運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白質及其生成和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了重組蛋白及其生成和使用方法，所述重組蛋白包括連接到腫瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的運鐵蛋白。本發(fā)明還提供了能夠表達所述重組蛋白的表達系統(tǒng)、質粒和細胞及其生產和使用方法。
【專利說明】運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白質及其生成和使用方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年8月17日提交的美國臨時申請N0.61/524，508的優(yōu)先權權益，此文整體附此作參考。
發(fā)明領域
[0003]本發(fā)明涉及重組蛋白及其生成和使用方法，所述重組蛋白包括連接到腫瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的運鐵蛋白。本發(fā)明還涉及能夠表達所述重組蛋白的表達系統(tǒng)及其生產和使用方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]脈絡膜新生血管(Choroidal neovascularization, CNV)是指脈絡膜血管系統(tǒng)的不受控生長，它會在諸如彈性假黃色瘤、血管樣條紋癥、組織胞漿菌病、點狀內層脈絡膜病變、濕性年齡相關黃斑變性(AMD)等疾病中導致嚴重視覺喪失。濕性AMD在玻璃疣(補體成分、脂質和載脂蛋白)淀積引起受限缺血性區(qū)域，造成低氧時發(fā)生。據(jù)信，低氧導致血管內皮生長因子(VEGF)分泌增加，其活化脈絡膜內皮細胞分泌基體金屬蛋白酶(MMP)。金屬蛋白酶降解細胞外基質，以此允許內皮細胞增殖及其向視網膜遷移。最后，MMP的作用造成新血管或CNV的形成，其能引起視網膜脫離和出血及由于血液和脂質泄漏所致的視網膜下?lián)p傷形成。在證實后，CNV是工業(yè)化國家的老年人群中視覺喪失的主要原因。
[0006]當前CNV的治療限于患者群體的一部分，并且聚焦于抑制VEGF在血管通透性過高(hyperpermeability)和新血管形成中的有害作用。然而，VEGF還在諸如傷口愈合、光感受器存活和脈絡膜毛細管床的維護等生理活動中起建設性的關鍵作用。當前，Ranibizumab (Lucentis?), Aflibercept (Eylea?)和 pegaptanib (Macugen?)是僅有的兩種目前為止批準用于治療CNV的治療劑。這些藥劑抑制VEGF。已經表明，在治療CNV方面ranibizumab 一般比 pegaptanib 更有效。Ranibizumab 與 VEGF-A 所有的同種型(isoform)結合，并抑制VEGF活性，包括血管通透性和生長。除兩種提及的治療劑外，還探索了貝伐珠單抗(Avastin?) (ranibizumab的親本全長抗體)作為針對CNV的標簽外(off label)治療。
[0007]盡管這些治療在治療CNV中獲得成功，但在這些治療上有固有的缺點，包括在活化的內皮細胞中缺乏凋亡和VEGF相關生理活動諸如傷口愈合的潛在損害。另外，ranibizumab的使用導致全身性危險,包括人玻璃體內給藥之后的血栓栓塞事件率增大。玻璃體內貝伐珠單抗還與缺血性發(fā)作、血壓升高、腦血管事故和死亡相聯(lián)系。另外，在CNV患者的臨床試驗中，對ranibizumab的響應率在CNV患者中只有約40%，而且來信數(shù)目增加(gain in number of letters)僅為 7.2。
[0008] 因此，需要新的和/或更有效的用于治療CNV的治療方法，其具有降低的副作用和/或更好的治療功效。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明的某些方面提供重組蛋白，其包括連接到腫瘤抑素或其他類似的抗血管生成蛋白的運鐵蛋白。在某些實施方案中，運鐵蛋白和腫瘤抑素彼此直接連接。在其他實施方案中，運鐵蛋白和腫瘤抑素彼此通過接頭共價連接。適用的接頭對于本專業(yè)技術人員是眾所周知的。
[0011 ] 本發(fā)明的其他方面提供質粒，其包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列。通常，編碼重組蛋白的核酸序列可操作連接到表達控制序列。
[0012]本發(fā)明的再其他方面提供重組核酸分子，其包括編碼重組蛋白的核酸序列，所述重組蛋白包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。在某些實施方案中，核酸序列可操作連接到表達控制序列。
[0013]本發(fā)明的再其他方面提供用重組核酸分子轉染并表達重組核酸分子的重組宿主細胞，所述重組核酸分子包括編碼重組蛋白的核酸序列，所述重組蛋白包含連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。
[0014]本發(fā)明其他方面提供一種用于生成包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的方法，所述方法包括:
[0015]用重組核酸分子轉染重組宿主細胞，所述重組核酸分子包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列；
[0016]在足以產生包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的條件下，培養(yǎng)轉染的宿主細胞；并
[0017]將該重組蛋白以基 本上純化的重組蛋白回收。
[0018]在某些實施方案中，重組蛋白包括直接連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。
[0019]本發(fā)明的再其他方面提供一種用于治療受試者中與脈絡膜新生血管(chOToidalneovascularization, CNV)有關的臨床狀況的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用治療有效量的重組蛋白，該重組蛋白包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。
[0020]在某些實施方案中，與CNV相聯(lián)系的臨床狀況包括彈性假黃色瘤、血管樣條紋癥、組織胞漿菌病、點狀內層脈絡膜病變或濕性年齡相關黃斑變性(AMD)。
[0021]本發(fā)明的成份還可以用來治療諸如但是不限于癌癥；癌癥關聯(lián)新血管化；角膜血管發(fā)生；增生性糖尿病性視網膜病變；新血管性(neovascular)青光眼；其他新血管性和血管性增生性眼病癥；以及身體其它地方的其他新血管性和血管性增生性病癥。
[0022]本發(fā)明的組合物可以利用對于本領域技術人員已知的任何方法給藥，包括但是不限于玻璃體內、靜脈內、脈絡膜上、表面、眼周、皮下、肌肉內、視網膜下、眼球后、鞏膜內等。
[0023]附圖簡述
[0024]圖1是表示運鐵蛋白-腫瘤抑素、貝伐珠單抗和腫瘤抑素的抗增殖活性的圖；
[0025]圖2是表示用不同濃度的腫瘤抑素、運鐵蛋白-腫瘤抑素和貝伐珠單抗蛋白對在脈絡膜內皮細胞中觀察到的內皮管形成的抑制的圖；
[0026]圖3是表示BN大鼠CNV損傷大小的體內評估的柱狀圖；
[0027]圖4是運鐵蛋白-腫瘤抑素持續(xù)性基因表達構建體的圖示。
[0028]發(fā)明詳述
[0029]本發(fā)明的某些方面提供包含連接(亦即，附著)到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白。運鐵蛋白可以直接或間接(例如，通過接頭)連接到腫瘤抑素。本發(fā)明其他方面提供重組核酸分子，其包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列。本發(fā)明的再其他方面提供用重組核酸分子轉染并表達該重組核酸分子的重組宿主細胞，該重組核酸分子包括編碼重組蛋白的核酸序列，該重組蛋白包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。本發(fā)明的再其他方面提供用于生成和使用重組蛋白的方法，所述重組蛋白包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。
