改進(jìn)的重組人膽鹽刺激脂酶制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及改進(jìn)的重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL)制劑，包括適于形成rhBSSL的凍干制劑的制劑、rhBSSL的凍干制劑本身、rhBSSL的單位劑型和rhBSSL的重建制劑。本發(fā)明的制劑包含rhBSSL、結(jié)晶填充劑和是與所述結(jié)晶填充劑不同的化學(xué)實(shí)體的非晶穩(wěn)定劑。本發(fā)明的制劑具有一種或多種期望的性質(zhì)，包括涉及在溶液中的穩(wěn)定性、減少聚集和/或不溶性聚集體的形成的那些。本發(fā)明的凍干制劑具有藥學(xué)實(shí)用性，特別是用于向人類嬰兒施用rhBSSL。
【專利說明】改進(jìn)的重組人膽鹽刺激脂酶制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及改進(jìn)的重組人膽鹽刺激脂酶(recombinant human bilesalt-stimulated lipase, rhBSSL)制劑,包括適于形成rhBSSL的凍干制劑的制劑、rhBSSL的凍干制劑本身、rhBSSL的單位劑型和rhBSSL的重建制劑。本發(fā)明的制劑具有一種或多種期望的性質(zhì)，包括涉及在溶液中的穩(wěn)定性、減少的聚集和/或不溶性聚集體的形成的那些。本發(fā)明的凍干制劑具有藥學(xué)實(shí)用性(pharmaceutical utility),尤其是向人類嬰兒施用 rhBSSL。
【背景技術(shù)】
[0002]在成年人中，輔脂酶依賴性胰脂酶(colipase-dependentpancreaticlipase, PTL)是負(fù)責(zé)膳食甘油三酯(TG)消化的主要酶。在新生嬰兒，且尤其是早產(chǎn)兒中，外分泌胰腺功能沒有完全發(fā)育(Manson&Weaver, 1997 ；Arch DisChild Fetal Neonatal Ed, 76:206-211)。因此，相比成年人胰腺，嬰兒中胰脂酶的表達(dá)較低(Lombardo, 2001 ；Biochim Biophys Acta, 1533:1-28 ；Li 等人 1007 ；Pediatr Res, 62:537-541)，相比成年人，在建立脂肪消化期間的管腔內(nèi)的PTL活性要低得多(Fredrikzon等人,1978 ；Paediatr Res, 12:138-140)且脂肪吸收不良并不少見(Carnielli 等人，1998 ；Am J Clin Nutr67:97-103 ； Chappe 11 等人，1986 ；J Pediatr, 108:439-443)。Lindquist 和 Hernell(1990 ;Curr Opin Clin Nutr MetabCare, 13:314-320)已綜述了生命早期中脂類的消化和吸收的主題。
[0003]在出生時(shí)，人類胎兒從以葡萄糖為主的能量供應(yīng)轉(zhuǎn)換為以脂類為主的能量供應(yīng)，因?yàn)橹净蚋唧w的TG作為新生兒的主要能量物質(zhì)，其構(gòu)成了人乳(human milk)和大多數(shù)嬰兒配方食品(infant formulae)中總能量的一半。因此,膳食TG的有效消化和吸收對(duì)嬰兒生長和發(fā)育是至關(guān)重要的。在母乳喂養(yǎng)(breastfed)的嬰兒中，由寬特異性脂酶，膽鹽刺激脂酶(BSSL) (EC3.1.1.13)補(bǔ)償?shù)蚉TL活性，膽鹽刺激脂酶(BSSL)從泌乳乳腺分泌至乳中以及從外分泌胰腺分泌。在早產(chǎn)兒中，母乳進(jìn)食期間母乳似乎提供了十二指腸內(nèi)含物中BSSL的主要部分(Fredrikzon等人，1978)，且母乳喂養(yǎng)的嬰兒比配方食品喂養(yǎng)(formula-fed)的嬰兒更有效地消化和吸收脂肪以及重要地長的長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA) ( Bernback等人，1990 ；J Clin Invest, 85:1221-1226 ；Carnielli 等人，1998)。
[0004]人乳作為足月兒以及早產(chǎn)兒營養(yǎng)來源的優(yōu)勢已在許多研究和專家小組的建議中被證明。因此，世界范圍內(nèi)推薦的喂養(yǎng)方法是母乳喂養(yǎng)。然而，由于醫(yī)學(xué)原因，母乳喂養(yǎng)或喂食母親自己的母乳并不總是可能的或推薦的，且由于一些其它的原因可能不會(huì)進(jìn)行母乳喂養(yǎng)。在嬰兒不是母乳喂養(yǎng)的情況下，通常使用嬰兒配方食品或庫存的和非庫存的巴氏消毒的和/或冷凍母乳。然而，在某些方面，對(duì)新生兒來說所有這些在營養(yǎng)上都是次優(yōu)的(suboptimal)。
[0005]由于病毒(人類免疫缺陷病毒[HIV]、巨細(xì)胞病毒[CMV]、肝炎)感染和較低程度的致病菌的傳播的風(fēng)險(xiǎn)，在所謂乳庫(milk bank)中使用的供體乳在使用前通常進(jìn)行巴氏消毒。然而，BSSL在人乳的巴氏消毒過程中被滅活(BjdrkSten等人，1980 ；Br MedJ, 201:267-272);其也不存在于任何現(xiàn)有的為早產(chǎn)的或足月新生兒提供營養(yǎng)的許多不同的配方食品中。相比巴氏消毒的母乳，已顯示在喂養(yǎng)新鮮母乳的嬰兒中脂肪吸收、體重增加和線性生長更高(Andersson 等人 2007 ;Williams 等人，1978 ；Arch Dis Child43:555-563)。這是為什么倡導(dǎo)不能喂養(yǎng)其自己母親的乳汁的新生兒、尤其是早產(chǎn)兒應(yīng)喂養(yǎng)來自其他母親的非巴氏消毒的乳汁的一個(gè)原因(Bjdrksten等人，1980)。
[0006]如由BUickbe丨名和 Hernell (1981 ;Eur J Biochem, 116:221-225)和ffang&Johnson(1983)報(bào)道的，已將天然人乳BSSL(hBSSL-ΜΑΜ)純化至均一性，且Nilsson (1990 ；Eur J Biochem, 192:543-550)鑒定了人 BSSL 的 cDNA 序列并在 W091/15234和TO91/18923中公開。來自數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室的表征和序列研究表明，蛋白質(zhì)hBSSL-MAM和胰羧酸酯水解酶(carboxylic ester hydrolase,CEH)(也稱為胰BSSL) 二者是同一基因的產(chǎn)物(例如，Baba 等人，1991 ;Biochem, 30:500-510 ；Hui 等人，1990 ；FEBS Lett, 276:131-134 ；Reue等人，1991 ；J Lipid Res, 32:267-276)。在分離cDNA序列之后，已在包括轉(zhuǎn)基因綿羊(rhBSSL-OVI)中產(chǎn)生了 rhBSSL 及其變體；例如在 US5716817、W094/20610 和 W099/54443中描述的。
[0007]Andersson 等人，2007 (Acta Paediatr96:1445-1449)報(bào)道了顯不母親自己的乳汁的巴氏消毒降低了早產(chǎn)兒的脂肪吸收和生長的隨機(jī)研究，并提出這些影響是由于基于乳汁的BSSL經(jīng)由巴氏消毒的滅活。最近，兩個(gè)隨機(jī)和對(duì)照臨床試驗(yàn)報(bào)道了，向巴氏消毒的母乳或嬰兒配方食品添加rhBSSL并施用至早產(chǎn)兒，顯示這些嬰兒的生長速度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善。例如，如由Maggio等人在“The Power or ProgrammingConference2010:1nternational conference on developmental origins of health anddisease”, Munich, 2010 年 5 月 6-8 日中展不的，及如由 Carnielli 等人在“The3rdcongressof the European Society of Paediatric Societies，，，Copenhagen, 2010 年 10 月 24 日中展示的。后者的展示還報(bào) 道了相比具有安慰劑的嬰兒配方食品，當(dāng)將rhBSSL添加到嬰兒配方食品時(shí)，總脂肪吸收系數(shù)(CFA)及二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)-兩種醫(yī)學(xué)和發(fā)育重要的長鏈多不飽和脂肪酸酸(LCPUFA)的改善的腸道吸收趨勢中小的但非統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加。
[0008]如上所述，來自母乳的BSSL是與由成熟的人胰腺產(chǎn)生的CEH相同的脂酶，其對(duì)成年人中TG的消化是重要的。因此，rhBSSL也已被開發(fā)作為用于成年人中由于慢性胰腺炎或囊性纖維化(CF)的外分泌胰腺功能不全(PI)的療法(例如，Strandvik等A , 2004 ； 18th North American Cystic Fibrosis Conference, St Louis MI ;摘要發(fā)表于Pediatr Pulmonol，S27:333)。最近已宣布，用rhBSSL的口服混懸液(其中描述為“布塞脂酶a (bucelipase alpha)”)，以170mg每天3次的劑量持續(xù)5_6天，以評(píng)價(jià)對(duì)患有CF和PI的成年患者脂肪吸收的影響的另外的II期試驗(yàn)(臨床試驗(yàn).政府標(biāo)識(shí)號(hào) NCT00743483)已完成，且結(jié)果展不在第 34 屆 European Cystic Fibrosis SocietyConference, Hamburg, Germany, 2011 年 6 月 8 日至 11 日中。
[0009]隨著rhBSSL的治療效用的越來越多的證據(jù)，提供具有特定屬性的、和/或可用于向成年人或向嬰兒、特別地向早產(chǎn)兒施用的用于制藥用途的rhBBSL的制劑將是期望的。例如，提供顯示改善的或延長的穩(wěn)定性，例如在減少的高分子量聚集體的形成方面；具有實(shí)用的或方便的存儲(chǔ)條件；具有更可靠和更均勻的重建屬性；顯示較長的保質(zhì)期；具有適合于制造或包裝的特征；和/或具備其它期望屬性的rhBBSL的制劑將是期望的。
[0010]治療性蛋白質(zhì)通常被提供為凍干制劑，該凍干制劑包含一定量的感興趣的蛋白質(zhì)及一種或多種制藥賦形劑，例如填充劑(bulking agent)、穩(wěn)定劑、和/或鹽。凍干(還稱為冷凍干燥)指的是使用低的溫度和壓力以通過升華(即從固態(tài)到蒸汽而不通過液相的相的變化)從液體制劑中除去溶劑通常為水的過程。凍干通常包括三個(gè)基本步驟:(I)冷凍；
