較兩個最佳比對的序列，確定兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如，A、T、C、G)的位置示出以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，用匹配位置數(shù)目除以比較窗口中總位置數(shù)目(即，窗口大小)，并且結(jié)果乘以100，以得到序列同一性百分比。
[0308]在兩種核酸情況下，短語“與……基本上相同”或“與……基本上相似”可指兩條或更多條序列在比較和比對以最大對應(yīng)時具有至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性。
[0309]本發(fā)明提供了分離的核酸或重組核酸，其在低嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的示例性序列雜交。在一些替代方面中，如本領(lǐng)域所公知并且如本文所描述的，嚴(yán)格條件是高嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件。這些方法可用于本發(fā)明的分離核酸。
[0310]“雜交”是指核酸鏈與互補鏈通過堿基配對結(jié)合的過程。雜交反應(yīng)可具有敏感性和選擇性，使得即使在其以低濃度存在的樣品中也可鑒定出特定的目的序列。嚴(yán)格條件可由例如預(yù)雜交和雜交溶液中鹽或甲酰胺的濃度，或者由雜交溫度來限定，并且在本領(lǐng)域中是公知的。例如，如以下詳述的，可通過降低鹽濃度，提高甲酰胺濃度，或者升高雜交溫度，改變雜交時間提高嚴(yán)格度。在一些替代方面中，如本文所述，本發(fā)明核酸由其在多種嚴(yán)格條件(例如，高、中等和低)雜交的能力限定。
[0311]本文提及低嚴(yán)格度包括并且涵蓋至少約O至至少約15% v/v甲酰胺和至少約IM至至少約2M鹽用于雜交，以及至少約IM至至少約2M鹽用于洗滌條件。一般來說，低嚴(yán)格度在約25-30°C至約42°C。溫度可改變并且使用較高溫度來代替甲酰胺和/或給出替代嚴(yán)格條件。在需要時可應(yīng)用替代嚴(yán)格條件，例如中等嚴(yán)格度，其包括并且涵蓋至少約16% v/v至至少約30% v/v甲酰胺和至少約0.5M至約0.9M鹽用于雜交，以及至少約0.5M至至少約0.9M鹽用于洗滌條件；或者高嚴(yán)格度，其包括并且涵蓋至少約31% v/v至至少約50% v/v甲酰胺和至少約0.01M至約0.15M鹽用于雜交，以及至少約0.01M至至少約0.15M鹽用于洗滌條件。一般來說，洗滌在 Tm=69.3+0.41 (G+C) %下進(jìn)行(Marmu 和 Doty, J.Mol.Biol.5:109，1962)。但是，隨著錯配堿基對數(shù)目每提高I %，雙鏈體DNA的Tm就降低IV (Bonner和Laskey, Eur.J.Biochem.46:83,1974)。甲酰胺在這些雜交條件下是任選的。因此，如下定義了特別優(yōu)選的嚴(yán)格度水平:低嚴(yán)格度為6X SSC緩沖液，0.l%w/v SDS，在25°C至42°C下；中等嚴(yán)格度為2X SSC緩沖液，0.1% w/v SDS，在范圍為20°C至65°C的溫度下；高嚴(yán)格度為0.1 X SSC緩沖液，0.1% w/v SDS，在至少65°C的溫度下。 [0312]在本發(fā)明核酸由其在高嚴(yán)格條件下雜交的能力限定時，這些條件包括在約37°C至42°C下的約50%甲酰胺。在一個方面中，本發(fā)明核酸由其在降低的嚴(yán)格度下雜交的能力限定，所述降低的嚴(yán)格度包括在約30°C至35°C下的約35%至25%甲酰胺的條件?；蛘撸景l(fā)明核酸由其在高嚴(yán)格度下雜交的能力限定，所述高嚴(yán)格度包括在42°C下在50%甲酰胺，5XSSPE,0.3% SDS和重復(fù)序列鎖定核酸(如cot_l或鮭精DNA)(例如，200n/ml經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA)中。在一個方面中，本發(fā)明核酸由其在降低的嚴(yán)格度條件下雜交的能力限定，所述降低的嚴(yán)格度條件包括在35°C的降低溫度下的35%甲酰胺。
[0313]本發(fā)明的另一個方面提供了用于測定生物樣品的診斷試劑盒，其包含一種或更多種用于檢測本發(fā)明標(biāo)志物的物質(zhì)和可用于幫助所述物質(zhì)檢測的試劑。還可包含另一些裝置，例如以接收生物樣品。所述物質(zhì)可以是任意合適的檢測分子。
[0314]在一個實施方案中，所述試劑盒包含對應(yīng)于SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11或12的
一種或更多種核酸分子或者基本上相似的核酸分子。如前文詳述的，這些序列可用作評估由測試樣品擴(kuò)增的產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)(對照)。
[0315]在另一個實施方案中，所述試劑盒包含一個或更多個擴(kuò)增引物組，所述引物組對應(yīng)于如下序列:
[0316](i)SEQ ID NO:13和14或者基本上相似的序列；
[0317](ii) SEQ IDNO: 13、14和15或者基本上相似的序列；
[0318](i i i) SEQ ID NO: 18和19或者基本上相似的序列；
[0319](iv) SEQ ID NO:20和21或者基本上相似的序列。
[0320]參照下面的非限制性實施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明。
[0321]實施例1
[0322]鑒定差異性DNA甲基化的推定區(qū)域
