對除草劑具有增強的耐受性的植物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及控制植物栽培場所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步驟：在該場所提供植物，所述植物至少包含：編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列，和/或編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶或突變的尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶(mut-HST)的核苷酸序列；向該場所施用有效量的所述除草劑。本發(fā)明還提供包含mut-HPPD的植物和獲得這樣的植物的方法。
【專利說明】對除草劑具有增強的耐受性的植物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明一般涉及賦予植物對除草劑具有農(nóng)業(yè)水平耐受性的方法。特別地，本發(fā)明涉及對“香豆酮(coumarone)衍生物”除草劑具有增加的耐受性的植物。更具體地，本發(fā)明涉及由誘變及雜交育種及轉(zhuǎn)化獲得的對“香豆酮衍生物”除草劑具有增加的耐受性的植物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀90年代早期以來，抑制異戍二烯基醌(prenylquinones)、質(zhì)體醌(plastoquinone)和生育酹(tocopherols)的生物合成中的關(guān)鍵酶4_輕苯基丙酮酸雙加氧酶(4-HPro;ECl.13.11.27)的除草劑已用于進行選擇性雜草控制。其阻斷生物合成路徑中4_輕苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成尿黑酸(homogentisate) (Matringe等人,2005，Pest ManagSc1.,第 61 卷:269-276 ;Mitchell 等人，2001，Pest Manag Sc1.第 57 卷:120-128)。認為質(zhì)體醌是類胡蘿卜素生物合成中八氫蕃茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase)的必需輔因子(Boeger 及 Sandmann, 1998, Pestic Outlook,第 9 卷:29-35)。其抑制會使植物質(zhì)體醌及維生素E庫耗盡，從而導(dǎo)致白化癥狀。類胡蘿卜素的損失，特別是其作為對抗光氧化作用的光系統(tǒng)保護劑功能的損失，會導(dǎo)致生長中的枝條組織中葉綠素及光合膜的氧化降解。結(jié)果是，葉綠體的合成和功能被破壞(Boeger和Sandmann, 1998)。尿黑酸爺尼基轉(zhuǎn)移酶(homogentisate solanesyl transferase, HST)催化質(zhì)體醌生物合成路徑中HPF1D之后的步驟。HST為異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，其使尿黑酸脫羧并且將來自茄尼基二磷酸酯的茄尼基轉(zhuǎn)移至尿黑酸而由此形成2-甲基-6-茄尼基-1，4-苯醌(MSBQ)，一種質(zhì)體醌生物合成路徑的中間物。HST酶為膜結(jié)合酶且編碼其的基因包括質(zhì)體靶向序列。
[0003]商品化4-HPH)抑制性除草劑的最重要化學(xué)類型包括吡唑啉酮類(pyrazolone)、
三酮類(triketone)及異續(xù)，唑類(isoxazole)。抑制劑通過形成穩(wěn)定離子偶極電荷轉(zhuǎn)移
復(fù)合物而模擬底物4-羥苯基丙酮酸與活性位點中的酶結(jié)合亞鐵離子的結(jié)合。在4-HPH)抑制性除草劑中，三酮磺草酮(triketone sulcotrione)為此組除草劑中首個用于農(nóng)業(yè)中的實例且鑒定了其作用機制(Schulz等人，1993，F(xiàn)EBS Lett.第318卷:162-166)。已報導(dǎo)三酮類是纖精酮(Ieptospermone)的衍生物，纖精酮是來自紅瓶刷(bottlebrush)
植物-紅千層屬物種(Callistemon spp)-的除草劑成分(Lee等.1997，Weed Sc1.Vol45,162-166)。
[0004]因為抑制植物中的反應(yīng)會導(dǎo)致經(jīng)處理植物的葉變白并且導(dǎo)致所述植物死亡,這些分子中的一些已用作除草劑(PalIett.K.E.等人1997Pestic.Sc1.5083-84)。本領(lǐng)域中描
述的以HPPD為靶的除草劑特別有:異唑類(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美國專利號 5，424，276)，特別是異惡唑草酮(isoxafIutole)，其