(2)一級(jí)干燥(primary drying);和(2) 二級(jí)干燥(secondary drying)。
[0011]冷凍干燥通常被認(rèn)為對(duì)生物分子例如蛋白質(zhì)的生物活性是破壞性的。損害程度隨著不同生物分子和不同條件有很大差別，且不同的研究者已研究了不同的系統(tǒng)。水溶液的冷凍可造成溶質(zhì)濃度或pH的初始增加，相比冷凍本身其對(duì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可更具破壞性。填充劑可被用于旨在增強(qiáng)固體團(tuán)塊(solid cake)的形成和干燥能力，或改善其藥物優(yōu)美性(elegance)。穩(wěn)定劑可被用于旨在穩(wěn)定生物分子的活性，取決于系統(tǒng)而具有有限的且不同程度的成功。Crowe,等人(1987 ；Biochem J ；242:1-10)描述了通過糖類穩(wěn)定干燥的磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)，并還在“The trehalose myth revisited:1ntroduction to a symposiumon stabilization of cells in the dry state”Cryobiology43, 89-105 (2001)中綜述了細(xì)胞的海藻糖穩(wěn)定機(jī)制的理解。
[0012]不同的研究人員已報(bào)道了使用多種賦形劑和賦形劑的組合以保護(hù)多種生物分子，包括以下實(shí)例。
[0013]W003/009817 描述了使用甘露醇或甘氨酸作為填充劑，以形成IGG抗體的穩(wěn)定的凍干制劑。
[0014]W02006/075072描述了用于生物傳感器的多種酶包括脂酶的冷凍干燥的制劑。甘
氨酸和甘露醇在其中用作結(jié)晶填充劑，而蛋白質(zhì)通常呈非晶態(tài)。
[0015]在EP1932519中，描述了骨形態(tài)發(fā)生蛋白特別是重組人生長和分化因子(rh⑶F)的凍干制劑，包括包含甘露醇的制劑及包含約PH4的甘氨酸的rhGDF的單獨(dú)制劑。
[0016]W02006/023665描述了 IL-1拮抗劑制劑，包括包含5_50mg/mL的蛋白質(zhì)和0.25-3.0%的甘氨酸作為凍干保護(hù)劑(Iyoprotectant)的預(yù)凍干制劑。
[0017]Chang等人(1996 ；Pharm Res, 13:243-249)描述了重組人白介素-1受體拮抗劑(rhlL-lra)的穩(wěn)定的冷凍干燥的制劑的形成，包括測試甘露醇或甘氨酸作為填充劑與非晶蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑尤其是蔗糖組合使用。
[0018]Hirakura等人(2004 ；Int J Pharm ；386:53-67)研究了在冷凍過程中溫度變化對(duì)含有磷酸鈉(10mM，pH7.0)和甘氨酸(300mM)的重組人白介素_11 (rhIL-11 ；5mg/mL)的凍干制劑的影響。
[0019]Leuckel 等人(1998 ;Pharm Dev and Tech3:325_336)研究了甘氨酸、賴氨酸-HCl或甘露醇作為結(jié)晶填充劑與非晶穩(wěn)定劑蔗糖或海藻糖組合對(duì)冷凍濃縮物和凍干物的屬性的影響。在沒有任何蛋白質(zhì)存在下，取決于賦形劑的特定組合和其濃度比，總有一個(gè)賦形劑能夠形成晶體。
[0020]Meyer 等人(2009 ；Eur J Pharm Sci, 38:29-38)研究了填充劑對(duì)凍干的抗 TNF 鼠(murine)單克隆IgG的穩(wěn)定性的影響。評(píng)價(jià)了鹿糖作為穩(wěn)定劑與填充劑甘露醇或甘氨酸組合對(duì)抗體穩(wěn)定性的影響。[0021]Tian等人(2007 ；Int J Pharmac, 335:20-31)評(píng)價(jià)了氨基酸制劑中人源化單克隆抗體的穩(wěn)定性。測試了抗CDlla和抗IgE抗體中組氨酸、精氨酸、甘氨酸或天冬氨酸的保護(hù)作用。
[0022]W099/27983描述了當(dāng)使用時(shí)較少“噴出(blow-out) ”的含有人生長激素的冷凍干燥制劑的一劑注射(one-dose syringe)。每單位劑量包含少于1.4mg的蛋白質(zhì)和各種比例的其它賦形劑，包括約0.2mg的甘氨酸和1.1mg的甘露醇/mg蛋白質(zhì),并且還包括磷酸鈉和
磷酸二鈉。
[0023]W02006/081320描述了適于冷凍干燥的液體制劑，其包含至少20mg/mL的蛋白質(zhì)、以小于I的重量:重量比的結(jié)晶填充劑和非晶溶質(zhì)。甘露醇和甘氨酸在其中被描述為常規(guī)的“結(jié)晶填充劑”，而且它們還可以被用作穩(wěn)定劑，只要其在冷凍干燥過程之后保持非晶態(tài)。一個(gè)實(shí)例在液體制劑中包括至少2.0% w/v的穩(wěn)定劑。
[0024]US2006/0275306描述了從液體制劑獲得的多種凍干的抗-1gG或抗-HER2抗體制劑，包括包含21mg/mL抗體與分別以250/25mM或55/276mM的甘露醇/甘氨酸的抗體制劑。
[0025]Pyne等人(2003 ；J Pharm Sci92:2172-2283)研究了甘露醇-甘氨酸系統(tǒng)中的溶質(zhì)結(jié)晶及其對(duì)冷凍干燥制劑中蛋白質(zhì)穩(wěn)定的影響。在冷凍物質(zhì)中甘露醇和/或甘氨酸晶體的形成受多種因素的影響，包括冷凍速率、液體預(yù)凍干制劑中甘露醇和甘氨酸的相對(duì)濃度和磷酸鹽緩沖液的存在/濃度。
[0026]W02007/112757公開了用于從多種液體制劑包括pH7.9 (pH范圍從7.5到8.5)的含有3.67mM Na2HPO4,27mM甘氨酸、250mM甘露醇的本體溶液，濃縮多肽包括重組人膽色素原脫氨酶(rhPBGD)以形成此 蛋白質(zhì)的凍干制劑的過程。
[0027]這些研究者報(bào)道了使用多種不同的賦形劑或其組合的不同程度的成功，如通過多種方法對(duì)多種生物分子和蛋白質(zhì)測量的。這些研究者都未報(bào)道rhBSSL制劑。
[0028]EP0317355總體公開了膳食組合物，其包含來自第一來源的營養(yǎng)基(nutritionalbase)，該營養(yǎng)基包含脂肪且缺乏膽鹽刺激脂酶；和來自第二來源的有效量的膽鹽刺激脂酶。
[0029]W091/18923總體公開了包含重組人膽鹽刺激脂酶的藥物組合物，W094/20610總體請求保護(hù)了包含人膽鹽刺激脂酶變體的藥物組合物，且W099/54443總體公開了包含從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的人膽鹽刺激脂酶的藥物組合物。在每個(gè)例子中都描述了此類藥物組合物可用于改善早產(chǎn)出生的嬰兒中的膳食脂類的利用率或用于治療與胰腺功能不全相關(guān)的病理病癥例如用于治療囊性纖維化。
[0030]共同待審的W02012/052059和W02012/052060 (其內(nèi)容在此通過引用整體被并入)公開了重組人膽鹽刺激脂酶的藥物組合物的制備和在早產(chǎn)人類嬰兒中增加生長速率和/或增加某些LCPUFDA的吸收的用途。其中公開的單位劑量是冷凍口服溶液，包含溶解于1.3mL注射用水的15mg/mL重組人膽鹽刺激脂酶。單位劑量從溶解于注射用水的凍干的松散(bulk)重組人膽鹽刺激脂酶制成的溶液的等份制備。簡而言之，凍干的松散重組人膽鹽刺激脂酶通過以下獲得:使用重組CHO細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)，使用多個(gè)步驟包括陰離子交換層析、滲濾、濃縮、和最后的冷凍干燥從細(xì)胞純化重組蛋白質(zhì)。由于rhBSSL藥物物質(zhì)凍干自rhBSSL的磷酸鹽/氯化鈉緩沖的本體溶液(bulk solution),凍干制劑和成品單位劑量還包含磷酸二氫鈉和氯化鈉。[0031]因此,存在關(guān)于提供生物分子諸如蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)(Iyoprotection)的賦形劑的最佳組合是什么的相矛盾的證據(jù)，且不存在關(guān)于那些用于或形成包含rhBSSL的凍干制劑的具體指導(dǎo)。不是賦形劑的任一組合都最適合于所有蛋白質(zhì)，而是需要有效程度(significant degree)的實(shí)驗(yàn)以獲得研究中蛋白質(zhì)的期望的結(jié)果。對(duì)適于rhBSSL的一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，包括在凍干、儲(chǔ)存、和/或使用期間保護(hù)蛋白質(zhì)的賦形劑，或提供其它期望屬性包括保質(zhì)期、制造和/或重建特征、或一個(gè)或多個(gè)如本文描述的其它屬性的賦形劑或其組合存在需求。
[0032]發(fā)明簡述
[0033]本發(fā)明的不同的方面和實(shí)施方案提供了上述一個(gè)或多個(gè)技術(shù)問題的解決方案，如在本文和/或權(quán)利要求中定義的或另外公開的。通常地，且通過簡述的方式，本發(fā)明的主要方面可被如下描述:
[0034]在一方面，本發(fā)明涉及適于凍干的制劑，所述制劑包含重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL);結(jié)晶填充劑；及是與所述結(jié)晶填充劑不同的化學(xué)實(shí)體的非晶穩(wěn)定劑。
[0035]在另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的液體制劑凍干獲得的凍干制劑，其中所述凍干制劑包含rhBSSL、結(jié)晶填充劑和非晶穩(wěn)定劑。在相關(guān)的方面，本發(fā)明還涉及此類凍干制劑的單位劑量。在其它相關(guān)的方面，本發(fā)明還涉及制備此類凍干制劑的方法，并涉及通過此方法獲得的凍干制劑。
[0036]在又另一方面，本 發(fā)明涉及制備rhBSSL的重建制劑的方法，所述方法包括以下步驟:提供本發(fā)明的凍干制劑或單位劑量；和在液體中重建所述凍干制劑或單位劑量。在相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及rhBSSL的重建制劑，包括:(i)以約IOmg和約20mg之間的絕對(duì)量存在的所述rhBSSL ； (ii)以約27mg和約62mg之間的絕對(duì)量存在的甘露醇；且(iii)以約2mg和約6mg之間的絕對(duì)量存在的甘氨酸；且其中所述制劑在液體嬰兒喂養(yǎng)品中重建，且所述重建制劑具有約6.4和約7.4之間的pH。