[0323]使用國際專利公開N0.W02011/017760中描述的亞硫酸氫鹽標(biāo)簽方法向三種結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和UM應(yīng)用DNA甲基化的全基因組分析，與來自周邊血液的DNA進(jìn)行比較。該技術(shù)表征了 TaqI(TCGA)和MspI (CCGG)限制性位點上的DNA甲基化水平。所鑒定的差異性甲基化位點中是位于染色體6，位置163，834，406上的TaqI限制性位點中的CpG位點。在比較8種結(jié)直腸癌DNA與其8中匹配正常組織DNA的樣品時，該位點還顯示出差異性甲基化。該位點鑒定出位于先前未表征的基因Refseq L0C100526820中，并且如下文所述研究了此處和周圍序列中的DNA甲基化。隨后將基因命名為CAHM(結(jié)直腸腺癌高甲基化)。
[0324]實施例2
[0325]來自10個正常組織標(biāo)本和10個結(jié)直腸癌標(biāo)本的結(jié)直腸組織標(biāo)本中SEQ ID NO:1中胞嘧啶的甲基化
[0326]設(shè)計引物以在用亞硫酸氫鹽進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化之后擴(kuò)增L0C100526820基因的兩個區(qū)域。與亞硫酸氫鈉反應(yīng)使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(隨后擴(kuò)增為胸腺嘧啶)，而5-甲基胞嘧啶沒有轉(zhuǎn)化；設(shè)計引物以等量擴(kuò)增甲基化和非甲基化DNA序列。
[0327]正向引物:5'ATTTGTAAAAATGTTGATTTTTGTTTTTTAGAT(SEQ ID NO:18)
[0328]反向引物:5'TCTTATTACACCTTCCCRTTATTCTA(SEQ ID NO:19)
[0329]將引物用于對10個結(jié)直腸癌標(biāo)本的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA，其匹配正常組織和正常血液 DNA 進(jìn)行 PCR。使用 Promega GoTaq master mix (不含 SybrGreen)、3mM MgCl2 以及200nM的引物和IOnm輸入DNA進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)條件為95°C下2分鐘(I次循環(huán))；然后為50次循環(huán)的95°C 15秒、56°C 30秒、72°C 30秒。將擴(kuò)增的DNA帶凝膠純化并且用接頭連接以在Roche454Titanium FLX系統(tǒng)上進(jìn)行測序。來自個體患者的樣品和血液DNA樣品分別用條形碼“MID”接頭(Roche Cat No05619211001)連接，使得序列讀數(shù)可歸屬于各個樣品以進(jìn)行序列比對和評分。根據(jù)提供有Roche文庫制備試劑盒和試劑的方案制備其文庫(SEQ IDNO:2，以下的實施例3)以及來自其他基因的擴(kuò)增子，并且對流動池的兩個半份進(jìn)行測序；一半包含所有的癌癥樣品并且一半包含等量的條形碼正常樣品。使用條形碼序列針對單個樣品分離亞硫酸氫鹽測序讀數(shù)，并將其與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的序列SEQ ID NO:6進(jìn)行比對。在最佳比對之后，對于每個樣品，確定了每個潛在CpG甲基化位點(參照擴(kuò)增子中的核苷酸位置，圖1中標(biāo)記為36、38、63等的位點)中胞嘧啶的分?jǐn)?shù)。
[0330]圖1(b)示出了擴(kuò)增子中每個CpG位點上甲基化的譜。紅線代表癌癥樣品，對應(yīng)的藍(lán)線示出匹配的正常組織DNA的甲基化狀態(tài)。明顯看出，癌癥樣品中有7個在大多數(shù)CpG位點上顯示出高甲基化水平(約80%)，兩個顯示出中等水平并且一個顯示出最低程度的甲基化。相對地，10個正常DNA樣品中有8個顯示出甲基化，一般在擴(kuò)增子中〈10%，一個為低水平10%至20%，并且一個為中等水平約30%。這種部分甲基化的正常樣品對應(yīng)的癌癥樣品是顯示出高水平甲基化的那些樣品之一。顯著地，分析來源于周邊血液的DNA在擴(kuò)增子中的所述CpG位點上顯示出最小程度的甲基化(〈3% )。因此，SEQ ID NO:1中CpG位點上的甲基化水平區(qū)分了結(jié)直腸癌DNA與匹配的正常結(jié)腸組織的DNA和來源于血液的對照DNA。
[0331]實施例3
[0332]來自10個正常組織標(biāo)本和10個結(jié)直腸癌標(biāo)本的結(jié)直腸組織標(biāo)本中SEQ ID NO:2中胞嘧啶的甲基化
[0333]使用以下引物，如SEQ IDNO:1地分析圖2(a)示出的相鄰區(qū)域SEQ ID NO:2:[0334]正向引物:5'GTYGTGTTGTTTTTTAGTTTTTTAGTAAATT (SEQ ID NO: 20)
[0335]反向引物:5’CACRATACRAAAAACTAATAAACTTTCCTTA (SEQ ID NO:21)