[0030]腫瘤抑素已經表明在治療CNV上是治療有效的。不受任何理論束縛，據(jù)信腫瘤抑素具有通過引起凋亡從而使血管發(fā)生消退的能力，即一種在當前CNV治療中缺乏的特性。
[0031]腫瘤抑素是一種內源性血管發(fā)生抑制劑，它最初從存在于基底膜中的膠原IV的C端非膠原域(NCl)獲得。據(jù)信，腫瘤抑素通過結合ανβ3整聯(lián)蛋白，阻止內皮細胞增生和另外通過誘使內皮細胞凋亡，起抑制血管形成作用。在不存在任何病理條件的情況下，在血管生成分子(諸如VEGF)和抗血管生成分子(諸如腫瘤抑素)之間維持平衡。在低氧和缺血的過程中，在血管生成分子和抗血管生成分子之間的平衡據(jù)信被干擾，因此引起新血管化。與腫瘤抑素一樣的血管發(fā)生抑制劑是人體對抗新血管化的固有機制的一部分。
[0032]腫瘤抑素比起ranibizumab和貝伐珠單抗具有許多優(yōu)點，而且據(jù)信治療上優(yōu)于這些抗體。至今，腫瘤抑素受體，即ανβ 3整聯(lián)蛋白，只在活化的內皮細胞上，而不在正常的血管上發(fā)現(xiàn)。因而，據(jù)信，腫瘤抑素提供一個在不影響諸如傷口愈合等生理過程情況下通往靶向活化的內皮細胞的途徑。腫瘤抑素促進內皮細胞凋亡，并據(jù)信由腫瘤抑素所引起的凋亡可以造成增生血管的消退，并因而在恢復正常視覺中是有利的。因而，腫瘤抑素可以在沒有任何明顯的抗VEGF治療相關副作用的情況下，有效治療新血管化并避免視覺喪失。
[0033]今人驚訝和意外的是，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素在CNV中的療效可以通過將腫瘤抑素連接到其他蛋白質而得到顯著增強。在一個特定的實施方案中，腫瘤抑素連接到運鐵蛋白，以便實現(xiàn)融合蛋白從視網膜色素上皮(RPE細胞)的極化分泌(polarizedsecretion)。當曝露于RPE單層時,與腫瘤抑素相比，該融合蛋白質優(yōu)先向基底外側分泌。用運鐵蛋白-腫瘤抑素基因轉染之后，與腫瘤抑素基因產物相比，所形成的運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質在極化的上皮細胞單層中更多向基底外側方向分泌。在緊鄰活化且新血管脈絡膜內皮的細胞處，重組運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白的基底外側分泌遞送腫瘤抑素，以此提高腫瘤抑素的治療活性。不受任何理論束縛，據(jù)信運鐵蛋白-腫瘤抑素增強的基底外側分泌在患有AMD的患者的眼中是顯著的，因為鐵含量和運鐵蛋白受體活性可能在這些患者的眼中升高。據(jù)信，消除鐵的最容易取得的途徑是通過脈絡膜血管系統(tǒng)。該途徑還導致升高的運鐵蛋白(及因此重組運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白)向脈絡膜的分泌。
[0034]基于上述內容，本發(fā)明人研究了一種新型運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白質(亦即，重組運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白)及其在抑制脈絡膜內皮細胞的遷移、增殖，管形成上的效能。將這些活性與貝伐珠單抗的活性比較。另外，本發(fā)明人已經確定，本發(fā)明的重組蛋白以極化方式在完全確立的極化細胞模型(例如，Madin-Darby犬腎臟，亦即，MDCK細胞)中分泌的能力。
[0035]正如在這里使用的，術語“運鐵蛋白”包括治療有效的運鐵蛋白片段。在某些實施方案中，術語“運鐵蛋白”是指至少具有可以結合整聯(lián)蛋白的運鐵蛋白肽片段的肽?；蛘撸g語“運鐵蛋白”通常是指具有整個運鐵蛋白肽序列的至少5個氨基酸的肽?；蛘?，術語“運鐵蛋白”是指具有整個運鐵蛋白肽序列的至少25%，通常至少50%，經常至少75%，更經常至少90%的肽，只要 該片段能夠選擇性與整聯(lián)蛋白結合。因而，任何治療有效的運鐵蛋白片段都可以用于重組蛋白向新血管區(qū)域的靶向攝取和分泌(例如，向脈絡膜分泌)。在某些實施方案中，治療有效的運鐵蛋白片段包括通?？梢赃x擇性與整聯(lián)蛋白結合的運鐵蛋白肽片段。
[0036]帶有生物活性的運鐵蛋白的某些片段對于本領域技術人員是已知的。應該認識到，本發(fā)明的范圍包括全長的運鐵蛋白和腫瘤抑素蛋白以及這些蛋白質中一個或兩者的片段，只要這樣的重組蛋白具有期望的生物活性。本領域技術人員可以容易地通過利用體外和體內實驗，諸如這里公開的實驗確定運鐵蛋白和/或腫瘤抑素的特定片段是否具有期望的生物活性。因而，本發(fā)明的范圍包括任何用于治療新血管性病癥的治療性融合蛋白(亦即，重組腫瘤抑素-運鐵蛋白蛋白)，其中腫瘤抑素和/或運鐵蛋白可以獨立是完整蛋白質或其片段。據(jù)信，重組蛋白通常比親本蛋白質在治療上更有效。本發(fā)明的組合物包括能夠在相關細胞中表達重組蛋白的重組蛋白或核酸構建體。
[0037]系列I肽。運鐵蛋白片段
[0038]這里討論的是能夠賦予基底外側分泌的一些代表性運鐵蛋白片段和用于鑒定和產生該運鐵蛋白片段的方法。
[0039]分析了運鐵蛋白蛋白質序列以及各種分泌性蛋白質的序列，并鑒定適宜產生能夠基底外側分泌/轉運的新融合蛋白的運鐵蛋白片段。諸如白介素6 (Holtkamp et al.,ClinExp Immunol.，1998，112 (I)，34-43)、白介素 8 (同上)和血管內皮生長因子 A (VEGF-A)(Sonoda et al.，AGING, 2010, 2 (I), 28-42)等各種基底外側分泌性蛋白質的肽序列的分析導致此類蛋白質的N端氨基酸中令人驚訝的相似性的鑒定。據(jù)信，包括白介素6、白介素8和血管內皮生長因子A(VEGF-A)的蛋白質是在基底外側分泌的，并具有豐富的亮氨酸氨基酸。另外，二亮氨酸(dileucines)(亦即，“LL”)存在于這些蛋白質的N端附近。根據(jù)這些認識，本發(fā)明人已經鑒定以下運鐵蛋白中可以負責運鐵蛋白-腫瘤抑素基底外側分泌的代表性肽:MRLAVGALL (SEQ ID NO:1) ；MRLAVGALLVC (SEQ ID NO:2) ;LLVCAVLGLCL (SEQ ID NO:3) ；GALLVCAVLGLCL(SEQ ID NO:4) ；LLVCAVLGLCLAV(SEQ ID NO:5) ；GALLVCAVLGLCLAV(SEQ IDNO:6);和MRLAVGALLVCLLVCAVLGLCLAV (SEQ ID NO:7)。因而，在某些實施方案中，包括這些肽的任何肽或重組肽都適宜于實現(xiàn)運鐵蛋白-腫瘤抑素的基底外側分泌。這些肽(亦即，這里公開的運鐵蛋白片段)在與腫瘤抑素或任何其他適用治療性蛋白質融合時，都會導致治療蛋白質的基底外側分泌(例如，跨越視網膜色素上皮向脈絡膜)。
[0040]系列II肽。能夠結合整聯(lián)蛋白的運鐵蛋白肽:
[0041]令人驚訝和意外的是，本發(fā)明人還已經發(fā)現(xiàn)，運鐵蛋白蛋白質除其預期的與運鐵蛋白受體相互作用以外，還可以與ανβ3整聯(lián)蛋白受體互相作用。本發(fā)明的重組運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質相信與作為腫瘤抑素受體的α νβ 3整聯(lián)蛋白受體互相作用，另外，由于存在運鐵蛋白，還與運鐵蛋白受體相互作用。利用運鐵蛋白-腫瘤抑素對ανβ3整聯(lián)蛋白受體的計算機入瑪(in silico docking),本發(fā)明人已經鑒定出運鐵蛋白蛋白質內與整聯(lián)蛋白受體互相作用的氨基酸。以下氨基酸是一些基于計算機入塢，相信與整聯(lián)蛋白受體互相作用的代表性肽:
[0042]Q(127)，N(129)，L(131)，N(148)，I (151)，G(152)，C(156)，L(158)，K(163)，
[0043]E (166)，K (167)，A (168);和