[0037]在另外的方面，本發(fā)明涉及甘氨酸穩(wěn)定存在于凍干制劑中的rhBSSL的用途，所述凍干制劑還包括不是甘氨酸的結(jié)晶填充劑，其中:所述甘氨酸基本上以非結(jié)晶形式存在于所述凍干制劑中；和/或所述凍干制劑以約0.2mg/mg所述rhBSSL和約0.3mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量包括所述甘氨酸。
[0038]在又另外的方面，本發(fā)明涉及減少和/或最小化存在于液體嬰兒喂養(yǎng)品中的rhBSSL的不溶性聚集體形成的方法，所述方法包括以下步驟:提供本發(fā)明的凍干制劑或單位劑量；和在液體嬰兒喂養(yǎng)品中重建所述凍干制劑或單位劑量。
[0039]在特定的方面，本發(fā)明還涉及確定rhBSSL聚集減少的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供本發(fā)明的凍干制劑或單位劑量；(ii)儲(chǔ)存所述凍干制劑或單位劑量 '及(iii)在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定所述凍干制劑或所述單位劑量中所述rhBSSL的高分子量百分比(% HMW)的水平，從而確定所述rhBSSL的聚集水平。
[0040]附圖簡述
[0041]胤I顯示于+5°C在O和18個(gè)月之間的儲(chǔ)存期間，實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的rhBSSL單體的不穩(wěn)定性(通過由SE-HPLC檢測的集成主峰(integrated main peak)量化):(a)顯示集成主峰的絕對(duì)％的減少；及(b)顯示集成主峰相對(duì)％減少的減少(每種制劑第O個(gè)月的主峰設(shè)定為100% )。存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度的一般種類由標(biāo)繪符號(hào)的陰影法指不，以實(shí)心符號(hào)表不77mM的“高”甘氨酸濃度，空心符號(hào)(open symbol)表示OmM的“低”甘氨酸濃度，且陰影線符號(hào)表示27mM(對(duì)于N6和N7)和33mM(對(duì)于N4)的
“中等”甘氨酸濃度。
[0042]Ml顯示于+25°C在O和18個(gè)月之間的儲(chǔ)存期間，實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的rhBSSL單體的不穩(wěn)定性(通過由SE-HPLC檢測的集成主峰量化):(a)顯示集成主峰的絕對(duì)％的減少；及(b)顯示集成主峰相對(duì)％減少的減少(每種制劑第O個(gè)月的主峰設(shè)定為100% )0使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0043]顯示于+40 °C在O和9個(gè)月之間的儲(chǔ)存期間，實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的rhBSSL單體的不穩(wěn)定性(通過由SE-HPLC檢測的集成主峰量化):(a)顯示集成主峰的絕對(duì)％的減少 '及(b)顯示了集成主峰相對(duì)％減少的減少(每種制劑第O個(gè)月的主峰設(shè)定為100% )0使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0044]Si顯示于+5°C在O和18個(gè)月之間的儲(chǔ)存期間，實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的rhBSSL聚集的速率(通過由SE-HPLC檢測的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化):(a)顯示使用總的集成HMW峰的絕對(duì)％的速率；及(b)顯示使用總的集成HMW峰的相對(duì)％增加的速率(每種制劑第O個(gè)月的總HMW峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0045]_顯示于+25°C在O和18個(gè)月之間的儲(chǔ)存期間，實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的rhBSSL聚集的速率(通過由SE-HPLC檢測的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化):(a)顯示使用總的集成HMW峰的絕對(duì)％的速率；及(b)顯示使用總的集成HMW峰的相對(duì)％增加的速率(每種制劑第O個(gè) 月的總HMW峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0046]厘衛(wèi)顯示于+40 °C在O和9個(gè)月之間的儲(chǔ)存期間，實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的rhBSSL聚集的速率(通過由SE-HPLC檢測的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化):(a)顯示使用總的集成HMW峰的絕對(duì)％的速率；及(b)顯示使用總的集成HMW峰的相對(duì)％增加的速率(每種制劑第O個(gè)月的總HMW峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0047]Ml顯示從實(shí)驗(yàn)AH7507的凍干制劑的N4、N5、N6和N7獲得的PXRD圖樣的疊加。箭頭標(biāo)記對(duì)應(yīng)于被發(fā)現(xiàn)只存在于制劑N5的結(jié)晶的β-甘氨酸的峰。
[0048]Μ8顯示代表于+40°C儲(chǔ)存9個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)AH7507制劑的預(yù)凍干制劑中的rhBSSL聚集(通過由SE-HPLC檢測的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化)對(duì)甘氨酸濃度之間的關(guān)系的散點(diǎn)圖。存在于每種預(yù)制劑中的甘露醇的濃度由標(biāo)繪符號(hào)的陰影法指示，以實(shí)心正方形表示307mM的“高”甘露醇濃度，空心正方形表示132mM的“低”甘露醇濃度，及陰影線正方形表示220mM的“中等”甘露醇濃度。
[0049]圖9顯示基于來自在+5°C和+25°C下儲(chǔ)存18個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7507的制劑的數(shù)據(jù),MLR模型的通過SE-HPLC檢測的集成主峰的系數(shù)圖。
[0050]圖10顯示來自被用于分析通過SE-HPLC檢測的來自在+5°C下儲(chǔ)存18個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7507的制劑的集成主峰的MLR模型的等值面(rhBSSL單體)。
[0051]圖11顯示基于來自在+5°C和+25°C下儲(chǔ)存18個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7507的制劑的數(shù)據(jù)，MLR模型的通過SE-HPLC檢測的所有集成高分子量(HMW)峰的和的系數(shù)圖(rhBSSL聚集體)。
[0052]圖12顯示來自被用于分析通過SE-HPLC檢測的來自在+5°C下儲(chǔ)存18個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7507的制劑的所有集成高分子量(HMW)峰的和的MLR模型的等值面(rhBSSL聚集體)。
[0053]胤顯示儲(chǔ)存于+5°C在O至12個(gè)月儲(chǔ)存后的實(shí)驗(yàn)AH7513和AH7517的凍干制劑的rhBSSL單體的不穩(wěn)定性-通過由SE-HPLC檢測的集成主峰量化:(a)集成主峰的％減少 '及(b)集成主峰的相對(duì)％減少(每種制劑第O個(gè)月的主峰設(shè)定為100% )。注意，對(duì)于實(shí)驗(yàn)AH7517，僅收集了第0、6、9和12個(gè)月時(shí)的數(shù)據(jù)。存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度的一般種類由標(biāo)繪符號(hào)的陰影法指示，以實(shí)心符號(hào)表示56mM的“高”甘氨酸濃度，空心符號(hào)表示OmM的“低”甘氨酸濃度，及陰影線符號(hào)表示44mM(對(duì)于G2)和50mM(對(duì)于G3)的“中等”甘氨酸濃度。
[0054]胤Ii顯示在+25°C儲(chǔ)存O至12個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7513和AH7517的凍干制劑的rhBSSL單體的不穩(wěn)定性-通過由SE-HPLC檢測的集成主峰量化:(a)集成主峰的％減少；及(b)集成主峰的相對(duì)％減少(每種制劑第O個(gè)月的主峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示收集的時(shí)間點(diǎn)和存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0055]圖15顯示在+40°C儲(chǔ)存后的實(shí)驗(yàn)AH7513和AH7517的凍干制劑的rhBSSL單體的不穩(wěn)定性-通過由SE-HPLC檢測的集成主峰量化:(a)儲(chǔ)存O至12個(gè)月后集成主峰的％減少。注意，對(duì)于實(shí)驗(yàn)AH7517，僅收集了第0、3和6個(gè)月時(shí)的數(shù)據(jù)；及(b)儲(chǔ)存O至6個(gè)月后集成主峰的相對(duì)％減少(每種制劑的第O個(gè)月的主峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0056]圖16顯示在+5 °C儲(chǔ)存O至12個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7513和AH7517的凍干制劑的rhBSSL聚集的速率-通過由SE-HPLC檢測的所有集成高分子量(HMW)峰的和量化:(a)總的集成HMW峰的增加 '及(b)總的集成HMW峰的相對(duì)％增加(每種制劑的第O個(gè)月的總HMW峰設(shè)定為100% )。注意，對(duì)于實(shí)驗(yàn)AH7517，僅收集了第0、6、9和12個(gè)月時(shí)的數(shù)據(jù)，并使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0057]胤II顯示在+25°C儲(chǔ)存O至12個(gè)月后的實(shí)驗(yàn)AH7513和AH7517的凍干制劑的rhBSSL聚集的速率-通過由SE-HPLC檢測的所有集成高分子量(HMW)峰的和量化:(a)總的集成HMW峰的增加 '及(b)總的集成HMW峰的相對(duì)％增加(每種制劑的第O個(gè)月的總HMW峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示收集的時(shí)間點(diǎn)和存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0058]圖18顯示在+40°C儲(chǔ)存后的實(shí)驗(yàn)AH7513和AH7517的凍干制劑的rhBSSL聚集的速率-通過由SE-HPLC檢測的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化:(a)儲(chǔ)存O至12個(gè)月后總的集成HMW峰的增加。注意，對(duì)于實(shí)驗(yàn)AH7517，僅收集了第0、3和6個(gè)月時(shí)的數(shù)據(jù)；及(b)儲(chǔ)存O至6個(gè)月后總的集成HMW峰的相對(duì)％增加(每種制劑的第O個(gè)月的總HMW峰設(shè)定為100% )。使用與上文描述相同的陰影法指示存在于每種預(yù)制劑中的甘氨酸濃度。