[0336]圖2(b)示出了擴(kuò)增子中每個CpG位點上甲基化的譜。紅線代表癌癥樣品，對應(yīng)的藍(lán)線示出匹配的正常組織DNA的甲基化狀態(tài)。擴(kuò)增子中心區(qū)域的序列特征限制了Roche454測序系統(tǒng)中的讀數(shù)長度；因此僅可評估鄰近序列讀數(shù)起始端的CpG位點。然而，清楚的是，癌癥特異性高甲基化包括擴(kuò)增子左端的前六個CpG位點(堿基61，染色體坐標(biāo)163,834,653至163,834, 6681)并且延伸至包括最后的10個CpG位點，在堿基195與252之間(染色體坐標(biāo)163，834，815至163,834,872)。另外，10個癌癥樣品中有9個顯示出中等或高的甲基化水平，并且僅一個匹配的正常組織顯示出任意顯著的甲基化。另外，該擴(kuò)增子中的CpG位點甲基化在周邊血液DNA中也非常低(<3%)。組合的數(shù)據(jù)指示，兩個所測序擴(kuò)增子所涵蓋的區(qū)域(即，染色體6(hgl9序列)的堿基163834295至163834906)表現(xiàn)出結(jié)直腸癌特異性高甲基化并且適合于開發(fā)用于檢測結(jié)直腸癌的測定。
[0337]實施例4
[0338]使用用于擴(kuò)增的甲基化特異性qPCR測定測量結(jié)腸組織標(biāo)本中CAHM基因(L0C100526820)中的甲基化水平
[0339]由結(jié)腸組織標(biāo)本(包括10個腺瘤、15個I期、18個B期、28個C期、7個IV期)、6個匹配的正常結(jié)腸標(biāo)本和7個其他正常結(jié)腸組織中提取DNA。使用Zymo EZ Gold亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒如制造商建議地對分離的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。
[0340]PCR測定是15yL反應(yīng)混合物，其包含最終濃度為IX白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、3mM MgCl2、200nM 寡核苷酸 SEQ ID N0:13 和 14、200μΜ dNTP(New EnglandBioLabs)、lX白金緩沖液以及分子探針SYBR Green(SYBRGreen)的1: 120，000稀釋液。循環(huán)條件為95°C維持2分鐘，然后是三個循環(huán)的92°C 15秒，62°C 15秒和72°C 20秒。然后是50 個循環(huán)的 82°C 15 秒，63°C 15 秒和 72°C 20 秒。在 RocheLightCycler480 實時 PCR 儀器中使用384孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0341]使用與周邊血液白細(xì)胞DNA混合的40pg至5ng全甲基化DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化水平，以得到5ng的總輸入。表1總結(jié)了 L0C100526820SEQ ID NO:3的甲基化頻率。發(fā)現(xiàn)PCR靶向的SEQ IDNO: 10在70%的提取自腺瘤的組織DNA中是陽性的，在總體癌組織標(biāo)本中有74%是陽性的，而僅在所測試的正常結(jié)直腸組織標(biāo)本的25%中是甲基化的(并且在這里為低水平)。
[0342]實施例5
[0343]通過測量來自25個結(jié)腸鏡檢查陰性健康正常對象、25名結(jié)直腸腺瘤患者和25名結(jié)直腸癌患者的游離循環(huán)血漿DNA中CAHM基因(L0C100526820)的甲基化水平來檢測結(jié)直腸贅生物
[0344] 由25名結(jié)直腸腺瘤患者、25名結(jié)直腸癌患者和25名結(jié)腸鏡檢查陰性健康患者的4mL人血漿中體乳DNA。使用來自血清/血漿的游離循環(huán)核酸的QIAmp Isolation (QIAGEN)進(jìn)行提取。使用Zymo亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒如制造商建議地對分離DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。從4mL血清中回收總計36 μ L的經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA。將來自每個患者的總計
2.5 μ L的經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA用于30 μ L的第一輪PCR反應(yīng)中，所述30 μ L的第一輪PCR反應(yīng)由最終濃度為IX白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、3.3mM MgCl2、200nM寡核苷酸 SEQ ID NO:13 和 15,200 μ M dNTP (New England BioLabs)和 IX 白金緩沖液組成。循環(huán)條件為95°C維持2分鐘，然后是7個循環(huán)的92°C 15秒，60°C 30秒和72°C 30秒。在PALM終點PCR循環(huán)器中使用96孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對I μ L來自PCR第一輪的物質(zhì)進(jìn)行第二次PCR，進(jìn)入15 μ L的總PCR反應(yīng)，其由最終濃度為I X白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、4mMMgC12、200nM 寡核苷酸 SEQ ID NO:13 和 14、200 μ M dNTP (New England BioLabs)、1X 白金緩沖液以及分子探針SYBR Green(SYBR Green)的1:120，000稀釋液組成。循環(huán)條件為95°C維持2分鐘，然后是三個循環(huán)的92°C 15秒，62°C 15秒和72°C 20秒。然后是47個循環(huán)的820C 15秒，62°C 15秒和72°C 20秒。在95°C下5秒，65°C I分鐘并且使用0.11°C /秒的傾斜速度連續(xù)提高至97°C，進(jìn)行解鏈曲線分析。在Roche LightCycler480實時PCR儀器中使用384孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物解鏈曲線在77.4°C +/-0.5°C的患者對象稱為陽性。使用與周邊血液白細(xì)胞DNA混合的40pg至5ng全甲基化DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化水平，以得到5ng的總輸入。表2總結(jié)了游離循環(huán)血漿DNA中CAHM基因(L0C100526820)的甲基化頻率。
