從簡單碳源合成ω-官能化的羧酸和羧酸酯的生物技術(shù)方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題是用于從簡單碳源生產(chǎn)官能化的羧酸和官能化的羧酸酯的生物技術(shù)方法。
【專利說明】從簡單碳源合成ω-官能化的羧酸和羧酸酯的生物技術(shù)方
法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明的主題是從簡單碳源生產(chǎn)ω -官能化的羧酸和ω -官能化的羧酸酯的生物技術(shù)方法。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]ω-官能化的羧酸和對應(yīng)的酯的生物技術(shù)生產(chǎn)目前僅僅以生物轉(zhuǎn)化的形式進(jìn)行描述，其中將對應(yīng)的羧酸作為底物與適當(dāng)?shù)纳锛?xì)胞接觸,其酶促催化必要的反應(yīng)。
[0003]適合于生產(chǎn)ω -氨基羧酸及其酯的此類方法和細(xì)胞例如描述于W02009077461中。
[0004]ΕΡ2322598還描述了在特定裝備的熱帶假絲酵母iropicaJis)細(xì)胞中從用作底物的脂肪酸生產(chǎn)ω-羥基羧酸及其酯。非常相似的程序描述于W02011008232中,其中阻斷了 β-氧化的假絲酵母細(xì)胞通過酶促氧化從脂肪酸開始形成了對應(yīng)的ω-官能化的羧酸和二酸。
[0005]需要作為底物的脂肪酸及其衍生物如今專門獲自植物和動物的油或脂肪。這具有非常多的缺點: 具體而言，作為BSE危機的后果，動物脂肪作為原材料仍面臨極低的客戶接受度。含有短鏈和中長鏈脂肪酸的植物油難于獲得,或者產(chǎn)自熱帶地區(qū)。由于在一些情況下清除了雨林以提供耕地面積，因此生產(chǎn)的可持續(xù)性在許多情況下產(chǎn)生問題。
[0006]此外，植物和動物油或脂肪對于各種原材料具有特定但確定的脂肪酸范圍。因此，本文進(jìn)行配對生產(chǎn)，其能夠?qū)δ骋恢舅岱N類是價格確定的。最后，但同樣重要的是，許多植物油同時也是食品,從而在某些情形下,在用作材料和用作食品之間可能產(chǎn)生了競爭。
[0007]本發(fā)明的目的是提供用于不依賴于脂肪酸作為反應(yīng)物生產(chǎn)ω-官能化羧酸和ω-官能化羧酸酯的生物技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)下文描述的含有遺傳修飾的細(xì)胞能夠解決針對本發(fā)明的問題。
[0009]因此,本發(fā)明的主題是這樣的微生物,其合成提高量的羧酸或羧酸酯,并且根據(jù)進(jìn)一步的遺傳特征提供具有ω-官能度的這些物質(zhì)。
[0010]本發(fā)明的進(jìn)^-步的主題是上述微生物用于生產(chǎn)ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的用途以及使用所述微生物生產(chǎn)ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的方法。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點是生產(chǎn)方法中的產(chǎn)物抑制能夠顯著降低。
[0012]本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)點是所述方法能夠從不相關(guān)碳源在培養(yǎng)上清液中生產(chǎn)具有高時空產(chǎn)量、高碳產(chǎn)量和高濃度的ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯。尤其是作為后者的結(jié)果,促進(jìn)了有效的后處理。
[0013]本發(fā)明包括用于生成重組微生物細(xì)胞的方法,所述微生物細(xì)胞能夠從不相關(guān)碳源生產(chǎn)ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯。
[0014]因此,本發(fā)明包括微生物,其具有第一種遺傳修飾,從而相比于它的野生型，它能夠從至少一種簡單碳源形成更多的羧酸或羧酸酯，其特征在于所述微生物具有第二種遺傳修飾,該遺傳修飾包括所述微生物具有至少一種酶E1的相比于它的野生型提高的活性，其催化羧酸或羧酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的ω-羥基羧酸或ω-羥基羧酸酯。
