用于產(chǎn)毒性測試的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測試試劑的組合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridium?botulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)檢測和分析)。尤其是，本發(fā)明涉及人誘導的多能干(hiPS)來源的細胞用于試劑檢測和分析的用途。
【專利說明】用于產(chǎn)毒性測試的組合物和方法
[0001]本申請要求2011年9月29日提交的美國臨時申請N0.61/540，693的優(yōu)先權(quán)，將其通過引用以其整體在本文合并。
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0002]本發(fā)明涉及用于測試劑(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)檢測和分析)的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明涉及人誘導的多能干(hiPS)來源的細胞用于試劑檢測和分析的用途。
【【背景技術(shù)】】
[0003]由革蘭氏陽性，土壤-居住細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)合成的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)是人類知道的最毒性物質(zhì)，且是神經(jīng)麻痹性疾病肉毒中毒的成因劑(Johnson E (2005) in Topley and Wilson's microbiology and microbialinfections, ed S.P.Borriello, P.R.Murray, and G.Funke (Hodder Arnold, London, UnitedKingdom)，ppl035 - 1088)。已描述被指定為A~G的BoNT的7種免疫學不同的血清型(Gimenez DF&Gimenez JA (1995) Int J Food Microbiol27:1 ~9) oBoNT起初作為~150kDa的單鏈多肽合成，但翻譯后蛋白水解切割產(chǎn)生由二硫鍵連接的~IOOkDa和~50kDa的不同重和輕鏈(HC和LC)。HC還被功能性地分為HCe和HCn亞結(jié)構(gòu)域。HCe結(jié)構(gòu)域負責識別及結(jié)合導致胞吞的特定神經(jīng)元細胞表面受體，而HCn結(jié)構(gòu)域負責胞吞囊泡膜中的通道形成和跨內(nèi)體膜的 LC 的轉(zhuǎn)位和內(nèi)化(Montecucco et al., (2004)Trends Microbiol 12:442-446 ;Fischer A&Montal M(2007)J Biol Chem282:29604-29611 ；Fischer A, et al(2009)ProcNatl Acad Sci U S A106:1330-1335)。在轉(zhuǎn)位期間，二硫鍵切割，及LC釋放到細胞胞質(zhì)溶膠及再作為 鋅-依賴性內(nèi)肽酶折疊為活性酶組分(Fischer et al., supra ；FischerA&Montal M(2007)Proc Natl Acad Sci U S A104:10447-10452)。LC然后特別在突觸前囊泡靶向及切割細胞內(nèi)SNARE蛋白，這導致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的抑制。各BoNT血清型具有不同切割靶，BoNT/A和E切割SNAP-25在不同位點，BoNT/B，D，F(xiàn)和G在不同位點切割VAMP/突觸泡蛋白，及 BoNT/C 切割 SNAP-25 和突觸融合蛋白(見 Montecucco C&Schiavo G(1994)MolMicrobiol 13:1 ~8 的綜述)。
[0004]天然存在的肉毒中毒是罕見但嚴重的疾病，在美國每年發(fā)生~110例和致死率是~5 ~10% (Johnson EA&Montecucco C(2008) in Handbook of Clinical Neurology, edAndrew G.Engel Elsevier, pp333_368)。由于它們的極度效力(對于 BoNT/A, lng/kg 的體重的估計的人致死劑量)(Bossi P, et al (2006)Cell Mol Life Sci63:2196-2212)，治療情況中涉及的疾病肉毒中毒的嚴重性和高成本，尤其以大規(guī)模，BoNT已被分類為類別A選擇劑及作為生物恐怖主義武器呈現(xiàn)嚴重的威脅(Arnon SS,等人(2001) JAMA285:1059-1070)。
[0005]BoNT/A及在更少得多的程度BoNT/B也被用作獨特和重要藥物來治療各種神經(jīng)肌肉病癥及用于化妝品。食品和藥物管理局批準的使用BoNT的條件包括化妝品治療及暫時減輕各種肌肉痙攣狀態(tài)病癥，多汗和偏頭痛(Chaddock JA&Acharya KR(2011)FEBS J278:899~904)。BoNT的化妝品和臨床應用在增加，開發(fā)用于藥學目的的BoNT的新制劑使需要臨床試驗，精確的效力確定，及中和抗體篩選。例如，BoNT被藥學施用用于治療:疼痛病癥，隨意肌肉強度，病灶張力失調(diào)，包括子宮頸，顱張力失調(diào)和良性自發(fā)眼瞼痙攣，單側(cè)面痙攣，及病灶痙攣狀態(tài)，胃腸病癥，多汗和化妝皺紋修正，眼瞼痙攣，口顎肌張力失調(diào)，開頜類型，閉頜類型，夜磨牙癥，Meige綜合征，舌張力失調(diào)，眼瞼失用癥，打開子宮頸張力失調(diào)，頸項前屈，頸后傾，頸側(cè)傾，斜頸，咽張力失調(diào)，喉張力失調(diào)，痙攣性發(fā)聲困難/收肌類型，痙攣性發(fā)聲困難/展肌類型，痙攣性呼吸困難，肢張力失調(diào)，臂張力失調(diào)，任務特定張力失調(diào)，作家痙攣，音樂家痙攣，高爾夫球員痙攣，腿張力失調(diào)，股內(nèi)收，股外展膝屈曲，膝延伸，踝屈曲,踝延伸，馬蹄內(nèi)翻足,畸形足張力失調(diào),紋狀體趾,趾屈曲,趾延伸,軸張力失調(diào)，pisa綜合征，腹部舞者張力失調(diào)，節(jié)段性張力失調(diào)，偏側(cè)肌張力障礙，一般張力失調(diào)，X-連鎖的張力失調(diào)帕金森癥中的張力失調(diào)，皮質(zhì)基底變性中的張力失調(diào)，X-連鎖的張力失調(diào)帕金森癥中的張力失調(diào)，遲發(fā)張力失調(diào)，脊髓小腦共濟失調(diào)中的張力失調(diào)，帕金森病中的張力失調(diào)，亨廷頓病中的張力失調(diào)，Hallervorden-Spatz病中的張力失調(diào)，多巴-誘導的運動障礙/多巴-誘導的張力失調(diào)，遲發(fā)運動障礙/遲發(fā)張力失調(diào)，陣發(fā)性運動障礙/張力失調(diào)，運動性非-運動性作用-誘導的腭肌陣攣，肌陣攣肌纖維顫搐，剛性，良性肌肉痙攣，遺傳性下顎震顫，反常性頜肌肉活性，半咀嚼痙攣，肥大性鰓肌病，咬肌肥大，脛骨前肌肥大，眼球震顫，振動幻覺核上性凝視麻痹，癲癇，持續(xù)性不全癲癇，痙攣性斜頸操作計劃，展肌聲帶麻痹，頑固性突變發(fā)聲困難，上食管括約肌功能障礙，聲帶肉芽腫，口吃抽動穢語綜合征，中耳肌陣攣，保護性喉閉合，喉切除術(shù)后，言語失敗，保護性上瞼下垂，眼瞼內(nèi)翻括約肌Odii功能障礙，假性食道弛不能，非失弛緩癥，食管運動神經(jīng)病癥，陰道痙攣，手術(shù)后固定震顫，膀胱功能障礙，逼肌括約肌協(xié)同 動作障礙，膀胱括約肌痙攣，單側(cè)面痙攣，神經(jīng)支配恢復術(shù)運動障礙，化妝品使用克勞足，皺眉面部不對稱，頦肌笑靨，僵人綜合征，破傷風前列腺增生，肥胖，治療嬰兒腦麻痹斜視，混合的麻痹相伴的，在視網(wǎng)膜剝離手術(shù)之后，在白內(nèi)障手術(shù)之后，在無晶狀體肌炎斜視中，肌病斜視，分離垂直性偏斜，作為斜視手術(shù)的附加，內(nèi)斜視，外斜視，失弛緩癥，肛門龜裂，外分泌腺活動過度，F(xiàn)rey綜合征，鱷淚綜合征，多汗，腋掌足底鼻漏，中風中的相對多涎，在帕金森氏中，在肌萎縮側(cè)索硬化癥中，痙攣性病情，在腦炎和脊髓炎自身免疫過程中，多發(fā)性硬化，橫貫性脊髓炎，Devic綜合征，病毒感染，細菌感染，寄生蟲感染，真菌感染，在遺傳性痙攣性輕截癱卒中后綜合征半球梗塞，腦干梗塞，脊髓梗塞中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，半球損傷，腦干損傷，脊髓損傷中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血，腦內(nèi)出血，蛛網(wǎng)膜下出血,硬膜下出血,脊柱內(nèi)出血中，在瘤形成,半球腫瘤,腦干腫瘤和脊髓腫瘤中。由此,在環(huán)境中，食品中，藥學制備物中，為抗體檢測，及在研究應用中BoNT活性的定量和可靠的檢測在防止肉毒中毒，為反恐怖主義，以及新藥物開發(fā)和患者安全性和產(chǎn)品的質(zhì)量控制和保證測試中是關(guān)鍵的。
