改善植物耐旱性、氮利用效率和產(chǎn)量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于修飾植物中乙烯敏感性的多核苷酸和相關(guān)多肽。在缺水和低氮環(huán)境中，乙烯不敏感轉(zhuǎn)基因玉米植物產(chǎn)生比非轉(zhuǎn)基因植物更高的谷粒產(chǎn)量。通過(guò)轉(zhuǎn)基因在所需組織和器官，或特定植物發(fā)育期中的受控表達(dá)，改變乙烯感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而建立了在非生物脅迫下產(chǎn)量更佳的轉(zhuǎn)基因植物。
【專利說(shuō)明】改善植物耐旱性、氮利用效率和產(chǎn)量

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。
[0002] 置量
[0003] 許多植物的馴化已與產(chǎn)量顯著增加相關(guān)。自然群體中發(fā)生的大多數(shù)表型變異是連 續(xù)的并通過(guò)多種基因影響來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)造成馴化植物中產(chǎn)量顯著不同的特定基因的鑒別已成 為農(nóng)業(yè)研究的重要焦點(diǎn)。
[0004] 乙烯（C2H4)是影響植物中的多個(gè)發(fā)育過(guò)程和適應(yīng)性反應(yīng)，例如發(fā)芽、花和葉衰老、 果實(shí)成熟、葉或果實(shí)脫落、根結(jié)瘤、程序性細(xì)胞死亡以及反應(yīng)脅迫和病原體攻擊的氣態(tài)植物 激素。另外的乙烯影響包括水生植物的莖延伸、根中氣室（通氣組織）的發(fā)育、葉偏上彎 曲、莖和苗膨大（與發(fā)育遲緩相關(guān)）、枯萎中的雌性特征、某些物種中的果實(shí)生長(zhǎng)、黃化苗中 的頂端彎鉤閉合、根毛形成、鳳梨科（Bromeliaceae)的開(kāi)花、黃化苗的橫生以及基因表達(dá) (如，聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等）的增加。這些效應(yīng)有時(shí) 受到生物和非生物作用，如其他植物激素、其他生理信號(hào)和環(huán)境的影響。
[0005] 乙烯通過(guò)成熟果實(shí)釋放，還通過(guò)大多數(shù)植物組織，如對(duì)脅迫（如，干旱、擁擠、病原 體攻擊、溫度脅迫、創(chuàng)傷等）作出反應(yīng)以及在成熟和衰老器官中產(chǎn)生。遺傳篩選鑒別了十幾 個(gè)涉及植物中乙烯反應(yīng)的基因。
[0006] 乙烯由確定的途徑從甲硫氨酸產(chǎn)生，該途徑涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM或Ado Met)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀氨基酸1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC)，該轉(zhuǎn)化由ACC合酶推進(jìn)。然后通 過(guò)ACC氧化酶的作用由ACC的氧化產(chǎn)生乙烯。或者，ACC可通過(guò)ACC脫氨酶的作用轉(zhuǎn)化為 α-酮丁酸和氨氣。
[0007] 植物激素乙烯調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育以及植物中的生物和非生物脅迫反應(yīng)。此處示 出的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)顯示ARGOS基因的異位表達(dá)賦予植物乙烯不敏感性。與具有正常乙烯敏感性 的非轉(zhuǎn)基因植物相比，乙烯不敏感性玉米植物在缺水和低氮環(huán)境下產(chǎn)生更高的谷粒產(chǎn)量。 通過(guò)ARGOS轉(zhuǎn)基因在所需組織和器官，或特定植物發(fā)育期中的受控表達(dá)，通過(guò)設(shè)計(jì)改變乙 烯感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而建立了在非生物脅迫下產(chǎn)量更佳的轉(zhuǎn)基因植物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 通過(guò)本發(fā)明體現(xiàn)的方法包括：調(diào)節(jié)植物中的乙烯敏感性的方法，其包括：向植物 細(xì)胞中引入包含編碼跨膜蛋白質(zhì)的多核苷酸的重組構(gòu)建體，所述跨膜蛋白質(zhì)包含具有序列 PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序，其中富脯氨酸結(jié)構(gòu)域位于第一跨膜序列和第二 跨膜序列之間，所述多核苷酸有效連接至啟動(dòng)子；以及表達(dá)所述多核苷酸以調(diào)節(jié)所述植物 中的乙烯敏感性水平，同樣其中富脯氨酸基序（PRM)序列包括原始PRM(SEQ ID N0:88)或 變體 PRM(SEQ ID NO :102)。
[0009] 另外該方法其中：植物選自：玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水 稻、大麥、小米、花生、甘蔗、芒草、禾本科、可可、亞麻薺、番薯和茄屬；乙烯敏感性減少；所 述構(gòu)建體為過(guò)表達(dá)構(gòu)建體；所述構(gòu)建體包含SEQ ID N0 :88或SEQ ID N0 :102。
[0010] 另一個(gè)實(shí)施例包括調(diào)節(jié)植物中的乙烯敏感性的方法，其包括：向植物細(xì)胞中引入 包含編碼TPT結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的核苷酸構(gòu)建體，所述TPT結(jié)構(gòu)域與TM1SEQ ID N0 :90或 TM2SEQ ID N0:91具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸有效連接至啟動(dòng)子，所述TPT 結(jié)構(gòu)域還包括前述脯氨酸基序，以及將所述植物在干旱或低氮條件下種植；其中植物選自： 玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、禾本科、可 可、亞麻薺、番薯和茄屬，來(lái)自單子葉植物，來(lái)自玉米。
[0011] 實(shí)施例還包括由前述方法產(chǎn)生的植物，包括：其中在與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行比較 時(shí)，該植物具有降低的乙烯敏感性；其中該植物具有降低的對(duì)非生物脅迫的敏感性；其中 該植物具有降低的對(duì)干旱脅迫的敏感性；其中該植物具有降低的對(duì)擁擠脅迫的敏感性；其 中該植物具有降低的對(duì)淹水脅迫的敏感性。
[0012] 另外的實(shí)施例包括分離的蛋白質(zhì)，其包含：來(lái)自SEQ ID N0 :89的多肽的至少20個(gè) 連續(xù)氨基酸的多肽；SEQ ID N0:89的多肽；與SEQ ID N0:89的多肽具有至少80%序列同 一性且與其具有共同的至少一個(gè)線性表位的多肽，其中所述序列同一性使用BLAST2. 0在 默認(rèn)參數(shù)下測(cè)定；以及至少一個(gè)如前述實(shí)施例中所述的多肽。
[0013] 本發(fā)明的實(shí)施例包括：編碼具有乙烯調(diào)控活性且具有SEQ ID N0 :89的序列的蛋 白質(zhì)的分離的多核苷酸序列，以及具有乙烯調(diào)控活性且具有SEQ ID N0 :89的序列的多肽。
[0014] 提供了 ARGOS基因在植物中異位表達(dá)以影響植物的乙烯敏感性的方法。ZmARGOS 構(gòu)建體顯示出改善的耐旱性、氮利用效率以及降低的植物的乙烯敏感性。
[0015] 提供了用于控制植物生長(zhǎng)以增加植物在脅迫下的產(chǎn)量的組合物和方法。所述組合 物包括來(lái)自玉米、大豆、擬南芥、水稻和高粱的ARG0S序列。本發(fā)明的組合物包含選自SEQ ID N0 :1-37、40-91和96的氨基酸序列和核苷酸序列及其變體和片段。
[0016] 編碼ARG0S序列的多核苷酸在DNA構(gòu)建體中提供以便在所關(guān)注的植物中表達(dá)。還 提供了包含本發(fā)明的序列的表達(dá)盒、植物、植物細(xì)胞、植物部分和種子。在具體的實(shí)施例中， 該多核苷酸有效連接到組成型啟動(dòng)子。
[0017] 提供了調(diào)節(jié)植物或植物部分中ARG0S序列水平的方法。所述方法包括將包含本發(fā) 明ARG0S序列的異源多核苷酸引入到植物或植物部分中。ARG0S多肽的水平可被提高或降 低。此類方法可用于增加植物的產(chǎn)量；在一個(gè)實(shí)施例中，該方法用于增加谷類的谷粒產(chǎn)量。
[0018] 增加作物產(chǎn)量的方法，該方法包括表達(dá)包含多核苷酸的重組構(gòu)建體，所述多核苷 酸編碼包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序的跨膜蛋白質(zhì)，其中富脯氨 酸結(jié)構(gòu)域位于第一跨膜序列和第二跨膜序列之間，所述多核苷酸有效連接至啟動(dòng)子；以及 增加作物的產(chǎn)量，其中所述產(chǎn)量在低于正常氮水平下增加。在一個(gè)實(shí)施例中，較低氮水平與 正常氮水平相比少約10%至約40%。在一個(gè)實(shí)施例中，較低氮水平減少至與正常氮水平相 比少約50%。在一個(gè)實(shí)施例中，所施用的氮水平在植物的后生殖期減少。在一個(gè)實(shí)施例中， 作物是玉米并且是雜交玉米。
[0019] 改善玉米植物的農(nóng)藝參數(shù)的方法，該方法包括表達(dá)包含多核苷酸的重組構(gòu)建體， 所述多核苷酸編碼包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序的跨膜蛋白質(zhì)， 其中富脯氨酸結(jié)構(gòu)域位于第一跨膜序列和第二跨膜序列之間，所述多核苷酸有效連接至啟 動(dòng)子；以及改善至少一個(gè)選自根生長(zhǎng)、苗生物量、根生物量、籽粒數(shù)、穗大小以及干旱脅迫的 農(nóng)藝參數(shù)。
[0020] 玉米植物的標(biāo)記輔助選擇的方法，所述玉米植物表現(xiàn)出改變的內(nèi)源基因表達(dá)模 式，該方法包括獲得在編碼跨膜蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因組區(qū)域中包含等位變異的玉米植 物，所述跨膜蛋白質(zhì)包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的富脯氨酸基序，其中多核苷 酸的表達(dá)與不具有變異的對(duì)照玉米植物相比增加；選擇包含變異的玉米植物；以及通過(guò)標(biāo) 記輔助選擇方法建立包含變異的玉米植物的群體。在一個(gè)實(shí)施例中，變異存在于基因組區(qū) 域的調(diào)控區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，變異存在于多核苷酸的編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，變異存在 于基因組區(qū)域的非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施例中，多核苷酸的表達(dá)在不同的遺傳背景下差別性 增加。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 :示出來(lái)自各種植物物種的本發(fā)明ARGOS多肽之間關(guān)系的系統(tǒng)樹(shù)圖：玉米、水 稻、大豆、高粱和擬南芥。
[0022] 圖2 :具有鑒定保守區(qū)的玉米、水稻、大豆、高粱和擬南芥多肽序列的比對(duì)。蛋白質(zhì) 具有C-端附近的非常保守的富脯氨酸區(qū)。N-端通常是有差異的。蛋白質(zhì)很短，在58至146 個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)，平均110個(gè)氨基酸。
[0023] 圖3 :ZmARG0Sl、2和3與AtARGOSl和4的比對(duì)，其共有區(qū)和保守置換突出顯示。
