制造生物聚合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制造生物聚合物的方法，包括以下工序：提供培養(yǎng)基，包括一碳源、一氮源及復(fù)數(shù)礦源；將真菌接種于所述培養(yǎng)基，接種量體積百分比是0.2-10％；培養(yǎng)所述培養(yǎng)基；過濾所述培養(yǎng)基，從而分離所述真菌與所述培養(yǎng)基；以及凈化所述生物聚合物；其中所述碳源對所述氮源的摩爾比率是5:1，所述培養(yǎng)基的酸堿值是pH5-9，溫度是25-45℃，接種量體積百分比是0.2-2％，搖床轉(zhuǎn)速是50-200轉(zhuǎn)數(shù)/分，培養(yǎng)時(shí)間是12-60小時(shí)。所制得的生物聚合物分子量是2.466x104-2.68x104道爾頓，具有復(fù)數(shù)官能團(tuán)、復(fù)數(shù)化學(xué)元素、糖、蛋白質(zhì)，最低絮凝效率90％，酸堿值是pH3-7，溫度是10-10℃。
【專利說明】制造生物聚合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及于制造生物聚合物的方法，特別是涉及黃曲霉培養(yǎng)，以制造如生物絮凝劑、生物助凝劑等的生物聚合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)水體由于大量的有害物質(zhì)，如微生物、膠體及毒性物質(zhì)入侵而產(chǎn)生不利影響，從而發(fā)生水污染。危險(xiǎn)的化學(xué)品處理不當(dāng)而排至下水道將導(dǎo)致毒性物質(zhì)進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，于是污染水供給，而危害水生生物。凝結(jié)及絮凝的工序是常見移除水中膠體或懸浮物質(zhì)的手法。如眾所周知，膠體是帶有負(fù)離子(約_30mV)，因此一般會(huì)采用正離子合成聚合物以中和膠體電荷，促使凝聚物沉淀。這些聚合物非常的昂貴，會(huì)污染環(huán)境，并且處理時(shí)必須遵守安全預(yù)防措施。為克服這些存在的問題，替代且適合的方案是采用的通過菌株從活性污泥制造的微生物絮凝劑或生物絮凝劑。
[0003]美國專利公開案2002/0074295A1揭示了一種處理污染液體的工序，所述液體與兩種帶相反電荷的聚合物材料接觸，其中至少一所述聚合物材料帶有支鏈，并且該些聚合物材料是以來自天然來源種類為佳(例如，藻類、細(xì)菌之類)。能使凝聚物形成且將所述凝聚物自所述液體分離。所述第一種和第二種聚合物材料可選自由多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及多羥基醇所組成的群族。然而該公開的專利的缺點(diǎn)在于必須采取兩段水處理工序，首先，污染液體以第一種聚合物 材料(自藍(lán)綠藻取得的具負(fù)離子，有支鏈的聚合物材料)進(jìn)行處理，接著一段時(shí)間后，與第二種聚合物材料(自聚氨基葡糖取得的具正離子，無支鏈的聚合物材料)接觸，以消除水中的污染物。此兩段水處理工序不僅不便且耗時(shí)，更需要大劑量的聚合物材料，方能降低水中污染物的濃度。
[0004]由于可生物降解無毒及其降解中間物不會(huì)引發(fā)二次污染的特性，微生物產(chǎn)生的生物絮凝劑已獲得產(chǎn)學(xué)界的多所關(guān)注。已知數(shù)種微生物能制造生物絮凝劑，例如醬油曲霉、擬青霉、紅串紅球菌、無花果沙雷菌以及膠質(zhì)芽孢桿菌。例如，美國公告專利5，250，201揭示了一種從液體分離藍(lán)藻細(xì)菌，特別是菌株J-1的方法，以及一種培養(yǎng)藍(lán)藻細(xì)菌以制造作為可使水中的碳?xì)浠衔锛坝皖愋纬扇闋钜旱娜榛瘎┑木酆衔?。該公開專利更有關(guān)以凈化及分離技術(shù)制造的聚合物質(zhì)，以及通過采用藍(lán)藻細(xì)菌的排出物質(zhì)，影響石油二次開采的方法。乳化劑的乳化作用是與溫度及PH酸堿值息息相關(guān)，研究顯示其在約26°C，pH酸堿值在5-9的范圍內(nèi)，能達(dá)到100%最大值。然而，該公開專利的缺點(diǎn)即在于乳化劑的乳化作用必須有限的溫度及PH酸堿值范圍內(nèi)，方能維持其最佳作用。