[0059]圖19顯示PXRD圖樣:獲得自:(a)實(shí)驗(yàn)AH7513的rhBSSL Fl的凍干制劑。箭頭標(biāo)記對(duì)應(yīng)于該制劑中存在的結(jié)晶的甘氨酸的峰；及(b)實(shí)驗(yàn)AH7517的rhBSSL G3的凍干制劑。箭頭標(biāo)記本來將指示結(jié)晶的甘氨酸的存在的峰的預(yù)期位置(在此制劑中丟失)。[0060]圖20顯示在不同溫度下儲(chǔ)存12個(gè)月的rhBSSL凍干制劑的SDS-PAGE的結(jié)果，以及它們各自的高分子量(HMW)聚集體的程度:(a)實(shí)驗(yàn)AH7513的制劑Fl和F2 ;及(b)實(shí)驗(yàn)AH7517的制劑G2和G3。
[0061]本發(fā)明的公開內(nèi)容
[0062]本發(fā)明，及其特定的非限制性方面和/或?qū)嵤┓桨福筛敿?xì)地總體描述如下:
[0063]在一方面，本發(fā)明涉及適于凍干的制劑，所述制劑包含:(i)重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL) ；(ii)結(jié)晶填充劑 '及(iii)是與所述結(jié)晶填充劑不同的化學(xué)實(shí)體的非晶穩(wěn)定劑。
[0064]除非另有說明，如下文敘述的術(shù)語一般都通過其通用含義來理解。
[0065]在本說明書和權(quán)利要求中使用術(shù)語“包括(comprising) ”或“包括(comprising
of)”的情況下，其不排除其它元素。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“由......組成(consisting
of) ”被認(rèn)為是術(shù)語“包括”的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。如果下文中一個(gè)組被定義為包括至少一定數(shù)目的實(shí)施方案，那么這也被理解為公開了優(yōu)選由這些實(shí)施方案的全部和/或只有這些實(shí)施方案組成的組。
[0066]在本發(fā)明的環(huán)境中，術(shù)語“約(about)”或“約(approximately) ”表示本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解仍確保所討論特征的技術(shù)效果的準(zhǔn)確度的區(qū)間。該術(shù)語通常表示從指定數(shù)值偏差±20%、± 15%、± 10%、以及優(yōu)選±5%。如將被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員領(lǐng)會(huì)的,對(duì)于給定技術(shù)效果的數(shù)值的特定此類偏差將取決于技術(shù)效果的性質(zhì)。例如，天然的或生物技術(shù)效果通?？删哂斜热嗽斓幕蚬こ袒夹g(shù)效果更大的此類偏差。
[0067]在當(dāng)提及單數(shù)名詞時(shí)使用不定冠詞或定冠詞，例如“一(a)”、“一(an)”或“該(the) ”的情況下，這包括該名詞的復(fù)數(shù)，除非另外特別說明某些事。
[0068]1.凍干法概況
[0069]凍干(也稱為冷凍干燥)指的是使用低的溫度和壓力以通過升華過程(即，從固態(tài)到蒸汽而不通過液相的相的變化)從液體制劑除去溶劑通常為水的過程。凍干通過減少一種或多種溶劑組分至不再支持化學(xué)反應(yīng)或生物生長的水平，有助于穩(wěn)定藥物制劑。
[0070]冷凍干燥過程是已知的。在某些情況下，冷凍干燥在“多歧管(manifold) ”過程中進(jìn)行，其中燒瓶、安瓿或小瓶(vial)被分別連接到多歧管或干燥罐的接口。在其它情況下，冷凍干燥作為“分批”過程進(jìn)行，其中一個(gè)或多個(gè)類似大小的載有類似產(chǎn)物的容器被一起放置于盤式干燥器中，在“批量(bulk)”過程中，將產(chǎn)物倒入大容量盤(bulk pan)并被干燥作為單個(gè)單元。在終止之前將產(chǎn)物從冷凍干燥罐中移出且然后包裝在氣密容器中。本文所描述的發(fā)明可與任何這些過程組合使用。
[0071]一般來說，凍干法經(jīng)歷至少三個(gè)階段:冷凍；一級(jí)干燥；和二級(jí)干燥。在某些情況下，在冷凍和一級(jí)干燥階段之間包括退火步驟可以是期望的。
[0072]在典型的冷凍干燥過程的第一步驟中，蛋白質(zhì)水溶液的樣品被冷卻至低于該產(chǎn)物的塌陷溫度(collapse temperature),直到該溶液被冷凍。在一級(jí)干燥的第二步驟中，施加真空至冷凍物質(zhì)，且在某些情況下，熱量被傳遞到冷凍團(tuán)塊導(dǎo)致升華。一般來說，冷凍干燥被用于從溶液或制劑中除去水。由于發(fā)生升華，水蒸汽穿過冷凍團(tuán)塊到冷凍干燥罐中。由于溫度升高，存在較高的飽和蒸氣壓，其導(dǎo)致增加的干燥速率。這導(dǎo)致縮短的冷凍干燥周期。在此階段期間干燥溫度的上限確保了產(chǎn)物的溫度被保持低于該產(chǎn)物的塌陷溫度。
[0073]在冷凍干燥期間，產(chǎn)物的“塌陷”與干燥制劑的減少的表面面積、體積的減小相關(guān)，且也可能與漸增的隨后的重建時(shí)間相關(guān)。在冷凍干燥的物質(zhì)塌陷事件中，尚未被除去的溶劑可成為被捕獲的。這可非期望地降低終產(chǎn)物的穩(wěn)定性及對(duì)其性能產(chǎn)生不利影響。塌陷溫度是指物質(zhì)軟化至不能支撐其自身結(jié)構(gòu)的點(diǎn)所處的溫度。通常，隨著溶劑水平經(jīng)由升華而減少，塌陷溫度升高。在含有蛋白質(zhì)的大多數(shù)系統(tǒng)中，該溫度的起始未被良好定義，并且可跨越一個(gè)溫度范圍而發(fā)生。因此，在較高的溫度下將維持其較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的物質(zhì)可以允許較快的處理。因此，除了在隨后的儲(chǔ)存期間穩(wěn)定蛋白質(zhì)，該混合物的成分可在冷凍干燥過程中賦予穩(wěn)定性。
[0074]除了在一級(jí)干燥期間升華的游離的冰，仍然存在大量的結(jié)合到產(chǎn)物的水分子。在二級(jí)干燥的第三步驟中，這些水被除去(被解吸)。因?yàn)樗械挠坞x冰已在一級(jí)干燥中被除去，現(xiàn)在可顯著地增加產(chǎn)物溫度，而不必?fù)?dān)心塌陷。二級(jí)干燥(解吸)實(shí)際上在一級(jí)階段期間開始，但在升高的溫度下(通常在30°C至50°C范圍內(nèi))，解吸更加迅速地進(jìn)行。二級(jí)干燥速率取決于產(chǎn)物溫度。可將真空系統(tǒng)保持在一級(jí)干燥期間所用的相同的水平，或可被改變。二級(jí)干燥繼續(xù)進(jìn)行直到該產(chǎn)物具有長期儲(chǔ)存可接受的含水量。取決于應(yīng)用，充分干燥的產(chǎn)物的含水量一般在0.5%和3%之間。
[0075]通過凍干法的脫水完成后，蛋白質(zhì)作為粉末或“塊狀物”被留下。通過減少塊狀物中的一種或多種溶劑組分(通常為水)至不再支持顯著的化學(xué)或物理降解速率的水平，凍干法有助于穩(wěn)定藥物制劑。塊狀物的結(jié)構(gòu)在允許物質(zhì)(例如治療性蛋白質(zhì)和任何其它賦形劑)被重建方面是重要的。如果塊狀物具有小孔，在冷凍干燥過程期間水的除去可受到阻礙。結(jié)果，干燥過程是不完整的，且塊狀物具有高含水量。如果塊狀物上形成有大孔，干燥過程是更有效的，且塊狀物具有低含水量。
[0076]I1.制劑
[0077]如上所述，凍干法 是其中適于凍干的液體制劑經(jīng)受冷凍干燥處理以獲得凍干(冷凍干燥)的制劑的方法。冷凍干燥制劑中的內(nèi)含物可根據(jù)活性劑和預(yù)期的施用途徑而改變。液體制劑一般包括溶劑和溶質(zhì)。溶質(zhì)通常包括活性劑，和任選地一種或多種賦形劑。所得的冷凍干燥制劑包含非晶固體基質(zhì)和少量的殘余未凍溶劑。非晶固體基質(zhì)包括活性劑，和任選地一種或多種賦形劑。
[0078]通常，制劑中不是溶劑或活性劑的任何組分都被稱為“賦形劑”，在制劑中包括“賦形劑”的原因有多種，盡管許多賦形劑的主要功能是為活性成分提供穩(wěn)定的液體環(huán)境，或在冷凍或干燥過程中保護(hù)活性劑。某些賦形劑可被用于實(shí)現(xiàn)制劑中的多種效果。例如，二糖，諸如鹿糖可作為冷凍保護(hù)劑、凍干保護(hù)劑、填充劑和張力調(diào)節(jié)劑(tonicity modifier)。當(dāng)其它賦形劑存在時(shí)，賦形劑的表現(xiàn)可發(fā)生變化。一些組合具有正協(xié)同效應(yīng)，其它組合則具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)共同作用的賦形劑的效應(yīng)的和大于各個(gè)賦形劑的累加效應(yīng)時(shí)發(fā)生正協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)賦形劑組合的效應(yīng)的和小于各個(gè)賦形劑的效應(yīng)的和時(shí)出現(xiàn)負(fù)協(xié)同效應(yīng)。下文提供了活性劑、溶劑和賦形劑的實(shí)例。
[0079]活性劑和重組人膽鹽刺激脂酶:
[0080]如本文所用的，術(shù)語“藥物制劑”是指包括至少一種活性劑，所述活性劑是重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL)或所述活性劑之一是重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL)的制劑兩者。