[0024] 圖4 :ARG0S8轉(zhuǎn)化到近交系。從T1近交系田間觀察結(jié)果收集數(shù)據(jù)。（A)代表性穗、 (C)穗長(zhǎng)度、（B)植株高度、（D)莖桿直徑測(cè)量。
[0025] 圖 5 :ZmARG0Sl(SEQ ID NO :2)與 ZmARG0S8(SEQ ID NO :44)的序列比對(duì)。
[0026] 圖6 :ZmARG0Sl和ZmARG0S8的預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)。
[0027] 圖7 :在幼苗期3倍氮濃度下ZmARG0S8對(duì)植物生物量積累的影響。*表示與非轉(zhuǎn) 基因無(wú)效植物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其中P < 0. 05。
[0028] 圖8 :轉(zhuǎn)基因 ZmARG0S8在多個(gè)位置試驗(yàn)中的田間谷粒產(chǎn)量。含*事件表示與非轉(zhuǎn) 基因無(wú)效植物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其中P < 0. 1。
[0029] 圖9 :在2mM硝酸濃度下ZmARG0S8對(duì)植物和穗生長(zhǎng)的影響。*表示與非轉(zhuǎn)基因無(wú) 效植物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其中P < 0. 05。
[0030] 圖10 :在6. 5mM硝酸濃度下ZmARG0S8對(duì)植物和穗生長(zhǎng)的影響。*表示與非轉(zhuǎn)基因 無(wú)效植物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其中P < 〇. 05。
[0031] 圖11 :ZmARG0Sl過(guò)表達(dá)對(duì)玉米植物中乙烯生物合成和反應(yīng)、含TPT結(jié)構(gòu)域跨膜 ARGOS蛋白的結(jié)構(gòu)以及玉米中ARGOS基因表達(dá)的激素調(diào)節(jié)的影響。
[0032] (A)Ubi :ZmARG0Sl玉米轉(zhuǎn)基因植物中乙烯產(chǎn)量的增加。分析近交系PHWWE的V7植 物的兩個(gè)最上方圍繞葉。經(jīng)過(guò)20小時(shí)的時(shí)間收集乙烯，隨后使用氣相色譜測(cè)量。轉(zhuǎn)基因植 物（TR)和野生型分離群體（WT)中的乙烯產(chǎn)量根據(jù)組織鮮重計(jì)算。確定六次重復(fù)的平均值 土標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯示了三個(gè)轉(zhuǎn)基因事件（E1、E2和E3)。
[0033] ?)在存在0(上）、25(中）或100以]?(下）乙烯前體40：的情況下在黑暗中發(fā)芽 的ZmARGOSl轉(zhuǎn)基因植物（TR)和野生型分離群體（WT)的五天齡玉米幼苗。顯示了一個(gè)代 表性事件。
[0034] (C)玉米ARG0S蛋白和擬南芥同源物結(jié)構(gòu)的示意性圖示。玉米ZmARGOSl中的 TPT結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)預(yù)測(cè)跨膜螺旋（TM1，aa79-101 ;TM2, aall〇-134)和富脯氨酸基序（PRM， aal02PPLPPPPS109)(上）組成。跨膜螺旋（TM1和TM2)、連接環(huán)（富脯氨酸基序，PRM)以 及膜中N-和C-端序列的預(yù)測(cè)取向在下圖中示出。
[0035] (0)211^1?031和211^1?038基因表達(dá)通過(guò)激素處理誘導(dǎo)。給玉米￥3幼苗噴灑5(^皿 八〇：、5(^1484、2(^1細(xì)胞分裂素（^6-芐基氨基嘌呤）、10(^1茉莉酸（從）和1(^皿 IAA。收集2和4小時(shí)的葉組織用于RNA提取。溴化乙錠染色的凝膠作為加樣對(duì)照示出。
[0036] 圖12 :ARG0S基因的序列比對(duì)顯示了草物種之間家族成員和同源物中的保守區(qū)。 保守區(qū)鑒別為 LX1X2LPLX3LPPLX4X5PP(SEQ ID N0 :86)，其中 XI = L、V、I ;X2 = L、V、I、F ; X3 = V、L、A ;X4 = P、Q、S ;X5 = P、A。
[0037] 圖13 :ZmARG0Sl的過(guò)表達(dá)賦予擬南芥乙烯不敏感性
[0038] (A)在存在或不存在乙烯前體ACC(10 μ Μ)的情況下發(fā)芽的3天齡黑暗生長(zhǎng)幼苗的 比較。顯示了野生型Col-0 (WT)代表性幼苗、載體對(duì)照和ZmARGOSl轉(zhuǎn)基因植物。
[0039] (B)在存在10、50或lOOppm氣態(tài)乙烯的情況下發(fā)芽的3天齡黃化幼苗的比較。
[0040] (C)在24°C光照（16小時(shí)照明，強(qiáng)度大約120mE m-2S-l)和23°C黑暗（8小時(shí)）的 生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)的ZmARGOSl轉(zhuǎn)基因植物（右）和載體對(duì)照（左）。
[0041] 上圖，種植16天后（DAP)的植物顯示出轉(zhuǎn)基因植物中的較小蓮座；下圖，39-DAP 植物顯示出延遲開(kāi)花和葉衰老表型。
[0042] (D)在與（A)中相同的條件下生長(zhǎng)的ZmARGOSl轉(zhuǎn)基因（右上）和載體對(duì)照植物 (左上）的花序。轉(zhuǎn)基因植物顯示出壽命延長(zhǎng)和花被器官保留。ZmARGOSl轉(zhuǎn)基因植物的花 瓣和萼片保持飽滿（右下），而在載體對(duì)照植物（左下）中，花序上的相同位置花的花被器 官脫落。
[0043] 圖14 :ZmARG0Sl過(guò)表達(dá)對(duì)擬南芥中etol-Ι突變體表型的影響。
[0044] (A)過(guò)表達(dá)ZmARGOSl的三天齡黃化etol-Ι幼苗（右）缺乏etol-Ι突變體（左） 的組成型乙烯反應(yīng)表型。
[0045] (B)光照生長(zhǎng)的etol-Ι突變體植物（右）、過(guò)表達(dá)ZmARGOSl的etol-Ι植物（左） 和載體對(duì)照（中）的形態(tài)。
[0046] 圖15 :在過(guò)表達(dá)ZmARGOSl的擬南芥中乙烯產(chǎn)量的增加和乙烯誘導(dǎo)基因表達(dá)的減 少。
[0047] (A)在種植20天后在光照下生長(zhǎng)的ZmARGOSl轉(zhuǎn)基因事件（El、E2和E3)、載體對(duì) 照（Vec)和野生型Col-0 (WT)蓮座葉中的乙烯產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)22小時(shí)的時(shí)間收集乙烯，隨后使 用氣相色譜測(cè)量。乙烯產(chǎn)量根據(jù)組織鮮重計(jì)算。誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差（η = 4)。
[0048] (Β)過(guò)表達(dá)ZmARGOSl的轉(zhuǎn)基因植物中乙烯反應(yīng)基因表達(dá)的下調(diào)?？俁NA從3周齡 植物的蓮座葉中提取。三個(gè)ZmARGOSl事件（E1、E2和E3)和載體對(duì)照（Vec)的RNA印跡分 析使用10 μ gRNA/道進(jìn)行，用乙烯誘導(dǎo)基因 EBF2和AtERF5檢測(cè)。溴化乙錠染色的凝膠在 底部作為加樣對(duì)照示出。
[0049] 圖16 :玉米ARG0S1在ctrl-1突變體背景中的過(guò)表達(dá)。
[0050] (A)過(guò)表達(dá)ZmARGOSl或載體對(duì)照的ctrl-Ι突變體植物的三天齡黃化幼苗在不存 在外源乙烯的情況下顯示出三倍反應(yīng)。
[0051] (B)過(guò)表達(dá)ZmARGOSl或載體對(duì)照的三十天齡ctrl-Ι突變體植物顯示出組成型乙 烯反應(yīng)表型。
[0052] 圖17 :玉米和擬南芥含TPT結(jié)構(gòu)域的跨膜ARGOS蛋白的過(guò)表達(dá)賦予降低的乙烯敏 感性。
[0053] (A)過(guò)表達(dá)玉米ZmARG0Sl、ZmARG0S9、ZmARG0S8和ZmARG0S7以及擬南芥同源基因 AtARG0S3和AtARG0S4的3天齡黃化幼苗中乙烯敏感性降低的表型。幼苗在存在10 μ M ACC 的情況下生長(zhǎng)。顯示了代表性轉(zhuǎn)基因 Τ1幼苗。
[0054] (Β)擬南芥AtARG0S2的過(guò)表達(dá)降低乙烯敏感性。四個(gè)隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因事件 (E1-E4)和野生型Col-O(WT)的T3幼苗在存在0、1.0和2. 5μΜ ACC的情況下在黑暗中生 長(zhǎng)3天。顯示了 20株幼苗的下胚軸和根的相對(duì)長(zhǎng)度平均值。在0μ M ACC下的下胚軸和根 長(zhǎng)度設(shè)定為100%。星號(hào)表示W(wǎng)T和轉(zhuǎn)基因植物之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其中Ρ< 0.01 (t 檢驗(yàn)）。誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差（η = 20)。
[0055] 圖18 :轉(zhuǎn)基因擬南芥中截短和突變ZmARGOSl的功能分析。
[0056] (A) ZmARGOSl變體的示意圖。ZmARGOSl的N-和C-端序列截短分別生成 TR-nl (aa31-144)、n2 (aa62-144)和 n3 (aa92-144)以及 TR-cl (aal-134)、c2 (aal-124)和 c3(aal-114)。TR-nc(aa62-134)的N-和C-端序列截短。TMlm包含第一跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1) 中的P83D和A84D的氨基酸置換。TM2m攜帶第二跨膜結(jié)構(gòu)域（TM2)中的L120D、L121D和 L122D突變。L104D表示富脯氨酸基序（PRM)中L104D的單個(gè)氨基酸置換。
[0057] (B)在存在10 μ M ACC的情況下過(guò)表達(dá)ZmARGOSl和截短和突變ZmARGOSl的野生 型對(duì)照和轉(zhuǎn)基因擬南芥的3天齡黃化幼苗的下胚軸和根長(zhǎng)度的測(cè)量值。示出了 12-20株T1 苗/構(gòu)建體的平均值土SD。
[0058] 圖19 :ZmARG0Sl中富脯氨酸基序的單個(gè)氨基酸置換分析。
[0059] 玉米ZmARGOSl基因的富脯氨酸基序（aal02PPLPPPPS109)中的八個(gè)氨基酸的每個(gè) 被天冬氨酸置換。在擬南芥中突變ZmARGOSl變體和野生型ZmARGOSl在CaMV35S啟動(dòng)子的 控制下過(guò)表達(dá)。根據(jù)黃色熒光蛋白標(biāo)記基因的表達(dá)針對(duì)每個(gè)構(gòu)建體隨機(jī)選擇二十五個(gè)T1 種子。在存在10 μ M ACC的情況下使用黃化幼苗測(cè)定乙烯反應(yīng)。野生型Col-Ο植物（WT) 作為對(duì)照。示出了代表性幼苗。
[0060] 圖20 :ZmARG0Sl蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜中的定位。
[0061] (A)過(guò)表達(dá)帶FLAG-HA表位標(biāo)簽的ZmARGOSl (ZmARGOSl)和無(wú)標(biāo)簽ZmARGOSl對(duì)照 (CK)的擬南芥細(xì)胞級(jí)分的蛋白質(zhì)印跡分析。將總（T)勻漿超離心，以分離可溶性（S)和微 粒體膜（M)級(jí)分。蛋白質(zhì)印跡分析用抗FLAG抗體進(jìn)行。
[0062] (B)表達(dá)帶AcGFP標(biāo)簽的ZmARGOSl的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因擬南芥的代表性下胚軸細(xì)胞的落 射熒光顯微術(shù)顯示出與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜相關(guān)的綠色熒光。