[0005]如他，美國公告專利4，948，733揭示了衍生自野生株生枝動(dòng)膠菌115，名為生枝動(dòng)膠菌115SL以及生枝動(dòng)膠菌115SLR兩種新的菌株。生枝動(dòng)膠菌的培養(yǎng)冷凍_70°C儲存在含有7%二甲亞砜與15%甘油的胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)液(TSB)培養(yǎng)基中。無論是儲存在胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)液培養(yǎng)基中，或者儲存在是化學(xué)成分為一公升蒸餾水含有25克葡萄糖、2*K2HP04、1*KH2P04、1*NH4C1、0.2 克 MgSO4.7Η20、0.01 克酵母抽提物的培養(yǎng)液，其中葡萄糖、MgSO4.7Η20、酵母抽提物及鹽均分別高壓消毒，生枝動(dòng)膠菌的菌株均進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。100毫升的生枝動(dòng)膠菌培養(yǎng)成長轉(zhuǎn)動(dòng)搖床或攪拌生物反應(yīng)器(200轉(zhuǎn)數(shù)/分)，30°C為期長達(dá)兩周。由于不會(huì)如其母菌株115生長表多糖莢膜層，此兩新菌株會(huì)產(chǎn)生新的表多糖(EPS)且具備母菌株所沒有，且可取的數(shù)種特質(zhì)，包括改良的培養(yǎng)特性，115SL表多糖反而不局限在細(xì)胞周圍的區(qū)域分泌黏液層。由于細(xì)胞不會(huì)受制在因營養(yǎng)素限制而致使其低速率成長或死亡的絮體內(nèi)，新菌株具備了更一致且可復(fù)制的成長循環(huán)及增加的成長率。是以，表多糖的產(chǎn)量更為一致且滴定濃度更高。將表多糖從細(xì)胞分離也更加容易且更合算。然而，生枝動(dòng)膠菌的菌株必須在高成本的高鹽度培養(yǎng)基中培育。此外，由于在水處理時(shí)，無莢膜細(xì)胞的周圍較少電荷出現(xiàn)，因此無莢膜層的生枝動(dòng)膠菌菌株恐致使金屬結(jié)合能力的降低。
[0006]于是，提供本發(fā)明，一種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基及環(huán)境條件中培養(yǎng)微生物菌株的有效方法，以制造最佳量的生物聚合物物質(zhì)十分必要。并且，此生物聚合物物質(zhì)或可有助于減低水污染，繼而有助于永續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物多樣性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的在于提供一種制造生物聚合物的方法，無需使用合成聚合物以大幅降低生產(chǎn)成本。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種培養(yǎng)真菌的方法，以制造用于液體澄清及水處理的生物聚合物。
[0009]本發(fā)明的又一目的在于提供一種培養(yǎng)真菌的方法，以制造最佳量的生物聚合物。