[0081]作為本發(fā)明多個(gè)方面中的組分的重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL)，是本文所描述、定義或提及的蛋白質(zhì)。例如，其包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可識(shí)別為人膽鹽刺激脂酶的多肽，其中所述人脂酶已從經(jīng)調(diào)整或修飾(例如，通過重組基因技術(shù))以產(chǎn)生此類多肽的非人類來源例如非人類生物體中產(chǎn)生或分離。
[0082]人膽鹽刺激脂酶(BSSL)是以多種標(biāo)識(shí)符或別名被知悉的酶；例如，“羧基酯脂酶(CEL) ”、“膽鹽激活脂酶(BAL) ”、“膽鹽依賴性脂酶(BSDL) ”、“羧酸酯酶”、“羧酸酯水解酶(CEH) ”，和一些其它別名和描述，如對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言從信息來源諸如“GeneCards”(www.genecards.0rg)將容易可得的。從人乳(和胰腺)已鑒定了人BSSL的許多天然的氨基酸序列和同種型，并且已描述了許多不同的氨基酸序列(典型地，從cDNA或基因組序列預(yù)測的)；所有這些在本文都被包含在術(shù)語“人膽鹽刺激脂酶”之內(nèi)。例如，人膽鹽刺激脂酶首先作為包含20至26個(gè)氨基酸信號(hào)序列的前體序列(precursorsequence),以及描述為具有722至733個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的成熟全長形式天然地產(chǎn)生(例如參見，Nilsson 等人，1990 ；W091/15234, W091/18923 ;由 cDNA 序列預(yù)測的多肽 GenBank提交 ID:X54457 ;GenBank ID:CAA38325.1 ;“CEL/BSSL” 的 GeneCards 條目；GenBankID:AAH42510.1 ；RefSeq ID:NP_001798.2 ；Swiss-Prot ID:P19835)。在另外的實(shí)例中，人膽鹽刺激脂酶的其它較短的同種型在Venter等人(2001 ；Science, 291:1304-1351)；GenBnk ID:AAC71012.1 ;Pasqualini 等人(1998 ;J Biol Chem, 273:28208-28218) ；GenBankID:EAW88031.1 ;W094/20610 和Bliickbery 等人(1995 ；Eur J Biochem, 228:817-821)中被描述。
[0083]在特定實(shí)施方案中，人膽鹽刺激脂酶包含具有包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列或如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在其它特定實(shí)施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂酶具有選自公開于以下的BSSL的成熟或前體形式的氨基酸序列=Nilsson等人，1990 ；W091/15234, W091/18923；RefSeq ID:ΝΡ_001798.2；GenBank ID:AAH42510.1 ；GenBankID:CAA38325.1 ;“CEL/BSSL”的 GeneCards 條目；Swiss-Prot ID:P19835。在另外的此類實(shí)施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂酶包括具有公開于先前的參考文獻(xiàn)中的任何序列或SEQID NO:2的至少720個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂酶包括具有在SEQ ID N0:2或W091/15234中公開的至少從位置I至101的氨基酸序列，或在SEQ ID N0:2中公開的至少從位置I至535的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如公開于Hansson等人，1993 ；J Biol Chem, 35:26692-26698的“變體A”，其中此類蛋白質(zhì)
具有膽鹽結(jié)合和/或膽鹽依賴性脂酶活性，如可通過例如在BlSekberg等人(1995 ；Eur JBiochem228:817-821)中公開的方法確定。
[0084] 因此，現(xiàn)在對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明顯的是，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂酶的這些描述的形式的一種或多種可用于本發(fā)明的多個(gè)方面。另外，對(duì)于此類人員將明顯的是，具有膽鹽依賴性脂解活性的其它(重組)蛋白質(zhì)(例如，如可通過公開于BMckberg等人，1995的方法確定的)，及氨基酸序列與本文描述的、定義的或提及的那些多肽序列相似的(重組)蛋白質(zhì)，在本發(fā)明中也可具有效用，并因此也被術(shù)語“人膽鹽刺激脂酶”包含。在某些此類實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)顯示與本文中描述的、定義的或提及的序列跨越至少約30、50、100、250、500、600、700、711、720、722、733或750個(gè)氨基酸的超過90%,95%,98%,99%,99.5%的序列同一性。在其它實(shí)施方案中，可對(duì)本文公開的、定義的或提及的BSSL多肽序列之一進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。例如，可對(duì)SEQ ID N0:2中公開的序列進(jìn)行1、2、3、4、5或直至10個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加。此類氨基酸的改變可以是中性改變(諸如中性氨基酸取代)，和/或其可以以某種(期望的)方式影響蛋白質(zhì)的糖基化、結(jié)合、催化活性或其它性質(zhì)。具有此類取代的蛋白質(zhì)，只要它們具有膽鹽依賴性脂解活性，也將被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員識(shí)別為本發(fā)明意義中的“人膽鹽刺激脂酶”。
[0085]在 其它實(shí)施方案中，人膽鹽刺激脂酶是從具有合適的核酸序列的核酸可表達(dá)的或本來由其編碼。通過非限定性實(shí)例的方式，所述脂酶是從包含SEQ ID NO:1的位置151和2316之間的序列或公開于W094/20610或Nilsson等人(1990)的序列的核酸可表達(dá)的或本來由其編碼。如還將被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員領(lǐng)會(huì)的，“合適的核酸序列”還將包含先前的核酸序列的變體。例如，不會(huì)改變由三聯(lián)體密碼子編碼的氨基酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的改變(諸如在第3個(gè)密碼子位置處)也將是“合適的”。如果此類核酸序列的亞片段編碼如本文所述的人膽鹽刺激脂酶的(短的)同種型，則該亞片段也將是“合適的”。此外，編碼具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的變體的蛋白質(zhì)的核酸序列，諸如上文描述的那些，也將是“合適的”。因此，本發(fā)明設(shè)想了其中(重組)人膽鹽刺激脂酶是由與包含SEQ ID N0:1的位置151和2316之間的序列的核酸或包含位置151和755位之間的序列的核酸雜交的核酸可表達(dá)或本來由其編碼的蛋白質(zhì)，并且其中所述蛋白質(zhì)具有膽鹽依賴性脂解活性的實(shí)施方案。在某些此類實(shí)施方案中，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，諸如將被普通技術(shù)人員知曉的，以及在一般教科書例如 Joe Sambrook和 David Russell 的“Molecular Cloning:A LaboratoryManual” (CSHL出版)中描述的。
[0086]在特定實(shí)施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂酶是通過本文描述的、定義的或提及的核酸表達(dá)而產(chǎn)生的。
[0087]本文描述的，定義的或提及的人膽鹽刺激脂酶，在本發(fā)明的環(huán)境中是重組膽鹽刺激脂酶(rhBSSL);即，其中所述人脂酶已由經(jīng)調(diào)整或修飾的(例如，通過重組基因技術(shù))以產(chǎn)生此類脂酶的非人類來源，諸如非人類生物體產(chǎn)生或從其中分離。在特定實(shí)施方案中，rhBSSL使用無細(xì)胞和/或體外轉(zhuǎn)錄-翻譯技術(shù)從本文描述的、定義的或提及的分離的核酸分子產(chǎn)生。可選地,使用重組非人類生物體,其中所述非人類生物體包括此核酸的至少一個(gè)拷貝，并且其中所述核酸可被所述非人類生物體表達(dá)以產(chǎn)生期望的蛋白質(zhì):rhBSSL。例如，可使用重組細(xì)菌、藻類、酵母或其它真核細(xì)胞，并且在某些實(shí)施方案中，從此類重組細(xì)胞的培養(yǎng)物中制備rhBSSL。在其它實(shí)施方案中，可由經(jīng)修飾的或特定選擇的人細(xì)胞的身體外(extra-corporal)培養(yǎng)物,例如通過它們的體外培養(yǎng)物制備rhBSSL。在又其它實(shí)施方案中，rhBSSL可通過其從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因牛(cattle)、綿羊(sheep)、山羊(goat)或兔的乳汁的分離而制備。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知曉可用于使用重組技術(shù)產(chǎn)生人膽鹽刺激脂酶的許多技術(shù)。
[0088]已顯示可從重組細(xì)胞培養(yǎng)物包括大腸桿菌(E.coli)、小鼠和倉鼠(Hansson等人，1993)以及巴斯德畢赤酵母(P.pastor is) (Trimple 等人,2004 ；Glycobiol, 14:265-274)細(xì)
胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生重組人膽鹽刺激脂酶。還已顯示可從轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁(Strdmqvist等人，1996 ;Transgen Res, 5:475-485)以及從轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁(W099/54443)中產(chǎn)生和分離重組人膽鹽刺激脂酶。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶從此類重組細(xì)胞的培養(yǎng)物或從此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中分離。在可選的實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶不是從轉(zhuǎn)基因綿羊或轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中分離的重組人膽鹽刺激脂酶。[0089]在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，從重組中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系的表達(dá)產(chǎn)物中分離重組人膽鹽刺激脂酶、由重組CHO細(xì)胞系產(chǎn)生重組人膽鹽刺激脂酶、或可由重組CHO細(xì)胞系表達(dá)或可從其中分離重組人膽鹽刺激脂酶。使用重組CHO細(xì)胞系表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生此類脂酶，可產(chǎn)生展示特定結(jié)構(gòu)、活性或其它特征性質(zhì)，諸如一個(gè)或多個(gè)描述于共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060中的特征性質(zhì)的rhBSSL，這兩個(gè)申請的內(nèi)容通過引用并入本文。以非限制性實(shí)例的方式，可用于本發(fā)明的rhBSSL可使用與本文的示例類似的或基本如本文示例中描述的或如共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060中描述的過程被分離，和/或展示與本文的示例類似的或基本如本文示例中描述的或如共同待審的申請 TO2012/052059 和 W02012/052060 中描述的特征。
[0090]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，由國際非專有名稱(InternationalNon-proprietary Name, INN)詞干(stem) “布塞脂酶”鑒定了重組人膽鹽刺激脂酶(參見WHO Drug Informational, 21:62，2007)，例如因?yàn)槠渚哂衅渲惺境龅陌被嵝蛄?。?dāng)參考SEQ ID N0:2使用時(shí)，本發(fā)明的重組人膽鹽刺激脂酶可具有位置Cys64-Cys80和Cys246-Cys257 處的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵，和 / 或在 Asn-187、Thr-538、Thr-549、Thr-559、Thr-576、Thr-587、Thr-598、Thr-609、Thr-620、Thr-631 和 Thr-642 處的一個(gè)或多個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)處被糖基化(在一個(gè)此種實(shí)施方案中，圖1.1中圖示的)。在某些此類實(shí)施方案中，rhBSSL呈糖型(glycoform)，且例如可具有“布塞脂酶α ”的INN。
[0091]在本發(fā)明的其它特定實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶具有不同于天然人膽鹽刺激脂酶(BSSL-MAM)和/或不同于例如在W099/54443中描述的已由從轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中分離產(chǎn)生的重組膽鹽刺激脂酶(rhBSSL-OVI)的形式的結(jié)構(gòu)、組成和/或其它特性。某些此種結(jié)構(gòu)和/或組成差異、或其它不同的特性在共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060中被描述。以非限制性實(shí)例的方式，在某些此類實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的重組人膽鹽刺激脂酶(基本)無其它乳蛋白質(zhì)或乳汁組分。如基于本發(fā)明的公開內(nèi)容將明顯的是，在某些實(shí)施方 案中，在向人類嬰兒施用之前將rhBSSL添加至基于乳汁的嬰兒喂養(yǎng)品。因此，在此類實(shí)施方案中，“不含其它乳蛋白質(zhì)或乳汁組分”將應(yīng)用于在將重組膽鹽刺激脂酶添加至所述基于乳汁的嬰兒食品前不久(例如臨添加之前)存在的重組膽鹽刺激脂酶的該形式、組合物或制劑。例如，在此類實(shí)施方案中，包含rhBSSL或容易被提供用于添加至任何嬰兒配方食品和/或巴氏消毒的母乳的rhBSSL的量的本發(fā)明藥物組合物或試劑盒組分不含此類基于乳汁的污染物。在某些此類實(shí)施方案中，rhBSSL無乳汁酪蛋白和乳清蛋白，例如乳鐵蛋白，或者無乳汁中天然的其它污染物，尤其是其中來源于人、綿羊或小鼠的乳汁的此類源自乳汁的蛋白質(zhì)和其它污染物。在這些實(shí)施方案中，“無”任何特定此類蛋白質(zhì)或污染物指通過常規(guī)檢測方法未能夠檢測到此類蛋白質(zhì)或其它污染物的實(shí)質(zhì)的量?？蛇x地，任何此類特定雜質(zhì)可以以低于約5%、例如低于約2%、1%、0.5%或0.1%的水平存在或基本上或?qū)嵸|(zhì)上不存在，或所有此類源自乳汁的蛋白質(zhì)或其它污染物的全部以低于約5%,例如低于約2%、I %、0.5 %或0.1 %的水平存在或基本或?qū)嵸|(zhì)上不存在。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，從細(xì)胞培養(yǎng)物例如從重組CHO細(xì)胞中產(chǎn)生和分離的重組人膽鹽刺激脂酶將被認(rèn)為“無”此類基于乳汁的污染物。
[0092]在本發(fā)明的某些其它此類實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶具有大于約70%的純度，例如大于約80 %、90 %或95 %的純度。在特定的此類實(shí)施方案中，此類百分比純度是總蛋白質(zhì)的百分比純度。如上所述，在可應(yīng)用的實(shí)施方案中，純度測量是在添加至任何嬰兒喂養(yǎng)品或其它施用介質(zhì)之前的含有所述脂酶的組合物的純度測量?？赏ㄟ^RP-HPLC、SE-HPLC或SDS-PAGE (采用SypiORuby或銀染色)技術(shù)確定此類純度值。
[0093]在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，尤其是如果重組人膽鹽刺激脂酶是使用(表達(dá)自)重組CHO細(xì)胞產(chǎn)生的，當(dāng)使用時(shí)本發(fā)明的rhBSSL可通過一種或多種結(jié)構(gòu)、活性或其它特性例如以下描述的那些被表征?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容及例如包括在共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060中描述的那些，確定此類結(jié)構(gòu)、活性或其它特性的方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將是已知的。
[0094]在本發(fā)明另外的某些此類實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶具有土土天然人膽鹽刺激脂酶(BSSL-MAM)的糖基化水平(整體/全部)，和/或具有太土從轉(zhuǎn)基因綿羊乳中分離的重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL-OVI)的糖基化水平(整體/全部)。糖基化的水平，諸如BSSL(或其樣品)的單糖和/或唾液酸含量的水平可使用高pH陰離子交換色譜-脈沖電流檢測(HPAEC-PAD)測量。在本發(fā)明特定實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶的總單糖含量(摩爾單糖/摩爾rhBSSL)在約20和100之間、約25和65之間或約25和55之間，例如在約40至45摩爾/(摩爾rhBSSL)。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，rhBSSL的總唾液酸含量(摩爾唾液酸/摩爾rhBSSL)在約20和35之間，例如在約25和30摩爾/(摩爾rhBSSL)之間。
[0095]在本發(fā)明的又其它某些此類實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶具有不同于BSSL-MAM和/ 或不同于rhBSSL-OVI的糖基化模式，例如O-聚糖?？墒褂镁哂屑す庹T導(dǎo)熒光檢測的毛細(xì)管電泳(CE-LIF)和/或HPAEC-PAD檢測此類差異。在本發(fā)明特定實(shí)施方案中，rhBSSL可具有約20和50摩爾之間的N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA = Neu5Ac)/摩爾rhBSSL [摩爾/(摩爾rhBSSL)]，例如約25和40摩爾/(摩爾rhBSSL)之間。用于本發(fā)明的rhBSSL可具小于約5摩爾N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA = Neu5Gc)/摩爾rhBSSL，例如小于約2摩爾/(摩爾rhBSSL)，或其中NGNA基本不可檢測。用于本發(fā)明的rhBSSL可具有小于約20摩爾巖藻糖/摩爾rhBSSL，例如小于約10、小于約5、小于或約2摩爾/(摩爾rhBSSL)，并且在某些實(shí)施方案中，巖藻糖基本不可檢測。用于本發(fā)明的rhBSSL可具有約5和25摩爾之間的半乳糖胺/摩爾rhBSSL，例如約10和20之間或約15和18摩爾之間/(摩爾rhBSSL)。用于本發(fā)明的rhBSSL可具有小于約10摩爾葡萄糖胺/摩爾rhBSSL，例如小于約5、小于約3或約2摩爾/(摩爾rhBSSL)。用于本發(fā)明的rhBSSL可具有約5和25摩爾之間的半乳糖/摩爾rhBSSL，例如約10和20之間或約15和18摩爾之間/(摩爾rhBSSL)。用于本發(fā)明的rhBSSL可具有小于約5摩爾葡萄糖/摩爾rhBSSL，例如少于約2摩爾/(摩爾rhBSSL)或其中葡萄糖基本不可檢測。用于本發(fā)明的rhBSSL可具有約2和8摩爾之間的甘露糖/摩爾rhBSSL，例如約4和6摩爾之間/(摩爾rhBSSL)。在本發(fā)明特定實(shí)施方案中，rhBSSL可具有關(guān)于其如或基本如共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060的表1.1中所示的單糖和/或唾液酸含量的特征譜(profile)。