[0063] (C)含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記的帶AcGFP標(biāo)簽的ZmARGOSl在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中的共 定位。
[0064] (D)含高爾基體標(biāo)記的AcGFP標(biāo)記ZmARGOSl在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中的共定 位。
[0065] 圖21 :來(lái)自多個(gè)物種的ARG0S多肽序列的比對(duì)鑒定保守跨膜片段。信息標(biāo)記如 下：
[0066] ID = SEQ ID，但草物種按照表1被標(biāo)識(shí)為argos#
[0067] St =比對(duì)序列組中的序列起始編號(hào)，
[0068] Ed =比對(duì)序列組中的序列結(jié)束編號(hào)，
[0069] TMH1/2 =跨膜片段，
[0070] Ident/TMH1，2 =同一性比率。
[0071] 利用Clustalw產(chǎn)生比對(duì)圖譜形式的與ZmARG0S8(SEQ ID NO :44)的比對(duì)。同一性 計(jì)算是與ZmARG0S8作為比較。
[0072] 圖22 :在2mM硝酸濃度下ZmARG0S8轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锷L(zhǎng)的影響。
[0073] 使三個(gè)UBI :ZmARG0S8轉(zhuǎn)基因事件以及無(wú)效對(duì)照在10升罐中生長(zhǎng)，在田間用2mM 硝酸處理。對(duì)八株植物/事件取樣，并收集以鮮重（g)計(jì)的苗和根生物量。（A) V7期的平 均苗（上）和根生物量（下）；(B) R3期的平均苗（上）和根生物量（下）。星號(hào)表示顯著 性，p < 0· 05。
[0074] 圖23 :在干旱脅迫下ZmARG0S8的過(guò)表達(dá)增加玉米產(chǎn)量。該圖描述了 10個(gè)獨(dú)立事 件的相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏漠a(chǎn)量增加，單位為蒲式耳/英畝。
[0075] 發(fā)明詳沭
[0076] -直存在對(duì)調(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性和乙烯反應(yīng)通路，以對(duì)植物發(fā)育或脅迫反應(yīng)進(jìn) 行操縱的需要。
[0077] 本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)改善植物中的產(chǎn)量和/或脅迫耐受性的基因的鑒定、表征和 操縱。產(chǎn)量和/或脅迫耐性的改善可通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯敏感性實(shí)現(xiàn)。
[0078] 本發(fā)明包括改變作物例如玉米的遺傳組成，使得此類作物可具有更高產(chǎn)量和/或 使其更能耐受脅迫條件的方法。此類公開(kāi)的用途是通過(guò)乙烯敏感性調(diào)節(jié)和/或乙烯反應(yīng)調(diào) 節(jié)同時(shí)增加產(chǎn)量和改善脅迫耐受性。
[0079] 乙烯反應(yīng)的調(diào)節(jié)包括但不限于：擁擠耐受性、結(jié)實(shí)和發(fā)育、在緊實(shí)土壤中生長(zhǎng)、淹 水耐受性、成熟和衰老、耐旱性和抗病性。本發(fā)明提供引起植物中的乙烯敏感性或乙烯反應(yīng) 的各種改變的方法和組合物，所述植物在正常或脅迫條件下產(chǎn)生改善的農(nóng)學(xué)性能。本發(fā)明 所公開(kāi)的植物與對(duì)照植物相比具有改變的乙烯敏感性。在一些植物中，改變的乙烯敏感性 涉及營(yíng)養(yǎng)組織、生殖組織、或營(yíng)養(yǎng)組織和生殖組織。本發(fā)明的植物可具有至少一種如下表 型，包括但不限于：與未轉(zhuǎn)化的植物相比在擁擠耐受性、結(jié)實(shí)和發(fā)育、在緊實(shí)土壤中生長(zhǎng)、淹 水耐受性、耐旱性、成熟和衰老以及抗病性方面的差異。
[0080] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術(shù)是本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)例僅為示例性的而不是限制性的。以 下內(nèi)容以舉例說(shuō)明的方式給出，而非意在限制本發(fā)明的范圍。
[0081] 借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導(dǎo)，這些公開(kāi)內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 將會(huì)想到本文所述公開(kāi)內(nèi)容的許多修改形式和其他實(shí)施例。因此，應(yīng)當(dāng)了解，這些公開(kāi)內(nèi)容 不限于所公開(kāi)的特定實(shí)施例，并旨在將修改形式和其他實(shí)施例包括在本文末尾所附權(quán)利要 求的范圍內(nèi)。雖然本文采用了特定術(shù)語(yǔ)，但它們僅以一般性和描述性含義使用而不出于限 制目的。
[0082] 除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物 學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。這類技 術(shù)在文獻(xiàn)中有完全的解釋。參見(jiàn)例如Langenheim and Thimann，BOTANY :PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS，John Wiley (1982) (Langenheim 和 Thimann，《植物 學(xué)：植物生物學(xué)及其與人類事務(wù)的關(guān)系》，約翰威立出版社，1982年）；CELL⑶LTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS，vol. 1，Vasil，ed. (1984)(《植物細(xì)胞培養(yǎng)與體細(xì)胞 遺傳學(xué)》，第 1 卷，Vasil 編輯，1984 年）；Stanier，et al.，THE MICROBIAL W0RLD，5thed.， Prentice-Hall (1986) (Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普倫蒂斯?霍爾出版社， 1986 年）；Dhringra and Sinclair，BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS，CRC Press (1985) (Dhringra和Sinclair,《植物病理學(xué)基本方法》，CRC出版社，1985年）；Maniatis，et al.， MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL(1982)(Maniatis 等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》， 1982 年）；DNA CLONING，vols. I and II，Glover，ed. (1985)(《DNA 克隆》，第 I 卷和 II 卷， Glover 編輯，I985 年）；0LIG0NUCLE0TIDE SYNTHESIS，Gait，ed. (1984)(《寡核苷酸合成》， Gait 編輯，1984 年）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，Hames and Higgins，eds. (1984)(《核 酸雜交》，Hames 和 Higgins 編輯，1984 年）和叢書(shū) METHODS IN ENZYMOLOGY，Colowick and Kaplan，eds，Academic Press，Inc. , San Diego，CA (《酶學(xué)方法》，Colowick 和 Kaplan 編 輯，學(xué)術(shù)出版社，加利福尼亞州圣地亞哥）。
[0083] 單位、前綴和符號(hào)可以它們SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5'到3'的 方向從左向右書(shū)寫(xiě)；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左向右書(shū)寫(xiě)。數(shù)值范圍包括限定 該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可通過(guò)它們通常知道的三字母符號(hào)表示或通過(guò)IUPAC-IUB 生化命名委員會(huì)（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號(hào) 表示。同樣，核苷酸可通過(guò)它們通常接受的單字母密碼表示。下面定義的術(shù)語(yǔ)通過(guò)參考本 說(shuō)明書(shū)整體進(jìn)行更完整的定義。
[0084] 在描述本發(fā)明時(shí)，將采用下面的術(shù)語(yǔ)，并且旨在如下文所指出的進(jìn)行定義。
[0085] 所謂"微生物"意指任何微生物（包括真核微生物和原核微生物），如真菌、酵母、 細(xì)菌、放線菌、藻類和原生動(dòng)物以及其他單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
[0086] 所謂"擴(kuò)增"意指構(gòu)建核酸序列的多個(gè)拷貝或與該核酸序列互補(bǔ)的多個(gè)拷貝，該構(gòu) 建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進(jìn)行。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 系統(tǒng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增（安大略省米西索加市加拿大基 因公司（Cangene，Mississauga, Ontario))、〇-β復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)（TAS) 和鏈置換擴(kuò)增（SDA)。參見(jiàn)例如 DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Persing,et al. ,eds. ,American Society for Microbiology,Washington, DC(1993)(《診斷分子微生物學(xué)：原理和應(yīng)用》，Persing等人編輯，《美國(guó)微生物學(xué)會(huì)》，華盛 頓，1993年）。擴(kuò)增的產(chǎn)物稱為擴(kuò)增子。
[0087] 術(shù)語(yǔ)"保守修飾的變體"同時(shí)適用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序 列而言，保守修飾的變體指編碼氨基酸序列的相同的或保守修飾的變體的那些核酸。由于 遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、 GCG和GCU全部編碼丙氨酸這種氨基酸。因而，在每個(gè)由密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，可將該 密碼子變更為所描述的相應(yīng)密碼子的任一種而不會(huì)改變所編碼的多肽。這種核酸變異為 "沉默變異"，代表保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文每種核酸序列還描述了該核酸的 每種可能的沉默變異。普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核酸中的每個(gè)密碼子（除了 AUG，它通常是 甲硫氨酸的唯一密碼子；一個(gè)例外是微球菌（Micrococcus rubens)，對(duì)于它來(lái)說(shuō)GTG是甲 硫氨酸密碼子（Ishizuka，et al.，（1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人， 1993年，《普通微生物學(xué)雜志》，第139卷，第425-432頁(yè)））可進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能上相同的 分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的每種沉默變異均隱含在每種所描述的多肽序列中并 以引用的方式并入本文。