[0010]于是，通過下 述本發(fā)明的揭示以實(shí)現(xiàn)前述目的。本發(fā)明涉及一種制造生物聚合物的方法，包括以下工序提供培養(yǎng)基，包括一碳源、一氮源及復(fù)數(shù)礦源；將真菌接種于所述培養(yǎng)基，接種量體積百分比是0.2-10% ;將黃曲霉接種于所述培養(yǎng)基，接種量體積百分比是0.2-10% ;培養(yǎng)所述培養(yǎng)基；過濾所述培養(yǎng)基，從而分離所述黃曲霉與所述培養(yǎng)基；凈化所述生物聚合物；其中所述碳源對所述氮源的摩爾比率是5:1，所述培養(yǎng)基的酸堿值是PH5-9，溫度是25-45°C，接種量體積百分比是0.2_2%，搖床轉(zhuǎn)速是50-200轉(zhuǎn)數(shù)/分，培養(yǎng)時(shí)間是12-60小時(shí)。所制得的生物聚合物分子量是2.466x104-2.68x104道爾頓，具有復(fù)數(shù)官能團(tuán)、復(fù)數(shù)化學(xué)元素、糖、蛋白質(zhì)，最低絮凝效率90%，酸堿值是pH3-7，溫度是10-100°C。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]為能從下述詳細(xì)說明進(jìn)一步了解本發(fā)明的技術(shù)特征與內(nèi)容，下面結(jié)合較佳實(shí)施例的附圖進(jìn)行說明。
[0012]圖1a顯示生物絮凝劑與復(fù)數(shù)碳源(蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉以及甘油)在高嶺土懸濁液72小時(shí)培養(yǎng)后的絮凝效率；
[0013]圖1b顯示生物絮凝劑與復(fù)數(shù)氮源(蛋白胨、酵母抽提物、谷氨酸、尿素、硫酸銨、硝酸銨以及硝酸鈉)在高嶺土懸濁液72小時(shí)培養(yǎng)后的絮凝效率；
[0014]圖1c顯示碳源/氮源的摩爾比率對生物絮凝劑制造的影響；
[0015]圖2顯示培養(yǎng)基中的pH酸堿值對生物絮凝劑制造的影響；
[0016]圖3顯示培養(yǎng)基中的溫度對生物絮凝劑制造的影響；
[0017]圖4顯示培養(yǎng)基中的黃曲霉接種量對生物絮凝劑制造的影響；
[0018]圖5顯示培養(yǎng)基的搖床轉(zhuǎn)速對生物絮凝劑制造的影響；[0019]圖6顯示培養(yǎng)基中存在的礦源對生物絮凝劑制造的影響；
[0020]圖7顯示黃曲霉成長曲線與生物絮凝劑制造的變化的關(guān)系；
[0021]圖8顯示生物絮凝劑的pH酸堿值及熱穩(wěn)定度；
[0022]圖9a顯示生物絮凝劑的表面；
[0023]圖9b顯示高嶺土懸濁液的表面；
[0024]圖9c顯示通過生物絮凝劑形成的凝聚物。
【具體實(shí)施方式】
[0025]因應(yīng)所需，于此公開發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施例；然而，應(yīng)該理解公開的本發(fā)明的實(shí)施例僅是本發(fā)明的示例，而可以各種的形式來實(shí)施本發(fā)明。因此，于此公開的具體功能細(xì)節(jié)不應(yīng)被解釋為限制，而僅應(yīng)解釋為權(quán)利要求的基礎(chǔ)。應(yīng)了解附圖和詳細(xì)說明并非意圖將說明書限于所公開的特定形式，而是相反地，意圖涵蓋屬于權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的所有改進(jìn)、均等物和替代方 案。另外，在本文中使用的任何標(biāo)題僅出于組織目的并且并非意圖限制說明書的范圍。如本文使用，措詞“可以”用來表達(dá)許可意義(即，意指“具有可能性”)，而非強(qiáng)制意義(即，意指“必須〃)。同樣地，措詞“包括(include)，，,包括(including)”和“包括(includes) ”意指“包括但不限于”。并且除非另外的注釋，措詞“一”表示“至少一”，而措詞“復(fù)數(shù)”表示“一或多”。術(shù)語按照那些在相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的用法來理解。在上述的各附圖中，相似的附圖標(biāo)記應(yīng)被理解為表示相同、相似或者相應(yīng)的特征或功能。以下參照圖la-9c對本發(fā)明進(jìn)行描述。
[0026]本發(fā)明涉及一種制造生物聚合物的方法，包括以下工序:
[0027]提供培養(yǎng)基，包括一碳源、一氮源及復(fù)數(shù)礦源；