[0006]許多BoNT檢測方法已出版，及它們可分為4大類別(Cai等人，(2007)Crit RevMicrobiol33:109~125的綜述):1.免疫學檢測全毒素的存在,但無法區(qū)別有活性的或無活性狀態(tài)的體外測定(ELISA) ；2.檢測毒素LC的酶促活性，但不區(qū)別有生物學活性的全毒素和僅LC的內(nèi)肽酶測定；3.體內(nèi)測定(小鼠生物測定)；及最后4.體內(nèi)模擬測定諸如半隔膜測定，局部注射測定，及使用原代或永生化的細胞的基于細胞的測定。為了檢測完全有活性的BoNT，檢測測定應測量中毒過程的全部步驟(例如:結(jié)合于細胞表面受體的HC，胞吞，囊泡通道形成，二硫鍵切割，LC轉(zhuǎn)導進細胞胞質(zhì)溶膠，及SNARE蛋白的最終蛋白水解切割)。僅小鼠生物測定和體內(nèi)模擬測定測量全部這些步驟。小鼠生物測定涉及給小鼠靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射BoNT的不同稀釋，然后觀察小鼠肉毒中毒的癥狀(肢麻痹，用力呼吸，裙皺的毛皮，等)(Hatheway CL (1988) in Laboratory diagnosis of infectiousdiseases:principles and practice.eds Balows A, Hausler WH, Ohashi M&TuranoMA(Springer-Verlag, New York)，pplll - 133 ;Schantz EJaK, D.A.(1978)Journal of theAssociation of Official Analytical Chemists61:96-99)和最終死亡。盡管MBA是定量的，且可監(jiān)測全部中毒步驟，但其具有大的出錯率，在實驗室之間或?qū)嶒炇抑畠?nèi)不標準化，需要大量的動物，及對應設備及訓練的人員。半隔膜和局部注射測定減少動物痛苦，且一些足夠敏感，但仍需要大量的動物及熟練的人員。 [0007]這些測定的這些清楚地鑒定的缺點刺激了來自調(diào)控機構(gòu)包括FDA和USDA的建議，以開發(fā)會提供對MBA特異性，敏感和定量替代性的基于細胞的模型(NationalInstitute of Environmental Health Sciences, 2008)。各種連續(xù)細胞系，包括神經(jīng)-2a和PC-12，已用于毒性測試，但對與MBA競爭不是敏感足夠的。源于大鼠，小鼠或雞的原發(fā)性神經(jīng)元，及源于小鼠胚胎干細胞的神經(jīng)元顯著地更敏感(Hall YH, et al(2004)JTmmunol Methods288:55-60 ；Keller JE, Cai F&Neale EA(2004)Biochemistry43:526-532 ；Lalli G, et al(1999)J Cell Scill2(Ptl6):2715-2724 ;Neale et al., (1999)J CellBioll47:1249-1260 ；Stahl AM, et al(2007)J Biomol Screenl2:370_377)。所描述的用于毒性測試及抗體檢測的最敏感細胞類型是原發(fā)性大鼠脊髓細胞(RSC)測定(Pellett等人，(2007) FEBS Lett581:4803-4808)，其相比MBA更敏感，可再現(xiàn)及良好關(guān)聯(lián)于小鼠生物測定(Pellett et al., (2010)J Pharmacol Toxicol Methods)。此外，源于胚胎干細胞的神經(jīng)兀已也顯不高度敏感(McNutt et al., (2011)Biochem Biophys Res Commun405:85-90 ；Pellett S, et al(2011)Biochem Biophys Res Commun404:388-392 ;Kiris E,et al(2011)Stem Cell Res)。但是，RSC測定仍需要使用一些動物及用于細胞制備的熟練的人員，且由于連續(xù)制備新批細胞的需求而不容易適應于測試標準化。
[0008]【發(fā)明概述】
[0009]本發(fā)明涉及用于測試試劑的組合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)檢測和分析)。尤其是，本發(fā)明涉及人誘導的多能干(hiPS)來源的細胞用于試劑檢測和分析的用途。
[0010]本發(fā)明的實施方式提供用于研究，篩選，臨床和治療性應用的神經(jīng)元細胞(例如，人(例如，iPS來源的))。在一些實施方式中，方法用于BoNT及對BoNT的中和抗體的檢測和分析。例示實施方式在這里及下文所述。另外的實施方式在本文所述及在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識之內(nèi)。
[0011]例如，在一些實施方式中，本發(fā)明提供檢定梭菌物種(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神經(jīng)毒素(BoNT))的活性的方法,包括:(a)使人誘導的多能干細胞(hiPS)來源的神經(jīng)元細胞與包含NT的組合物接觸；及(b)檢定NT的生物學活性。在一些實施方式中，梭菌物種是肉毒梭菌(Clostridium botulinum),丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum),或巴氏梭菌(Clostridium baratii)。在一些實施方式中，BoNT包括全部7種知道的血清型，包括血清型A，B, C，D，E，F(xiàn)和G及各血清型之內(nèi)已知道的亞型。在一些實施方式中，NT是重組體，突變體或嵌合NT。在一些實施方式中，生物學活性是SNAP-25，VAMP或突觸融合蛋白的切割。在一些實施方式中，測定是定性的，而在其他實施方式中，測定是定量的。在一些實施方式中，NT經(jīng)純化，而在其他實施方式中，其在復合物，溶液或基質(zhì)中。在一些實施方式中，NT是重組體。在一些實施方式中，NT與選自下列的另一分子綴合:治療性模式，標志物，成像劑，酶，受體，抗體或生物活性化合物。在一些實施方式中，方法還包括在接觸hPS來源的神經(jīng)元細胞之前，使NT與測試化合物接觸的步驟。在一些實施方式中，測試化合物是NT的抗體(例如，中和抗體)或小分子抑制物。在一些實施方式中，中和抗體經(jīng)純化或在血清或抗毒素樣品中。
[0012]本發(fā)明還提供檢定梭菌物種神經(jīng)毒素(例如，BoNT)的活性的方法，包括:(a)使人誘導的多能干(hiPS)來源的神經(jīng)元細胞與包含(a)NT ;及(b)中和抗體的組合物接觸；及(b)檢定NT的生物學活性。
[0013]本發(fā)明也涉及測定包含有生物學活性的BoNT的制備物(優(yōu)選，藥學包含有生物學活性的BoNT的制備物)中有生物學活性的BoNT的量的方法及。在一些實施方式中，方法包括下列步驟:(a)使hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞與包含有生物學活性的BoNT的制備物的樣品接觸 '及(b)測定存在于制備物中的有生物學活性的BoNT的量通過檢定樣品的BoNT的生物學活性。
[0014]在進一步實施方式中，本發(fā)明提供人誘導的多能干(hiPS)細胞來源的神經(jīng)元細胞用于檢定BoNT的活性的用途。
[0015]在本文描述了另外的實施方式。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0016]圖1顯示iPS神經(jīng)元中的BoNT受體表達。A.使iPS細胞成熟4，7，10，14和21天，及經(jīng)蛋白印跡檢定BoNT受體的表達水平。B.使iPS細胞成熟5，10，15和20天，并將成年人腦細胞用于實施定量-PCR測定。
[0017]圖2顯示平鋪在7種不同底物上的iPS神經(jīng)元的BoNT/Al敏感度的比較(顯示在右側(cè))。
[0018]圖3顯示iPS神經(jīng)元和RSC細胞的BoNT/Al敏感度。
[0019]圖4顯示檢測iPS神經(jīng)元中的BoNT/Al活性的時間依賴性。
[0020]圖5顯示相比RSC細胞，iPS神經(jīng)元的BoNT/Al攝取速度。
[0021]圖6顯示由神經(jīng)元的活性-依賴性BoNT/Al攝取。A.在細胞-刺激培養(yǎng)基中使iPS神經(jīng)元和RSC細胞暴露于55U或275U的BoNT/Al經(jīng)1，5，10和15分鐘，之后去除毒素，并24h溫育。B.使iPS神經(jīng)元在神經(jīng)元和細胞-刺激培養(yǎng)基中暴露于55U的BoNT/Al經(jīng)1，5和lOmin。C.使神經(jīng)元在細胞-刺激培養(yǎng)基中暴露于1.7~55U的BoNT/Al經(jīng)5min，用神經(jīng)元培養(yǎng)基洗滌兩次，并溫育24h。
[0022]圖7顯示iPS神 經(jīng)元中抗體保護測定的蛋白印跡和光密度測定法數(shù)據(jù)。A.使iPS神經(jīng)元暴露于1.5U的毒素和抗體經(jīng)24h。B.使iPS神經(jīng)元在細胞-刺激培養(yǎng)基中暴露于55U的毒素-抗體混合物經(jīng)5分鐘，移出混合物，將細胞洗滌兩次，并溫育24h。
[0023]圖8顯示iPS神經(jīng)元對BoNT/A復合物及純化的BoNT/A的敏感度。A.比較純化的BoNT/A I 和 BoNT/Al 復合物的 SDS-PAGE 凝膠(自 Invitrogen 的階梯:See Blue? Plus2前染色的標準)。B.在48h毒素暴露之后iPS神經(jīng)元對BoNT/Al純化的毒素和BoNT/Al復合物的敏感度。
[0024]圖9顯示iPS神經(jīng)元中BoNT/B，C和E活性的檢測。使iPS神經(jīng)元成熟7天和使RSC細胞平行暴露于BoNT/B (A)，/C (B)及/E (C)的系列稀釋48h。
[0025]【定義】
[0026]為了輔助本發(fā)明的理解，以下定義許多術(shù)語和短語:[0027]如本文所用，術(shù)語“宿主細胞”指稱任何真核生物或原核生物細胞(例如，哺乳動物細胞，禽細胞，兩棲動物細胞，植物細胞，魚細胞和昆蟲細胞)，無論位于體外或體內(nèi)。
[0028]如本文所用，術(shù)語〃細胞培養(yǎng)物〃指稱細胞的任何體外培養(yǎng)物。包括在此術(shù)語之內(nèi)的是連續(xù)細胞系(例如，具有永生表型)，原代細胞培養(yǎng)物，有限細胞系(例如，非-轉(zhuǎn)化的細胞)和體外維持的任何其他細胞群，包括卵母細胞和胚胎。
[0029]如本文所用，術(shù)語“毒性”指稱，相比在毒物施用之前的相同的細胞或組織，對細胞或組織的任何有害或有害效應。
[0030]如本文所用，術(shù)語“藥物組合物”指稱活性劑與惰性或有活性的載體的組合，使組合物尤其適合于體外，體內(nèi)或離體診斷或治療性用途。
[0031 ] 如本文所用，術(shù)語“藥學可接受的載體”指稱任何標準藥學載體，諸如磷酸鹽緩沖溶液，水，乳劑(例如，諸如油/水或水/油乳劑)，及各種類型的潤濕劑。組合物也可包括穩(wěn)定劑和防腐劑。例如載體，穩(wěn)定劑和佐劑。(見例如，Martin, Remington’s PharmaceuticalSciences, 15th Ed., Mack Publ.C0., Easton, PA[1975])?