[0044] C (246)，T (250)，R (251)，D (259)，E (337)，I (342)，L (345)，T (349)，E (357)，[0045]K (359)，L (366)，E (370)，W (377)，C (396)，I (400)，N (402)，E (404)，
[0046]A (405)，D (406)，L (423)，V (424)，P (425)，E (429)。
[0047]根據(jù)這些互相作用的氨基酸，以下運鐵蛋白的肽被設計成那些能夠與整聯(lián)蛋白受體互相作用的:GFQNLNIGCLKEKAVA(SEQ ID NO:8) ；LLCTRDEILTEKLEffCINEADLVPENY(SEQ ID
NO:9);運鐵蛋白127_168 ;運鐵蛋白125_17(| ;運鐵蛋白246_259 ;運鐵蛋白244_261 ;運鐵蛋白337_429 ;和運鐵蛋白335_431。正如在這里使用的，術語“運鐵蛋白x_y”是指以氨基酸“X”為起點，以氨基酸“y”為終點的運鐵蛋白氨基酸序列。
[0048]系列III肽。能夠結合到運鐵蛋白受體的運鐵蛋白片段
[0049]以下公開的是一些發(fā)現(xiàn)能夠結合到運鐵蛋白受體的代表性運鐵蛋白片段。
[0050]據(jù)信，運鐵蛋白中以下氨基酸與運鐵蛋白受體互相作用。運鐵蛋白161_169 ;H(368)，R(371), L(372), D(375), E(376), S(378), V(379) ；PRKPLEKAV(SEQ ID NO:10);運鐵蛋白159-171 ;運鐵蛋白;和運鐵蛋白％eii。因而，運鐵蛋白的這些片段也可以用于本發(fā)明的方法。
[0051]系列IV肽。帶有抗血管生成和/或抗癌活性的腫瘤抑素片段
[0052]術語“腫瘤抑素”包括治療有效的腫瘤抑素片段。具體地說，術語“腫瘤抑素”包括相對于在沒有任何附加的腫瘤抑素肽的情況下利用運鐵蛋白，能夠增大運鐵蛋白遞送的腫瘤抑素肽部分或片段。因而，在某些實施方案中，術語“腫瘤抑素”是指至少具有相對于沒有此類肽的運鐵蛋白，可以增大運鐵蛋白的治療有效性的腫瘤抑素肽片段的肽?；蛘撸g語“腫瘤抑素”是指具有整個腫瘤抑素肽序列的至少25%，通常至少50%，經常至少75%，和更經常至少90%的肽。某些帶有生物活性(例如，抗血管生成活性)的腫瘤抑素片段對于本領域技術人員是已知的。應該認識到，本發(fā)明的范圍(以及術語“腫瘤抑素”)包括全長腫瘤抑素蛋白質及其片段。
[0053]腫瘤抑素是一種結合到ανβ 3整聯(lián)蛋白受體和抑制腫瘤生長的血管發(fā)生抑制劑。以前的缺失誘變研究(例如，見 Eikesdal et al.，PNAS, 2008，105 (39)，15040-15045 ；和 Thevenard et al.，Int.J.Cancer, 2010,126,1055-1066)已經識別出帶有抗血管生成活性的腫瘤抑素的以下氨基酸片段:腫瘤抑素74_98 ;腫瘤抑素185_2(13 ;和YSNSG(SEQ ID NO:11)。
[0054]本發(fā)明人還已經通過計算機蛋白質建模根據(jù)上述肽序列設計新型肽。在一個特定的實施方案中，在兩點處用H(組氨酸)取代D(天冬氨酸)，如下所示:TMPFLFCNVNHVCNFASRNHYSYWL(SEQ ID NO:12)
[0055]據(jù)信，用D代替H造成一個在H正電荷和其他蛋白質電荷之間有利的凈靜電相互作用。在某些其他實施方案中，疏水性殘基丙氨酸(A)和亮氨酸(L)用精氨酸(R)(—種親水性氨基酸)取代。這些修飾的肽中的一些包括:TMPFLFCNVNDVCNFSSRNDYSYWL(SEQ ID NO:13) ；TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWR (SEQ ID NO:14) ；CNYYSNSYSFffLRSLNPER (SEQ ID NO:15)；和 CNYYSNSYSFWLASSNPER(SEQ ID NO:16)。
[0056]精氨酸包含負責其極性的胍基。據(jù)信，用親水性精氨酸取代疏水性殘基依靠與該溶劑形成的額外氫鍵有助于改善該蛋白質的穩(wěn)定性。另外，據(jù)信，在PH7.4時其胍基帶正電荷的精氨酸將在表面上引入電荷，并提供在該蛋白質表面上額外相互作用的途徑。上述這些天然序列或修飾片段中的任何一個都可以用來建立本發(fā)明的融合或重組蛋白。因此，應該認識到，術語“運鐵蛋白”和“腫瘤抑素”包括那些修飾，其中一個或多個氨基酸殘基用非野生型氨基酸(包括同系物氨基酸)取代。本領域技術人員閱讀了本公開之后可以容易地確定適用的氨基酸取代。
[0057]正如上面討論的，除運鐵蛋白和腫瘤抑素的全長重組蛋白以外，本發(fā)明的范圍包括其中運鐵蛋白和/或腫瘤抑素的全長蛋白質中的一個或兩者用上面公開的任何相應的部分肽取代的重組的蛋白質。
[0058]因此，本發(fā)明的范圍包括重組蛋白，其中來自上述系列I或III肽中公開的肽或運鐵蛋白本身的與上述系列II或IV肽中公開的肽或腫瘤抑素本身的肽/蛋白質的任何組合(例如，與任何治療性蛋白質或諸如腫瘤抑素的肽或系列II或IV肽的肽融合的系列I肽；和與序列I肽等融合的序列II肽)。另外，系列I肽可以與任何新的治療性大分子組合以靶向攝取/轉運/分泌。
[0059]檢查以下不擬作為限制的實施例，本發(fā)明的其它目標、優(yōu)點和新型特征對本領域技術人員將變得顯而易見。在這些實施例中，推斷性地歸結為實踐的程序用現(xiàn)在時態(tài)描述，而已經在實驗室進行的程序用過去時態(tài)描述。
實施例
[0060]材料和方法
[0061]實施例1
[0062]材料:Transwell?濾器(0.4 μ m孔徑)購自Coming Inc., NY。牛血清白蛋白購自 Sigma Aldrich (MO)。BD 基質膠基質生長因子還原性(Matrigel Matrix Growth FactorReduced)購自 BD Biosciences (CA)。DNA 梯，Lipofectamie?: 2000 試劑和 DAPI 染料購自Invitrogen Corporation (CA)。所用限制酶購自 New England Biolabs (MA)。QuikChange?位點定向誘變試劑盒購自Agilent Technologies (CA)。運鐵蛋白基因、脈絡膜內皮細胞(RF/6A)和RF/6A細胞培養(yǎng)基購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection), VA0 QIAGEN? 質粒 Giga 試劑盒購自 QIAGEN Inc.(CA)。TALON? 金屬親和樹脂(目錄 #635502)購自 Clonetech Laboratories, Inc.(CA)。BCA? 蛋白質分析試劑盒，用以估計蛋白質含量，購自Pierce Biotechnology, Inc.(IL)(目錄#23225)?，F(xiàn)成凝膠，即來自 Bio-Rad laboratories, Inc.(CA)的 10% Ready Gel Tris-HCIR 和來自 FisherScientinc (PA)的EZ Run?預染蛋白梯在SDS PAGE凝膠電泳過程中使用。BCA?蛋白質分析試劑盒購自 Thermo Fisher Scientific (IL)。
[0063]質粒的構建:為了進行該項研究制備了四種不同的構建體，其包含以下cDNA，即(a)腫瘤抑素；(b)腫瘤抑素-EGFP ; (c)運鐵蛋白-腫瘤抑素(見圖4，它示意性顯示運鐵蛋白-腫瘤抑素持續(xù)性基因表達構建體。帶有運鐵蛋白的類似構建體對腫瘤抑素的長期表達是有用的)；和(d)運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP。全部引物購自IntegratedDNATechnologies Inc.(CA)，用于該實驗。利用正向引物(5’-CGATGGATCCGCAACCTGGACAACGAGAGGCTT-3’)(SEQ IDNO:17)和反向引物(5’-CGATCTCGA GAGTGTCTTTTCTTCATGCACACC-3’)(SEQID NO:18)將腫瘤抑素cDNA用PCR擴增，并以BamHl和Xho I片段連接到載體PSecTag2B中。利用pEGFP載體(Clonetech Laboratories,CA)作為模板并利用正向引物(5’-ATCGATAAGCTTTGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’)(SEQ ID NO:19)和反向引物(5’-ATCGATGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’)(SEQ ID NO:20)將 EGFP 作為 Hind III 和 BamHl 片段克隆到 PSecTag2B 載體中。