[0028]將真菌接種于所述培養(yǎng)基，接種量體積百分比是0.2_10%，所述真菌實(shí)在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0029]培養(yǎng)所述培養(yǎng)基，條件為搖床轉(zhuǎn)速是0-250轉(zhuǎn)數(shù)/分，培養(yǎng)時(shí)間是12-96小時(shí)，溫度是 15-45 0C ；
[0030]過濾所述培養(yǎng)基，從而分離所述真菌與所述培養(yǎng)基；
[0031]凈化所述生物聚合物；
[0032]其特征在于:
[0033]所述真菌是黃曲霉；
[0034]所述碳源是選自由蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉以及甘油所組成的群族；
[0035]所述氮源是選自由蛋白胨、酵母抽提物、谷氨酸、尿素、硫酸銨、硝酸銨以及硝酸鈉所組成的群族；
[0036]所述復(fù)數(shù)礦源是選自由鎂、鉀、鐵、氯以及其任意組合所組成的群族；
[0037]所述碳源對所述氮源的摩爾比率是5:1，所述培養(yǎng)基的pH酸堿值是5-9，溫度是25-450C，接種量體積百分比是0.2-2%,搖床轉(zhuǎn)速是50-200轉(zhuǎn)數(shù)/分，培養(yǎng)時(shí)間是12-60小時(shí)。
[0038]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基是在轉(zhuǎn)動(dòng)搖床或攪拌生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0039]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述碳源是蔗糖。[0040]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述氮源是蛋白胨。
[0041]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基的pH酸堿值是7。
[0042]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基的溫度是40°C。
[0043]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述接種量體積百分比是2%。
[0044]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述搖床轉(zhuǎn)速是200轉(zhuǎn)數(shù)/分。
[0045]在本發(fā)明制造生物聚合物的方法的一較佳實(shí)施例中，所述培養(yǎng)時(shí)間是60小時(shí)。
[0046]本發(fā)明更涉及一種所述的制造生物聚合物的方法所制得的生物聚合物，所述生物聚合物的分子量是2.466x104-2.68x104道爾頓，具有復(fù)數(shù)官能團(tuán)、復(fù)數(shù)化學(xué)元素、糖、蛋白質(zhì)，PH酸堿值在3-7間，溫度在10-100°C間的最低絮凝效率是90%。
[0047]在本發(fā)明制得的生物聚合物的一較佳實(shí)施例中，所述復(fù)數(shù)官能團(tuán)是選自由羥基、碳?xì)浠?、酰胺原子團(tuán)、羧基、胺類、甲氧基以及其任意組合所組成的群族。
[0048]在本發(fā)明制得的生物聚合物的一較佳實(shí)施例中，所述復(fù)數(shù)化學(xué)元素包括碳、氫、氧、氮以及硫。
[0049]以下是本發(fā)明一種制造生物聚合物的方法的實(shí)施例，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)更明顯易懂。應(yīng)該理解下述本發(fā)明的實(shí)施例僅是示例，而非對本發(fā)明的限制。
[0050]實(shí)施例