為用于玉米的選擇性除草劑；二酮腈類(EP496630、EP496631)，特別地2-氰基-3-環(huán)丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙烷 _1，3_ 二麗及 2_ 氛基 _3_ 環(huán)丙基-1- (2_S02CH3_4_2, 3C12苯基)丙烷-1，3- 二酮；諸如描述于EP625505、EP625508、美國專利號5，506, 195中的三酮類，特別地磺草酮；*pyrazolinates。此外,眾所周知的除草劑苯批唑草酮(topramezone)也在易感植物物種中引發(fā)與上文描述的4-HPH)抑制性漂白除草劑同樣類型的植物毒性癥狀，包括生長中的枝條組織中葉綠素喪失和壞死。苯吡唑草酮屬于化學(xué)種類吡唑啉酮類或苯甲?；吝蝾惽矣?006年商業(yè)引進。當在萌芽后施用時，該化合物選擇性控制玉米中廣譜的一年生窄葉雜草和寬葉雜草。
[0005]植物對“香豆酮衍生物除草劑”的耐受性也已在許多專利中加以報導(dǎo)。國際申請?zhí)朤O2010/029311 —般地描述HPTO核酸及/或HST核酸在植物中引發(fā)除草劑耐受性的用途。W02009/090401、W02009/090402、W02008/071918、W02008/009908 具體公開了某些“香豆酮衍生物除草劑”及“香豆酮衍生物除草劑”耐受性的植物株系。
[0006]3種主要策略可用于使植物耐受除草劑，亦即(I)用將除草劑或其活性代謝物轉(zhuǎn)化成無毒產(chǎn)物的酶去除除草劑毒性，諸如用于溴苯腈(bromoxynil)耐受性或草銨膦(basta)耐受性的酶(EP242236、EP337899) ； (2)將靶酶突變成對除草劑或其活性代謝物敏感性較小的功能性酶，諸如用于草甘膦(glyphosate)耐受性的酶(EP293356、Padgette
S.R.等人，J.Biol.Chem., 266, 33, 1991);或(3)過表達敏感性酶，使得鑒于此酶的動力學(xué)常數(shù)，在植物中生產(chǎn)相對于除草劑足夠的靶酶量，以致盡管存在其抑制劑，仍有足夠的功能性酶可用。已經(jīng)描述了第三種策略用于成功獲得對HPH)抑制劑具有耐受性的植物(W096/38567)。US2009/0172831公開了編碼具有酶促活性的氨基酸序列的核苷酸序列，使得該氨基酸序列對HPH)抑制劑除草劑化學(xué)品具有抗性，特別是三酮抑制劑特異的HPH)突變體。
[0007]迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)尚未描述含有至少一個突變的HPro核酸的香豆酮衍生物除草劑耐受性植物?，F(xiàn)有技術(shù)亦尚未描述在除從中獲得HPro基因的基因組以外的基因組中含有突變的香豆酮衍生物除草劑耐受性作物。因此，本領(lǐng)域需要自其它基因組及物種鑒定香豆酮衍生物除草劑耐受基因。本領(lǐng)域亦需要對除草劑例如香豆酮衍生物除草劑具有增強的耐受性且含有至少一個突變的HPro核酸的作物。亦需要控制此類作物或其附近雜草生長的方法。當向包含作物的區(qū)域施用除草劑時，這些組合物及方法允許使用噴藥技術(shù)。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明解決了該技術(shù)問題，本發(fā)明涉及控制植物栽培場所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步驟:
[0010]a)在該場所提供包含至少一個如下核酸的植物，所述核酸包含:
[0011](i)編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(mut-HPH))的核苷酸序列，和/或
[0012](ii)編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶或突變的尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶(mut-HST)的核苷酸序列，
[0013]b)向該場所施用有效量的所述除草劑。
[0014]此外，本發(fā)明涉及:通過使用包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56 或其變體的核酸編碼的mut-HPPD，和/或通過使用包含核苷酸序列SEQ ID NO:47或49或其變體的核酸編碼的mut-HST，鑒定香豆酮衍生物除草劑的方法。[0015]所述方法包括以下步驟:
[0016]a)產(chǎn)生包含編碼野生型或mut-HPH)的核酸的轉(zhuǎn)基因細胞或植物，其中表達野生型或 mut-HPPD ；
[0017]b)向a)的轉(zhuǎn)基因細胞或植物及相同品種的對照細胞或植物施用香豆酮衍生物除草劑；
[0018]c)在施用所述測試化合物之后，測定轉(zhuǎn)基因細胞或植物及對照細胞或植物的生長或生存力，以及
[0019]d)選擇使對照細胞或植物的生長較之轉(zhuǎn)基因細胞或植物的生長降低的測試化合物。
[0020]另一目的涉及鑒定編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的mut-HPH)的核苷酸序列的方法，該方法包括:
[0021]a)生成mut-HPro編碼核酸的文庫，
[0022]b)通過在細胞或植物中表達每種所述核酸和用香豆酮衍生物除草劑處理所述細胞或植物，篩選所得mut-HPH)編碼核酸的群體，