[0032]如本文所用，術(shù)語“檢測(detect)”，“檢測(detecting) ”或“檢測(detection) ”可描述發(fā)現(xiàn)或分辯或特定觀察可檢測標記的組合物的一般行為。
[0033]如本文所用，術(shù)語〃純化的(purified) 〃或〃純化(to purify) 〃指稱自樣品去除組分(例如，混雜物)。例如，抗體通過去除混雜的非-免疫球蛋白來純化；它們也通過去除不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白來純化。非-免疫球蛋白的去除和/或不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白的去除導致樣品中靶-反應性免疫球蛋白的百分率的增加。在另一例中，重組多肽在細菌宿主細胞中表達,并將多肽通過去除宿主細胞蛋白來純化；樣品中重組多肽的百分率由此增加。
[0034]如本文所用，術(shù)語〃樣品〃以最廣義使用。在一種意義上，其意指包括自任何來源獲得的樣本或培養(yǎng)物，以及生物學和環(huán)境樣品。生物學樣品可從動物(包括人)得到及包括流體，固體，組織和氣體。生物學樣品包括細胞，組織，血制品，諸如血漿，血清等。但是該例不旨在被解釋為限制可應用于本發(fā)明的樣品類型。在一些實施方式中，樣品也可為包含有生物學活性的BoNT的制備物的樣品，諸如待應用于藥物或化妝目的的BoNT制備物。而且，在本公開的一方面，樣品也可為被懷疑包含BoNT的環(huán)境樣品或食品樣品。
[0035]【發(fā)明詳述】
[0036]本發(fā)明涉及測試試劑的組合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)檢測和分析)。尤其是，本發(fā)明涉及人誘導的多能干(hiPS)來源的細胞用于試劑檢測和分析的用途。
[0037]本發(fā)明的實施方式提供檢測和分析BoNT的系統(tǒng)和方法。在一些實施方式中，系統(tǒng)和測定法利用人iPS來源的神經(jīng)元作為用于肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)檢測的高度敏感和可再現(xiàn)的平臺。在一些實施方式中，神經(jīng)元是GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元的98%純泛(pan)-神經(jīng)元群，并作為分化的細胞產(chǎn)生及冷凍保存。在另一方面，神經(jīng)元是基本上純的GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元的泛-神經(jīng)元群，并作為分化的細胞產(chǎn)生及冷凍保存，其中關(guān)于神經(jīng)元細胞而言，細胞是至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %或至少96 %純。在本發(fā)明的實施方式的開發(fā)過程期間進行的實驗展示，細胞表達由全部BoNT血清型的BoNT中毒所必需的全部受體和底物。BoNT檢測測定展示，源于iPS的神經(jīng)元對于BoNT/A，B，C和E及中和抗體的定量檢測是高度敏感的。
[0038]在2007年11月，2個獨立小組首次顯示，人成纖維細胞可通過活化一小組沉默的基因來簡單地重編程為多能干細胞(Takahashi K, et al (2007) Celll31:861-872 ；Yu J, etal (2007) Science318:1917-1920)。這些細胞被稱為誘導的多能干細胞和可類似于細胞系維持及冷凍保存。此發(fā)現(xiàn)開啟了開發(fā)模擬全效、分化的人體細胞及不需要任何動物使用的巨大數(shù)的人iPS來源的細胞模型的機會。
[0039]在選擇用于在本文所述的系統(tǒng)和方法中使用的iPS細胞中，優(yōu)選的是，細胞可可靠地和可再現(xiàn)地產(chǎn)生及以對于該研究足夠的量產(chǎn)生分化的細胞的純?nèi)?。在一些實施方式中，該細胞可獲自 Cellular Dynamicslnc.(Madison, WI)。
[0040] 在本發(fā)明的實施方式的開發(fā)過程期間進行的實驗證實，源于人iPS的神經(jīng)元是對于肉毒神經(jīng)毒素，中和抗體和抑制物的檢測，及對于BoNT細胞進入及運輸研究高度敏感、選擇性和物種-特異性的細胞模型。這些神經(jīng)元對于BoNT效力確定以及對于抗體檢測，抑制物篩選，及研究應用適合取代MBA。
[0041]【1.細胞】
[0042]如本文所述，本發(fā)明的實施方式提供試劑諸如BoNT的檢測和分析中使用的多能來源的干細胞。在一些實施方式中，細胞是人(例如，人誘導的多能干細胞來源的細胞(hiPS)來源的神經(jīng)元細胞或人胚胎干細胞)。產(chǎn)生iPS細胞的方法描述于，例如，Yu等人，Science.2009May8 ；324(5928):797-801.Epub2009, W02011056971 和 W02011025852，各通過引用以其整體在本文合并。在一些實施方式中，使用適合的方法將iPS細胞分化為神經(jīng)元(例如，描述于美國專利申請US2010/0279403和US2010/0216181的那些，各通過引用以其整體在本文合并)。
[0043]在一些實施方式中，神經(jīng)元是GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元的98 %純泛-神經(jīng)元群，并作為分化的細胞產(chǎn)生及冷凍保存。在一些實施方式中，利用可商購的神經(jīng)兀來源的 iPS 細胞(例如，來自 Cellular Dynamics Inc.(Madison, WI)或 GlobalStem,(Rockville, MD)的那些)，盡管可利用其他來源的。在一些實施方式中，細胞是神經(jīng)元hiPS細胞。
[0044]在另一方面，細胞是神經(jīng)元是GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元的基本上純的泛-神經(jīng)元群，并作為分化的細胞產(chǎn)生及冷凍保存，其中細胞是相對于神經(jīng)元細胞至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少96%純。
[0045]本發(fā)明不限于本文所述的細胞?？衫昧硗獾募毎岛驮毎囵B(yǎng)物。例如，在一些實施方式中，利用膽堿能神經(jīng)元。
[0046]在一些實施方式中，適合的細胞系表達對于BoNT中毒必需或足夠的受體和底物。[0047]在一些實施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)和試劑盒，其包含本文所述的細胞系以及對于實施BoNT的檢測和分析必需、足夠或有用的組分。例如，在一些實施方式中，試劑盒包含細胞和細胞培養(yǎng)試劑(例如，板，緩沖劑，等)，測定試劑，對照(陽性和陰性BoNT和/或抑制物對照)和用于實施及分析測定的使用說明。
[0048]在本發(fā)明的一方面，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞通過由以上說到的過程產(chǎn)生的hiPS細胞分化和/或成熟為神經(jīng)元細胞可獲得或已獲得。該神經(jīng)元細胞分化,在一方面，可通過于約37°C及在約5% CO2下培養(yǎng)hiPS細胞來達到。在一方面，培養(yǎng)用培養(yǎng)基可為補充了 B27 及 glutamax 的 Neurobasal 培養(yǎng)基(Invitrogen, Inc., USA)。在仍另一方面，在聚-賴氨酸包被的板上培養(yǎng)細胞，在仍再一方面，板再包被基質(zhì)膠(BD Bioscience, USA)。在一方面，將96孔板用于培養(yǎng)，其中細胞以約40，000細胞/孔的密度生長。在一方面，使細胞接種約24小時。之后，一方面使細胞成熟約2~約28天，在一方面，約4~約14或，在一方面，約4~約7天。
[0049]在一方面，所述的hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞通過基本上描述于以下隨附實施例的分化和成熟過程獲得。
[0050]本發(fā)明的 實施方式也涉及由上述的分化和成熟過程獲得的hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞。
[0051]在一方面，該hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞特征在于存在以下標志物之一種或更多，在一方面全部:β 3-微管蛋白，NeuN, vGAT, vGLUT2, NSE神經(jīng)元-特異性烯醇酶)或Tbrl (T-結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子I)。對于β 3-微管蛋白或NeuN而言，見到本發(fā)明的hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)物中陽性細胞數(shù)是約99%。對于vGAT或VGLUT2而言，在一方面見到，培養(yǎng)物的至少部分細胞對于所述的標志物是陽性的。
[0052]在一方面，該hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞特征在于缺失以下標志物之一種或更多及，在一方面全部:GFAP，TH, NNE (非-神經(jīng)元烯醇酶)，Tbr2 (T-結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2)，或NoGo a, C。對于GFAP而言，見到hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)物中陽性細胞數(shù)顯著地低，而在一方面，約5%以下或甚至約1%以下，在一方面，對于余下標志物而言，見到它們，如果存在，以可檢測的量以下存在。
[0053]上述的標志物的存在或缺失或量可，在一方面，通過常規(guī)免疫學技術(shù)測定。例如，標志物可通過免疫組織學染色技術(shù)，細胞裂解物的蛋白印跡分析測定或，至于β 3-微管蛋白或NeuN由FACS分析測定。還描述了其他檢測技術(shù)(見，例如，US2012/0178083,US2008/0280301, Englund2005, J Neurosci25:247-251 ；Dupuis2002, Neurobiology ofDiseaseslO: 358-365 ;各通過引用在本文合并)。
[0054]在再一方面，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞特征在于以下電生理學性質(zhì)之至少一種及，在一方面全部:Na2+通道被河豚毒素(TTX)抑制，K+通道被四乙基銨抑制，L-型Ca2+通道被硝苯地平抑制，P/Q-型Ca2+通道被W-美洲蜘蛛毒素IVA抑制或N-型Ca2+通道被W-食魚螺毒素GVIA抑制。該電生理學性質(zhì)可由標準電生理學測量測試，包括，例如，在將細胞用相應抑制物處理之前及之后實施膜片鉗測量。
[0055]在另一方面，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞特征在于對BoNT及，在一方面，對BoNT/A的敏感度。而且，細胞，在一方面，也以劑量依賴性方式敏感于其他神經(jīng)毒性化合物及，尤其是，敏感于至少一種或全部以下化合物:星形孢菌素，ATP競爭性激酶抑制物，氯丙嗪或吩噻嗪。向上述的化合物的敏感度可在，例如，細胞活力測定中測定。
[0056]在一方面，關(guān)于神經(jīng)突生長物而言，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞也敏感于以下化合物之至少一種及，在一方面全部:抗霉素A，絲裂霉素C，MK571，PD98092或星形孢菌素。