[0345]看出檢測的敏感性隨著癌癥分期提高而提高。這些數(shù)據(jù)證實了分離自血清的DNA中L0C100526820甲基化的特異性測定用于檢測結(jié)直腸贅生物的潛在應(yīng)用。
[0346]實施例6
[0347]使用用于擴(kuò)增的甲基化特異性qPCR測定測量結(jié)腸乳腺、前列腺和肺組織
[0348]標(biāo)本中CAHM(L0C100526820)的甲基化水平
[0349]由包括以下的組織標(biāo)本中提取DNA:10個乳腺癌和10個匹配的正常乳腺組織標(biāo)本、10個非癌和10個匹 配的正常肺組織標(biāo)本以及5個前列腺癌和5個匹配的正常前列腺組織標(biāo)本。此外，包括之前未測試的10個結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和10個匹配的正常結(jié)腸組織標(biāo)本的群體作為對照。使用200nM CFFl引物以及如Devos等.Clin Chem2009 ；55 =1337-1346所述的循環(huán)條件在改性的15 μ LPCR混合物中測定分離DNA的濃度，所述PCR混合物包含:0.05U/y L 白金 TaqDNA 聚合酶(Invitrogen) U X 白金緩沖液、3mM MgCl2、200 μ M dNTP 和200nM TaqMan 探針(5，-6FAM-ATG GAT GAA GAA AGA AAG GAT GAGT-BHQ-1) (SEQ ID NO:22)。
[0350]使用Epitect Plus Bisulfite試劑盒(QIAGEN)如制造商建議地對Iyg DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽純轉(zhuǎn)化。在15 μ L PCR中以對于每種引物900ηΜ的最終濃度使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化特異性ACTB引物(正向引物:5’ GTG ATG GAG GAG GTT TAG TAA GTT ;反向引物:5’ -AATTAC AAA AAC CAC AAC CTA ATA AA)測定經(jīng)純化的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化DNA的濃度，所述PCR包含
0.05U/ μ L 白金 TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、I X 苯甲基緩沖液、2mMMgCl2、200 μ M dNTP和IOOnM TaqMan 探針(5’-6FAM_ACC ACC ACC CAA CAC ACA ATA ACA AAC ACA-BHQ-1) (SEQ ID NO:25)。PCR 循環(huán)條件:95°C 2 分鐘；60 次循環(huán)的[95°C，10 秒；60°C，50 秒];4°C 10 秒。
[0351 ] 在25 μ L反應(yīng)混合物中使用CAHM PCR測定測定5ng亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化組織DNA中的CAHM甲基化水平(一式三份)，所述反應(yīng)混合物包含最終濃度為I X白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、3mM MgCl2、200nM 寡核苷酸 SEQ ID NO: 13 和 14、200 μ M dNTP、I X 白金緩沖液以及分子探針SYBR Green(Invitrogen)的1:120，000稀釋液。PCR循環(huán)條件:95°C，2分鐘；3次循環(huán)的[92°C，15秒；62°C，15秒；72°C，20秒];然后是50次循環(huán)的[82°C，15秒；63°C，15秒；72°C，20秒]，然后通過以下設(shè)定進(jìn)行解鏈曲線分析:在95°C 5秒，65°C I分鐘，以0.11°C /秒連續(xù)獲得(5/秒)逐漸升高至97°C ;然后冷卻至40°C維持10秒。在ROcheLightCycIer480實時PCR儀器中使用96孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0352]使用20pg至5ng全甲基化DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化水平。表3總結(jié)了 CAHM基因(L0C100526820)SEQ ID NO:3 的甲基化頻率。
[0353]PCR靶向的SEQ ID NO: 10在10個結(jié)直腸癌標(biāo)本的9個和10個正常標(biāo)本的I個中為多于2%甲基化的。相對地，CAHM在10個配對前列腺標(biāo)本的任何一個中都沒有顯示出甲基化。在20個匹配肺標(biāo)本的3個(2個正常和I個癌癥)以及匹配乳腺標(biāo)本的18個中測量出低水平甲基化(小于0.3% )。僅2個乳腺癌標(biāo)本具有多于2%的CAHM甲基化。這些數(shù)據(jù)不僅證實了與其他癌癥相比CAHM基因座中甲基化用于檢測結(jié)腸癌的高敏感性，還證實了 CAHM甲基化可檢測乳腺癌的亞組。