[0023]c)比較由所述mut-HPH)編碼核酸群體提供的香豆酮衍生物除草劑耐受性水平與由對照HPro編碼核酸提 供的香豆酮衍生物除草劑耐受性水平，
[0024]d)選擇至少一種mut-HPH)編碼核酸，所述核酸較之對照HPTO編碼核酸提供顯著增加的香豆酮衍生物除草劑耐受性水平。
[0025]在一個優(yōu)選的實施方案中，較之由對照HPro編碼核酸提供的香豆酮衍生物除草劑耐受性，步驟d)中選出的mut-HPro編碼核酸提供至少2倍的香豆酮衍生物除草劑耐受性。
[0026]抗性或耐受性可通過生成包含步驟a)的文庫的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物和比較所述轉(zhuǎn)基因植物與對照植物來確定。
[0027]另一目的涉及鑒定含有編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的mut-HPPD或mut-HST的核酸的植物或藻類之方法，該方法包括:
[0028]a)在植物細胞或綠藻的培養(yǎng)物中鑒定香豆酮衍生物除草劑的有效量，
[0029]b)用誘變劑處理所述植物細胞或綠藻，
[0030]c)使所述經(jīng)誘變處理的細胞群體與a)中鑒定出的香豆酮衍生物除草劑有效量接觸，
[0031]d)選擇在這些測試條件下存活的至少一個細胞，
[0032]e)對來自d)中所選細胞的HPH)和/或HST基因進行PCR擴增及測序，和將此序列與野生型HPro或HST基因序列進行比較。
[0033]在一個優(yōu)選的實施方案中，誘變劑為甲烷磺酸乙酯。
[0034]另一目的涉及編碼mut-HPH)的分離的核酸，該核酸可通過如上定義的方法鑒定。
[0035]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及由野生型或mut-HPH)核酸轉(zhuǎn)化的植物細胞或已經(jīng)被突變的植物，以獲得表達，優(yōu)選過表達野生型或mut-HPH)核酸的植物，其中所述核酸在植物細胞中的表達導(dǎo)致較之野生型品種的植物細胞對香豆酮衍生物除草劑增強的抗性或耐受性。
[0036]在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的植物細胞轉(zhuǎn)化了野生型或mut-HPH)核酸，所述核酸包含 SEQ ID NO:1, 51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56或其變體或衍生物的序列。
[0037]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核酸在植物中的表達導(dǎo)致，較之野生型品種的植物，該植物對香豆酮衍生物除草劑的增強的抗性。
[0038]本發(fā)明的植物可為轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因植物。
[0039]優(yōu)選地，核酸在植物中的表達導(dǎo)致較之野生型品種的植物，本發(fā)明植物對香豆酮衍生物除草劑的增強的抗性。
[0040]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及由包含本發(fā)明的植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的種子，其中就相對于野生型品種的種子增強的香豆酮衍生物除草劑抗性而言，該種子是純種(true breeding)的。
[0041]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)較之野生型品種的植物細胞具有香豆酮衍生物除草劑增強抗性的轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，所述方法包括用包含野生型或mut-HPH)核酸的表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞。
[0042]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括:(a)用包含野生型或mut-HPH)核酸的表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞，以及(b)從植物細胞產(chǎn)生具有對香豆酮衍生物除草劑的增強的抗性的植物。
[0043]優(yōu)選地，表達盒還包含在植物中具有功能的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)及翻譯起始調(diào)控區(qū)。
[0044]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的mut-HPH)作為選擇標志物。本發(fā)明提供鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分的方法，所述方法包括:a)提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分，其中該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分包含編碼如下文所述的本發(fā)明mut-HPH)多肽的分離的核酸，其中該多肽用作選擇標志物，且其中該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分可任選地包含其它分離的目的核酸山)使經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分與至少一種香豆酮衍生物抑制性化合物接觸；c)確定植物細胞、植物組織、植物或其部分是否受抑制劑或抑制性化合物影響；以及d)鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分。