[0064]如下以IgK分泌序列交換運鐵蛋白，即首先用Nhel及Sfil消化我們的構建體以除去 IgK 序列。利用正向引物(5，-AGTCGCTAGCATGAGGCTCGCCGTG GGAGCCC-3’ ) (SEQ ID NO:21)和反向引物(5，-AGTCGCGGCCGGCTGG GCCAGGTCTACGGAAAGTGCAGGCT-3’) (SEQ ID NO:22)(其分別包含限制位點Nhel和Sfil位點)擴增運鐵蛋白，并克隆到線性化載體中。將運鐵蛋白摻入包含腫瘤抑素和PEGFP的PSecTag2B中。在該過程中除去PSecTag2B的Igk基因部分。使用同一正向和反向引物將運鐵蛋白摻入只包含腫瘤抑素的PsecTag2B載體中，以生成運鐵蛋白-腫瘤抑素質粒。
[0065]利用大腸桿菌(E.coli)細菌的dH5a菌株增加全部質粒,并利用QIAGEN?質粒Giga試劑盒擴增。在TAE緩沖液中制備I %瓊脂糖凝膠，并用以研究cDNA構建體。利用GelDoc XR?成像系統(tǒng)(Bio-Rad laboratories, Inc.CA)拍攝照片。
[0066]蛋白質的生產和純化:用于構造質粒的PSecTag2B載體(如上所述)具有六組氨酸標簽，它可以幫助述化培養(yǎng)基中分泌的蛋白質。在ARPE(人視網膜色素上皮)細胞中轉染該質粒，以表達所建立的融合蛋白。將ARPE細胞培養(yǎng)，直至達到80%匯合。利用Lipofectamine? 2000試劑進行ARPE細胞的暫態(tài)轉染。TALON?.金屬親和樹脂用以純化有組氨酸標簽的蛋白質。BCA?蛋白質分析試劑盒用以估計洗脫液的蛋白質含量。利用牛血清白蛋白(Sigma Aldrich, MO)制作蛋白質估計標準曲線。
[0067]ARPE細胞的共聚焦顯微術:在APRE細胞中研究腫瘤抑素-EGFP質粒，以觀察EGFP基因在該細胞中發(fā)揮功能。將ARPE細胞培養(yǎng)，直至達到80%匯合。利用Lipofectamine?2000試劑進行ARPE細胞的暫態(tài)轉染。對細胞核完成DAPI (4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，二鹽酸鹽)染色。沒有用腫瘤抑素-EGFP質粒轉染且僅DAPI染色的ARPE細胞用作對照。
[0068]為了研究運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP和腫瘤抑素-EGFP的內在化，使蛋白質脈絡膜內皮細胞暴露于運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP和腫瘤抑素-EGFP蛋白質達24小時。24小時后，將細胞用冷PBS pH7.4洗滌，然后用冷酸性緩沖液(pH5.0)洗滌，并利用4%低聚甲醛固定并用DAPI染色。在Nikon Clsi?共聚焦顯微鏡下觀察細胞。
[0069]運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP融合蛋白質的極化分泌:為了進行融合蛋白極化分泌的研究，選擇MDCK細胞系，因為它是一種充分了解的極化系統(tǒng)。MDCK細胞具有向頂端或基底外側表面遞送膜蛋白質的路徑。
[0070]將MDCK細胞鋪在Transwell濾器上，并利用EVOM?電阻計(World PercisionInstruments, CA)測量轉移上皮電阻(Trans epithelial electrical resistance, TEER)。當TEER大于300 Ω時，如上所述用腫瘤抑素-EGFP或運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP質粒轉染細胞。轉染24小時后，固定MDCK細胞并利用DAPI核染料染色。單獨從基底外側和頂側兩者收集該培養(yǎng)基，并利用BCA?蛋白質分析試劑盒量化融合蛋白。
[0071]細胞增殖分析:用脈絡膜內皮細胞(RF/6A)研究腫瘤抑素蛋白質和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質對在VEGF165的作用下細胞增殖的作用。用MTT分析來估算細胞增殖。
[0072]在約20，000個細胞/孔的接種密度下將脈絡膜內皮細胞(RF/6A，第9次傳代)在96-孔板中分配，并容許粘附孔24小時。24小時后，用VEGF165(R&D systems, MN)溶液在50ng/ml濃度下使細胞孵育。利用50ng/mL的VEGF165誘導RF/6A細胞增殖。在96孔中，3孔保留作為對照，其只包含RF/6A細胞和50ng/mL的VEGF165。其余各孔以不同的濃度包含貝伐珠單抗、腫瘤抑素或運鐵蛋白-腫瘤抑素。
[0073]對于貝伐珠單抗使用這些濃度:1.5_500nM。在24小時結束時吸出培養(yǎng)基，并將200 μ I無血清新鮮培養(yǎng)基加到每個孔中。MTT試劑(Sigma Aldrich, MO)，亦即3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基溴化四鈉)，(20 μ I溶解于PBSpH7.4中的5mg/ml MTT)加到每個孔中，并在37°C孵育3小時。吸出培養(yǎng)基，并將所形成的甲腸(formazan)晶體溶解在200 μ I DMSO中。加入DMSO之后,該晶體溶解,并利用微板讀板儀(microplate reader)在570nm測量顏色吸光度。在下一個實驗中，在以下濃度:7.8_1000nM，用腫瘤抑素或運鐵蛋白-腫瘤抑素代替貝伐珠單抗。遵循與上文所述相同的方法。在1.5-500nM濃度使用運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質(對于每個濃度，η = 3)。
[0074]管形成分析:在4°C融化基質爿交?過夜。為了進行管形成分析，將75ul融化的基質膠涂布在每一個孔的底部，制備48孔板。該孔板在37°C保持30分鐘使基質膠聚合。將脈絡膜內皮細胞轉移到包含基質膠的48孔板。每個孔包含6xl03個細胞。三個孔保留作為對照，不摻入腫瘤抑素。其它的45個孔包含上文對增殖分析描述的濃度的腫瘤抑素蛋白質。該板在37°C保持18小時。利用光學顯微鏡分析管形成。使用同一方法進行運鐵蛋白-腫瘤抑素和貝伐珠單抗蛋白質實驗。利用范圍為0.15至500nM的濃度(對于每個濃度，η =3)。
[0075]細胞i千移分析:利用基質膠停入室(8 μ m孔徑,Becton Dickinson,MA)進行體外細胞遷移分析。將0.5ml無血清培養(yǎng)基中的5x10s個細胞懸浮液加到基質膠室?？子肐mllOng/ml VEGF溶液填充。該室在37°C在95%空氣/5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時。該膜下表面上的細胞用蘇木精和伊紅染料染色。侵入細胞在Nikon顯微鏡下以40倍放大倍數(shù)拍攝像片，并對于每個濃度，在三個膜的五個視野中計數(shù)。用同一方法進行運鐵蛋白-腫瘤抑素和貝伐珠單抗蛋白質實驗。利用濃度為 0.15至500nM的范圍(對于每個濃度，η = 3)。