[0015]在本發(fā)明的范圍,將術(shù)語“第一種遺傳修飾”理解為表示微生物的至少一種遺傳修飾，其中相比于野生型菌株，一種或多種基因的表達(dá)被修飾，即提高或降低。
[0016]在本發(fā)明的范圍,將術(shù)語“簡單碳源”理解為表示這樣的碳源,其中在碳骨架上,至少--個C-C鍵已經(jīng)被破壞和/或所述簡單碳源的至少一個碳原子必須與另一分子的至少一個碳原子形成至少一個新的鍵，以獲得“更多種形成的羧酸或羧酸酯”的碳骨架。
[0017]除非另有說明，所有說明的百分比(％)均為質(zhì)量百分比。
[0018]可以將碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素和半纖維素，但還有甘油或最簡單的有機分子諸如C02、CO或合成氣體用作碳源。
[0019]本發(fā)明優(yōu)選的羧酸或羧酸酯是在羧酸鏈中具有多于一個，尤其是3-36個、優(yōu)選6-24個、尤其是10-14個碳原子的那些。這可以是直鏈的、支鏈的、飽和的或不飽和的，并且任選被其他基團(tuán)所取代。
[0020]羧酸酯優(yōu)選是其中醇組分來源于甲醇、乙醇或其他具有3-18個碳原子的伯醇，尤其是甲醇和乙醇。
[0021]尤其優(yōu)選的是,羧酸是選自以下的組的脂肪酸:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、山崳酸、二十四烷酸、蠟酸`、褐煤酸、蜂花酸、十一碳烯酸、肉豆蔻腦酸、巖芹酸、油酸、反油酸、異油酸、順二十碳-9-烯酸、二十碳烯酸、鯨蠟烯酸、芥酸、神經(jīng)酸、亞油酸、α -亞麻酸、Y -亞麻酸、金蓋花素酸、石榴酸、α -桐酸、β -桐酸、花生四烯酸、二____卜碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、斑鳩菊酸、蓖麻油酸
及其酯，其中所述脂肪酸酯優(yōu)選是其中醇組分來源于甲醇、乙醇或其他具有3-18個碳原子的伯醇，尤其是甲醇和乙醇。
[0022]本發(fā)明優(yōu)選的是,基于優(yōu)良的遺傳可達(dá)性,使用選自細(xì)菌的微生物,尤其選自包含以下，優(yōu)選由其組成:乏養(yǎng)菌屬iAbiotrophia、、Acaryochloris、Jcci皿/JiAacier、醋弧菌屬(Ace ti vibrio )、醋酸樸菌屬Oice tobac ter )、醋鹽桿菌屬C4ce tohalobiω? )、醋絲菌屬(Acetonema )、無色桿菌屬(Jchromobacter)、氛基酸球菌屬(Jcidaminococcus )、酸微菌屬
嗜酸菌屬(Acidiphi Iium)、酸硫桿狀菌屬(.Acidi thiobaci I Ills')、舊菌屬(J ci dobac teri Wffl )、熱酸菌屬(J ci do thermus )、食酸菌屬dit/o vorax )、不動桿菌屬(Acine tobac ter )、放線桿菌屬(Actinobaci Ilus )、放線菌屬{Actinomyces )、束絲放線菌屬 tinosynnema )、氣球菌屬 CAerococcus )、氣微菌屬(Aeromicrohium )、氣單胞菌屬iAeromonas),阿菲波菌屬(Afipia)、凝聚桿菌屬(Aggregatibacter)、土壤桿菌屬(Agrobac teri um )、Ahrensi a、Akkermansi a、食堿菌屬 iAlcani vorax )、脂環(huán)酸芽胞桿菌屬(Alicycliphilus)、脂環(huán)酸樸菌犠i ('Ali eye 1baci I lus、、Alii vibrio、喊湖生菌屬{Alkali limni colei) ^ Alkaliphl Ius ^ 異著色菌 M U11 o chrotm t i um)、交替單胞菌目
【權(quán)利要求】
1.微生物,其具有第一種遺傳修飾,從而相比于它的野生型，它能夠從至少一種簡單碳源形成更多的羧酸或羧酸酯， 其特征在于，所述微生物具有第二種遺傳修飾，該遺傳修飾包括所述微生物相比于它的野生型顯示出至少一種酶E1的提高的活性， 所述酶E1催化羧酸或羧酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的ω-羥基羧酸或ω-羥基-羧酸酯。
2.權(quán)利要求1的微生物,其特征在于所述酶E1選自組: EC 1.14.15.3的Ela Ρ450烷羥化酶和Elb AlkB烷羥化酶。