[0045]本發(fā)明還涉及含有本文所述的突變的經(jīng)純化的mut-HPro蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可用于分子建模研究中以設(shè)計對除草劑耐受性的進一步改良。蛋白質(zhì)純化方法為熟知的，且可容易地使用市售產(chǎn)品或采用例如于Protein Biotechnology, Walsh和Headon(Wiley, 1994)中所述的特別設(shè)計的方法來達成。
[0046]附圖簡述
[0047]圖1:來自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Cr_HPPDla, Cr_HPPDlb)、小立碗蘚(Physcomitrella patens) (Pp_HPPDl)、稻(Oryzasativa) (Osj_HPPDl)、小麥(Triticum aestivum) (Ta_HPPDl)、玉蜀黍(Zeamays) (Zm_HPPDl)、擬南芥(Arabidopsisthaliana) (AtJIPF1D)、大豆(Glycine max) (Gm_HPPD)和葡萄(Vitis vinifera) (Vv_HPPD)的HPro酶的氨基酸序列比對和保守區(qū)域。
[0048]*來自基因組測序計劃的序列。基因座位ID(Locus ID):GRMZM2G088396
[0049]**基于NCBI GenPept登錄號CAG25475的氨基酸序列。
[0050]圖2顯示用于HPHVHST序列的大豆轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)化載體的載體圖。[0051]圖3顯示表達大麥屬(Hordeum)野生型HPI3D (HvHPH)，Seq ID: 1/2)的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的萌發(fā)試驗。植物在(A) 7-(2，6-二氯-3-吡啶)-5，5-二甲基-6，6-二氧代-硫代吡喃并[4，3-b]吡啶-8-醇和(B) 7-[2，4- 二氯-3-(3-甲基-4，5- 二氫異3惡唑_5_基)苯基]-5，5-二甲基-6，6-二氧代-硫代吡喃并[4，3-b]吡唳-8-醇上萌發(fā)。
[0052]圖4顯示表達擬南芥野生型HPH)或其所示突變體的轉(zhuǎn)基因分離的Tl大豆植物處理后5天的除草劑噴霧試驗。顯示了來自單獨事件的植物。未轉(zhuǎn)化的對照植物標記為野生型。所使用的香豆酮衍生物除草劑為7-(2，6- 二氯-3-吡啶)_5，5- 二甲基-6，6- 二氧代-硫代吡喃并[4, 3-b]吡唳-8-醇。
[0053]圖5顯示表達擬南芥野生型HPH)或其所示突變體的轉(zhuǎn)基因分離的Tl玉米植物處理后4天的除草劑噴霧試驗。顯示了來自單獨事件的植物。未轉(zhuǎn)化的對照植物標記為野生型。所使用的香豆酮衍生物除草劑為7-(2，6- 二氯-3-吡啶)_5，5- 二甲基-6，6- 二氧代-硫代吡喃并[4, 3-b]吡唳-8-醇。
[0054]序列表
[0055]表1
[0056]
【權(quán)利要求】
1.控制植物栽培場所不需要的植被的方法，所述方法包括以下步驟: a)在該場所提供包含至少一個核酸的植物，其中所述核酸包含: (i)編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(mut-HPro)的核苷酸序列，和/或 (?)編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶或突變的尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶(mut-HST)的核苷酸序列， b)向該場所施用有效量的所述除草劑， 其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中⑴的核苷酸序列包含SEQID NO: 1，51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56 的序列、或其變體或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中(ii)的核苷酸序列包含SEQID NO:47或49的序列、或其變體或衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一的方法，其中植物包含至少一個另外的異源核酸，所述核酸包含(iii)編碼除草劑耐受酶的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之任一的方法，其中香豆酮衍生物除草劑組合一種或多種其它HPPD和/或HST靶向除草劑一起施用。