[0057]而且，在一方面，關(guān)于線粒體膜電位損失而言，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞敏感于以下化合物之至少一種或，在一方面，全部:抗霉素A或纈氨霉素。
[0058][I1.測定和用途】
[0059]本發(fā)明的實施方式提供檢定BoNT的組合物和方法。測定被用于研究，臨床，診斷和治療性應用中。
[0060]在一些實施方式中，測定利用多能細胞(例如，hiPS來源的神經(jīng)元細胞)。使用人細胞提供物種-特 異性模型的優(yōu)勢。此外，與源于癌細胞系或修飾的細胞系的神經(jīng)元(其可不是體細胞神經(jīng)元的反映)相反，源于多能細胞的神經(jīng)元是正常，健康神經(jīng)元的代表。
[0061]在一些實施方式中，測定利用神經(jīng)元細胞例如，hiPS來源的神經(jīng)元細胞，以篩選BoNT的效力。在其他實施方式中，測定就BoNT的毒性進行篩選。在仍進一步實施方式中，測定法就BoNT的中和抗體的存在或性質(zhì)進行篩選或就活性篩選其他生物醫(yī)藥。在一些實施方式中，測定是定量的，而在其他實施方式中，它們是定性的。
[0062]在一些實施方式中，細胞首先培養(yǎng)在適合的基質(zhì)中。在一些實施方式中，培養(yǎng)細胞，以便獲得神經(jīng)元的成熟。相比既有測定中使用的細胞，在本發(fā)明的實施方式中使用的多能細胞提供更快速成熟的優(yōu)勢。在一些實施方式中，細胞接下來暴露于毒素(例如，BoNT)經(jīng)適合的時期。毒素暴露之后，通過使用適合的方法計算期望的參數(shù)(例如，EC50)。本文所述的測定適宜于檢測純化的BoNT和在復合物中(例如，與如見于天然環(huán)境及一些藥學制備物中的其他蛋白復合)的BoNT。本文所述的測定適宜于檢測任意數(shù)的BoNT血清型(例如，BoNT/A, B, C，D, E, F和其G)或變體或嵌合體。在一些實施方式中，BoNT被重組表達。在其他實施方式中，它們自細菌細胞純化。
[0063]在一些實施方式中，實施抗體保護測定，以測試中和抗體。盡管BoNT被有效用于就各種病情治療大量的患者(見Dhaked等人，Indian J Med Resl32:489_503的綜述)，一些會發(fā)展中和抗體，其會阻止進一步治療的成功。例如，在子宮頸張力失調(diào)的治療中估計，~5%的被治療的患者會發(fā)展會阻礙進一步治療的中和BoNT抗體(Kessler等人，(1999)J Neurol246:265~274)。目前，患者未被在它們的治療過程中，就中和抗體的發(fā)展進行監(jiān)測，因為高度敏感和定量測定不是可商購的(Sesardic等人，(2004)MovDisordl9Suppl8:S85_91)。使用iPS神經(jīng)元的本文呈現(xiàn)的測試平臺提供接收了 BoNT的重復的治療劑或化妝注射的患者血清中BoNT-中和抗體的敏感和定量檢測。中和抗體可在任意數(shù)的樣品類型中進行檢測(例如，純化的抗體，血清，抗毒素，等)。
[0064]在一些實施方式中，測試BoNT的小分子抑制物(例如，為研究或藥物篩選)。例如，在一些實施方式中，使細胞首先暴露于BoNT，然后暴露于抑制物，使細胞共暴露于二者，或使細胞首先暴露于抑制物，然后暴露于BoNT。
[0065]可利用任意數(shù)的適合的端點測量來檢定BoNT活性。例包括，但不限于，蛋白印跡，神經(jīng)遞質(zhì)釋放，ELISA(Nuss JE, et al (2010) J Biomol Screenl5:42_51)或細胞內(nèi)表達的報告子諸如，例如，F(xiàn)RET傳感器(Dong等人，(2004)Proc Natl Acad Sci U S AlOl:14701-14706)。[0066]在一些實施方式中，本文所述的測定可用于在BoNT或衍生物作為藥物產(chǎn)生期間測試質(zhì)量控制或在診斷評定，在臨床治療的優(yōu)化及施劑及治療性模式的選擇中用于研究用途。
[0067]本文所述的測定的另外的應用包括，但不限于，檢測抑制物和診斷，臨床，篩選及研究用途。
[0068]在一些實施方式中，本發(fā)明提供檢定肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)的活性的方法，包括:(a)使hiPS來源的神經(jīng)元細胞與包含BoNT的組合物接觸；及(b)檢定BoNT的生物學活性。
[0069]在所述的方法的一方面，檢定可包括測定BoNT的生物學活性的存在或缺失。該測定有時也在本文被稱為定性測定。需知，基于BoNT生物學活性的存在或缺失，可總結(jié)于在包含或懷疑包含所述有生物學活性的BoNT的組合物中有生物學活性的BoNT的存在或缺失。而且，在仍另一方面，檢定可包括測定在包含有生物學活性的BoNT的組合物中有生物學活性的BoNT的量。需知 ，有生物學活性的BoNT的量可源于就在組合物中所述的BoNT檢定的生物學活性的量。該測定可有時在本文也被稱為定量測定。
[0070]在本發(fā)明的方法的一方面，BoNT是選自梭菌神經(jīng)毒素的不同血清型組的神經(jīng)毒素，例如，選自，例如，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C I，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F 或 BoNT/G。而且，在一方面，在本發(fā)明的方法中可將破傷風毒素(TeNT)用作神經(jīng)毒素。
[0071]細菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)和破傷風梭菌(Clostridium tetani)分別天然地產(chǎn)生這些高度有力的神經(jīng)毒素，例如，肉毒毒素(BoNT)和破傷風毒素(TeNT)。這些神經(jīng)毒素特異性結(jié)合于神經(jīng)元細胞及破壞神經(jīng)遞質(zhì)釋放。各毒素作為大致150kDa的無活性單鏈蛋白合成。翻譯后處理涉及二硫橋形成，及被細菌蛋白酶的限制的蛋白水解(切割)。有活性的二鏈神經(jīng)毒素由2條鏈組成，由二硫鍵連接的大致50kDa的N-端輕鏈和大致IOOkDa的重鏈。神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)上由3個結(jié)構(gòu)域組成，例如，催化性輕鏈，包括轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(N-端一半)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C-端一半)的重鏈,見,例如，Krieglsteinl990, EurJ Biocheml88，39 ;Krieglsteinl991，Eur J Biochem202，41 ;Krieglsteinl994，J ProteinCheml3, 49。BoNT多肽和TeNT多肽的結(jié)構(gòu)已被描述于上述的參考文獻。
[0072]BoNT和TeNT的7種抗原性地不同的血清型是通過切割SNARE蛋白來阻斷突觸胞吐的Zn2+-內(nèi)切蛋白酶。神經(jīng)毒素導致見于肉毒中毒和破傷風病癥的弛緩性肌肉麻痹，見Fischer2007,Proc Natl.Acad.Sc1.USA104, 10447。
[0073]在仍另一方面，修飾的BoNT或TeNT的活性可在本發(fā)明的方法中檢定。該修飾的 BoNT 可源于上述的 BoNT/A，BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 或 BoNT/G 或通過向BoNT或TeNT的氨基酸序列導入至少一個取代，添加和/或缺失來源于TeNT。該修飾的BoNT或TeNT，由此，可具有與以上提及的任何一種BoNT或TeNT的氨基酸序列具有至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語〃同一”指稱通過測定2個氨基酸序列之間的同一氨基酸數(shù)來表征的序列同一性，其中序列被比對，從而獲得最高順序匹配。其可通過使用公開的以計算機程序編碼化的技術(shù)或方法計算諸如，例如，BLASTP 或 FASTA (Altschul 1990，J Mol Biol215, 403)。百分率同一性值，在一方面，在整個氨基酸序列上計算。為比較不同序列的基于各種算法的一系列程序是熟練的工人可利用的。在此情景中，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法給出特別可靠的結(jié)果。為了實施序列比對，可使用程序PileUp (Higginsl989，CAB10S5，151)或程序Gap和BestFit (Needlemanl970, J Mol Biol48 ；443 ；Smithl981, Adv Appl Math2, 482)，其是 GCG軟件包的部分(Genetics Computer Groupl991, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)。以上以百分率(％)敘述的序列同一性值，在本發(fā)明的另一方面，使用程序GAP，用以下設置，在整個序列區(qū)測定:空位權(quán)重:50，長度重量:3，平均匹配:10.000和平均錯配:
0.000，除非另外特別說明，其應總是被用作用于序列比對的標準設置。
[0074]在一方面，各上述的修飾的BoNT或TeNT多肽保留一個或更多及，在另一方面，全部相應未修飾的多肽的生物學性質(zhì)，即BoNT/A，BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F,BoNT/G或TeNT。本領(lǐng)域技術(shù)人員會同意，在蛋白水解活化之后全生物學活性維持，即使可想到，未加工的前體可發(fā)揮一些生物學功能或是部分有活性的。本文所用的"生物學性質(zhì)"指稱(a)受體結(jié)合，(b)內(nèi)化，(c)跨內(nèi)體膜轉(zhuǎn)位進胞質(zhì)溶膠，和/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白的內(nèi)源性蛋白分解性切割。用于評定生物學活性的體內(nèi)測定包括小鼠LD50測定和離體小鼠半隔膜測定,如描述于,例如，Dressier等人。(Dressler2005, Mov Disord20:1617-1619，Keller2006, Neurosciencel39:629-637)。生物學活性通常以小鼠單位(MU)表達。如本文所用，IMU是神經(jīng)毒性組分的量，其在腹膜內(nèi)注射之后殺滅50%的特定的小鼠群，即小鼠腹膜內(nèi)LD50。在再一方面，修飾的多肽可改善或改變生物學性質(zhì)，例如，它們可包含改善酶識別或可改善受體結(jié)合或上述任何其他性質(zhì)的切割位點。
[0075]在一方面，修飾的BoNT或TeNT可檢定由本文所述的以上方法提到的生物學活性之一種或更多及，在一方面，全部。
[0076]在本發(fā)明的一方面，修飾的BoNT或TeNT選自，例如，BoNT或BoNt/TeNT雜合體，再靶向的BoNT，再靶向的TeNT和嵌合BoNT或TeNT。描述了修飾的BoNT和TeNT。
[0077]在本發(fā)明的方法的一方面，接觸包括使至少2個不同組分物理接近，以允許所述組分的物理和/或化學相互作用。在上述的方法中，使hiPS來源的神經(jīng)元細胞與包含或懷疑包含有生物學活性的BoNT的組合物接觸。接觸在足以允許在組合物中包含的有生物學活性的BoNT對hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞發(fā)揮其生物學活性的時間及條件下實施。在一方面，由此，接觸應使(a)受體結(jié)合，(b)內(nèi)化，(c)跨內(nèi)體膜轉(zhuǎn)位進胞質(zhì)溶膠，和/或(d)突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白或模擬hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞中的所述過程的底物的內(nèi)源性蛋白分解性切割。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知哪種條件需應用于hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞的給定培養(yǎng)物。接觸可，在一方面，在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中實施，其中將hiPS細胞來源的神經(jīng)兀細胞，在孔板上，在適合的培養(yǎng)基中，及在適合的培養(yǎng)條件下，通過向培養(yǎng)基添加待由本文所述的方法檢定BoNT活性的組合物的樣品來培養(yǎng)。