[0354]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文所述的本發(fā)明易于進(jìn)行除本文具體所述那些之外的變化和修改。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有的這些變化和修改。本發(fā)明還包括本說明書所提及或指示的各個或總體的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任意兩個或更多個所述步驟或特征的任意組合和全部組合。
[0355]表1
【權(quán)利要求】
1.一種在個體中篩選大腸或乳腺贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834097-163834982限定的DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域更高的甲基化水平指示贅生性大腸或乳腺細(xì)胞或者傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括評估選自由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834295-163834500 或 Chr6:163834621-163834906 限定的區(qū)域之一或二者的 DNA 區(qū)域的甲基化狀態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述方法包括評估選自由Hgl9坐標(biāo)Chr6:163834393-163834519 或 Chr6:163834393-163834455 限定的區(qū)域之一或二者的 DNA 區(qū)域的甲基化狀態(tài)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括評估一個或更多個選自以下的胞嘧啶殘基或者相反DNA鏈上第n+1位處對應(yīng)的胞嘧啶的甲基化:
Chr6:163834330 Chr6:163834332 Chr6:163834357
Chr6:163834373 Chr6:163834384 Chr6:163834390
Chr6:163834392 Chr6:163834406 Chr6:163834412
Chr6:163834419 Chr6:163834443 Chr6:163834448
Chr6:163834452 Chr6:163834464 Chr6:163834483
Chr6:163834653 Chr6:163834660 Chr6:163834672
Chr6:163834675 Chr6:163834678 Chr6:163834681
Chr6:163834815 Chr6:163834824 Chr6:163834835
Chr6:163834840 Chr6:163834853 Chr6:163834855
Chr6:163834858 Chr6:163834863 Chr6:163834869
Chr6:163834872。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中使用以下方法檢測所述DNA甲基化: (i)甲基化特異性PCR; (ii)MethyLight測定； (iii)甲基化敏感性單核苷酸引物延伸； (iv)甲基化CpG島擴(kuò)增；
(V) HeavyMethyl 測定；
(vi)Headloop PCR ;或 (vii)Helper依賴性鏈反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所分析的DNA區(qū)域是SEQID NO:1區(qū)域或基本上相似的區(qū)域，并且經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟后的分離自非贅生性對照的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:5，而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向之對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:6。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所利用的引物對應(yīng)于SEQID NO:18和19或者與其基本相似。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所分析的DNA區(qū)域是SEQID NO:2區(qū)域或基本上相似的區(qū)域，并且經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟后的分離自非贅生性對照的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:7，而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向之對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:8。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所利用的引物對應(yīng)于SEQID NO:20和21或者與其基本相似。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所分析的DNA區(qū)域是SEQID NO:3區(qū)域或基本上相似的區(qū)域，并且經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟后的分離自非贅生性對照的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:9，而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向之對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO =IO0