[0076]分子入坦:使用Accelery’ s 發(fā)現(xiàn)觀測儀(discovery visualizer)v2.5.1.9167 (Accelry' s, Inc.CA)研究腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素對α V β 3整聯(lián)蛋白受體的計算機入塢。用膠原IV的非膠原域(PDB#1LI1)的晶體結構作為參照，開發(fā)腫瘤抑素的同源物模型。使用無鐵人類血清運鐵蛋白(PDB#2HAV)的晶體結構作為參照，開發(fā)運鐵蛋白用的同源物模型。制備該蛋白質并完成能量最小化。通過用肽鍵將腫瘤抑素融合到運鐵蛋白的C端，建立運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白。為了腫瘤抑素與ανβ3整聯(lián)蛋白入塢研究，利用腫瘤抑素的同源性模型作為配體，并入塢到ανβ 3整聯(lián)蛋白的胞外域(PDB#1JV2)的晶體結構上。為了運鐵蛋白-腫瘤抑素與ανβ 3整聯(lián)蛋白入塢研究，使融合蛋白質入塢到α νβ 3整聯(lián)蛋白受體(PDB#1JV2)。
[0077]凋亡分析:利用DeadEnd色度TUNEL (TdT介導的dUTP缺口末端標記)系統(tǒng)(Promega Corporation, WI)研究凋亡。將脈絡膜內皮細胞(IxlO5個細胞/孔)鋪在12孔板中蓋玻片上，并容許粘附24小時。24小時后，使細胞暴露于不同濃度的貝伐珠單抗(1、10和IOOnM)，腫瘤抑素(100、250和500nM)和運鐵蛋白-腫瘤抑素(1、10和IOOnM)蛋白質。蛋白質暴露24小時后，然后洗滌細胞，用4%低聚甲醛固定，并利用在磷酸鹽緩沖液pH7.4中的0.2 % Triton?: X-1OO溶液透化。細胞按照與DeadEnd?色度TUNEL分析系統(tǒng)一起提供
的標準方案進一步染色。以40倍放大倍數(shù)在光學顯微鏡下研究細胞。
[0078]在蹤角j那威大鼠(brown Norway rat)矛口月永絡膜平載片(natmount)中誘導CNV:
[0079]成年雄性掠色挪威大鼠(150_180g)購自Harlan Sprague Dawley Inc.(Indianapolis, IN, USA)。利用腹膜內注射 40_80mg/ml 氯胺酮和 10_12mg/kg 賽拉嗪(xylazine)混合物麻醉大鼠。如下進行激光燒傷誘導。局部給藥1%托批卡胺(tropicamide)溶液使瞳孔放大。將蓋玻片放在眼上和2.5%羥丙甲纖維素溶液滴注之后使底部可視化。利用 532nm 二極管激光(Oculight Glx ；Index Inc., Mountain View, CA,USA)和狹縫燈(Zeiss 狹縫燈 30SL ；Carl Zeiss Meditec Inc.，Dublin, CA, USA)將八個與視神經同心的激光點(100mm，150mW，100ms)放入每個大鼠的右眼中。左眼用作每個動物的對照。通過在“氣泡形成(bubble formation) ”終點確定布魯赫(Bruch)氏膜破損。從研究中排除施加激光后顯示眼內出血的大鼠。激光燒傷誘導之后，容許CNV損傷發(fā)展14天。14天結束時，對大鼠玻璃體內施用下列治療之一，(a)PBS pH7.4, (b)貝伐珠單抗、(c)腫瘤抑素蛋白質，和(d)運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質。治療14天結束時,對大鼠實施安樂死,并摘出眼。
[0080]對于脈絡膜平載片,利用腹膜內注射80mg/kg氯胺酮和10mg/kg賽拉嗪混合物麻醉大鼠。用10ml PBS (pH7.4)輸注大鼠,接著用10ml4%低聚甲醒輸注。最后,輸注4ml50mg/ml異硫氰酸熒光 素(FITC)-右旋糖酐溶液(2xl06Da)。然后，摘出眼，并制備平載片。用Nikon EZ-Cl共聚焦顯微鏡利用488和568nm激發(fā)波長對平載片成像。利用ImageJ軟件獲得CNV區(qū)域。
[0081]結果
[0082]質粒構律:對分別為5813、6521、8550和7842個堿基對的腫瘤抑素、腫瘤抑素-EGFP、運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP和運鐵蛋白-腫瘤抑素質粒的1%瓊脂糖凝膠拍攝照片(未示出)。對IKb DNA梯以大小標記物運行。拍攝腫瘤抑素(28kDa)和運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP(135kDa)蛋白質的SDS凝膠電泳圖(未示出)。還拍攝電泳圖以得到其插入PSecTag2B之后腫瘤抑素的堿基對測序結果。利用毛細管電泳(AppliedBiosystems, CA)完成測序。在ARPE細胞中研究腫瘤抑素-EGFP基因表達，并拍攝圖像(未示出)。還拍攝了表達腫瘤抑素-EGFP蛋白質的ARPE細胞的共聚焦顯微鏡照片(100X)(未示出)。進行DAPI染色，以染色細胞核。用沒有腫瘤抑素-EGFP轉染的ARPE細胞作為對照，以消除任何背景熒光。
[0083]確定運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質的內在化。暴露于運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質后，在RF/6A細胞中觀察到強烈的EGFP信號。細胞表面上的任何蛋白質預期都通過酸性緩沖液沖洗而除去。這是由于構成細胞膜的脂質磷脂的PKa所致。磷酸根基團的最低的PKa約為2，說明磷酸根基團不會處于H3PO4的不帶電狀態(tài)就是在pH2帶有單個負電荷(H2PCV)。在高于約2的pH，具有兩個負電荷(ΗΡ04_2)的機率增大。因此，假定EGFP信號是只由于內在化蛋白質造成。RF/6A細胞暴露于腫瘤抑素-EGFP蛋白質的結果是沒有可觀察到的內在化。
[0084]運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP融合蛋白的極化分泌:
[0085]用MDCK細胞研究運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質的基底外側分泌。該實驗拍攝的圖像顯示，運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質在該細胞的基底外側分泌。在共聚焦顯微鏡下檢查基底外側時，看不到細胞邊界。該可能是Transwell濾器的多孔屬性造成的，它不允許光反射回顯微鏡，而且還可阻擋到該細胞的光路。這可能是來自濾器基底外側的細胞缺乏可見性的一個可能的理由。盡管從基底外側看不到細胞，但DAPI染色和來自分泌蛋白質的EGFP信號在基底外側清晰可見。在共聚焦顯微鏡下研究濾器頂側時可以清晰觀察到細胞。在該細胞基底外側表面上觀察到蛋白質分泌。這種情況至少可以通過兩個途徑說明。該蛋白質可能結合到該細胞表面的受體，或該蛋白質可能嵌入該濾器中(對于基底外側分泌的蛋白質)。在基底外側和頂端培養(yǎng)基中分泌的蛋白質的量化進一步確定運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質的分泌徑路。
[0086]對從頂端和基底外側培養(yǎng)基收集的運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質進行提純。測定頂端和基底外側培養(yǎng)基中的蛋白質含量。頂側培養(yǎng)基包含23.17%，而基底外側包含76.83%的運鐵蛋白-腫瘤抑素-EGFP蛋白質。在這兩個培養(yǎng)基中分泌的總蛋白認為是100%。從在完成極化MDCK細胞研究之后收集的頂端和基底外側培養(yǎng)基，提純腫瘤抑素-EGFP蛋白質(對照)。該頂端培養(yǎng)基包含68.84%，而基底外側包含31.16%的腫瘤抑素-EGFP蛋白質。這些數(shù)據(jù)表明，具有運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白可以明顯增大融合蛋白質的基底外側分泌。不存在運鐵蛋白時，腫瘤抑素更多在頂例分泌出8.84%)，相比之下，融合蛋白質中存在運鐵蛋白時，只有23.17%在頂側分泌。