[0088] 對(duì)于氨基酸序列，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列作出的會(huì)改 變、添加或缺失所編碼的序列中的單個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸的各個(gè)置換、缺失或添加， 在該變更導(dǎo)致氨基酸為化學(xué)類似的氨基酸所置換時(shí)，為"保守修飾的變體"。因而，還可變 更選自1至15的整數(shù)的任何數(shù)目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10個(gè) 變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經(jīng)修飾的多肽序列類似的生物活性。例 如，底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合通常為天然蛋白質(zhì)對(duì)于其天然底物的至少30%、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，優(yōu)選60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守置換 表是本領(lǐng)域所熟知的。
[0089] 下面的六個(gè)組各含有對(duì)彼此而言是保守置換的氨基酸：
[0090] 1)丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸⑴；
[0091] 2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E);
[0092] 3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);
[0093] 4)精氨酸（R)、賴氨酸⑷；
[0094] 5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、繳氨酸（V);以及
[0095] 6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0096] 還可參見(jiàn) Creighton，PROTEINS，W. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton，《蛋白 質(zhì)》，弗里曼公司，1984年）。
[0097] 本文所用的"基本上由......組成"意指在如下情況下目標(biāo)多核苷酸可包括額外 的序列：該額外的序列在嚴(yán)格雜交條件下不會(huì)選擇性地雜交至與該多核苷酸相同的cDNA， 且該雜交條件包括在〇. IX SSC和0. 1 %十二烷基硫酸鈉中在65 °C下進(jìn)行的洗滌步驟。 [0098] 就指定的核酸而言，所謂"編碼"意指包含翻譯成指定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì) 的核酸可在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)包含非翻譯序列（例如內(nèi)含子），或可缺少這種居間的非翻 譯序列（例如，如在cDNA中）。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過(guò)使用密碼子來(lái)確定的。通常， 氨基酸序列由核酸利用"通用"遺傳密碼來(lái)編碼。然而，可使用如在某些植物、動(dòng)物和真菌線 粒體、細(xì)菌山羊支原體（Mycoplasma capricolum) (Yamao，et al.，（1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA82 :2306-9(Yamao等人，1985年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第82卷，第2306-2309 頁(yè)）），或纖毛蟲(chóng)大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密碼的變體，當(dāng)用這些生物體 表達(dá)該核酸時(shí)。
[0099] 當(dāng)通過(guò)合成法制備或改變核酸時(shí)，可利用將在其中表達(dá)核酸的預(yù)期宿主的已知密 碼子偏好性。例如，盡管本發(fā)明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表 達(dá)，但可對(duì)序列進(jìn)行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量 偏好性，因?yàn)檫@些偏好性已被證實(shí)不同（Murray，et al.，（1989)Nucleic AcidsRes. 17: 477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁(yè)），將其以引用的方式并 入本文）。因而，具體氨基酸的玉米偏好密碼子可由來(lái)自玉米的已知基因序列得出。關(guān)于來(lái) 自玉米植物的28種基因的玉米密碼子使用在Murray等人（出處同上）的表4中列出。
[0100] 如本文所用，針對(duì)核酸的"異源"為起源于外來(lái)物種的核酸，或者，如果起源于相同 物種的話，則為通過(guò)蓄意的人為干預(yù)對(duì)其天然形式在組成和/或基因座方面進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性 修飾的核酸。例如，有效連接至異源結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子是來(lái)自不同于衍生該結(jié)構(gòu)基因的物 種的物種，或者如果是來(lái)自相同的物種，則對(duì)一者或二者由其初始形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性的修 飾。異源蛋白質(zhì)可起源于外來(lái)物種，或者，如果起源于相同物種，則通過(guò)蓄意的人為干預(yù)對(duì) 其天然形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性的修飾。
[0101] 所謂"宿主細(xì)胞"意指含有載體并且支持該表達(dá)載體的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌（E. coli)，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)、植物、兩棲動(dòng)物 或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞或雙子葉植物細(xì)胞，包括但不限于玉 米、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、卡諾拉油菜、大麥、小米和番茄。特別優(yōu)選的 單子葉宿主細(xì)胞是玉米宿主細(xì)胞。
[0102] 術(shù)語(yǔ)"雜交復(fù)合體"包括指由兩條相互選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核 酸結(jié)構(gòu)。
[0103] 在將核酸插入細(xì)胞的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"引入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，包括 指核酸摻入進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸可摻入進(jìn)細(xì)胞的基因組（例如染色體、質(zhì)粒、 質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)（例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0104] 術(shù)語(yǔ)"分離的"指諸如核酸或蛋白質(zhì)之類的物質(zhì)，該物質(zhì)實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其 天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。分離的物質(zhì)任選包含未 發(fā)現(xiàn)在其天然環(huán)境中與其一起的物質(zhì)。如本文所定義，"分離的"核酸也稱為"異源"核酸。 除非另有規(guī)定，否則術(shù)語(yǔ)"ARGOS核酸"意指包含編碼ARGOS多肽的多核苷酸（"ARGOS多核 苷酸"）的核酸。
[0105] 如本文所用，"核酸"包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物：其 以與天然存在的核苷酸（例如肽核酸）相似的方式雜交至單鏈核酸。
[0106] 所謂"核酸文庫(kù)"意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含且實(shí)質(zhì)上代表指定生 物體的基因組的整個(gè)被轉(zhuǎn)錄的部分。示例性的核酸文庫(kù)如基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 在標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)參考書(shū)有教導(dǎo)，如Berger and Kimmel，⑶IDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES (Berger 和 Kimmel，《分子克隆技術(shù)指南》），選自叢書(shū) METHODS IN ENZYM0L0GY， vol. 152, Academic Press，Inc.，San Diego, CA (1987)(《酶學(xué)方法》，第 152 卷，學(xué)術(shù)出版社， 加利福尼亞州圣地亞哥，1987 年）；Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，2nded.，vols. 1-3(1989) (Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第2版，第1-3卷， 1989 年）；以及 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY，Ausubel，etal.，eds，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons，Inc. (1994Supplement)(《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》，Ausubel等人編輯， 選自《實(shí)驗(yàn)室指南》，格林出版聯(lián)合公司與約翰威立父子出版公司的合資公司）。
[0107] 如本文所用，"有效連接"包括指第一序列（如啟動(dòng)子）和第二序列之間的功能性 連接，其中啟動(dòng)子序列起始或介導(dǎo)對(duì)應(yīng)第二序列的DNA的轉(zhuǎn)錄。一般來(lái)講，有效連接意指被 連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相 同的閱讀框內(nèi)。