[0051]真菌，黃曲霉菌株44-1由馬來西亞吉隆坡，馬來西亞博特拉大學(xué)生物學(xué)研究所微生物保藏單位，生物技術(shù)機(jī)構(gòu)，生物工業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物技術(shù)部門(UNiCC)分離并且保存。黃曲霉存貯培養(yǎng)是在瓊脂斜面培養(yǎng)基，溫度維持在4°C，并且每30-40天進(jìn)行一次隔代培養(yǎng)。瓊脂斜面培養(yǎng)基包含4g/L馬鈴薯提取物、20g/L葡萄糖、15g/L瓊脂，初始pH酸堿值是
5.6±0.2。
[0052]提供的培養(yǎng)基包括一碳源、一氮源及復(fù)數(shù)礦源，所述碳源是選自由蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉以及甘油所組成的群族；所述氮源是選自由蛋白胨、酵母抽提物、谷氨酸、尿素、硫酸銨、硝酸銨以及硝酸鈉所組成的群族；所述復(fù)數(shù)礦源是選自由鎂、鉀、鐵、氯以及其任意組合所組成的群族。在一較佳實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基包含30g/L蔗糖作為碳源，
3.0g/L蛋白胨作為氮源，0.5g/L含水硫酸鎂(MgSO4.7Η20)，0.5g/L氯化鉀(KCl)，0.01g/L硫酸亞鐵(FeSO4)，1.0g/L磷酸氫二鉀(K2HPO4)，初始pH酸堿值調(diào)整成6.0。在另一較佳實(shí)施例中，其中的氯化鉀亦可以以氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化錳(II)以及氯化鐵(III)提供。在一較佳實(shí)施例中，所述碳源對所述氮源的摩爾比率以0:11:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1 及 50:1 進(jìn)行測試。
[0053]然后將黃曲霉接種于所述培養(yǎng)基，以產(chǎn)生黃曲霉接種體，接種量體積百分比是0.2-10%。在一較佳實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基是在瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。含有黃曲霉的所述瓊脂斜面培養(yǎng)基切成數(shù)塊，并且浸泡在100毫升的蒸餾水中。黃曲霉懸浮在蒸餾水中，然后通過轉(zhuǎn)動(dòng)搖床或攪拌生物反應(yīng)器以30°C進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)。隨后過濾懸浮的黃曲霉獲得黃曲霉接種體。
[0054]培養(yǎng)工序通過調(diào)整多個(gè)培養(yǎng)參數(shù)，例如碳源、氮源、碳源對氮源的摩爾比率、pH酸堿值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間，以獲得如生物絮凝劑、生物助凝劑及類似其的生物聚合物。在一較佳實(shí)施例中，生物絮凝劑是細(xì)菌，真菌，藻類及酵母所分泌的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的生物聚合物物質(zhì)。生物絮凝劑的組成及特性視微生物絮凝劑-產(chǎn)生菌、培養(yǎng)基組成以及環(huán)境條件而決定。
[0055]在另一較佳實(shí)施例中，培養(yǎng)基是通過轉(zhuǎn)動(dòng)搖床或攪拌生物反應(yīng)器以搖床轉(zhuǎn)速0-250轉(zhuǎn)數(shù)/分，溫度15-45°C，進(jìn)行12-96小時(shí)的培養(yǎng)。隨后進(jìn)行過濾從而分離黃曲霉為殘?jiān)螒B(tài)，生物絮凝劑為濾液形態(tài)。將黃曲霉的生物質(zhì)放置在烤爐中4個(gè)小時(shí)，以80°C進(jìn)行干燥。
[0056]生物絮凝劑的凈化