[0078]在一方面,適合的培養(yǎng)條件包含在約37°C及在約5% CO2下培養(yǎng)。在一方面，培養(yǎng)用培養(yǎng)基是補充了 B27 及 glutamax 的 Neurobasal 培養(yǎng)基(Invitrogen, Inc., USA)。在仍另一方面，在聚-賴氨酸包被的板上培養(yǎng)hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞,在仍再一方面,利用再包被基質(zhì)膠(BD BiosciencejUSA)的板。在一方面，將96孔板用于培養(yǎng)，其中細胞以約10，000~約100，000細胞，在再一方面，約20，000~約60，000細胞和在仍一方面約40，000細胞/孔的密度生長。在 一方面，使細胞接種約24小時。在一方面，然后，使細胞成熟約2~約28天，在一方面，約4~約14或，在一方面，約4~約7天，之后實施接觸。[0079]在仍一方面，所述的接觸如描述于下文隨附實施例進行實施。
[0080]在本發(fā)明的方法的一方面，包含有生物學活性的BoNT的組合物是已知包含有生物學活性的BoNT的組合物或懷疑包含有生物學活性的BoNT的組合物。組合物可除了所述的有生物學活性的BoNT之外，還包含其他成分，諸如，例如，適合的溶劑和/或穩(wěn)定化劑諸如蛋白及，在一方面，80見'(撤70，撤17，撤33或見'順(他?))的復合蛋白，或其他蛋白穩(wěn)定劑。組合物也可進一步包含例如，通過增強在本文別處提及的BoNT的任何生物學活性來輔助BoNT的生物學活性的蛋白。在仍一方面，組合物可包含多于一種BoNT。
[0081]在一方面，組合物是肉毒或包含有生物學活性的BoNT的其他細菌細胞或非-細菌細胞的細胞裂解物。在一方面，該組合物也是自該細胞裂解物由部分純化獲得的BoNT制備物，例如粗提物，或BoNT的純化，例如，純化的BoNT制備物。在另一方面，組合物是包含混合的組分的人工組合物。在仍一方面，組合物是如在本文別處定義的待用作藥物組合物的制備物。
[0082]在本發(fā)明的方法的一方面，檢定BoNT的生物學活性通過測定突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白的內(nèi)源性蛋白分解性切割或，如果存在，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞中由有生物學活性的BoNT的其他底物切割來實施。
[0083]在一些實施方式中，突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白或其他基質(zhì)具有由待檢定的BoNT或TeNT識別的神經(jīng)毒素切割位點。本文所用的神經(jīng)毒素切割位點指稱由神經(jīng)毒素多肽的內(nèi)源性蛋白酶識別及切割的切割位點。描述了被神經(jīng)毒素蛋白酶識別的切割位點(見，例如，EP1926744B1 ;通過引用以其整體在本文合并)。原理上，神經(jīng)毒素切割位點可為基質(zhì)中天然地存在 的切割位點或是由神經(jīng)毒素多肽蛋白酶識別及切割的人工設計的切割位點。
[0084]由BoNT/A蛋白酶識別及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/A切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人SNAP25A或B或自下列物種的同源物，旁系同原物或其直系同原物:大鼠，小鼠，牛，擔尼魚屬(Danio),鯽屬(Carassius),爪蟾屬(Xenopus),電鰩屬(Torpedo),球海膽屬(Strongylocentrotus),槍烏賊屬(Loligo),椎實螺屬(Lymnaea)或雨虎屬(Aplysia)。源于所述蛋白的適合的切割位點公開于EP1926744B1。
[0085]由BoNT/B蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/B的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/細胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，雞VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，電鰩屬(Torpedo) VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus) VAMP,果妮屬(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo)VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia)VAMP或新小桿線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于所述蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。
[0086]由BoNT/Cl蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/Cl的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人和小鼠突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IBl，突觸融合蛋白2-1，突觸融合蛋白2-2，突觸融合蛋白2-3，突觸融合蛋白3A或突觸融合蛋白1B2，?；虼笫笸挥|融合蛋白1A，突觸融合蛋白IBl或突觸融合蛋白1B2，大鼠突觸融合蛋白2或大鼠突觸融合蛋白3，小鼠突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IBl，突觸融合蛋白1B2，突觸融合蛋白2，突觸融合蛋白3A，突觸融合蛋白3B或突觸融合蛋白3C，雞突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白2 ;爪蟾屬(Xenopus)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B，擔尼魚屬(Danio)突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IB或突觸融合蛋白3，電鰩屬(Torpedo)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B,球海膽屬(Strongylocentrotus)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B,果蠅屬(Drosophila)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B,水蛭屬(Hirudo)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B，槍烏賊屬(Loligo)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B，椎實螺屬(Lymnaea)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白IB或任何直系同原物，旁系同原物或其同源物。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。
[0087]由BoNT/D蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/D的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/細胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，雞VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，電鰩屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus) VAMP,果妮屬(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia)VAMP或新小桿線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。[0088]由BoNT/E蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/E的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是，該蛋白是人SNAP-25A或B或自下列物種的同源物，旁系同原物或其直系同原物:大鼠，小鼠，牛，擔尼魚屬(Danio)，鯽屬(Carassius)，爪蟾屬(Xenopus)，電耀屬(Torpedo)，球海膽屬(Strongylocentrotus)，槍烏賊屬(Loligo),椎實螺屬(Lymnaea)或雨虎屬(Aplysia)。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。
[0089]由BoNT/F蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/F的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/ 細胞短蛋白聚糖，牛 VAMP-2，大鼠 VAMP-2 或 VAMPUl VAMP-1，VAMP-2 或 VAMP-3，電耀屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus)VAMP,果妮屬(Drosophila)sybA, synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio) VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia) VAMP或新小桿線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。
[0090]由BoNT/G蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由BoNT/G的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/ 細胞短蛋白聚糖，牛 VAMP-2，大鼠 VAMP-2 或 VAMPUl VAMP-1，VAMP-2 或 VAMP-3，電耀屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus)VAMP,果妮屬(Drosophila)sybA, synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio) VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia) VAMP或新小桿線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。[0091]由TeNT蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的一方面，源于敏感于由TeNT的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/細胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，雞VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，電鰩屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus) VAMP,果妮屬(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia)VAMP或新小桿線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。