[0108] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"植物"包括指整個(gè)植物、植物器官（例如葉、莖、根等）、種子 和植物細(xì)胞和它們的子代。如本文所用，植物細(xì)胞包括但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚、分生 組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。可用于本發(fā)明方法的植物 種類通常與適用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物，包 括以下屬的種：南瓜屬（Cucurbita)、薔薇屬（Rosa)、葡萄屬（Vitis)、胡桃屬（Juglans)、 草莓屬（Fragaria)、百脈根屬（Lotus)、苜猜屬（Medicago)、驢食草屬（Onobrychis)、三 葉草屬（Trifolium)、胡蘆巴屬（Trigonella)、紅豆屬（Vigna)、柑桔屬（Citrus)、亞麻 屬（Linum)、老鸛草屬（Geranium)、木薯屬（Manihot)、胡蘿卜屬（Daucus)、擬南芥屬（擬 南芥）、蕓苔屬（Brassica)、蘿卜屬（Raphanus)、白芥屬（Sinapis)、顛爺屬（Atropa)、辣 椒屬（Capsicum)、曼陀羅屬（Datura)、天仙子屬（Hyoscyamus)、番爺屬（Lycopersicon)、 煙草屬（Nicotiana)、爺屬（爺屬）、碧冬爺屬（Petunia)、毛地黃屬（Digitalis)、馬珠草 屬（Majorana)、菊苣屬（Ciahorium)、向日葵屬（Helianthus)、萵苣屬（Lactuca)、雀麥 屬（Bromus)、天門冬屬（Asparagus)、金魚(yú)草屬（Antirrhinum)、萱草屬（Heterocallis)、 Nemesis、天竺葵屬（Pelargonium)、黍?qū)伲≒anteum)、狼尾草屬（Pennisetum)、毛茛屬 (Ranunculus)、千里光屬（Senecio)、蛾蝶花屬（Salpiglossis)、黃瓜屬（Cucumis)、布洛 華麗屬（Browaalia)、大豆屬（Glycine)、豌豆屬（Pisum)、菜豆屬（Phaseolus)、黑麥草 屬（Lolium)、稻屬（Oryza)、燕麥屬（Avena)、大麥屬（Hordeum)、黑麥屬（Secale)、蔥屬 (Allium)和小麥屬（Triticum)。特別優(yōu)選的植物是玉米（Zea mays)。
[0109] 如本文所用，"產(chǎn)量"包括指收獲時(shí)針對(duì)谷粒水分（通常是15% )進(jìn)行了調(diào)整后的 每英畝谷類作物的蒲式耳數(shù)。谷粒水分是在收獲時(shí)的谷粒中測(cè)量。谷粒的經(jīng)調(diào)整的測(cè)試重 量確定為針對(duì)收獲時(shí)的谷粒水分水平進(jìn)行了調(diào)整的重量，單位磅/蒲式耳。
[0110] 如本文所用，"多核苷酸"包括指脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，所 述類似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì)：在嚴(yán)格雜交條件下其所雜交的核苷 酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻譯成與天然存在 的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因 的全長(zhǎng)序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術(shù)語(yǔ)包括指指定的序列及其互補(bǔ)序列。因 而，為了穩(wěn)定性或?yàn)榱似渌驅(qū)χ麈溸M(jìn)行了修飾的DNA或RNA是如該術(shù)語(yǔ)在本文所意指 的"多核苷酸"。此外，包含稀有堿基（如次黃嘌呤核苷）或修飾堿基（如三苯甲基化的堿 基）（僅舉兩個(gè)例子）的DNA或RNA是多核苷酸（如該術(shù)語(yǔ)在本文所用的）。應(yīng)當(dāng)理解，已 對(duì)DNA和RNA進(jìn)行了很多種修飾，這些修飾起到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的。本 文所用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸涵蓋多核苷酸的這類經(jīng)化學(xué)修飾、酶修飾或代謝修飾的形式，以及 病毒和細(xì)胞（包括特別是簡(jiǎn)單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞）特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式。
[0111] 術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這 些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物 的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0112] 本文所用的"啟動(dòng)子"包括指DNA的在轉(zhuǎn)錄起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋 白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。"植物啟動(dòng)子"是能夠引發(fā)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟 動(dòng)子。示例性的植物啟動(dòng)子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基 因的細(xì)菌獲得的那些啟動(dòng)子，所述細(xì)菌如農(nóng)桿菌（Agrobacterium)或根瘤菌（Rhizobium)。 例子為優(yōu)先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中的轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子被稱為"組織偏好的"。"細(xì)胞類型"特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)在一 個(gè)或多個(gè)器官中某些細(xì)胞類型中的表達(dá)，例如根或葉中的維管細(xì)胞。"誘導(dǎo)型"或"調(diào)控型" 啟動(dòng)子是處于環(huán)境控制下的啟動(dòng)子?？蓪?shí)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例 子包括無(wú)氧條件或光的存在。另一類型的啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，例如在花粉發(fā)育過(guò)程 中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。組織偏好的、細(xì)胞類型特異性的、發(fā)育調(diào)節(jié)的和誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子構(gòu)成 了"非組成型"啟動(dòng)子類別。"組成型"啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下活躍的啟動(dòng)子。
[0113] 術(shù)語(yǔ)"ARGOS多肽"指一條或多條氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括其片段、變體、同源 物、等位基因或前體（例如原前蛋白或前蛋白）。"ARGOS蛋白"包括ARGOS多肽。除非另有 規(guī)定，否則術(shù)語(yǔ)"ARGOS核酸"意指包含編碼ARGOS多肽的多核苷酸（"ARGOS多核苷酸"） 的核酸。
[0114] 如本文所用，"重組的"包括指已通過(guò)引入異源核酸進(jìn)行修飾的細(xì)胞或載體，或者 源于經(jīng)這樣修飾過(guò)的細(xì)胞的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)不以天然（非重組）形式的細(xì) 胞內(nèi)的相同形式存在的基因，或因?yàn)樾钜馊藶楦深A(yù)而表達(dá)原本異常表達(dá)、表達(dá)不足或根本 不表達(dá)的天然基因。本文所用的術(shù)語(yǔ)"重組的"不涵蓋通過(guò)天然發(fā)生的事件（例如自發(fā)突 變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座）進(jìn)行的細(xì)胞或載體的變更，所述事件為例如在沒(méi)有蓄意人為干 預(yù)的情況下發(fā)生的那些。
[0115] 本文所用的"重組表達(dá)盒"是具有一系列規(guī)定核酸元件的通過(guò)重組法或合成法產(chǎn) 生的核酸構(gòu)建體，其允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄?？蓪⒅亟M表達(dá)盒摻入到質(zhì)粒、染色體、 線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達(dá)載體的重組表達(dá) 盒部分還包含待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動(dòng)子。
[0116] 術(shù)語(yǔ)"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"在本文中可互換使用，指摻入進(jìn)蛋白質(zhì)、 多肽或肽（統(tǒng)稱"蛋白質(zhì)"）中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外進(jìn)行 限制，否則可涵蓋可以以與天然存在的氨基酸類似的方式發(fā)揮功能的天然氨基酸已知類似 物。
[0117] 應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)知道，本發(fā)明不僅僅涵蓋特定的示例性序列。在 給定位點(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)等同的氨基酸，但不影響編碼多肽的功能特性的核酸片段變化是本領(lǐng)域 熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一個(gè)疏水性較小的殘基例如甘氨酸， 或疏水性較大的殘基例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子置換。類似地，還可預(yù)期一個(gè) 帶負(fù)電的殘基置換為另一個(gè)，例如天冬氨酸置換為谷氨酸，或一個(gè)帶正電的殘基置換為另 一個(gè)，例如賴氨酸置換為精氨酸的變化產(chǎn)生功能等同的產(chǎn)物。還可預(yù)期使多肽分子的N-端 和C-端部分改變的核苷酸變化不會(huì)改變多肽的活性。每個(gè)所推薦的改變均在本領(lǐng)域的常 規(guī)技術(shù)內(nèi)，正如確定編碼產(chǎn)物的生物活性的保留。
[0118] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以是包含這樣氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列包含選 自表1中列出的SEQ ID N0的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入和/或 添加。置換可以是保守的，意指某氨基酸殘基被另一個(gè)具有類似物理和化學(xué)特性的殘基替 代。保守置換的非限制性例子包括含脂族基團(tuán)氨基酸殘基例如Ile、Val、Leu或Ala之間的 替代，以及極性殘基之間的替代，例如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn替代。
[0119] 來(lái)源于氨基酸缺失、置換、插入和/或添加的蛋白質(zhì)可在編碼其野生型蛋白質(zhì) 的DNA受到例如已知的定點(diǎn)誘變時(shí)制備（參見(jiàn)例如Nucleic Acid Researchl0(20): 6487-6500 (1982)(《核酸研究》，第10卷，第20期，第6487-6500頁(yè)，1982年），該文獻(xiàn)全文 據(jù)此以引用方式并入）。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)氨基酸"旨在意指可通過(guò)定點(diǎn)誘變 缺失、置換、插入和/或添加的氨基酸的可能數(shù)量。