[0057]2公升95%冷乙醇(4°C )加入I公升含有生物絮凝劑的濾液以獲取沉淀物。將獲取的所述沉淀物再溶解在100毫升的去離子水。將50毫升，2%的氯化十六烷吡啶(CPC)加入溶液中并且攪拌。三小時(shí)后,收集所述沉淀物并溶解在100毫升，0.5摩爾的氯化鈉溶液中。然后再將2公升95%冷乙醇加入以獲取沉淀物。以乙醇沖洗所述沉淀物。且溶解所述沉淀物在5毫升的去離子水并予以真空干燥。I公升含有生物絮凝劑的濾液可獲得約
0.402克的純生物絮凝劑。
[0058]絮凝效率的決定
[0059]高嶺土懸濁液是用以測量含有生物絮凝劑濾液的絮凝效率。2克的高嶺土(德國莫克產(chǎn))懸濁于I公升的去離子水中。將I毫升含有生物絮凝劑的濾液加入99毫升的高嶺土懸濁液在400毫升 的燒杯中后，以I摩爾的氫氧化鈉或鹽酸將pH酸堿值調(diào)整成7.0。將混合物以200轉(zhuǎn)數(shù)/分劇烈地?cái)嚢鐸分鐘后，再以80轉(zhuǎn)數(shù)/分緩慢地?cái)嚢?分鐘。然后通過可沉降固體測定儀(JLT6，VELP SCIENTIFICA，Italy)使其定立5分鐘。通過分光亮度計(jì)(GENESYS10UV, Thermo Scientific, USA)以550納米，測量澄清液(獲得的上清液)的光密度(OD)。將含有生物絮凝劑的濾液以空白培養(yǎng)基取代，進(jìn)行同樣條件的對照控制試驗(yàn)。絮凝作用及可依據(jù)下述公式計(jì)算:
[0060]絮凝效率=(A-B)/AXlOO %
[0061]A及B分別是對照試驗(yàn)與樣品上清液的0D550 (550納米的光密度)。
[0062]圖1a顯示生物絮凝劑與多種碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉以及甘油)相同濃度取代蔗糖在高嶺土懸濁液72小時(shí)培養(yǎng)后的絮凝效率。當(dāng)果糖及甘油作為培養(yǎng)基中的碳源，生物絮凝劑相對較低時(shí)，對生物絮凝劑產(chǎn)量而言，以蔗糖、淀粉及葡萄糖為較佳的碳源。然若如因圖1a顯示的最高的生物絮凝劑，蔗糖可選作為單獨(dú)的碳源。
[0063]在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)黃曲霉研究氮源的影響。圖1b顯示除了僅氮源作改變?？偟膩碚f，有機(jī)氮源(蛋白胨、酵母抽提物及尿素)有利于通過黃曲霉產(chǎn)生生物絮凝劑，而非有機(jī)氮源，硫酸銨及硝酸鈉則會(huì)導(dǎo)致較低的生物絮凝劑產(chǎn)量，但硝酸銨會(huì)影響淀粉培養(yǎng)基的生物絮凝劑制造。如圖1b顯示，對生物絮凝劑制造而言，蛋白胨是較佳的。
[0064]如圖1c顯示，當(dāng)碳源對氮源(C:N)的摩爾比率增加至5:1，可觀察到生物絮凝劑產(chǎn)量明顯地增加。再增加的C:N摩爾比率則無相對的影響，甚至導(dǎo)致生物絮凝劑產(chǎn)量的降低。此表示C:N摩爾比率5:1對生物絮凝劑制造而言是較佳的。
[0065]培養(yǎng)基的pH酸堿值亦會(huì)影響微生物絮凝劑-產(chǎn)生菌的養(yǎng)分吸收與酶促反應(yīng)。介于PH酸堿值范圍2-9之間，屬酸的pH酸堿值范圍2-4的絮凝效率最低。pH酸堿值范圍5_9對生物絮凝劑制造而言是較佳的。然，如圖2所示，pH酸堿值7對生物絮凝劑制造而言是最佳的。
[0066]圖3顯示培養(yǎng)基中的溫度對生物絮凝劑制造的影響。培養(yǎng)溫度超過25°C后，絮凝效率顯著地在40°C時(shí)達(dá)到86.2%。最大的酶促反應(yīng)僅能在最佳溫度獲得。較低的培養(yǎng)溫度可致使黃曲霉部分地蟄伏，其產(chǎn)生生物絮凝劑的酶促系統(tǒng)無法完全激活。因此，如圖3所示，對生物絮凝劑制造而言的最佳溫度是40°C。
[0067]圖4顯示培養(yǎng)基中的黃曲霉接種量對生物絮凝劑制造的影響。黃曲霉接種體的接種量體積百分比從0.2至2%逐漸增加。當(dāng)菌株的接種量體積百分比為2%時(shí)，生物絮凝劑的絮凝效率達(dá)到86.6%。然而，再徒增接種量亦未能致使更高的絮凝效率。2%的接種量體積百分比，對黃曲霉而言是最佳的接種量，能促使黃曲霉適應(yīng)培養(yǎng)基，并助長生物絮凝劑的生產(chǎn)率。