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所利用的引物對應(yīng)于SEQID NO:13和14或者與其基本相似。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所分析的DNA區(qū)域是SEQID NO:4區(qū)域或基本上相似的區(qū)域，并且經(jīng)歷亞硫酸氫鈉誘變步驟后的分離自非贅生性對照的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:11，而分離自表現(xiàn)出大腸或乳腺贅生物發(fā)生或發(fā)生傾向之對象的對應(yīng)區(qū)域的序列基本上對應(yīng)于SEQ ID NO:12ο
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所利用的引物對應(yīng)于SEQIDNO:13、14和15。
14.一種在個 體中篩選大腸贅生物的發(fā)生或發(fā)生傾向的方法，所述方法包括在來自所述個體的生物樣品中評估由Hgl9坐標(biāo)Chr6 =163834295-163834500限定的DNA區(qū)域的表達(dá)水平，其中相對于對照水平，所述DNA區(qū)域更低的表達(dá)水平指示贅生性大腸細(xì)胞或傾向于發(fā)生贅生性狀態(tài)的細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述表達(dá)水平是mRNA表達(dá)或蛋白質(zhì)表達(dá)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述贅生性細(xì)胞是腺瘤或腺癌。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其中所述對照水平是非贅生性水平。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述贅生物是結(jié)直腸贅生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是糞便樣品、灌腸洗液、外科手術(shù)切除、組織活檢或血液樣品。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述個體是人。
21.一種用于測定生物樣品的診斷試劑盒，其包含一種或更多種多核苷酸以及至少一種用于檢測基因甲基化的試劑，所述多核苷酸與至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的診斷序列雜交。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含使非甲基化胞嘧啶殘基選擇性突變的化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含: (i)亞硫酸氫鈉； (?)引物，其與至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的診斷序列雜交；以及 (iii)可檢測標(biāo)記的探針，其區(qū)分已用亞硫酸氫鹽處理的甲基化DNA與非甲基化DNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含對照DNA序列，其代表所述診斷序列的甲基化或非甲基化形式。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述DNA序列是SEQIDNO:5、6、7、8、9、10、11或12中的一種或更多種，或者是基本上相似的核酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含一個或更多個擴(kuò)增引物組，所述引物組對應(yīng)于如下序列: (i)SEQ ID NO: 13和14或基本上相似的序列； (ii)SEQIDNO: 13、14和15或基本上相似的序列； (iii)SEQ ID NO:18和19或基本上相似的序列；或者 (iv)SEQ ID NO:20和21或基本上相似的序列。
27.—種分離的核酸分子,其選自: (i)分離的核酸分子或與其互補的分子或者其片段或衍生物，其包含一種或更多種如SEQ ID NO:5至12中任一種所示的核苷酸序列，或者在所述序列長度上具有至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或更高同一性的核苷酸序列，或者能夠在低嚴(yán)格條件下與所述核酸分子或其互補形式雜交的核苷酸序列；或者 (?)分離的核酸分子或者其衍生物或片段，其包含一種或更多種基本上如SEQ ID NO:5至12中任一種所示核苷酸序列或者所述分子的片段。
【文檔編號】C12Q1/68GK104024427SQ201280049431
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月25日
【發(fā)明者】彼得·勞倫斯·莫洛伊, 勞倫斯·查爾斯·拉普安特, 蘇珊·卡爾廷·彼得森, 蘇珊·瑪格麗特·米切爾 申請人:臨床基因組學(xué)私人有限公司, 聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織