[0087]細胞增殖分析:VEGF165誘發(fā)的細胞增殖被腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質的存在抑制。圖1表示在腫瘤抑素、運鐵蛋白-腫瘤抑素和貝伐珠單抗蛋白質的作用下的細胞增殖。用MTT分析斷定腫瘤抑素(.)，運鐵蛋白-腫瘤抑素(Λ )和貝伐珠單抗( )在受VEGF(50ng/ml)刺激的脈絡膜內皮細胞增殖上的抗增生活性。用MTT試劑治療之后，利用UV-Vis分光光度計測量吸光度。對于η = 3，數(shù)據(jù)表示為平均值土S.D.。正如該曲線圖所表明的，與只用腫瘤抑素對比時，運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質在減少細胞增殖上高度有效。求出運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質的IC5tl為5.97ηΜ。對于只用腫瘤抑素蛋白質，求出為185.7ηΜ。還對貝伐珠單抗測試對細胞增殖的抑制，并且發(fā)現(xiàn)其效能為IC5tl為
7.78ηΜ。
[0088]在抑制細胞增殖上，運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質比貝伐珠單抗更有效。與貝伐珠單抗相比，運鐵蛋白-腫瘤抑素還能抑制數(shù)目更多的細胞，高于該蛋白質的ic5(l。在15.6nM的濃度，運鐵蛋白-腫瘤抑素抑制作用差不多是84%，而貝伐珠單抗的抑制作用約為63%。
[0089]管形成分析:在腫瘤抑素、運鐵蛋白-腫瘤抑素和貝伐珠單抗的不同濃度下，拍攝管形成的代表性圖像(未示出)?？磥?，管形成隨著腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質的濃度增大而減少。腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質兩者都能抑制管形成，而在貝伐珠單抗的作用下對管形成沒有明顯的抑制作用。在利用運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白進行的管形成分析中，在125nM濃度下觀察到基本上完全阻止管形成。圖2表示所有三種測試蛋白質的S形曲線擬合圖。18小時之后估算管形成。對于η = 3，數(shù)據(jù)表示為平均值土 S.D.。
[0090]侵入分析:侵入分析模擬體內基底膜，而細胞趨向于向諸如VEGF等化學引誘物遷移。圖像表明，在腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質的作用下，侵入細胞的數(shù)目減少。隨著腫瘤抑素蛋白質的濃度在該養(yǎng)基中增加，觀察到侵入基質膠侵入室的細胞數(shù)目明顯減少。還拍攝在腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素的作用下侵入膜的細胞圖像(未示出)。用VEGF(10ng/ml)作為化學引誘物，而且其表明在不存在腫瘤抑素或運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質的情況下，膜的侵入相當嚴重。然而，VEGF在誘導膜侵入中的作用在這兩種蛋白質之任一種存在的情況下是降低的，盡管VEGF存在。這表明，甚至在存在諸如VEGF等刺激物的情況下，腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質在減少細胞遷移和侵入上的效能。
[0091]與只用腫瘤抑素蛋白質相比，運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質顯著減少侵入。在15和125nM(P<0.05)的濃度，運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質的作用顯著地不同于腫瘤抑素。然而，在250和500nM的較高濃度下，該差異基本上不顯著。這表明，侵入傾向是飽和的(細胞不再是侵入性的，并且被吸引到VEGF)，而在在更高的濃度不影響進一步侵入。該作用不同于在利用這兩種蛋白質研究的細胞增殖和管形成中觀察到的。與運鐵蛋白-腫瘤抑素的
12.14nM相比，貝伐珠單抗呈現(xiàn)8.0nM的較低IC5tl值，并表明在細胞侵入中VEGF的重要作用。
[0092]分子入塢:對入塢到αΥβ 3整聯(lián)蛋白受體的腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素用計算機產生分子模型。這兩種不同入塢蛋白質的能量值表明，運鐵蛋白-腫瘤抑素的入塢(相互作用能量為-130.43kcal/mol)在能量上比單獨的腫瘤抑素入塢(相互作用能量為-113.28kcal/mol)更有利。
[0093]凋亡分析:拍攝了在腫瘤抑素、運鐵蛋白-腫瘤抑素和貝伐珠單抗的作用下呈現(xiàn)凋亡的細胞的代表性圖像(未示出)。在測試的所有三個濃度(分別為100、250和500nM和1、10和IOOnM)，腫瘤抑素和運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質在脈絡膜內皮細胞中誘導凋亡。貝伐珠單抗(1、10和IOOnM濃度)沒有誘生明顯的凋亡，而且類似于在對照PBS中觀察到的情況。 [0094]在棕色挪威大鼠和脈絡膜平載片中誘導CNV:
[0095]發(fā)現(xiàn)運鐵蛋白-腫瘤抑素在減少激光誘發(fā)的CNV損傷面積上比貝伐珠單抗和腫瘤抑素更有效(圖3)。在脈絡膜平載片中處理14天結束時，量化CNV損傷大小。CNV損傷
大小的定量比較示于圖3 (*表示與用腫瘤抑素治療對比時P < 0.05。1"表示與貝伐珠單抗對比時P <0.05。對于每一組中η = 42-48個損傷，數(shù)據(jù)表示為平均值土S.D.)。運鐵蛋白-腫瘤抑素治療的大鼠，與貝伐珠單抗和腫瘤抑素治療的大鼠相比，損傷大小顯著降低。
[0096]討論
[0097]本發(fā)明的某些方面提供重組蛋白，其包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。本發(fā)明的重組蛋白(具體地說，運鐵蛋白-腫瘤抑素重組(例如融合)蛋白)具有增強的與ανβ3整聯(lián)蛋白的結合，并相對于單獨的腫瘤抑素分別以高21、25和31倍的活性抑制內皮細胞增殖、遷移和管形成。另外，已經表明，在抑制脈絡膜內皮細胞增殖和管形成方面，運鐵蛋白-腫瘤抑素比貝伐珠單抗更有效。此外，運鐵蛋白-腫瘤抑素重組蛋白對于在體內抑制CNV比只用運鐵蛋白顯示更高的效能。本發(fā)明其他方面提供能夠產生重組蛋白的質粒表達系統(tǒng)，所述重組蛋白包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白(亦即，運鐵蛋白-腫瘤抑素融合蛋白)。在某些實施方案中，本發(fā)明的質粒表達系統(tǒng)允許該蛋白質向匯合細胞單層的基底外側優(yōu)先分泌。
[0098]實驗表明，運鐵蛋白-腫瘤抑素的重組蛋白以分別比腫瘤抑素(IC5tl為185.7ηΜ)和貝伐珠單抗(IC5tl為7.78ηΜ))大31倍和1.3倍的效力抑制內皮細胞增殖(IC5tl為5.97nM)。不受任何理論束縛，據(jù)信運鐵蛋白-腫瘤抑素比腫瘤抑素效能大31倍和比貝伐珠單抗活性好1.3倍是兩個可能機制的結果。首先，據(jù)信，運鐵蛋白改善腫瘤抑素至α νβ 3整聯(lián)蛋白受體的結合效力。利用計算機建模，本發(fā)明人已經確定，運鐵蛋白與ανβ3整聯(lián)蛋白具有結合相互作用。計算機建模還顯示，該融合蛋白比只用腫瘤抑素呈現(xiàn)更好的相互作用能量(-130.43kcal/mol對-113.28kcal/mol)。重組蛋白運鐵蛋白-腫瘤抑素的改善活性的第二個可能的機制據(jù)信是融合蛋白質的內在化。觀察到運鐵蛋白-腫瘤抑素被脈絡膜內皮細胞內在化。對于腫瘤抑素，該內在化不明顯。
[0099]有可能運鐵蛋白-腫瘤抑素也可以通過只在內在化之后被激活的路徑起作用。諸如內皮他丁(endostatin)和血管他丁(angiostatin)等其他內源抗血管生成蛋白已經表現(xiàn)出與包含RGD的蛋白質諸如纖連蛋白和玻璃體結合蛋白(vitronectin)形成復合物。復合物形成對于這些抗血管生成蛋白的活性是重要的，而且發(fā)現(xiàn)這些蛋白質在缺乏纖連蛋白或玻璃體結合蛋白的小鼠中無活性。纖連蛋白由內皮細胞大量(約3.0 μ g/105個細胞/天)分泌，而且一旦內在化，包含R⑶的蛋白質諸如纖連蛋白在細胞的胞質中的積累導致凋亡。因而，有可能運鐵蛋白融合至腫瘤抑素會增大包含RGD的蛋白質諸如纖連蛋白的胞質含量，以此誘導細胞凋亡。對于腫瘤抑素，這種可能性不明顯，因為在實試驗中它未顯示出任何內在化的跡象。對于腫瘤抑素，其與ανβ 3整聯(lián)蛋白的結合據(jù)信是作用的主機制。