[0068]圖5顯示培養(yǎng)基的搖床轉(zhuǎn)速在50-200轉(zhuǎn)數(shù)/分時(shí)，生物絮凝劑產(chǎn)量最高。增加最大速度至250轉(zhuǎn)數(shù)/分，則致使生物絮凝劑產(chǎn)量降低。搖床轉(zhuǎn)速?zèng)Q定了培養(yǎng)基中的溶氧度，其亦會(huì)影響黃曲霉的養(yǎng)分吸收與酶促反應(yīng)。200轉(zhuǎn)數(shù)/分的搖床轉(zhuǎn)速是生物絮凝劑制作的最佳速度。
[0069]圖6顯示培養(yǎng)基中存在的礦源對生物絮凝劑制造的影響。如圖6所示鈉、鉀、鈣、鎂的存在會(huì)促進(jìn)黃曲霉的生物絮凝劑制作，但鐵存在則會(huì)發(fā)生抑制。參見圖6，鉀是用于生物絮凝劑制作的最佳礦源。
[0070]圖7顯示黃曲霉成長曲線與生物絮凝劑制造的變化的關(guān)系?？偟膩碚f，生物絮凝劑產(chǎn)量與生物質(zhì)的成長成正比且隨時(shí)間增加。生物絮凝劑的絮凝效率在60小時(shí)早期穩(wěn)定階段即增至最大(87.2% )，表示生物絮凝劑是通過生物合成的長成而制造?？剐跄割惖幕钚?，致使在晚期穩(wěn)定階段絮凝效率開始降低。72小時(shí)后，黃曲霉的死亡率開始超過其產(chǎn)生率。菌株進(jìn)入衰退階段，生物絮凝劑的絮凝效率逐漸下降。對應(yīng)絮凝效率屬性，PH酸堿值的屬性顯示pH酸堿值在48小時(shí)內(nèi)從7.0降至5.3，接著在96小時(shí)內(nèi)稍微增至5.6。因此，60小時(shí)是生物絮凝劑制作的最佳培養(yǎng)時(shí)間。
[0071]生物絮凝劑的特性描述
[0072]生物絮凝劑的成分分析
[0073]純化生物絮凝劑的化學(xué)分析顯示全部糖與全部蛋白質(zhì)的比例分別是28.3%及5.7%。此結(jié)果顯示生物絮凝劑主要是一多糖生物絮凝劑。通過三氟乙酸將純化生物絮凝劑水解，以確定其他糖類，例如中性糖，糖醛酸以及氨基糖。純化生物絮凝劑的元素分析，其碳(C)、氫⑶、氧(O)、氮(N)及硫⑶的主要成分重量百分比分別是29.9%、4.8%、34.7%、3.3%及2.0 %。通過凝膠滲透色譜法(GPC)系統(tǒng)，生物絮凝劑的分子量確定是2.466x104-2.68x104 道爾頓。
[0074]生物絮凝劑的官能團(tuán)分析
[0075]純化生物絮凝劑的紅外線譜顯示約在3285CHT1的寬展峰值，羥基團(tuán)的特征，以及約在2927CHT1的弱C - H伸縮吸收帶。在1333與1633CHT1的峰值皆因COO-鍵非對稱振動(dòng)。在1538CHT1的峰值則歸于NH彎曲振動(dòng)。在1007CHT1的強(qiáng)吸收峰值顯示C - O伸縮振動(dòng)以及甲氧基團(tuán)的存在，亦即現(xiàn)有所有糖衍生物的典型特征。
[0076] 生物絮凝劑的pH酸堿值穩(wěn)定性[0077]圖8顯示生物絮凝劑的pH酸堿值及熱穩(wěn)定度，其中在pH酸堿值3.0-7.0的范圍內(nèi)，絮凝效率可超過90 %。當(dāng)pH酸堿值高于7后，絮凝效率明顯下降。
[0078]生物絮凝劑的熱穩(wěn)定度
[0079]生物絮凝劑的熱穩(wěn)定度研究顯示生物絮凝劑非常的穩(wěn)定(圖8)。若生物絮凝劑的PH酸堿值維持在3.0-7.0之間，則由于生物絮凝劑的成分是多糖，因此在廣泛的溫度范圍內(nèi)(10-100°C)絮凝效率均超過90%。
[0080]澄清液的生物絮凝劑機(jī)制
[0081]在水體中無論是膠體或微粒的雜質(zhì)均帶負(fù)電荷，因此采用帶正離子的生物絮凝劑將使絮凝最有效。生物絮凝劑表面(圖9a)與膠體間的庫倫相互作用會(huì)產(chǎn)生吸引及膠體表面的電荷中和，致使凝聚物的形成(圖9c)以及降低兩者間的電反斥力。表1顯示生物絮凝劑與高嶺土懸濁液(配制混水)的界達(dá)電位，其中具有-9.3mV的界達(dá)電位的已處理的高嶺土懸濁液趨向絮凝以具備較澄清的液體。圖9b顯示高嶺土懸濁液的表面。在一較佳實(shí)施例中，凝聚物的形成或可懸浮在液體的頂部、沉在液體的底部，或可易自液體過濾或移除。在一較佳實(shí)施例中，界達(dá)電位表示分散系中鄰近相似的帶電微粒(維生素)間的相斥程度。OmV的界達(dá)電位顯具液體澄清工序中的最佳絮凝表現(xiàn)。