[0120] 定點(diǎn)誘變可以例如如下使用與待突變的單鏈?zhǔn)删wDNA互補(bǔ)，不同的是具有特定 錯(cuò)配（即，所需突變）的合成寡核苷酸引物實(shí)現(xiàn)。也就是說(shuō)，上述合成寡核苷酸用作引起互 補(bǔ)鏈通過(guò)噬菌體合成的引物，然后所得的雙鏈DNA用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物 置于瓊脂上，從而允許噬菌斑從含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成。因此，理論上，50%的新菌落包 含突變?yōu)閱捂湹氖删w，而其余50 %具有原始序列。在允許與具有上述所需突變的DNA完 全相同的DNA雜交，但不與具有原始鏈的DNA雜交的溫度下，允許所得的噬菌斑與通過(guò)激酶 處理標(biāo)記的合成探針雜交。隨后，拾取與探針雜交的噬菌斑并培養(yǎng)以收集其DNA。
[0121] 允許生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入和/ 或添加，同時(shí)保持其活性的技術(shù)包括上述定點(diǎn)誘變，以及其他技術(shù)，例如用誘變劑處理基因 的那些，以及其中基因選擇性裂解以移除、置換、插入或添加所選的一個(gè)或多個(gè)核苷酸然后 連接的那些。
[0122] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以是包含這樣的核苷酸序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)，其包含選 自表1中列出的SEQ ID N0的核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、置換、插入和/或 添加。核苷酸缺失、置換、插入和/或添加可通過(guò)定點(diǎn)誘變或上述其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
[0123] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以是包含這樣的核苷酸序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)，其在嚴(yán)格 條件下與選自表1中列出的SEQ ID N0的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。
[0124] 術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格條件下"意指兩個(gè)序列在中等或高度嚴(yán)格條件下雜交。更具體地 講，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以例如根據(jù)DNA的長(zhǎng)度輕松地確定中等嚴(yán)格條件?；?條件在 Sambrook, et al. , Molecular Cloning ：ALaboratory Manual, third edition, chapters6and7, Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001 (Sambrook 等人，《分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，第6和7章，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2001年）中示出，并且包括使用硝化 纖維過(guò)濾器的預(yù)洗滌溶液5xSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)，約50%甲酰胺、2xSSC至 6xSSC、約40-50°C的雜交條件（或其他類似雜交溶液，例如Stark溶液，約50%甲酰胺、約 42°C )以及例如約40-60°C、0. 5-6xSSC、0. 1 % SDS的洗滌條件。優(yōu)選地，中等嚴(yán)格條件包括 在約50°C和6xSSC下雜交（和洗滌）。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以例如根據(jù)DNA的長(zhǎng)度輕松 地確定高度嚴(yán)格條件。
[0125] 一般來(lái)講，此類條件包括與中等嚴(yán)格條件相比，在較高溫度和/或較低鹽濃度下 雜交和/或洗滌（例如在約65°C，6xSSC至0. 2xSSC，優(yōu)選地6xSSC，更優(yōu)選地2xSSC，最優(yōu)選 地0. 2xSSC下雜交）。例如，高度嚴(yán)格條件可包括如上所定義的雜交，并且在大約65-68°C、 0. 2xSSC、0. 1%SDS下洗滌。在雜交和洗滌緩沖液中SSPE(lxSSPE為0. 15M NaCl、10mM NaH2P04 和 1. 25mM EDTA，pH7. 4)可代替 SSC(lxSSC 為 0. 15M NaCl 和 15mM 檸檬酸鈉）；在 雜交完成后進(jìn)行洗漆15分鐘。
[0126] 使用商購(gòu)獲得的雜交試劑盒也是可能的，其不使用放射性物質(zhì)作為探針。具體例 子包括用ECL直接標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)（安瑪西亞公司（Amersham))雜交。嚴(yán)格條件包括例如 使用包括在試劑盒中的雜交緩沖液在42°C下雜交4小時(shí)，該緩沖液補(bǔ)充有5% (w/v)阻斷 試劑和0. 5M NaCl，并且在0. 4% SDS、0. 5xSSC中55°C下洗滌20分鐘兩次，在2xSSC中室溫 下洗滌5分鐘一次。
[0127] 術(shù)語(yǔ)"選擇性雜交"包括指在嚴(yán)格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交 的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測(cè)地更高（例如，至少2倍于背景），并且基本上排 除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少40 %的序列同一性，優(yōu)選60-90 %的 序列同一'丨生，最優(yōu)選1〇〇%的序列同一'I"生（即互補(bǔ)性）。
[0128] 術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"包括指探針與其靶序列雜交的程度將比它與 其他序列雜交的程度可檢測(cè)地更高（例如，至少2倍于背景）的條件。嚴(yán)格條件是序列依 賴性的，并且將在不同環(huán)境下不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒別與探針 可最高達(dá)100%互補(bǔ)的靶序列（同源探測(cè)）?；蛘撸梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中的一 些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到較低程度的相似性（異源探測(cè)）。優(yōu)選地，探針長(zhǎng)為大約500個(gè)核苷酸， 但長(zhǎng)度可變化很大，從小于500個(gè)核苷酸到等于靶序列的整個(gè)長(zhǎng)度。
[0129] 如本文所用，"轉(zhuǎn)基因植物"包括指在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般 來(lái)講，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多 核苷酸可單獨(dú)整合進(jìn)基因組中，或者作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組中。"轉(zhuǎn)基因" 在本文中用來(lái)包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、 組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過(guò)從最初的轉(zhuǎn)基因進(jìn) 行有性雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"不涵蓋通過(guò)常規(guī) 植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或 自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組（染色體基因組或染色體外基因組）的改變。
[0130] 如本文所用，"載體"包括指用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。 載體常常是復(fù)制子。表達(dá)載體允許插入其中的核酸轉(zhuǎn)錄。
[0131] 以下術(shù)語(yǔ)用于說(shuō)明兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系：(a) "參 考序列"、（b) "比較窗口"、（c) "序列同一性"、（d) "序列同一性百分比"和（e) "實(shí)質(zhì)上相 同"。
[0132] 如本文所用，"參考序列"是用作序列比較基準(zhǔn)的確定的序列。參考序列可以是指 定序列的子集或全部；例如全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0133] 如本文所用，"比較窗口 "意指包括指多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該 比較窗口中的該多核苷酸序列相比于參考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失 (即空位），以便兩個(gè)多核苷酸的最佳比對(duì)。通常，比較窗口長(zhǎng)度為至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸， 任選可為30、40、50、100個(gè)或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，為避免由于在多核苷酸序列中 納入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。
[0134] 將核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。局部同源性算 法（BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2 :482(Smith 和 Waterman,1981 年，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》，第2卷，第482頁(yè)））可以對(duì)用于比較的序列進(jìn)行最佳比對(duì)；Needleman and Wunsch, (1970)J. 1\1〇1.13;[01.48:443-53(他6(1161]^11和￥11118(311，1970 年，《分子生物 學(xué)雜志》，第48卷，第443-453頁(yè)）的同源性比對(duì)算法（GAP);相似性搜索方法（Tfasta 和 Fasta) (Pearson and Lipman，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :2444 (Pearson 和 Lipman，1988年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第85卷，第2444頁(yè)））；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施 包括，但不限于：加利福尼亞州山景城Intelligenetics公司（Intelligenetics，Mountain View，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL，威斯康星遺傳學(xué)軟件包（Wisconsin GeneticsSoftware Package?:)第8版（可得自遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，GCX}?:程序，加利福尼 亞州圣地亞哥 Accelrys 公司（Genetics Computer Group，GCG'、programs，Accelrys， Inc.