6.鑒定香豆酮衍生物除草劑的方法，所述方法通過使用由包含核苷酸序列SEQID NO:1, 51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56或其變體或衍生物的核酸編碼的mut-HPPD、和/或使用由包含核苷酸序列SEQ IDNO:47或49或其變體或衍生物的核酸編碼的mut-HST來進行，其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包含以下步驟: a)生成包含編碼mut-HPH)的核酸的轉(zhuǎn)基因細胞或植物，其中表達mut-HPH)； b)對a)的轉(zhuǎn)基因細胞或植物和對相同品種的對照細胞或植物施用香豆酮衍生物； c)測定施用所述測試化合物之后轉(zhuǎn)基因細胞或植物及該對照細胞或植物的生長或生存力，及 d)選擇使對照細胞或植物的生長較之轉(zhuǎn)基因細胞或植物的生長降低的測試化合物。
8.鑒定編碼對香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的mut-HPH)的核苷酸序列的方法，該方法包括: a)生成mut-HPH)編碼核酸的文庫， b)通過在細胞或植物中表達每種所述核酸且用香豆酮衍生物處理所述細胞或植物，篩選所得mut-HPro編碼核酸的群體， c)比較由所述mut-HPH)編碼核酸群體提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平與由對照HPPD編碼核酸提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平， d)選擇至少一種mut-HPH)編碼核酸，較之對照HPH)編碼核酸，其提供對“香豆酮衍生物”的顯著增加的耐受性水平， 其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中較之由對照HPH)編碼核酸提供的對香豆酮衍生物除草劑的耐受性，步驟d)中選出的mut-HPH)編碼核酸提供至少2倍的香豆酮衍生物除草劑耐受性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中抗性或耐受性通過生成包含步驟a)的文庫的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物和比較所述轉(zhuǎn)基因植物與對照植物而測定。
11.編碼mut-HPPD的分離的核酸，所述核酸包含SEQID NO: 2, 5，8，11，14，17，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，53，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，48，50、或其變體或衍生物。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中核酸可以通過權(quán)利要求8至10之任一中定義的方法鑒定。
13.轉(zhuǎn)化了野生型或mut-HPH)核酸的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中較之野生型品種的植物細胞，所述核酸在植物細胞中的表達導(dǎo)致對香豆酮衍生物除草劑增強的抗性或耐受性，其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物，其中野生型或mut-HPPD核酸包含選自以下的多核苷酸序列:a)如SEQ ID NO: 1，51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56 中所示的多核苷酸、或其變體或衍生物山)如SEQ ID NO:47或49中所示的多核苷酸、或其變體或衍生物；c)編碼如 SEQ ID NO:2，5，8，11，14，17，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，53，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，48，50中所示的多肽或其變體或衍生物的多核苷酸；d)包含a)至c)之任一多核苷酸的至少60個連續(xù)核苷酸的多核苷酸 '及e)與a)至d)之任一的多核苷酸互補的多核苷酸。
14.表達誘變的或重組的mut-HPH)的植物，其中所述mut-HPH)包含SEQID NO: 2，其中該氨基酸序列在一個或多個氨基酸位置上不同于相應(yīng)的野生型植物的HPH)的氨基酸序列，其中位置236的氨基酸不是丙氨酸；位置411的氨基酸不是谷氨酸；位置320的氨基酸不是亮氨酸；位置403的氨基酸不是甘氨酸；位置334的氨基酸不是亮氨酸；位置353的氨基酸不是亮氨酸；位置321的氨基酸不是脯氨酸；位置212的氨基酸不是纈氨酸；和/或位置407的氨基酸不是甘氨酸，其中當在植物中表達時，所述HPH)賦予植物較之相應(yīng)的野生型植物品種增加的除草劑耐受性，其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