[0082]表1:生物絮凝劑、高嶺土懸濁液及已處理的高嶺土懸濁液的界達(dá)電位。
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種制造生物聚合物的方法，包括以下工序: 提供培養(yǎng)基，包括一碳源、一氮源及復(fù)數(shù)礦源； 將真菌接種于所述培養(yǎng)基，接種量體積百分比是0.2-10% ； 培養(yǎng)所述培養(yǎng)基，條件為搖床轉(zhuǎn)速是0-250轉(zhuǎn)數(shù)/分，培養(yǎng)時(shí)間是12-96小時(shí)，溫度是15-45 0C ； 過濾所述培養(yǎng)基，從而分離所述真菌與所述培養(yǎng)基； 凈化所述生物聚合物； 其特征在于: 所述真菌是黃曲霉； 所述碳源是選自由蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉以及甘油所組成的群族； 所述氮源是選自由蛋白胨、酵母抽提物、谷氨酸、尿素、硫酸銨、硝酸銨以及硝酸鈉所組成的群族； 所述復(fù)數(shù)礦源是選自由鎂、鉀、鐵、氯以及其任意組合所組成的群族； 所述碳源對所述氮源的摩爾比率是5:1，所述培養(yǎng)基的pH酸堿值是pH5-9，溫度是25-450C，接種量體積百分比是0.2-2%,搖床轉(zhuǎn)速是50-200轉(zhuǎn)數(shù)/分，培養(yǎng)時(shí)間是12-60小時(shí)。
2.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基是在轉(zhuǎn)動(dòng)搖床或攪拌生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述碳源是蔗糖。
4.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述氮源是蛋白胨。
5.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基的酸堿值是pH7。
6.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基的溫度是40。。。
7.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述接種量體積百分比是 2 。
8.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述搖床轉(zhuǎn)速是200轉(zhuǎn)數(shù)/分。
9.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)時(shí)間是60小時(shí)。
10.如權(quán)利要求1所述的制造生物聚合物的方法所制得的生物聚合物，其特征在于:所述生物聚合物的分子量是2.466xl04t-2.68xl04道爾頓，具有復(fù)數(shù)官能團(tuán)、復(fù)數(shù)化學(xué)元素、糖、蛋白質(zhì)，酸堿值在PH3-7間，溫度在10-100°C間的最低絮凝效率是90%。
11.如權(quán)利要求11所述的生物聚合物，其特征在于:所述復(fù)數(shù)官能團(tuán)是選自由羥基、碳?xì)浠?、酰胺原子團(tuán)、羧基、胺類、甲氧基以及其任意組合所組成的群族。
12.如權(quán)利要求11所述的生物聚合物，其特征在于:所述復(fù)數(shù)化學(xué)元素包括碳、氫、氧、氣以及硫。
【文檔編號】C12R1/67GK103998612SQ201280053572
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月2日
【發(fā)明者】阿茲尼·愛德利斯, 艾哈邁德·H.·羅札伯, 諾拉菲薩·阿布杜拉, 羅斯法里贊·穆罕默德 申請人:馬來西亞博特拉大學(xué)