，San Diego, CA))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下 文獻(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明：Higginsh and Sharp，（1988)Gene73:237_44(Higgins 和 Sharp，1988 年， 《基因》，第 7 卷，第 237_244 頁(yè)）；Higgins and Sharp，（l989)CABIOS5:l5l_3(Higgins 和 Sharp, 1989年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》，第5卷，第151-153頁(yè)）；Corpet，et al.， (1988) Nucleic Acids Res. 16 :10881-90 (Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 頁(yè)）；Huang,et al·, (1992)Computer Applications in the Biosciences8: 155-65 (Huang等人，1992年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》，第8卷，第155-165頁(yè)）以及 Pearsonet al·，（1994)Meth. Mol. Biol. 24 :307-31 (Pearson 等人，1994 年，《分子生物學(xué)方 法》，第24卷，第307-331頁(yè)）。用于多個(gè)序列的最佳全局比對(duì)的優(yōu)選程序是PileUp (Feng and Doolittle，（1987) J. Mol. Evol·，25 :351-60 (Feng 和 Doolittle，1987 年，《分子進(jìn) 化學(xué)雜志》，第 25 卷，第 351-360 頁(yè)），其類似于 Higgins and Sharp，（1989)CABI0S5: 151-53 (Higgins和Sharp，1989年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》，第5卷，第151-153頁(yè)） 中描述的方法，將文獻(xiàn)以引用的方式并入本文?？捎糜跀?shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索的BLAST家族程 序包括：BLASTN，用于核苷酸查詢序列針對(duì)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢；BLASTX，用于核苷 酸查詢序列針對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢；BLASTP，用于蛋白質(zhì)查詢序列針對(duì)蛋白質(zhì)數(shù) 據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢；TBLASTN，用于蛋白質(zhì)查詢序列針對(duì)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢；以及 TBLASTX，用于核苷酸查詢序列針對(duì)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行查詢。參見(jiàn)⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Chapterl9, Ausubel, et al. , eds., Greene Publishing and Wiley_Interscience，New York(1995)(《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》，第19章 ，Ausubel 等人編輯，格林出版和威利-英特科學(xué)出版公司，紐約，1995年）。
[0135] GAP利用Needleman和Wunsch(出處同上）的算法來(lái)尋找兩個(gè)完整序列的比對(duì)，該 比對(duì)使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對(duì)和空位位置，并產(chǎn)生具有最大 數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對(duì)。它允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和 空位延伸罰分。GAP對(duì)于其插入的每個(gè)空位，必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇 大于零的空位延伸罰分，GAP對(duì)于每個(gè)插入的空位必須另外利用空位長(zhǎng)度乘以空位延伸罰 分。威斯康星遺傳學(xué)軟件包（Wisconsin Genetics Software Package^ )第10版中的默 認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以以選自 0-100的整數(shù)來(lái)表示。因而，例如，空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、30、40、50 或更大。
[0136] GAP給出具有最佳比對(duì)的家族中的一個(gè)成員。可能存在這個(gè)家族的許多成員，但其 他成員沒(méi)有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對(duì)的四個(gè)優(yōu)值因子：品質(zhì)、比率、同一性和相似性。 品質(zhì)是為了比對(duì)序列而最大化的度量（metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同 一性百分?jǐn)?shù)是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。將對(duì)應(yīng) 于空位的符號(hào)忽略。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的評(píng)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值）時(shí)，評(píng)定為 相似性。威斯康星遺傳學(xué)軟件包（Wisconsin Genetics Software Package1' )第10版中 所用的評(píng)分矩陣為 BL0SUM62(參見(jiàn) Henikoff and Henikoff，（1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA89 :10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第10915 頁(yè)））。
[0137] 除非另外指明，否則本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2. 0程 序包，采用默認(rèn)參數(shù)獲得的值（Altschul，et al.，（1997)Nucleic Acids Res. 25 : 3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402頁(yè)）。
[0138] 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解的，BLAST搜索假定蛋白質(zhì)可以隨機(jī)序列建模。然 而，許多真實(shí)蛋白質(zhì)包含非隨機(jī)序列區(qū)，該非隨機(jī)序列可為同聚段、短周期重復(fù)或富含一種 或多種氨基酸的區(qū)域。這種低復(fù)雜性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白質(zhì)之間比對(duì)，盡管該蛋白質(zhì)的 其他區(qū)域完全不相似?？刹捎枚喾N低復(fù)雜性過(guò)濾程序來(lái)減少這種低復(fù)雜性比對(duì)。例如，可單 獨(dú)使用或聯(lián)合使用 SEG(Wooten and Federhen，（1993)Comput.Chem. 17 :149-63 (Wooten 和 Federhen，1993 年，《計(jì)算化學(xué)》，第 17 卷，第 149-163 頁(yè)））和 XNU (Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States，1993 年，《計(jì)算化學(xué)》，第 17 卷，第 191-201頁(yè)））低復(fù)雜性過(guò)濾程序。
[0139] 在兩條核酸或多肽序列的情形中，本文所用的"序列同一性"或"同一性"是指當(dāng)在 指定的比較窗口上進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)兩個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分 數(shù)針對(duì)蛋白質(zhì)使用時(shí)，認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基 酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)（例如電荷或疏水性）的其他氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變 分子的功能性質(zhì)。如果序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的 保守性質(zhì)。差別在于這種保守置換的序列被說(shuō)成具有"序列相似性"或"相似性"。作出這 個(gè)調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換評(píng)定為部分錯(cuò)配而不 是完全錯(cuò)配，從而增加序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守 置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。例如，根據(jù)Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :ll_17(Meyers 和 Miller，1988 年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的 應(yīng)用》，第4卷，第11-17頁(yè)）的算法計(jì)算保守置換的分?jǐn)?shù)，例如如在程序PC/GENE (美國(guó)加利 福尼亞州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中所實(shí)現(xiàn)的。
[0140] 本文所用的"序列同一性百分?jǐn)?shù)"意指通過(guò)在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序 列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列（不包含添加或缺 失）相比包含添加或缺失（即空位），以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。該百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的： 確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù) 目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序 列同一性百分?jǐn)?shù)。