15.表達誘變的或重組mut-HPH)的植物，其中所述mut-HPH)包含SEQID NO:53,其中該氨基酸序列在一個或多個氨基酸位置上不同于相應(yīng)的野生型植物的HPH)的氨基酸序列，其中位置293的氨基酸不是谷氨酰胺；位置335的氨基酸不是甲硫氨酸；位置336的氨基酸不是脯氨酸；位置337的氨基酸不是絲氨酸；位置363的氨基酸不是谷氨酸；位置368的氨基酸不是亮氨酸；位置422的氨基酸不是甘氨酸；位置385的氨基酸不是亮氨酸；位置393的氨基酸不是異亮氨酸；和/或位置421的氨基酸不是賴氨酸，其中當在植物中表達時，所述HPro賦予植物較之相應(yīng)的野生型植物品種增加的除草劑耐受性，其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
16.由包含權(quán)利要求13中定義的植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物或由權(quán)利要求14或15的植物產(chǎn)生的種子，其中就相對于野生型品種的種子增強的香豆酮衍生物除草劑抗性而言，該種子是純種(true breeding)的,其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
17.生產(chǎn)較之野生型品種的植物細胞具有增強的香豆酮衍生物除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，所述方法包括用包含mut-HPH)核酸的表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
18.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括:(a)用包含mut-HPH)核酸的表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞，以及(b)從植物細胞產(chǎn)生具有對香豆酮衍生物除草劑的增強的抗性的植物，其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中mut-HPH)核酸包括選自以下的多核苷酸序列:a)如 SEQ ID NO:1, `51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，3`9，41，43，45，52，54，56中所示的多核苷酸、或其變體或衍生物；b)如SEQ ID NO:47或49中所示的多核苷酸、或其變體或衍生物；c)編碼如SEQ ID NO: 2, `5，8，11，14，17，20，22，24，26，`28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，53，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，6`6，48，50 中所示的多肽或其變體或衍生物的多核苷酸；d)包含a)至c)之任一多核苷酸的至少60個連續(xù)核苷酸的多核苷酸；及 e)與a)至d)之任一的多核苷酸互補的多核苷酸。
20.權(quán)利要求17至19之任一的方法，其中表達盒還包含在植物中具有功能的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)及翻譯起始調(diào)控區(qū)。
21.鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分的方法，所述方法包括:i)提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分，其中該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分包含 SEQ IDNO:1, `51，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，18，19，21，23，25，27，29，`31，33，35，37，39，41，43，45，52，54，56中所示的多核苷酸或其變體或衍生物，其中多核苷酸編碼用作選擇標記的mut-HPH)多肽，其中該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分可以包含其它分離的多核苷酸；ii)使經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分與至少一種香豆酮衍生物化合物接觸；iii)確定該植物細胞、植物組織、植物或其部分是否受該抑制性化合物影響；以及iv)鑒定或選擇該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、植物組織、植物或其部分， 其中所述香豆酮衍生物除草劑包含具有選自表2式1、2、3和4的通式的化合物。
【文檔編號】C12N15/82GK103930548SQ201280053591
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月2日
【發(fā)明者】J·赫茨勒, S·特雷施, T·米茨納, M·維切爾, J·萊爾希爾, R·阿朋特, L·帕爾拉帕多, J·M·保利克 申請人:巴斯夫歐洲公司