[0092] 由BoNT蛋白酶識別的及切割的神經(jīng)毒素切割位點，在本發(fā)明的另一方面，源于BoNT蛋白中發(fā)現(xiàn)的自動催化性切割位點。在一方面，待根據(jù)本發(fā)明使用及源于給定BoNT或TeNT的自動催化性切割位點的神經(jīng)毒素切割位點包含至少6，至少8，至少10或至少15 個連續(xù)殘基，其包括:BoNT/A 殘基 250Tyr-251Tyr，BoNT/B 殘基 256Phe_257Phe，BoNT/Cl 殘基 257Phe-258Tyr，BoNT/D 殘基 257Phe_258Phe，BoNT/E 殘基 239Pro_240Leu，BoNT/F 殘基 254Pro-255Leu，BoNT/G 殘基 256Phe_257Phe，TeNT 殘基 259Ile_260Tyr，BoNT/A 殘基 Phe266-Gly267，BoNT/B 殘基 Phe272_Gly273，BoNT/C I 殘基 Phe273_Gly274，BoNT/D 殘基 Phe273-Gly274，BoNT/E 殘基 Phe255_Gly256，BoNT/F 殘基 Phe270_Gly271，BoNT/G 殘基Phe272-Gly273或TeNT殘基Phe275_Gly276。源于蛋白的適合的切割位點公開于，例如，EP1926744B1。
[0093]在本發(fā)明的一方面，BoNT和TeNT的上述神經(jīng)毒素切割位點的切割可通過測定由上述的蛋白的切割獲得的一種或更多切割產(chǎn)物來檢定。源于蛋白的產(chǎn)物可由特異性結(jié)合所述的切割的產(chǎn)物，但不結(jié)合未切割的蛋白的抗體測定。該特異性結(jié)合抗體與產(chǎn)物的結(jié)合可通過在本文或在別處所述的技術(shù)測定。例如，特異性地結(jié)合的抗體可共價或非-共價連接于可檢測的標記物。該可檢測的標簽可為與特異性地結(jié)合的抗體共價連接的可檢測的部分或其可為檢測劑，諸如檢測抗體或特異性結(jié)合特異性地結(jié)合的抗體及允許，例如，經(jīng)與之共價連接的可檢測的部分檢測的適體。各種類型的該免疫測定可以此方式用于測定切割的產(chǎn)物及，由此，用于檢定BoNT或TeNT的生物學活性。
[0094]一方面，本文定義的具有神經(jīng)毒素切割位點的蛋白的切割可通過蛋白印跡測定。在另一方面，所述切割可通過ELISA，RIA或其他免疫學檢定形式，包括在本文別處提及的那些測定。
[0095]在另一方面，可使用人工底物，其包含上述神經(jīng)毒素切割位點，及在所述位點切割后，至少一種物理和/或化學性質(zhì)改變。例如，該一方面涉及的底物可包含能彼此物理學和/或化學相互作用，且被具有神經(jīng)毒素切割位點的接頭隔開的第I和第2部分。作為切割位點的切割的結(jié)果，2部分之間的上述的相互作用會改變。適合的部分是，例如，在未切割的狀態(tài)中呈現(xiàn)共振能量轉(zhuǎn)移的供體和受體熒光團，所述共振能量轉(zhuǎn)移在切割之后間斷?；蛘撸蓱脽晒鈭F和猝滅劑，其中猝滅劑的淬滅效應在切割之后逆轉(zhuǎn)。所述種類的底物描述于，例如下列文獻中的任何一個:EP1438586B1，EP2208067A1, EP1543329A2, EP1869459B1,EP2293064B1, EP1920248B1, EP2264458A1, EP2332959A2, W02011/47241, EP1901069B1,EP2293064B1, EP1807698B1或EP2107112B1 ;各通過引用以其整體在本文合并。
[0096]在本發(fā)明的方法的仍一個特定方面，檢定通過通過使用第I抗體及，在一方面，特異性結(jié)合所述切割的SNAP-25的單克隆抗體測定切割的SNAP-25的量來測定存在于hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞中的切割的SNAP-25的量來實施。而且，存在于細胞中的總SNAP-25，例如，切割的及未切割的SNAP-25，由第2抗體及，在一方面，結(jié)合所述總SNAP-25的多克隆抗體測定。在一方面，結(jié)合的第I抗體的量和結(jié)合的第2抗體的量可通過檢測劑，在一方面，由一種或更多允許區(qū)別結(jié)合的第I抗體的量和結(jié)合的第2抗體的量的檢測抗體來測定。例如，可使用偶聯(lián)于第I標記物及結(jié)合于第I抗體的第I檢測抗體和偶聯(lián)于第2標記物及結(jié)合于第2結(jié)合的抗體的第2檢測抗體。結(jié)合的第I抗體及結(jié)合的第2抗體的量及，由此，切割的及總SNAP-25的量可隨后源于測定的第I和第2標記物的量。在一方面，在本文涉及的第I標記物可為酶諸如辣根過氧化物酶。在另一方面，在本文涉及的第2標記物可為酶諸如堿性磷酸酶。標記物可用于催化非-熒光底物向熒光產(chǎn)物的可檢測的轉(zhuǎn)變。
[0097]在本發(fā)明的方法的仍另一方面，檢定通過測定神經(jīng)遞質(zhì)釋放進，例如，培養(yǎng)基來實施。釋放的或非-釋放的神經(jīng)遞質(zhì)的量可通過在本文或在別處所述的技術(shù)測定。
[0098]有利地，由本發(fā)明涵蓋的方法基于非-動物資源，例如，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞，及，因此，避免動物測試。然而，hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞允許測試需要的BoNT的全部生物學活性，例如，(a)受體結(jié)合，(b)內(nèi)化，(C)跨內(nèi)體膜轉(zhuǎn)位進胞質(zhì)溶膠，和/或(d)突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白的內(nèi)源性蛋白分解性切割。因此，方法可用于安全性或質(zhì)量控制措施以及具有修飾的生物學性質(zhì)的BoNT的開發(fā)(通常需要，例如，大規(guī)模篩選方法)。
[0099]本發(fā)明也涉及測定包含有生物學活性的BoNT的制備物中有生物學活性的BoNT的量的方法，包括 下列步驟:(a)使hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞與所述的制備物的樣品接觸；及(b)通過檢定樣品的BoNT的生物學活性來測定存在于制備物中的有生物學活性的BoNT的量。
[0100]本發(fā)明也涉及hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞用于檢定組合物中BoNT活性的用途，如在本文別處特別說明。
[0101]在一方面，檢定包括測定BoNT活性和/或有生物學活性的BoNT的存在或缺失。用于有生物學活性的BoNT的定性測定可用于，例如，旨在風險評定的應用，以便防止由BoNT導致的任何傷害，例如，作為在BoNT的生產(chǎn)過程期間或在藥物或化妝品應用期間的安全性控制措施或用于防止基于BoNT的犯罪行為，諸如生物恐怖主義。
[0102]在另一方面，檢定包括測定BoNT活性和/或有生物學活性的BoNT的量。有生物學活性的BoNT的定量測定可在BoNT制備或調(diào)整用于化妝品或藥物應用的有生物學活性的BoNT的適當?shù)膭┝康倪^程期間使用。由此，該測定也可作為適當?shù)乃幬锘蚧瘖y產(chǎn)品的質(zhì)量控制或制劑的手段有用。
[0103]本發(fā)明也涉及hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞用于測定包含所述有生物學活性的BoNT的制備物中有生物學活性的BoNT的量的用途，如在本文別處特別說明。
[0104]本說明書以上引用的參考文獻通過引用以它們的整個公開內(nèi)容和此說明書中特別提及的公開內(nèi)容并入本文。
[0105]【實驗】
[0106]提供下列實施例，以便展示及進一步例證本發(fā)明的特定優(yōu)選的實施方式和方面，且不被解釋為限制其范圍。
[0107]【實施例】[0108]【實施例1】
[0109]【Α.方法】
[0110]神經(jīng)元細胞:由Cellular Dynamics Inc.(Madison, WI)供給冷凍的人iPS來源的神經(jīng)元。將神經(jīng)元根據(jù)Cellular Dynamics的使用說明解凍，及由錐蟲藍排除測定進行活細胞計數(shù)。除非另外指示，將細胞以40，000細胞/孔的密度接種于包被了 0.01 %聚-L-鳥氨酸(SIGMA)和 8.3 μ g/cm2 基質(zhì)膠(BD Biosciences)的 96-孔皿(TPP, MidSci)，并在神經(jīng)元培養(yǎng)基(補充B27及glutamax的Neurobasal,全部來自Invitrogen并由0)1供給)于37 C ,5% CO2中溫育指定的成熟時間。在接種之后24h,完全更換培養(yǎng)基，然后每2~3天更換一半的培養(yǎng)基。
[0111]原代大鼠脊髓(RSC)細胞如之前描述(Pellett等人，2007和2010)制備，并以75，000細胞/孔的密度接種于 基質(zhì)膠-包被的96-孔板。
[0112]肉毒桿菌神經(jīng)毒素:從之前描述的肉毒梭菌(C.botulinum)株Hall A hyper,OkraB, Brazil C 和 Beluga E 制備純?nèi)舛旧窠?jīng)毒素(BoNT)A, B, C 和 E(150kDa)和 BoNT/A 復合物(Malizio et al., (2000)Methods Mol Biol 145:27-39 ；Prabakaran et al., (2001)Toxicon39:1515-1531)，其中由Malizio等人(2000)的方法，用在硫酸銨沉淀之前向培養(yǎng)物添加0.2mg/ml的酵母RNA(SIGMA)的另外的步驟實施BoNT/C純化。將毒素溶于磷酸鹽緩沖液，PH7.4和40%甘油，并存儲于_20°C直到使用。通過小鼠生物測定(HathewayCL(1988), supra ；Schantz EJ&Kautter DA(1978)J Assoc Off Anal Chem61:96-99)測定BoNT/A, /B, /C, /E和BoNT/A-復合制備物的活性，及比毒性是7 X IO7小鼠LD50單位/mg (BoNT/AI)，7.7X107LD50 單位 /mg (BoNT/AI 復合物)，I X IO8LD50 單位 /mg (BoNT/B)，1.1 X IO7LD50 單位 /mg (BoNT/C)，及 7.6 X IO7LD50 單位 /mg (BoNT/E)。
[0113]神經(jīng)元毒性測定:除非另外說明，對于全部神經(jīng)元毒性測定，在50 μ I的神經(jīng)元培養(yǎng)基中使iPS神經(jīng)元暴露于BoNT的系列稀釋。如在結(jié)果中所示，在一些測定中將原代大鼠脊髓細胞用作對照細胞。以最少三個重復測試全部樣品，且總是包括無毒素的陰性對照。在特定的曝露時間之后，移出毒素溶液，并使細胞在50 μ I的IXLDS樣品緩沖劑(Invitrogen)中裂解。就SNAP-25，或VAMP2切割，由蛋白印跡分析細胞裂解物，如之前描述(Pellett等人，(2007)，見上；Pellett等人，(2010)，見上)。由光密度測定法，使用Foto/Analyst FX系統(tǒng)和TotalLab Quant軟件(Fotodyne)定量切割的及未切割的條帶。制備數(shù)據(jù)標繪圖及通過使用PRISM軟件導出EC5tl。