[0096]在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的重組人膽鹽刺激脂酶在凝集素結(jié)合或Lewis-抗原結(jié)合測試的特征譜或量,例如分別在Bliiekberg等人(1995)和Landberg等人(1997)中描述的那些試驗(yàn)和特征譜方面與BSSL-MAM以及與rhBSSL-OVI不同。此類凝集素結(jié)合或Lewis-抗原結(jié)合測試可指示這些不同形式的BSSL之間的糖基化模式的差異。可使用其它技術(shù)鑒定和/或表征可用于本發(fā)明的重組人膽鹽刺激脂酶。例如，rhBSSL可通過以下被表征(和/或與BSSL-MAM或與rhBSSL-OVI相區(qū)分):內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化，然后用具有定量UV檢測(214nm處)的反相HPLC分析所得肽，并記錄/檢查所得色譜圖。所得色譜圖中的差異可歸因于-并因此還反映了-包括rhBSSL的特定肽的糖基化的獨(dú)特特征，其具有保留時(shí)間方面的特定差異。
[0097]在本發(fā)明又另外的實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶具有90KDa和75KDa之間的分子量。在特定的此類實(shí)施方案中，所述脂酶的分子量在約84KDa和86KDa之間，例如約85KDa?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)包括MALDl-MS確定分子量。使用相同檢測技術(shù)，通過比較，BSSL-MAM的分子量被測量為實(shí)質(zhì)上較大(例如，約IOOKDa)，且rhBSSL-OVI的分子量被測量為實(shí)質(zhì)上較小(例如，約78KDa)。
[0098]在本發(fā)明其它另外的此類實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶可包括具有不同氨基酸長度的序列的重組人膽鹽刺激脂酶分子的群。在某些此類實(shí)施方案中，與最長或(預(yù)測的)全長形式(例如由SEQ ID N0:2所示)相比，以C末端1、2、3、4、5或直至10個(gè)氨基酸較短的形式存在的脂酶分子的量大于以此類最長或(預(yù)測的)全長形式存在的脂酶分子的量的50%。在某些此類實(shí)施方案中，約100%和500%之間的最長(或預(yù)測的全長)脂酶分子的量是作為較短脂酶分子例如從C末端短I或2個(gè)氨基酸存在的量。在特定的此類實(shí)施方案中，約200%和400%之間，例如約300%的最長(或預(yù)測的全長)分子(例如由SEQID NO: 2所示)的量，是作為較短脂酶分子例如從C末端短I或2個(gè)氨基酸存在的量。在特定實(shí)施方案或前述中，小于1%的最長(或預(yù)測的全長)所述脂酶分子的量，是作為短了2個(gè)氨基酸的脂酶分子存在的量。在其它實(shí)施方案中，在2至5倍之間，例如約3倍數(shù)目的最長(或預(yù)測的)所述脂酶分子以從C末端比此類最長(或預(yù)測的分子短1、2、3、4、5或直至10個(gè)氨基酸的形式存在。
[0099]在本發(fā)明又其它另外的此類實(shí)施方案中，重組人膽鹽刺激脂酶可具有比從乳汁中分離的BSSL和/或rhBSSL-OVI更大的比活性。例如，rhBSSL的比活性可以在高于BSSL-MAM和/或rhBSSL-OVI的比活性的約15%和35%，例如約20%或25%之間(基于質(zhì)量)。測量人BSSL的比活性的技術(shù)將為普通技術(shù)人員所知曉并且包括使用丁酸4-硝基苯酯(PNPB)測定，如本文示例中一般描述的。BSSL的其它體外測定是已知的，例如通過使用阿拉伯樹膠中乳化的甘油三油酸酯作為BSSL的底物并使用膽酸鈉(IOmM)作為激活的膽鹽(例如，如由 Bjjickberg和 Hernell, 1981 ;Eur J Biochem，116:221-225 描述的)。在特定實(shí)施方案中，在測量比活性之前，可通過例如使用肝素親和色譜法和尺寸排阻色譜法的技術(shù)將BSSL純化至高純度。
[0100]如普通技術(shù)人員將理解的是，用于本發(fā)明的重組人膽鹽刺激脂酶可通過本文描述的或定義的一種以上的區(qū)別特征來表征，例如上述那些。例如，2個(gè)或多個(gè)(例如3、4、5或更多個(gè))此類特征的組合可一起表征用于本發(fā)明的重組人膽鹽刺激脂酶的特定實(shí)施方案。
[0101]在本發(fā)明該方面的某些實(shí)施方案中，所述rhBSSL以約lmg/mL和約35mg/mL之間的濃度存在；優(yōu)選地，其中所述濃度為約10mg/mL和約15mg/mL之間；更優(yōu)選地,其中所述濃度選自由下列構(gòu)成的組:約llmg/mL ;約12mg/mL ;約13mg/mL ;和約14mg/mL。在可選的實(shí)施方案中，例如其中較低有效量的rhBSSL是期望的那些實(shí)施方案中，所述rhBSSL以約I和約5mg/mL之間；優(yōu)選約2、3或4mg/mL的濃度存在。[0102]如現(xiàn)在將在普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)的，存在于制劑或組合物中的rhBSSL的量/濃度可以絕對(duì)量(例如，質(zhì)量或摩爾量)和/或按照活性單位的數(shù)目表示。參考活性標(biāo)準(zhǔn)BSSL分子，可使用本文描述的PNPB測定容易確定rhBSSL的活性?；钚詒hBSSL的合適質(zhì)量在以上給出的質(zhì)量范圍內(nèi)。由于復(fù)合物蛋白質(zhì)例如rhBSSL的分子量可例如由于糖基化的差異而不同，所述脂酶的量可以以除按照質(zhì)量以外例如按照(活性)摩爾量的方式來定義。技術(shù)人員將容易地能夠進(jìn)行從特定mg量到對(duì)應(yīng)的微摩爾量的其它轉(zhuǎn)換?？蛇x地，重組人膽鹽刺激脂酶的量可按照脂酶活性以酶單位(U)表示，例如定義為在測定條件下催化形成I微摩爾產(chǎn)物/分鐘的所述脂酶的量，例如，在諸如本文中描述的BSSL活性的體外測定中確定的。
[0103]溶劑
[0104]如之前討論的，凍干法是借以將溶劑從液體制劑中除去的過程。如本文所用的，術(shù)語“溶劑”是指能夠溶解或懸浮一種或多種溶質(zhì)的制劑的液體組分。術(shù)語“溶劑”可以指單一溶劑或溶劑的混合物。用于藥物制劑的常用溶劑為注射用水(WFI)。取決于制劑或冷凍干燥過程，在液體制劑中包括一種或多種有機(jī)溶劑可以是期望的。例如，在制劑中包括有機(jī)溶劑以增強(qiáng)一種或多種活性成分的溶解度可以是期望的。合適的有機(jī)溶劑的實(shí)例包括，但不限于，乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、叔丁醇、丙酮、環(huán)己烷和二甲基亞砜(DMSO)。
[0105]填充劑
[0106]填充劑的目的是向制劑提供體積(bulk)并增強(qiáng)塊狀物形成。如本文所用的，術(shù)語“填充劑”包括“結(jié)晶”和“非結(jié)晶”填充劑兩種。術(shù)語“結(jié)晶”填充劑指的是在典型的凍干條件下能夠形成晶體結(jié)構(gòu)的填充劑。
[0107]通常，結(jié)晶填充劑 是指在冷凍期間(例如，約0°C和約_50°C之間的溫度)能夠結(jié)晶的填充劑。在冷凍過程期間，結(jié)晶填充劑可需要退火、熱處理步驟或其它組分以促進(jìn)結(jié)晶。例如，取決于凍干過程的條件和/或存在于制劑中的其它賦形劑，填充劑在凍干期間可以是或可以不是結(jié)晶的。典型地，當(dāng)液體制劑包含足夠量的結(jié)晶填充劑(例如，當(dāng)結(jié)晶填充劑與非晶溶質(zhì)/組分(例如，rhBSSL或其它賦形劑)的比為至少約1.0、約1.25或約1.5)并允許在凍干過程中結(jié)晶時(shí)，該結(jié)晶填充劑可形成制劑的非晶組分(例如，rhBSSL)的結(jié)構(gòu)支撐基質(zhì)。如本文所用的，術(shù)語“結(jié)構(gòu)支撐基質(zhì)”是指晶體結(jié)構(gòu)提供的對(duì)制劑的支撐物(類似于“支架”)，使得塊狀物的宏觀結(jié)構(gòu)在一級(jí)干燥期間基本上不受屬于結(jié)構(gòu)支撐基質(zhì)的間隙之內(nèi)的非晶溶質(zhì)的任何“微塌陷”的影響。該結(jié)晶結(jié)構(gòu)支撐基質(zhì)可允許一級(jí)干燥，具有在產(chǎn)物的非晶組分的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度之上的產(chǎn)物溫度。
[0108]在此方面的某些實(shí)施方案中，結(jié)晶填充劑對(duì)rhBSSL的相對(duì)質(zhì)量濃度大于約I比1，例如大于約1.25比1、大于約1.5比1、大于約2.0比I或大于約2.5比1，例如約2.0比I和5.0比I之間。
[0109]在本發(fā)明所有方面的特定實(shí)施方案中，所述結(jié)晶填充劑不是氨基酸，諸如多元醇，例如，其中所述結(jié)晶填充劑是甘露醇。
[0110]如由實(shí)施例3證明的，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，相比不包括結(jié)晶填充劑的液體制劑，結(jié)晶填充劑諸如甘露醇的添加顯著提高了 rhBSSL的凍干制劑的穩(wěn)定性。
[0111]在適于本發(fā)明的凍干法的制劑的特定實(shí)施方案中，所述結(jié)晶填充劑是以約50mM和約500mM之間的濃度存在的甘露醇；優(yōu)選地，其中所述濃度為約IOOmM和400mM之間，或150mM和300mM之間。在優(yōu)選的此類實(shí)施方案中，甘露醇的濃度為約175mM和約250mM之間，且更優(yōu)選地，其中所述甘露醇以約180mM和約210mM之間的濃度存在；例如，其中甘露醇的濃度選自由下列構(gòu)成的組:約185mM ;約190mM ;約195mM ;約200mM ;和約205mM。
[0112]穩(wěn)定劑
[0113]穩(wěn)定劑可包括本發(fā)明的制劑和/或組合物。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑和/或組合物還可包括穩(wěn)定劑，諸如非晶穩(wěn)定劑，其是與所述結(jié)晶填充劑不同的化學(xué)實(shí)體。