[0141] 術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的"實(shí)質(zhì)上相同"意指利用所描述的比對(duì)程序之一采用標(biāo)準(zhǔn)參 數(shù)與參考序列比較時(shí)，多核苷酸包含具有50-100%之間的序列同一性，優(yōu)選至少50%的序 列同一'I"生，優(yōu)選至少60 %的序列同一'丨生，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 % 且最優(yōu)選至少95%序列同一性的序列。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨 基酸相似性、閱讀框定位等等適當(dāng)調(diào)整這些值以確定兩個(gè)核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相 應(yīng)同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)同一性通常意指55-100%之間的序列同一 性，優(yōu)選至少55 %，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %、80 %、90 %，最優(yōu)選至少95 %。
[0142] 在肽的情形中，術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)相同"指肽包含在指定比較窗口上與參考序列具有 55-100%之間的序列同一性；優(yōu)選與參考序列具有至少55%的序列同一性，優(yōu)選60%，優(yōu) 選70%，更優(yōu)選80%，最優(yōu)選至少90 %或95 %的序列同一性。優(yōu)選地，利用Needleman和 mmsch(出處同上）的同源比對(duì)算法進(jìn)行最佳比對(duì)。兩條肽序列是實(shí)質(zhì)上相同的指示是，一 種肽可與針對(duì)第二種肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別 僅在于保守置換的話，則這兩種肽實(shí)質(zhì)上相同。此外，當(dāng)某種肽與第二種肽差別在于非保守 變化時(shí)，如果抗體識(shí)別的表位實(shí)質(zhì)上相同，則它們實(shí)質(zhì)上相同。"實(shí)質(zhì)上相似的"肽共有如上 所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可在于保守氨基酸變化。
[0143] 本發(fā)明公開(kāi)了 ARGOS多核苷酸和多肽。本發(fā)明的新型核苷酸和蛋白質(zhì)具有表明它 們調(diào)控細(xì)胞數(shù)量并因而在植物發(fā)育中起重要作用的表達(dá)模式。該多核苷酸在多種植物組織 中表達(dá)。該多核苷酸和多肽因而提供了操縱植物發(fā)育來(lái)改變種子和營(yíng)養(yǎng)組織發(fā)育、時(shí)間安 排或組成的機(jī)會(huì)。這可用于產(chǎn)生不育植物、無(wú)種子植物或具有改變的胚乳組成的植物。
[0144] 核酸
[0145] 本發(fā)明特別提供包括ARGOS多核苷酸在內(nèi)的RNA、DNA及它們的類似物和/或嵌合 體的分離的核酸。
[0146] 本發(fā)明還包括為在不同生物體中表達(dá)而經(jīng)優(yōu)化的多核苷酸。例如，對(duì)于多核苷酸 在玉米植物中的表達(dá)，可變更該序列以解決特定的密碼子偏好性和改變GC含量，如根據(jù) Murray等人（出處同上）所述。關(guān)于來(lái)自玉米植物的28種基因的玉米密碼子使用在Murray 等人（出處同上）的表4中列出。
[0147] 本發(fā)明的ARGOS核酸包括分離的ARGOS多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0148] (a)編碼ARGOS多肽及其經(jīng)保守修飾的和多態(tài)性的變體的多核苷酸；
[0149] (b)與（a)或（b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；
[0150] (c) (a)或（b)的多核苷酸的互補(bǔ)序列。
[0151] 下面的表1列出了本文公開(kāi)的多核苷酸和多肽的具體成份
[0152] 表 1·
[0153]

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性的方法，包括： a. 在植物細(xì)胞中引入包含編碼跨膜蛋白質(zhì)的多核苷酸的重組構(gòu)建體，所述跨膜蛋白質(zhì) 包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中所述脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域位 于第一跨膜序列與第二跨膜序列之間，所述多核苷酸可操作地連接至啟動(dòng)子；以及 b. 表達(dá)所述多核苷酸以調(diào)節(jié)所述植物中的乙烯敏感性的水平。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脯氨酸富含基序（PRM)序列包括： a. 原始 PRM(SEQ ID N0:88)，或 b. 變體 PRM(SEQ ID N0:102)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物選自：玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小 麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、芒草、禾本科、可可、亞麻薺、番薯和茄屬。
4. 一種調(diào)節(jié)植物中乙烯敏感性的方法，包括： a. 在植物細(xì)胞中引入包含編碼TPT結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的核苷酸構(gòu)建體，所述TPT結(jié)構(gòu) 域與TM1SEQ ID N0:90或TM2SEQ ID N0:91具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸可操 作地連接至啟動(dòng)子，所述TPT結(jié)構(gòu)域還包括根據(jù)權(quán)利要求2中所述的脯氨酸基序；以及 b. 將所述植物種植在干旱或低氮條件下。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物選自：玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小 麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、禾本科、可可、亞麻薺、番薯和茄屬。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自玉米。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乙烯敏感性降低。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述構(gòu)建體為過(guò)表達(dá)構(gòu)建體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述構(gòu)建體包含SEQ ID NO :88或SEQ ID NO: 102。
11. 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中當(dāng)與未轉(zhuǎn)化的植物相比時(shí)，所述植物具有 降低的乙烯敏感性。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有降低的對(duì)非生物脅迫的敏 感性。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有降低的對(duì)干旱脅迫的敏感 性。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有降低的對(duì)擁擠脅迫的敏感 性。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有降低的對(duì)淹水脅迫的敏感 性。
17. -種分離蛋白質(zhì)，其包含選自下列的成員： a. 來(lái)自SEQ ID NO :89的多肽的至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽； b. SEQ ID NO :89 的多肽； c. 與SEQ ID NO :89的多肽具有至少80%序列同一性且與其具有共同的至少一個(gè)線性 表位的多肽，其中所述序列同一性使用BLAST2. 0在默認(rèn)參數(shù)下測(cè)定；以及 d.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成員所編碼的至少一個(gè)多肽。
18. -種分離的多核苷酸序列，其編碼具有乙烯調(diào)控活性且具有SEQ ID NO :89的序列 的蛋白質(zhì)。
19. 一種具有乙烯調(diào)控活性且具有SEQ ID NO :89的所述序列的多肽。
20. -種增加作物植物的產(chǎn)量的方法，所述方法包括 a. 表達(dá)包含編碼跨膜蛋白質(zhì)的多核苷酸的重組構(gòu)建體，所述跨膜蛋白質(zhì)包含具有序列 PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中所述脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域位于第一跨膜序 列和第二跨膜序列之間，所述多核苷酸可操作地連接至啟動(dòng)子；以及 b. 增加所述作物的所述產(chǎn)量，其中所述產(chǎn)量在低于正常氮水平下增加。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述較低氮水平與正常氮水平相比少約10%至 約 40%。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述作物是玉米。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述玉米是雜交玉米。
24. -種改善玉米植物的農(nóng)藝參數(shù)的方法，所述方法包括 a. 表達(dá)包含編碼跨膜蛋白質(zhì)的多核苷酸的重組構(gòu)建體，所述跨膜蛋白質(zhì)包含具有序列 PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域位于第一跨膜序列和 第二跨膜序列之間，所述多核苷酸可操作地連接至啟動(dòng)子；以及 b. 改善至少一個(gè)選自根生長(zhǎng)、苗生物量、根生物量、籽粒數(shù)、穗大小和干旱脅迫的農(nóng)藝 參數(shù)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述農(nóng)藝參數(shù)在低氮水平下改善。
26. -種玉米植物的標(biāo)記輔助選擇的方法，所述玉米植物表現(xiàn)出改變的內(nèi)源基因表達(dá) 模式，所述方法包括： a. 獲得在編碼跨膜蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因組區(qū)域中包含等位變異的玉米植物，所述 跨膜蛋白質(zhì)包含具有序列PPLXPPPX(SEQ ID N0:96)的脯氨酸富含基序，其中所述多核苷酸 的表達(dá)與不具有所述變異的對(duì)照玉米植物相比增加； b. 選擇包含所述變異的所述玉米植物；以及 c. 通過(guò)標(biāo)記輔助選擇方法建立包含所述變異的玉米植物的群體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述變異存在于所述基因組區(qū)的所述調(diào)控區(qū)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述變異存在于所述多核苷酸的所述編碼區(qū)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述變異存在于所述基因組區(qū)的所述非編碼 區(qū)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸的所述表達(dá)在不同遺傳背景下差 別性地增加。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104093842SQ201280053864
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月31日
【發(fā)明者】R.L.阿奇巴德, 郭梅, R.古普塔, M.魯佩, K.舍爾林, 史金瑞, C.R.西蒙斯, 王海音, 武璟瑞 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司