[0100]再一次不受任何理論束縛，據(jù)信與單獨的腫瘤抑素類似，運鐵蛋白-腫瘤抑素的重組蛋白通過抑制蛋白質合成并誘導凋亡來抑制細胞增殖。本發(fā)明人已經觀察到重組運鐵蛋白-腫瘤抑素蛋白質比單獨的腫瘤抑素更大的抗凋亡活性。貝伐珠單抗在脈絡膜內皮細胞內沒有施加任何觀察到的凋亡活性。先前已有報告指出，對于貝伐珠單抗在角膜內皮細胞、視網膜神經節(jié)細胞和視網膜-RPE-脈絡膜培養(yǎng)物中缺乏凋亡活性。
[0101]實驗表明，運鐵蛋白-腫瘤抑素的重組蛋白以比單獨腫瘤抑素多25倍的效力抑制脈絡膜內皮細胞中的管形成。據(jù)信，運鐵蛋白-腫瘤抑素重組蛋白的內在化導致運鐵蛋白-腫瘤抑素和纖連蛋白的復合物，它可能更強烈地結合至其他活化的內皮細胞并阻止管形成。貝伐珠單抗對脈絡膜內皮細胞中的管形成未顯示出任何顯著的抑制作用。一般相信，管形成在膠原IV，VIII，XV，XVIII和層粘連蛋白8和10 (其存在于基底膜中)的作用下發(fā)生。這些組分往往促進內皮細胞的穩(wěn)定性、粘著和遷移。諸如VEGF等生長因子也存在于基底膜基質中。然而，VEGF看來在管形成中不起重要的作用，因為管形成甚至在存在貝伐珠單抗的情況下也高效率發(fā)生，已知貝伐珠單抗通過中和胞外基質中的VEGF而起作用。
[0102]據(jù)信，在血管發(fā)生的過程中，基底膜降解后，內皮細胞遷移到臨時的基底膜樣基質上。已知VEGF在內皮細胞的遷移中起重要的作用，而且本發(fā)明人已經利用一個Boyden室細胞遷移分析研究了該過程。該分析的目的之一是評定VEGF對內皮細胞侵入基底膜的影響，所述內皮細胞進一步將形成血管。在10ng/ml VEGF的作用下,使用重組蛋白運鐵蛋白-腫瘤抑素時，比只用腫瘤抑素時，細胞遷移顯著地降低。已經表明，腫瘤抑素抑制成簇粘附激酶(focal adhesion kinase, FAK)磷酸化。缺乏FAK激活最后導致對細胞遷移的抑制作用。據(jù)信，重組蛋白運鐵蛋白-腫瘤抑素施加類似的影響，盡管以更大的程度。
[0103]將運鐵蛋白融合到腫瘤抑素的另一個主要優(yōu)點是，該融合蛋白質的優(yōu)先基底外側分泌。差不多75%的重組蛋白運鐵蛋白-腫瘤抑素向細胞的基底外側分泌，相比之下僅用腫瘤抑素蛋白質只有約35%。這提供在玻璃體內遞藥后具有靶向增生的脈絡膜內皮細胞的能力的重組蛋白運鐵蛋白-腫瘤抑素。玻璃體內遞送治療劑之后，RPE細胞由于這些細胞的緊密連接屬性而充當治療劑進一步移動的屏障。運鐵蛋白-腫瘤抑素依靠其基底外側分泌屬性，比腫瘤抑素或貝伐珠單抗有利。玻璃體內施用的運鐵蛋白-腫瘤抑素向脈絡膜內皮細胞且在疾病部位附近放置腫瘤抑素。
[0104]體內研究表明，運鐵蛋白-腫瘤抑素在抑制脈絡膜新血管化上效能較高。與用貝伐珠單抗或腫瘤抑素治療的大鼠對比，用運鐵蛋白-腫瘤抑素治療的BN大鼠眼中的損傷大小顯著更低。
[0105]這些結果表明，運鐵蛋白-腫瘤抑素是一種比貝伐珠單抗好的治療劑，因為除別的以外，(a)運鐵蛋白-腫瘤抑素是一種比貝伐珠單抗好的細胞增殖抑制劑，(b)運鐵蛋白-腫瘤抑素導致脈絡膜內皮細胞凋亡，這是貝伐珠單抗所缺乏的，(C)運鐵蛋白-腫瘤抑素抑制管形成，而貝伐珠單抗在抑制管形成上不起作用。與只用腫瘤抑素相比，在用以評定新血管化的全部體外分析中，運鐵蛋白-腫瘤抑素施加>=20倍的效力。更顯著地，與貝伐珠單抗和腫瘤抑素對比，運鐵蛋白-腫瘤抑素在體內減少激光誘發(fā)的CNV上更有效。
[0106]實施例2
[0107]Tf-T蛋白的牛產和提純:用以構造質粒的PSecTag2B載體具有六組氨酸標簽，它有助于在該培養(yǎng)基中分泌的蛋白質的提純。將ARPE細胞(第24次傳代)在12孔板中培養(yǎng)，直到80%匯合。擴增的Tf-T (運鐵蛋白-腫瘤抑素)質粒(在PSecTag2B載體中克隆)在DMEM/F12培養(yǎng)基中稀釋，并與Lipofectamine式劑混合。該質粒和Lipofectamine復合物加到每個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中。通過往返搖動孔，溫和地攪拌復合物。細胞在37°C在5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時。24小時結束時，收集培養(yǎng)基并提純。用TALON?.盒屬親和樹脂提純融合蛋白。從細胞收集的培養(yǎng)基與樹脂混合，并在室溫溫和地攪動孵育20分鐘。利用50mM磷酸鈉、300mM氯化鈉和150mM咪唑的水溶液(pH7.0)洗脫結合到樹脂的蛋白質。隨后，通過針對沒有咪唑的類似緩沖液滲析(利用2000MWC0透析包)從該蛋白質溶液清除咪唑。BCA?蛋白質分析試劑盒用來估計蛋白質含量。如上所述，對三個單獨的批進行提純，并利用SDS凝膠電泳(PAGE)，熒光分光術和圓二色性，評定再現(xiàn)性。
[0108]為了進行凝膠電泳，將5μ g蛋白質與4倍加載染料混合并煮沸5分鐘。樣本在4-20 %梯度SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad，Hercules, CA)上運行。使用遠-UV光譜區(qū)域(190-250nm)中圓二色性(⑶)來研究Tf-T和腫瘤抑素二級結構。在AVIV62型DS分光旋光計(AVIV Biomedical，Inc.，NJ)上獲得⑶光譜。蛋白質容液轉移進Imm路徑長度石英室，并放入恒溫皿架(cell holder)。利用2nm帶寬以0.25nm間隔收集數(shù)據(jù)。在5mM磷酸鹽緩沖液PH7.4中制備100M腫瘤抑素和Tf-T溶液。通過在280nm激發(fā)蛋白質完成熒光光譜學。從300_400nm波長收集放射光譜。在Spectramax M5微板讀板儀(MolecularDevices,LLC)上進行實驗。
[0109]腫瘤抑素和Tf-T蛋白的表征:利用SDS凝膠電泳(PAGE)、大小排阻層析(SEC)、圓二色性和動態(tài)光散射進行Tf-T的表征。為了進行凝膠電泳，把5 μ g蛋白質與4倍裝入染料混合并煮沸5分鐘。樣本在4-20%梯度SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad, Hercules, CA)上運行。利用Agilent SEC-3柱(1.D.7.8mm和長度300mm)進行SEC。注入樣本流速為Iml/分鐘。注入的樣品體積為25 μ I。SEC用的流動相是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)ρΗ7.4。
[0110] 使用在遠-UV光譜區(qū)域的⑶來研究Tf-T和腫瘤抑素二級結構。在AVIV62型DS分光旋光計(AVIV Biomedical，Inc.，NJ)上獲得⑶光譜。蛋白質溶液轉移到Imm通道長度石英室并放入恒溫皿架中。利用2nm帶寬以0.25nm間隔收集數(shù)據(jù)。用Malvern納米分級器(Nanosizer)估算lmg/ml腫瘤抑素和Tf-T溶液的顆粒大小。
[0111]腫瘤抑素和Tf-T融合蛋白的分泌:為了進行蛋白質分泌研究，選擇RPE細胞單層，以估算Tf-T的分泌樣式。首先，對細胞表征其電阻、緊密連接形成和核染色樣式。將RPE細胞鋪在 Transwell 濾器上，并利用EVOM? 電阻計(WorldPrecision Instruments, CA)測量跨上皮電阻(TEER)。當TEER > 200 Ω.cm2時，還用ZO-1染色確定緊密連接形成。在室溫加入10%甲醛(0.5ml在頂側和1.5ml在基底外側)，將帶有TEER > 200 Ω.cm2的細胞的濾器固定30分鐘。通過加入包含5%山羊血清的0.1% Trioton XlOO (0.5ml在頂側)于室溫對細胞進一步透化I小時。將稀釋至1:100稀釋液的ZOl —抗(0.5ml在頂側)加到細胞上并在室溫孵育I小時。將經FITC標記的二抗(0.5ml在頂側)(稀釋至1:100稀釋液)加到細胞上并在室溫孵育I小時。細胞用Sμg/ml DAPI (4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)孵育5分鐘，以染色細胞核。用鋒利的刀片切出濾器，并轉移到玻璃載玻片上，通過加入SuperMount封固介質(BioGenex, CA)固定,并在共聚焦顯微鏡下目測。