3.權(quán)利要求1或2的微生物，其特征在于第二種遺傳修飾另外包含所述微生物具有選自以下酶的相比于它的野生型提高的活性: 酶E2,其催化ω -氧代羧酸或ω -氧代羧酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的ω -氨基羧酸或ω -氨基羧酸酯， 酶E3,其催化α -酮基羧酸轉(zhuǎn)化為氨基酸， 酶E4，其催化ω-羥基羧酸或ω-羥基羧酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的ω-氧代羧酸或ω -氧代竣酸酯，和 酶E5，其催化ω-氧代羧酸或ω-氧代羧酸酯轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的ω-羧基羧酸或ω -羧基羧酸酯。
4.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物,其特征在于所述第二種遺傳修飾包含選自E1E2E3' E1E2 E3E4, E1E5和E1E4E5的酶的提高的活性的組合。
5.權(quán)利要求2-4中至少一項的微生物,其特征在于 所述酶E2為ω-轉(zhuǎn)氨酶， 所述酶E3為EC 1.4.1.1的丙氨酸脫氫酶， 所述酶E4 SEC 1.1.3.20的脂肪醇氧化酶、EC 1.1.99.-的AlkJ醇脫氫酶或EC1.1.1.1或EC 1.1.1.2的醇脫氫酶，和
所述酶 E5 為 EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4 或 EC 1.2.1.5 的醛脫氫酶。
6.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述酶E1為由a:[kBGT編碼的來自惡臭假單胞菌iPsoudomorms putida)GPol的燒單加氧酶和具有多肽序列的蛋白，其中多達(dá)60%的氨基酸殘基相比于上述參考序列通過缺失、插入、取代或其組合而修飾，并且其仍具有至少50 %的具有相應(yīng)的、上文提及的參考序列的蛋白的活性。
7.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述第二種遺傳修飾另外包含所述微生物相比于它的野生型形成更多的alkL基因產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求7的微生物，其特征在于所述alkL基因產(chǎn)物由選自革蘭氏陰性細(xì)菌的生物的alkL基因所編碼，所述革蘭氏陰性細(xì)菌尤其來自于含有以下、優(yōu)選由其組成的組:假單胞菌屬種(.Pseudomonas sp.)、固氮菌屬種{Azotobacter sp.)、脫亞硫酸菌屬種iDesulfitobacterium sp.)、伯克氏菌屬種iBurkholderia sp.),優(yōu)選洋蔥伯克氏菌{Burkholderia cepacia )、黃色單胞菌屬種(Xan thomonas sp.)、紅樸菌屬種{Rhodobeicter sp.)、青枯菌屬種sp.)、代爾夫特菌屬種sp.)和立克次體屬種(Ri cke t tsia sp.)、Oceani caul is sp.、柄桿菌屬種(Caulobac ter sp.)、海桿菌屬種sp.)和紅假單胞菌屬種(/Soi/o/xsewobffloaas.sp.),優(yōu)選惡臭假單'月包菌(.Pseudomonas putida)、Oceanicaulis alexandri1、7jC油海木十菌(Marinobacteraquaeolei)，尤其是惡臭假單胞菌 GPol 和 P1、Oceanicaulis alexandrii HTCC2633、柄桿菌屬種K31和水油海桿菌VT8。
9.權(quán)利要求7或8至少一項的微生物，其特征在于所述alkL基因產(chǎn)物選自:由SeqIDN0.1和Seq ID N0.3編碼的蛋白和
具有多肽序列 Seq ID N0.2、Seq ID N0.2、Seq ID N0.4、Seq ID N0.5、Seq ID N0.6或Seq ID N0.7的蛋白和 具有這樣多肽序列的蛋白，其中相對于Seq ID N0.2, Seq ID N0.4, Seq ID N0.5, SeqID N0.6或Seq ID N0.7多達(dá)60%的氨基酸殘基通過缺失、插入、取代或其組合而修飾,并且其仍具有至少50%的具有相應(yīng)的參考序列Seq ID N0.2,Seq ID N0.4,Seq ID N0.5,SeqID N0.6或Seq ID N0.7的蛋白的活性。