[0114]基質(zhì)選擇:為了選擇最佳表面基質(zhì)，將神經(jīng)元接種于7個不同基質(zhì)?；|(zhì)由下列組成:包被了 1.0 μ g/cm2層粘連蛋白(PDL層粘連蛋白)或8.3 μ g/cm2基質(zhì)膠(PDL基質(zhì)膠)的聚-D-賴氨酸包被的板(BD bioscience)，包被了 0.01 %聚-L-鳥氨酸之后包被了 1.0 μ g/cm2層粘連蛋白(PL0層粘連蛋白)或8.3 μ g/cm2基質(zhì)膠(PL0基質(zhì)膠)的板，自BD Biosciences購買的PLO-層粘連蛋白包被的板(PL0-層粘連蛋白(BD))，來自BDBiosciences 的 PDL 包被的板(PDL (BD))，或 0.01 % PLO 包被的板(PLO(CDI))。使神經(jīng)元成熟14天，并通過使神經(jīng)元暴露于毒素的系列稀釋48h來測定對BoNT/A的敏感性。使一些神經(jīng)元維持6周，并如上再次測試。
[0115]受體表達分析:為受體表達分析，將iPS神經(jīng)元以0.75ml的體積，以210，000細胞/孔的密度平鋪在24-孔板上。在75μ IlXLDS樣品緩沖劑(Invitrogen)中平鋪之后4，7，10，14和21天分別自3孔收獲細胞。細胞裂解物由用于SV2A，B和C同種型，突觸結(jié)合蛋白I和II，SNAP-25, VAMP的表達的蛋白印跡進行分析，其中使用識別VAMP2的抗體或識別VAMP1，2和3同種型，及突觸融合蛋白的抗體。將β-肌動蛋白用作裝載對照，及將原代大鼠脊髓細胞用作陽性對照。SV2C抗體(Janz R&Sudhof TC(1999)Neuroscience94:1279-1290)由Roger Janz慷慨地提供。全部其他抗體來自Synaptic Systems (哥廷根，德國)。全部抗體識別人蛋白。
[0116]為了由實時qPCR進行mRNA分析，使iPS神經(jīng)元的3個獨立培養(yǎng)物分別維持指示的時間。使細胞在板上直接裂解，并通過使用RNeasy Mini試劑盒和RNA酶-游離的DNA酶套件(Qiagen，Valencia, CA)純化RNA。為了陽性對照，購買人成年總腦 RNA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)。對于全部樣品，通過使用SuperScript VILO cDNA 合成試劑盒(Life Technologies, Carlsbad, CA)產(chǎn)生 cDNA。在
Light Cycler? 480II (Roche, Basel, Switzerland)上，使用 Taq Mail? Gene 表達
Master Mix和以下TaqMan人Gene表達測定來實施實時qPCR擴增:SNAP25 (Hs00938962_ml) ；STX1A (Hs00270282_ml) ；STXIB(HsO 1041 3 I5_ml) ；VAMPl(Hs0024991 1_ml) ；VAMP2 (Hs00360269_ml) ；VAMP3(Hs00922166_ml) ；SV2A(Hs00372069_ml)；SV2B(Hs00208178_ml) ；SV2C(Hs00392676_ml) ；SYT1(Hs00194572_ml) ；SYT2(Hs00980604_ml)和人GAPDH內(nèi)源性對照引物組(全部自Life Technologies)。對全部樣品實施AbsQuant/第2衍生分析，并經(jīng)標準化為內(nèi)源性GAPDH表達的Cp來將Cp值轉(zhuǎn)化為相對倍數(shù)變化。在3個生物學重復內(nèi)，為各基因計算平均值和標準偏差。為各基因?qū)嵤┘夹g(shù)性四重PCR反應。
[0117]活性-依賴性BoNT/Al攝取測定:將BoNT/Al稀釋至55或275U/50 μ I的細胞-刺激(含有 2.2mM CaCl 和 5 6mM KCl,補充 B27 及 glutamax 的 Invitrogen 自定義 Neurobasal培養(yǎng)基)或神經(jīng)元培養(yǎng)基的濃度，并添加到成熟4天的⑶I iPS神經(jīng)元和RSC細胞。將細胞與毒素溫育分別1，5，10和15min。關(guān)于陰性對照，將無毒素的相應培養(yǎng)基加入細胞。移出毒素，并將細胞立即用200 μ I的神經(jīng)元培養(yǎng)基洗滌兩次，隨后在200 μ I的新鮮神經(jīng)元培養(yǎng)基中溫育24h。以一式四份樣品收集。
[0118]為了確定用于5min之內(nèi)BoNT/Al的活性-依賴性攝取的最小需要的毒素濃度，將毒素稀釋至1.72~55U之間/50 μ I的細胞-刺激培養(yǎng)基的濃度。使4天成熟的iPS神經(jīng)元暴露于毒素稀釋5min，之后移出毒素，并用神經(jīng)元培養(yǎng)基2次洗滌，和在神經(jīng)元培養(yǎng)基中溫育24h。以一式四份測試全部稀釋。
[0119]抗體-保護分析:ΒοΝΤ/Α1特異性抗體根據(jù)Johnson等人，1993制備。通過使用2種不同方法分析iPS神經(jīng)元中的BoNT/Al活性被中和抗體的抑制。為第I測定，將55U的BoNT/A I與連續(xù)稀釋的抗體在細胞-刺激培養(yǎng)基中組合，并于37°C溫育lh，以使抗體-毒素相互作用。使成熟4天的iPS神經(jīng)元暴露于毒素-抗體混合物5分鐘,之后移出毒素-抗體混合物，并用神經(jīng)元培養(yǎng)基進行2次洗滌步驟，并在神經(jīng)元培養(yǎng)基中溫育24h。為第2測定，將1.5U的BoNT/A與抗體的系列稀釋在神經(jīng)元培養(yǎng)基中組合，并于37°C溫育lh。使iPS神經(jīng)元暴露于毒素-抗體混合物24h。與小鼠生物測定的比較使用與5~10U的BoNT/Al，在環(huán)境溫度，在167 μ L的體積中預溫育1.5h的抗體的系列稀釋。將體積調(diào)整至500 μ 1，并每稀釋注射進4只小鼠。[0120]【B.結(jié)果】
[0121]iPS神經(jīng)元表達對于BoNT中毒重要的受體:為了測定是否人iPS來源的神經(jīng)元可用于檢測BoNT活性，分別由蛋白印跡和定量PCR(qPCR)分析對于BoNT細胞進入和催化性活性必需的受體和酶促靶的表達(圖1)。蛋白印跡導致SV2A，SV2B (模糊條帶)，突觸結(jié)合蛋白1，突觸融合蛋白，SNAP-25，VAMP2和β -肌動蛋白的信號，其在細胞平鋪之后21天的時期未變化(圖1Α)。盡管VAMP2用VAMP2特異性抗體檢測，識別全部3種VAMP同種型的抗體導致無信號，表明VAMP2在iPS神經(jīng)元中是主要VAMP同種型。將原代大鼠脊髓細胞裂解物用作用于抗體檢測的陽性對照，且iPS神經(jīng)元對比RSC細胞的條帶中的不同強度可由于由抗體的差異識別或由于不同表達水平。由qPCR的相同的蛋白的mRNA水平的分析指示分析的全部蛋白的表達(圖2B)包括SV2B和C同種型，突觸結(jié)合蛋白2，及VAMPl和3，這些未由蛋白印跡檢測到。但是，那些同種型的mRNA水平至少200倍少于由蛋白印跡檢測的同種型的那些(SV2A，突觸結(jié)合蛋白1，及VAMP2)。由此，qPCR數(shù)據(jù)確證蛋白印跡數(shù)據(jù)，并指示，iPS神經(jīng)元主要表達SV2A，突觸結(jié)合蛋白I和這些蛋白的VAMP2同種型，這與代表前腦神經(jīng)兀的神經(jīng)兀一致(Janz R&Sudhof TC(1999)Neuroscience94:1279-1290)。全部蛋白的表達水平貫穿研究時期未變化，表明細胞在平鋪之后4天完全成熟，并保持穩(wěn)定至少21天。
[0122]表面基質(zhì)不影響用于BoNT/Al測定的細胞的質(zhì)量:為了測定是否平鋪基質(zhì)影響對BoNT的敏感度，就BoNT/Al敏感度測試將神經(jīng)元平鋪在7個不同基質(zhì)上。神經(jīng)元附接于全部基質(zhì)及在全部基質(zhì)上成熟，形成軸突及樹突的增加的網(wǎng)絡。在有或無層粘連蛋白或基質(zhì)膠的板上生長的細胞之間觀察到顯著形態(tài)學差異。在H)L(BD Biosciences)層粘連蛋白或基質(zhì)膠板上或在PLO(Cellular Dynamics)層粘連蛋白或基質(zhì)膠板上生長的細胞通常以單層生長，但主要沿板的周界形成具有自它們延伸的長軸突的一些聚集物。相反，在PLO或PDL板上生長的細胞保持在具有在細胞網(wǎng)絡之間延伸的軸突及樹突的細胞的單個單層。在PLO層粘連蛋白(BD Biosciences)上生長的細胞類似于在PLO或PDL板上生長的細胞。
[0123]在14天的成熟之后，使神經(jīng)元暴露于BoNT/A的系列稀釋，及細胞裂解物的蛋白印跡分析指示，對于全部測試的底物，SNAP-25切割幾乎相同(圖2)。檢測限是0.05小鼠LD5tl單位，及在1.75和3.5U之間切割完全。EC50S為0.21~0.31。
[0124]這些數(shù)據(jù)指示，細胞可平鋪在用于此測定的任何測試的表面基質(zhì)上。全部以下實驗在PLO-基質(zhì)膠包被的板上實施。為了減少細胞聚集，使用TPP板(MidSci)，其具有更平的表面區(qū)域。此完全消除了孔周界周圍的聚集。
[0125]4~14天的細胞成熟時間提供優(yōu)良和敏感的BoNT/Al測試平臺:為了測定是否細胞成熟時間影響iPS神經(jīng)元的BoNT敏感度，就BoNT/Al敏感度，在平行平鋪之后4和7天，使用相同的毒素稀釋分析細胞。也平行測試原代大鼠脊髓細胞(RSC細胞)，以比較iPS神經(jīng)元與RSC細胞(目前就BoNT檢測描述的最敏感細胞)的敏感度(Pellet etal., 2007, supra ；Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods)。得到的數(shù)據(jù)一貫地顯示成熟4或7天的細 胞的敏感度上無統(tǒng)計學地顯著差異，EC50是~0.3U(圖3)。此近似于以上對第14天細胞(圖2)及對RSC細胞觀察到的EC5(i。iPS神經(jīng)元的劑量-應答曲線相比RSC細胞顯著地更陡，及以1.75U達到100%切割，而在RSC細胞中以使用的毒素濃度未達到100%切割。此可能是由于iPS神經(jīng)元的高純度。由此，成熟4~14天的細胞提供用于BoNT/Al檢測和定量的可再現(xiàn)和高度敏感的基于細胞的模型。此外，4個不同iPS細胞批的測試指示在BoNT/Al敏感度上無主要差異。
[0126]iPS神經(jīng)元的敏感度隨更長曝露時間而增加:通過使細胞暴露于系列BoNT/Al稀釋及在毒素添加之后6，16，24和48h收獲樣品來檢查iPS神經(jīng)元中BoNT檢測的時間依賴性。得到的數(shù)據(jù)一貫地指示，48h暴露產(chǎn)生最高敏感度，相比24h測定~3-倍數(shù)增加和相比16h測定~6-倍數(shù)增加(圖4)。6h毒素暴露導致敏感度~130倍減小，約40單位的EC5(I。
[0127]iPS神經(jīng)元相比RSC細胞具有更快的BoNT/Al攝取速度:通過使iPS神經(jīng)元和RSC細胞平行暴露于82U的BoNT/Al及評定在2，4，6，8和IOh的SNAP-25切割來檢查BoNT/Al到iPS神經(jīng)元(相比RSC細胞)的攝取速度。將2種不同培養(yǎng)基用于區(qū)分活性-依賴性和活性-獨立性毒素攝取，由于神經(jīng)元活性已被報道導致BoNT的更快的攝取(Keller等人，(2004)，見上)。第I培養(yǎng)基是神經(jīng)元培養(yǎng)基(NM)，及第2培養(yǎng)基是細胞-刺激培養(yǎng)基(CSM)，其是用以化學刺激神經(jīng)元細胞活性的含有56mM KCl和2.2mM CaCl2的神經(jīng)元培養(yǎng)基的修飾的版本。