[0112]為了估算分泌樣式，細胞用200 μ g腫瘤抑素或Tf-T蛋白質在頂側孵育。轉染24小時之后，從基底外側和頂側單獨收集培養(yǎng)基，并利用TALON金屬親和樹脂提純。利用BCA?.蛋白質分析試劑盒量化腫瘤抑素和Tf-T蛋白質。
[0113]Tf-T蛋白質的穩(wěn)定性:對Tf-T蛋白質評定其在(a)pH4.0和8.0緩沖液中，(b)三(羥甲基)氨基甲烷 (TRIS)和磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液(pH7.0)，和(c)范圍為IOmM至250mM氯化鈉的離子強度(pH7.0)中的穩(wěn)定性。蛋白質溶液暴露于上述條件48小時，并利用圓二色性和熒光光譜學評定穩(wěn)定性。在圓二色性和熒光光譜學外用SDS PAGE評定pH穩(wěn)定性。
[0114]在CNV i秀發(fā)的棕色挪威大鼠中的早期時間點效能研究:
[0115]成年雄性掠色挪威(BN)大鼠(150_180gm)購自Harlan Sprague Dawley Inc.(Indianapolis, IN, USA)。利用腹膜內注射40-80mg/ml氯胺酮和10_12mg/kg賽拉嗪混合物麻醉大鼠。正如在實施例1所描述，進行激光燒傷的誘導。激光燒傷誘導后，容許CNV損傷發(fā)展7天。7天結束時，對大鼠玻璃體內施用以下治療之一，(a)PBS pH7.4，(b)貝伐珠單抗或(C)Tf-T蛋白質。利用熒光素血管造影術監(jiān)測治療之前和之后CNV損傷的發(fā)展。為了進行熒光素血管造影術，麻醉大鼠，用局部給藥I %托吡卡胺溶液使瞳孔放大，并通過尾靜脈給大鼠施用200 μ 11%突光素鈉。利用Genesis Df底部照相機(Kowa Optimed Inc, CA)立即監(jiān)測自損傷的泄漏。利用ImageJ軟件獲得CNV區(qū)域。
[0116]結果
[0117]Tf-T蛋白質的牛產和提鈍:在制各和測試的三枇Tf-T中得到IOOKdaTf-T蛋白質的單一條帶。用所描述的方法產生的Tf-T具有類似的熒光和圓二色性譜。
[0118]腫瘤抑素和Tf-T蛋白質的表征:SDS PAGE中IOOkDa和28kDa的單一條帶和在SEC的單峰顯示Tf-T和腫瘤抑素的純度。Tf-T的顆粒大小為8.0nm,多分散性指數(shù)(polydispersity index, PDI)為 0.414。腫瘤抑素的顆粒大小為 3.9mn，PDI 為 0.359。Tf-T圓二色性譜的⑶掃描表明，Tf-T具有大多數(shù)β -片層和轉角(約60% )，也伴有α -螺環(huán)(約32%)的存在。腫瘤抑素的結構也富含β片層和轉角(約50%)。然而，腫瘤抑素具有較少的α-螺環(huán)(約16%)，并具有較多的無規(guī)卷曲結構(約40%)。因此，對于這兩種蛋白質，圓二色性譜是不同的。
[0119]Tf-T融合蛋白質的分泌:在Transwell濾器上培養(yǎng)4周時，RPE細胞形成緊密連接。通過ZO-1蛋白質染色也確定緊密連接形成。RPE細胞顯示清楚的ZO-1染色樣式，并勾勒出單層內RPE細胞的均勻的多邊形狀。繼蛋白質頂端暴露之后，RPE細胞向基底外側分泌126.8 μ g/ml的Tf-T蛋白質。相反,僅12.3 μ g/ml中瘤抑素向基底外側分泌。
[0120]Tf-T蛋白質的穩(wěn)定件:發(fā)現(xiàn)Tf-T在ρΗ7.0最穩(wěn)定。SDS PAGE表明，與對照Tf-T相比，在PH4-6條帶強度降低，這指示蛋白質降解。另外，熒光和圓二色性表明，除pH7.0外在所有PH值信號都減弱。因為發(fā)現(xiàn)蛋白質在pH7.0最穩(wěn)定，在pH7.0進行進一步的穩(wěn)定性研究(離子強度和緩沖液)。
[0121]獲得了暴露于磷酸鹽檸檬酸鹽和TRIS緩沖液中的NaCllOmM至250mM的Tf-T的熒光和圓二色性譜。Tf-T顯示，在存在磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液的情況下，沒有離子強度改變的作用。然而，在存在NaC1250mM和TRIS緩沖液的情況下，Tf-T信號減弱。因而，磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液更好地適用于該蛋白質。
[0122]CNV誘導的棕色挪威大鼠中早期時間點效能研究:
[0123]當在早期時間點(CNV誘發(fā)后7天)開始治療時，Tf-T治療的大鼠與貝伐珠單抗治療的大鼠對比，損傷大小降低。這表明，Tf-T作為針對脈絡膜新血管化的預防性處理是有效的。
[0124]本發(fā)明的上述討論是為了舉例說明和描述的目的呈現(xiàn)的。上述內容不意圖將本發(fā)明限制于這里公開的 一種或多種形式。盡管本發(fā)明的描述包括一個或多個實施方案和某些變型和修改的描述，但是其它變型和修改在本發(fā)明的范圍內，例如，在了解本公開之后，其在本領域技術人員的技術和知識的范圍內。意圖以容許的程度獲得包括備選實施方案的權利，包括與要求保護的那些交替，可互換和/或等同的結構、功能、范圍或步驟，不論此類交替、可互換和/或等同的結構、功能、范圍或步驟是否在這里公開，而不意圖公開獻出任何可專利性的主題。
【權利要求】
1.重組蛋白，其包括連接到腫瘤抑素(tumstatin)的運鐵蛋白。
2.權利要求1的重組蛋白，其中運鐵蛋白和腫瘤抑素彼此直接連接。
3.權利要求1的重組蛋白，其中運鐵蛋白和腫瘤抑素彼此通過接頭共價連接。
4.質粒，其包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列。
5.權利要求4的質粒，其中所述編碼重組蛋白的核酸序列可操作連接到表達控制序列。
6.重組核酸分子，其包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列。
7.權利要求6的重組核酸分子，其中所述核酸序列可操作連接到表達控制序列。
8.重組宿主細胞，其用重組核酸分子轉染并且表達該重組核酸分子，所述重組核酸分子包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列。
9.一種用于生成包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的方法，所述方法包括: 用重組核酸分子轉染重組宿主細胞，所述重組核酸分子包括編碼包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的核酸序列； 在足以產生包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白的重組蛋白的條件下，培養(yǎng)轉染的宿主細胞；并 將該重組蛋白以基本上純化的重組蛋白回收。
10.權利要求9的方法，其中所述重組蛋白包括直接連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。
11.一種用于治療受試者中與脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)有關的臨床狀況的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用治療有效量的重組蛋白，該重組蛋白包括連接到腫瘤抑素的運鐵蛋白。
12.權利要求11的方法，其中所述與CNV有關的臨床狀況包括彈性假黃色瘤(pseudoxanthoma elasticum)、血管樣條紋癥(angioid streaks)、組織胞衆(zhòng)菌病(histoplasmosis)、點狀內層脈絡膜病變(punctuate inner choroidopathy)或濕性年齡相關黃斑變性(AMD) (wet age related macular degeneration)。
【文檔編號】C12N15/63GK103998470SQ201280051256
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年8月15日 優(yōu)先權日:2011年8月17日
【發(fā)明者】U·B·科姆佩拉, R·I·沙因曼, P·泰亞吉 申請人:科羅拉多大學董事會法人團體