10.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它選自 大腸桿菌、假單胞菌屬種{Pseudotnonas sp.)、突光假單胞菌iPseudomormsfIuorescens ')^ 惡臭假單月包菌(Pseudomonas putida )Λ IS 氏{段單胞菌(.Pseudomonas·stoizeri )、不動樸菌屬種sp.)、伯克氏菌屬種sp.)、泰國伯克氏菌(Mirrkholderia thaiIandensis )、藍(lán)藻(Cyanobakterie/?)、克雷伯氏菌屬種{.Klebsiella sp.)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌 iKI ebs i e 11 aox.ytoca')、沙門氏菌屬種{Salmonellasp.)、根瘤菌屬種sp.)和苜猜根瘤菌)、芽孢桿菌屬種{Bacillus sp.)、枯草芽抱樸菌subtiIiS、、橡麗m {Clostridium sp.)、棒樸菌屬種(2'.sp.)、谷氨酸棒桿菌glut:andcum)、％}_奸蔑罵CBreν?bacterium sp.)、小球藻屬種(67?./ore././a sp.)和念珠藻屬種(Absioc sp.)?！?br> 11.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物,其特征在于所述第^-種遺傳修飾為至少--種選自以下組的酶的相比于所述微生物野生型的酶活性提高的活性:
Ei 酰基-ACP 硫酯酶，優(yōu)選 EC 3.1.2.14 或 EC 3.1.2.22 的,
Eii 酰基-CoA 硫酯酶，優(yōu)選 EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20 或EC 3.1.2.22 的， Eiib?；?CoA: ACP轉(zhuǎn)酰酶， Eiii聚酮合酶，其催化參與羧酸和羧酸酯的合成的反應(yīng)，和 Eiv己酸合酶。
12.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物,其特征在于它具有第三種遺傳修飾,該遺傳修飾包含至少一種酶Eiib、Ev、Evi或Evii的相比于所述微生物野生型的酶活性提高的活性,所述酶參與轉(zhuǎn)化羧酸或ω-官能化的羧酸為羧酸酯或ω-官能化的羧酸酯，并選自組: Eiib?；?CoA: ACP轉(zhuǎn)酰酶,其轉(zhuǎn)化ACP硫酯為CoA硫酯或者轉(zhuǎn)化CoA硫酯為ACP硫酯， Ev蠟酯合酶或醇O-?；D(zhuǎn)移酶,優(yōu)選EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.84的,其催化從酰基-輔酶A硫酯或?；?ACP硫酯和醇合成酷， Evi?；?CoA (輔酶Α)合酶,優(yōu)選EC 6.2.1.3的,其催化?；?輔酶A硫酯的合成，和
Evii ?；蝓ッ?，優(yōu)選 EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.4、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC3.1.2.20或EC 3.1.2.22的，其催化?；蝓ヅc醇轉(zhuǎn)化為羧酸酯。
13.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述第三種遺傳修飾包含選自以下的酶的提高的活性的組合:
Ev、Evj ； -, EvEv1、EvjEvij 矛P EviEviiEiibo
14.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它具有第四種遺傳修飾，該遺傳修飾包含至少一種選自以下組的酶的相比于所述微生物野生型的酶活性提高的活性: Eiib?；?CoA (輔酶A):ACP (酰基載體蛋白)轉(zhuǎn)酰酶，其轉(zhuǎn)化ACP硫酯為CoA硫酯或者轉(zhuǎn)化CoA硫酯為ACP硫酯， Evi?；?CoA (輔酶A)合酶，優(yōu)選EC 6.2.1.3的，其優(yōu)選催化酰基輔酶A硫酯的合成， Eviii?；?CoA (輔酶A)還原酶,優(yōu)選EC 1.2.1.42或EC 1.2.1.50的,其優(yōu)選催化酰基-輔酶A硫酯的還原為對應(yīng)的烷-1-醛或烷-1-醇， Eix脂肪酸還原酶(也為脂肪醛脫氫酶或芳醛氧化還原酶)，優(yōu)選EC 1.2.1.3、EC1.2.1.20或EC 1.2.1.48的,其優(yōu)選催化烷酸還原為對應(yīng)的烷-1-醛,和 Ex?；?ACP (酰基載體蛋白)還原酶,優(yōu)選EC 1.2.1.80的,其優(yōu)選催化?；?ACP硫酯還原為對應(yīng)的烷-1-醛或烷-1-醇。
15.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述第二種遺傳修飾包含選自以下的酶的提高的活性的組合:
Eyiii' Eixλ Ex、EviEviii 和 EviExEiibO
16.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它含有第五種遺傳修飾，該遺傳修飾，包含至少一種選自以下組的酶的相比于所述微生物野生型的酶活性降低的活性: Ea酰基-CoA合酶，優(yōu)選EC 6.2.1.3的,其催化?；?輔酶A硫酯的合成，
Eb ?；?CoA 脫氫酶,優(yōu)選 EC 1.3.99.-、EC 1.3.99.3 或 EC 1.3.99.13 的,其催化?；?輔酶A硫酯的氧化以產(chǎn)生對應(yīng)的烯酰-輔酶A硫酯， Ec?；?CoA氧化酶，優(yōu)選EC 1.3.3.6的，其催化?；?輔酶A硫酯氧化為對應(yīng)的烯酰-輔酶A硫酯， Ed烯酰-Cok水合酶,優(yōu)選EC 4.2.1.17或EC 4.2.1.74的,其催化烯酰-輔酶A硫酯水合為對應(yīng)的3-羥酰基-輔酶A硫酯， Ee 3-羥?；?CoA脫氫酶，優(yōu)選EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.211的，其催化3-羥?；?輔酶A硫酯氧化為對應(yīng)的3-氧代?；?輔酶A硫酯,和 Ef乙酰基-Cok?；D(zhuǎn)移酶,優(yōu)選EC 2.3.1.16的,其催化乙?；鶑?-氧代?；?輔酶A硫酯轉(zhuǎn)移至輔酶A，并由此產(chǎn)生縮短兩個碳原子的酰基-輔酶A硫酯。
17.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物用于生產(chǎn)ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的用途,尤其是權(quán)利要求3或4的微生物,用于生產(chǎn)ω-氨基-羧酸和ω —氨基羧酸酯的用途,尤其是用于生產(chǎn)ω-氨基月桂酸和ω-氨基月桂酸甲酯和ω-氨基月桂酸乙酯以及ω-氨基己酸和ω-氨基己酸甲酯和ω-氨基己酸乙酯的用途。
18.用于從簡單碳源生產(chǎn)ω-官能化的羧酸和ω-官能化的羧酸酯的方法,其包括以下方法步驟 I)將權(quán)利要求卜16中至少^-項的微生物與包含所述簡單碳源的培養(yǎng)基接觸， II)將所述微生物在能夠使所述微生物從簡單碳源形成ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯的條件下培養(yǎng)，和III)任選分離形成的ω-官能化的羧酸或ω-官能化的羧酸酯。
19.權(quán)利要求18的方法,其尤其利用權(quán)利要求3-15和18中至少一項的微生物從簡單碳源生產(chǎn)ω-氨基羧酸和ω-氨基羧酸酯，尤其是ω-氨基月桂酸和ω-氨基月桂酸甲酯和ω-氨基月桂酸乙酯以及ω-氨基己酸和ω-氨基己酸甲酯和ω-氨基己酸乙酯。
20.用于生產(chǎn)基于ω-氨基羧酸、尤其是基于ω-氨基月桂酸或ω-氨基己酸的聚酰胺的方法，其包括以F方法步驟: (aI)通過權(quán)利要求21的方法生產(chǎn)ω-氨基羧酸， (a2)不同ω-氨基羧酸的任選混合物的聚合而獲得聚酰胺，其中基于所有所述方法中使用的ω-氨基羧酸的至少一部分ω-氨基羧酸,優(yōu)選至少50重量％在步驟(al)中產(chǎn)生，或用來自步驟(al)的ω-氨基羧酸。
21.聚酰胺,其通過權(quán)利要求20的方法可獲得，尤其是聚酰胺12和聚酰胺6。
22.權(quán)利要求18的方法,其尤其利用權(quán)利要求3-1.6中至少一項的微生物從簡單碳源生產(chǎn)ω-羥基羧酸和ω-羥基羧酸酯,尤其是ω-羥基月桂酸和ω-羥基月桂酸甲酯和ω-羥基月桂酸乙酯以及ω-羥基己酸和ω-羥基己酸甲酯和ω-羥基己酸乙酯。
23.權(quán)利要求18的方法,其尤其利用權(quán)利要求3-18中至少一項的微生物從簡單碳源生產(chǎn)ω-羧基羧酸和ω-羧基羧酸酯,尤其是ω-羧基月桂酸和ω-羧基月桂酸甲酯和ω-羧基月桂酸乙酯以及ω-羧基己酸和ω-羧基己酸甲酯和ω-羧基己酸乙酯。
【文檔編號】C12P1/04GK103857793SQ201280050644
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月15日
【發(fā)明者】S.沙費爾, N.德克, J.吉倫, H.赫格, T.哈斯, M.佩特, H-G.亨內(nèi)曼, M.韋澤爾, M.福蘭 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限公司