[0128]iPS神經(jīng)元相比RSC細胞導致顯著地更早和更完全的SNAP-25切割。在iPS神經(jīng)元中，在8h達到100%的SNAP-25切割，和在~4h達到50% SNAP-25切割(圖5)。相反，RSC細胞在IOh之后達到僅~70~80% SNAP-25切割，及在6h觀察到~50%的SNAP-25切割。對于任一 細胞類型，在神經(jīng)元和細胞-刺激培養(yǎng)基之間未觀察到差異，指示在時間范圍內(nèi)測試的神經(jīng)元活性不影響B(tài)oNT攝取入細胞。這些數(shù)據(jù)指示，iPS神經(jīng)元相比RSC細胞顯著地更敏感于BoNT/A，且以更快的速度攝取毒素，盡管此測定不區(qū)分SNAP-25的更快的毒素攝取和更快的切割。
[0129]在活性-依賴性測定中，iPS神經(jīng)元攝取BoNT/Al相比RSC細胞顯著地更快:為了進一步檢查是否iPS神經(jīng)元以活性-依賴性樣式攝取BoNT，使4天成熟的iPS神經(jīng)元和RSC細胞在細胞-刺激培養(yǎng)基中分別暴露于55和275U的BoNT/Al。使細胞暴露于毒素1，5，10或15min,之后是完全毒素移出和在神經(jīng)元培養(yǎng)基中溫育24h,以使進行SNAP-25切割。在暴露于55U的BoNT/Al之后早至lmin，在iPS神經(jīng)元中觀察到顯著SNAP-25切割(圖6A)。在5min之后，約75%的SNAP-25被切割，且隨著更久毒素暴露無顯著變化，指示5分鐘之內(nèi)完成的攝取。暴露于275U在測試的全部曝露時間導致完全SNAP-25切割(圖6A)。相反，RSC細胞暴露于55單位的BoNT/Al在達15min曝露時間之后未導致顯著SNAP-25切割，且在暴露于275U至少IOmin后僅約30~40%的SNAP-25被切割(圖6A)。此指示iPS神經(jīng)元以活性-依賴性樣式攝取BoNT/Al，且指示相比在RSC細胞中，此攝取顯著地更有效和更快發(fā)生。
[0130]為了確認iPS神經(jīng)元中的快速攝取是活性-依賴性的，使神經(jīng)元在細胞-刺激培養(yǎng)基或神經(jīng)元培養(yǎng)基中暴露于55U的BoNT/A經(jīng)1，5或lOmin。在用細胞-刺激培養(yǎng)基處理的細胞中有顯著地更多的SNAP-25切割，在Imin之后觀察到50%的SNAP-25的切割和在5min后觀察到70%切割(圖6B)。相反，在神經(jīng)元培養(yǎng)基中，在10分鐘后僅約20%的SNAP-25被切割(圖6B)。此指示BoNT/Al快速攝取進iPS神經(jīng)元是活性-依賴性的。
[0131]為了測定由iPS神經(jīng)元的活性-依賴性BoNT/Al攝取的濃度依賴性，使細胞在細胞-刺激培養(yǎng)基中暴露于1.7~55U的BoNT/Al經(jīng)5min。在毒素移出之后，將細胞溫育24h，以使SNAP-25切割發(fā)生。隨增加毒素濃度觀察到SNAP-25切割的濃度依賴性增加，以約30U發(fā)生50% SNAP-25切割(圖6C)。
[0132] BoNT/A I特異性抗體保護iPS神經(jīng)元免于被BoNT/Al進行SNAP-25切割:由抗體保護測定使用2種不同檢定形式確認iPS BoNT測定的特異性。在第I測定中，使細胞暴露于毒素抗體混合物經(jīng)24h，使用達到幾乎完全SNAP-25切割所需要的最小量的毒素(1.5單位)。在第2測定中，使細胞在細胞-刺激培養(yǎng)基中暴露于55U BoNT/A和連續(xù)稀釋的抗體的混合物5min，之后是毒素移出和溫育24h。第I測定在抗體檢測中產(chǎn)生了顯著地更高敏感度。神經(jīng)元用少至0.0025 μ I的抗體完全被保護免于SNAP-25的切割。降至0.000625 μ I的抗體還觀察到顯著的部分保護(圖7Α)。當使用0.5U的BoNT/Al和48h暴露，在RSC細胞中測試抗體時，之前觀察到相同的保護模式。由小鼠生物測定測試相同的抗體稀釋指示相比小鼠生物測定，基于細胞的測定的至少~10倍更大敏感度，如之前數(shù)據(jù)也顯示。+RSC測定已顯示相比小鼠生物測定，在中和抗體檢測中更敏感(Pellett，S.2007，見上)。第2 (活性-依賴性)測定是約10倍欠敏感，為全保護每50 μ I需要0.016 μ I的抗體，及用
0.004 μ I觀察到部分保護(圖7Β)。
[0133]此確認此測定的特異性，且指示iPS神經(jīng)元提供用于中和抗體檢測的優(yōu)良的和高度敏感的測定，且指示用更少毒素更久暴露相比需要更多毒素但較短曝露時間的活性-依賴性測定更敏感?；钚?依賴性測定對于一些目的有用，諸如可具有細胞毒性的或需要溶于可經(jīng)時傷害神經(jīng)元的溶劑的化合物或抗毒素的篩選。
[0134]在其天然的復合物中的BoNT/Al毒素的檢測相比純化的毒素的檢測更敏感:在梭菌中作為與幾種其他蛋白(非毒性非血細胞凝集素蛋白(NTNH)和在BoNT/A的情況中是血細胞凝集素(HA))的復合物表達 BoNT(Johnson EA&Bradshaw M(2001)Toxicon39:1703-1722的綜述)。非-毒性復合蛋白被認為保護毒素免于消化道的降解pH (Oguma etal., (2000)Microbial Foodborne Diseases:Mechanisms of Pathogenesis and Toxin
Synthesis273-293)。BoNT/A 的最通常使用的醫(yī)療制備物(BOTOX?和 Dysportd)制備)由整個毒素復合物組成，盡管FDA現(xiàn)在已批準含有僅純化的BoNT的較新制劑(Xeomin?制備)。為了測定是否在其天然的復合物中的BoNT/Al被檢測為具有與iPS神經(jīng)元中純BoNT/Al等同靈敏度，使細胞平行暴露于等同量的BoNT/Al復合物或純化的BoNT/A 10復合物由約24% BoNT/A I和76%其他非毒性關(guān)聯(lián)的蛋白組成，如由光密度測定法測定(圖8A)。純化的BoNT/Al制備物和BoNT/Al復合物具有近似比活性(7X 107U/mg和7.3X107U/mg)。在直接比較中，復合物的組分中需要顯著地少的毒素，以達到全SNAP-25切割(圖SB)。此發(fā)現(xiàn)指示，在此測定中，復合物的非-毒性蛋白增加BoNT/lA活性，這可能是由于神經(jīng)元培養(yǎng)基中的保護性效應。
[0135]iPS神經(jīng)元是用于BoNT血清型B，C和E的檢測的高度敏感的細胞模型=BoNT受體分析指示，iPS神經(jīng)元表達SNARE蛋白和全部BoNT血清型的細胞進入所需要的受體(圖1)。BoNT/A 及 /E 切割 SNAP-25，BoNT/B 切割 VAMP，及 BoNT/C 切割 SNAP-25 和突觸融合蛋白(Humeau等人，(2000)Biochimie82:427~446)。為了測試神經(jīng)元對不同血清型的敏感度，將BoNT/B，C或E的系列稀釋平行加入iPS神經(jīng)元或RSC細胞經(jīng)48h，并為它們的相應神經(jīng)元底物的切割而經(jīng)蛋白印跡檢定細胞裂解物。iPS神經(jīng)元以相比RSC細胞等同或更大敏感度一貫地檢測到全部BoNT血清型(圖9)。iPS神經(jīng)元和RSC細胞的EC5tl值是，對于BoNT/B 是 15.7IU 和 29.22U (圖 9A)，對于 BoNT/C 是 0.4U 和 0.36U (圖 9B)，及在 iPS 神經(jīng)元中BoNT/E是1.79U(圖9C)。RSC細胞中BoNT/E的EC5tl值無法用PRISM軟件推導，但估計近似于iPS神經(jīng)元的EC5tl值(圖9C)。[0136]以上說明書中提及的全部出版物，專利，專利申請和登錄號通過引用以它們的整體在本文合并。盡管本發(fā)明已關(guān)聯(lián)特定實施方式描述，但應明白，要求保護的發(fā)明應不過度地被限制于該特定實施方式。事實上，本發(fā)明的描述的組合物和方法的各種修飾和變異對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會是顯而易見的，及旨在落入以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.檢定肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)活性的方法,包括:(a)使人誘導的多能干細胞(hiPS)來源的神經(jīng)元細胞與包含BoNT的組合物接觸；以及 (b)檢定所述BoNT的生物學活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述BoNT具有選自下列的血清型:A，B,C，E及所述BoNT的修飾的變體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物學活性選自:SNAP-25的切割，VAMP2的切割和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定是定性測定。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定是定量測定。
6.權(quán)利要求1的方法,其中所述BoNT經(jīng)純化。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述BoNT在復合物中。
8.權(quán)利要求1的方法，還包括在接觸所述hPS來源的神經(jīng)元細胞之前,使所述BoNT與測試化合物接觸的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述測試化合物是抗體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體是中和抗體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述中和抗體在選自下列的樣品中:純化的抗體，血清和抗毒素。
12.檢定肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經(jīng)毒素(BoNT)活性的方法,包括: (a)使人誘導的多能干(hiPS)細胞來源的神經(jīng)元細胞與包含(i)BoNT及(ii)中和抗體的組合物接觸；以及 (b)檢定所述BoNT的生物學活性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述BoNT具有選自下列的血清型:A，B，C，E及所述BoNT的修飾的變體。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述生物學活性選自:SNAP-25的切割，VAMP2的切割和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述測定是定性測定。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述測定是定量測定。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述BoNT經(jīng)純化。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述BoNT在復合物中。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述中和抗體在選自下列的樣品中:純化的抗體，血清和抗毒素。
20.測定包含有生物學活性的BoNT的制備物中有生物學活性的BoNT的量的方法，所述方法包括下列步驟:(a)使hiPS細胞來源的神經(jīng)元細胞與包含有生物學活性的BoNT的制備物的樣品接觸；以及 (b)通過檢定所述樣品的BoNT的生物學活性來測定存在于制備物中的有生物學活性的BoNT的量。
21.人誘導的多能干(hiPS)細胞來源的神經(jīng)元細胞用于檢定BoNT的活性的用途。
【文檔編號】C12Q1/02GK103958747SQ201280053513
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】E·A·約翰遜, S·佩萊特, W·H·特普, R·C·M·懷特瑪詩 申請人:塞爾斯納普有限責任公司