[0114]術(shù)語“非晶”穩(wěn)定劑是指在典型的凍干條件下，能夠采取非晶形式的穩(wěn)定劑。術(shù)語“非晶”被普通技術(shù)人員通常理解，并包括描述缺少-至可檢測的程度-晶體的長程有序特征的固體的含義。
[0115]在本發(fā)明的制劑和/或組合物的某些實(shí)施方案中，非晶穩(wěn)定劑不是蔗糖；優(yōu)選地，所述非晶穩(wěn)定劑不是糖類；更優(yōu)選地，所述非晶穩(wěn)定劑是氨基酸。在特定的此類實(shí)施方案中，所述非晶穩(wěn)定劑選自由下列構(gòu)成的組=L-精氨酸；L-組氨酸；L-脯氨酸；L-丙氨酸；和甘氨酸；最優(yōu)選地，其中所述非晶穩(wěn)定劑是甘氨酸。
[0116]如由本文的實(shí)施例所證明的，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，非晶穩(wěn)定劑諸如甘氨酸的添加，對(duì)存在于凍干制劑中的rhBSSL的穩(wěn)定性具有附加的和協(xié)同效應(yīng)。此類有益效果尤其是當(dāng)甘氨酸以特定范圍的濃度/量存在于制劑中時(shí)被顯示。
[0117]因此，在適于本發(fā)明的凍干法的制劑的特定實(shí)施方案中，所述非晶穩(wěn)定劑是甘氨酸，以約IOmM和約IOOmM之間的濃度存在于此制劑中；優(yōu)選地，其中所述甘氨酸的濃度在約20mM和約70mM之間； 更優(yōu)選地，其中所述濃度在約30mM和55mM之間；最優(yōu)選地，所述甘氨酸以約35mM和50mM之間的濃度，諸如以選自由下列構(gòu)成的組的甘氨酸濃度存在于此制劑中:約 36mM ;約 38mM ;約 40mM ;約 42mM ;約 44mM ;約 46mM ;和約 48mM。
[0118]pH或緩沖劑
[0119]緩沖液通常被包含在藥物制劑中以保持制劑的pH處于生理上可接受的pH。制劑的期望pH還可受到活性劑的影響。例如，大部分生物藥物活性劑在特定pH范圍內(nèi)具有較高的活性。通常，制劑的pH被保持在約4.0和約8.0之間、約5.5和約7.5之間、或約6.0和約7.2之間。通常，緩沖液以約2mM至約50mM、或約IOmM和25mM之間的濃度被包含在液體制劑中。
[0120]合適的緩沖液的實(shí)例包括源自酸諸如磷酸、烏頭酸、檸檬酸、gluaric、蘋果酸、琥珀酸和碳酸。通常地，采用緩沖液作為這些酸之一的堿金屬鹽或堿土金屬鹽。通常，緩沖液是磷酸鹽或檸檬酸鹽，通常是檸檬酸鹽，例如檸檬酸鈉或檸檬酸。其它合適的緩沖液包括醋酸鹽、Tris和組氨酸緩沖液。
[0121]在適于凍干的制劑的特定實(shí)施方案中，所述制劑具有約6.3和約7.5之間的pH值；優(yōu)選地，所述pH值在約6.6和約7.2之間；更優(yōu)選地，其中所述pH值選自由下列構(gòu)成的組:約6.7 ;約6.8 ;約6.9 ;約7.0 ;和約7.1。
[0122]在某些實(shí)施方案中，適于凍干的制劑還可包括磷酸鈉緩沖液。在特定的此類實(shí)施方案中，適于凍干的制劑包含以約2mM和約20mM之間的磷酸鹽濃度存在的磷酸鈉；優(yōu)選地，其中所述磷酸鹽濃度為約5mM和約15mM之間；更優(yōu)選地，其中所述磷酸鹽濃度選自由下列構(gòu)成的組:約6mM ;約8mM ;約IOmM ;約12mM ;和約14mM。
[0123]將被普通技術(shù)人員理解的是，磷酸鹽的濃度將包括，取決于pH而處于可應(yīng)用的相對(duì)濃度的任何或三種形式的磷酸鹽形式(H3P04、(H2PO4) \ (HPO4)2-或(PO4)3-),在生物pH范圍下其將通常包括(H2PO4)' (即04)2_離子作為占主導(dǎo)地位的磷酸鹽形式。因此，在生理pH下，磷酸鈉緩沖液通常由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉之間的平衡提供。
[0124]其它賦形劑
[0125]其它賦形劑可被添加至本發(fā)明的任何制劑/組合物。其它賦形劑可以包括等滲劑，例如鹽和/或防腐劑、甜味劑、著色劑、填充劑(filler)，等等。
[0126]在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑/組合物還可包括氯化鈉。例如，適于凍干的制劑可包括氯化鈉，以約IOmM和30mM之間的氯化物濃度存在；優(yōu)選地，其中所述氯化物濃度為約15mM和25mM之間；更優(yōu)選地，其中所述氯化物濃度選自由下列構(gòu)成的組:約ISmM ;約20mM ;約 22mM ;和約 24mM。
[0127]II1.本發(fā)明的特定制劑和其它方面
[0128]本發(fā)明人在本文公開了包括rhBSSL的適于凍干的具有特定濃度范圍內(nèi)的特定組合的賦形劑的特定制劑。如實(shí)例中所證明的，此制劑在形成rhBSSL的凍干制劑方面具有特定效用，其顯示了本文已描述的一個(gè)或多個(gè)特征中的改善。因此，在特定實(shí)施方案中，適于本發(fā)明的凍干法的制劑包含:
[0129].以約10mg/mL和15mg/mL之間的濃度存在的rhBSSL ;
[0130].以約180mM和210mM之間的濃度存在的甘露醇；
[0131].以約35mM和50mM之間的濃度存在的甘氨酸；
[0132]?以約2mM和20mM之間優(yōu)選約5mM和15mM之間的磷酸鹽濃度存在的磷酸鈉；和
[0133].以約5mM和50mM之間優(yōu)選約15mM和25mM之間的氯化物濃度存在的氯化鈉，
[0134]?其中制劑具有約6.3和7.2之間的pH值。當(dāng)此(液體)制劑通過例如如本文描述的方法冷凍干燥時(shí)，形成了 rhBSSL的凍干制劑，其顯示本已描述的一個(gè)或多個(gè)特征中的改善。
[0135]因此，本發(fā)明的另一方面涉及通過適于凍干的制劑的凍干可獲得的，諸如獲自適于凍干的制劑的凍干的凍干制劑，如本文描述的。
[0136]在某些此類方面中，所述凍干制劑中的rhBSSL基本上以非結(jié)晶形式存在。例如，小于約20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%的所述rhBSSL可以呈結(jié)晶形式，或沒有結(jié)晶形式的rhBSSL可例如通過粉末X-射線衍射分析是可檢測的。在優(yōu)選的此類實(shí)施方案中，所述rhBSSL以非晶形式存在。
[0137]在凍干制劑的特定實(shí)施方案中，結(jié)晶填充劑是甘露醇。在某些此類實(shí)施方案中，所述甘露醇基本上呈結(jié)晶形式存在；和/或所述甘露醇以約Img和約10mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量被包含。優(yōu)選地，甘露醇以約2mg和約5mg/mg rhBSSL之間，更優(yōu)選地以約2.7mg和約3.lmg/mgrhBSSL之間的相對(duì)量被包含。提及組分的“基本上存在”是指，以約5%和約50%之間，例如以約10%和約50%之間或約25%和約50%之間的組分呈給定的形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述甘露醇絕大多數(shù)呈結(jié)晶形式存在。提及組分的“絕大多數(shù)存在”是指，大于約50 %，諸如大于約60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的組分呈給定的形式。
[0138]本發(fā)明人證明，除了結(jié)晶填充劑之外，令人驚訝地，在本發(fā)明的某些凍干制劑中沒有檢測到其它結(jié)晶形式。特別地，并參考實(shí)施例4中描述的制劑，不存在結(jié)晶甘氨酸、結(jié)晶磷酸鈉的證據(jù)，且甚至不存在結(jié)晶氯化鈉的證據(jù)。[0139]因此，在凍干制劑的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述甘露醇是所述制劑的基本呈結(jié)晶形式存在的唯一組分。例如，甘露醇是凍干制劑中晶體可被檢測到的唯一組分；例如，通過使用粉末X-射線衍射分析檢測。在凍干制劑的可選實(shí)施方案中，所述甘露醇是基本呈結(jié)晶形式存在的唯一賦形劑；或其中所述甘露醇是制劑中存在的唯一填充劑；和/或是呈結(jié)晶形式存在的唯一填充劑，例如基本呈結(jié)晶形式存在。
[0140]本發(fā)明的凍干制劑包含是與所述結(jié)晶填充劑不同的化學(xué)實(shí)體的非晶穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的凍干制劑的優(yōu)選此類實(shí)施方案中，所述非晶穩(wěn)定劑是甘氨酸，并且:所述甘氨酸基本呈非結(jié)晶形式存在；和/或所述甘氨酸以約0.1mg和約0.5mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量被包含。優(yōu)選地，甘氨酸以約0.1mg和約0.4mg/mg rhBSSL之間，更優(yōu)選地以約0.2mg和約0.3mg/mg rhBSSL之間的相對(duì)量被包含。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含甘氨酸作為所述非晶穩(wěn)定劑，其中所述甘氨酸呈非晶形式存在。例如，通過粉末X-射線衍射分析沒有能夠檢測到呈結(jié)晶形式的甘氨酸，例如特別地不存在可檢測的特征為結(jié)晶甘氨酸的峰，例如不存在可檢測的D值17.906、23.693和/或28.4292 Θ處的粉末X-射線衍射峰。
[0141]在凍干制劑的特定此類優(yōu)選形式中，所述甘氨酸是制劑中存在的唯一穩(wěn)定劑，和/或是基本呈非結(jié)晶形式存在的唯一穩(wěn)定劑，且在又更優(yōu)選的形式中，甘氨酸是呈非晶形式存在的唯一穩(wěn)定劑。
[0142]在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含磷酸鈉；優(yōu)選地，其中所述磷酸鈉基本呈非結(jié)晶形式存在；和/或所述磷酸鈉以約0.015mg和約0.25mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量被包含。在此類實(shí)施方案中，所述磷酸鈉可包括磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉。
[0143]本發(fā)明人證明了 如下驚人的發(fā)現(xiàn):盡管甘氨酸(已知促進(jìn)磷酸鈉結(jié)晶的賦形劑)存在于本發(fā)明的某些制劑中，結(jié)晶磷酸鈉是不可檢測的。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含呈非晶形式存在的磷酸鈉。
[0144]在又另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含氯化鈉；優(yōu)選地，其中所述氯化鈉基本呈非結(jié)晶形式存在；和/或所述氯化鈉是以約0.02mg和約0.3mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量被包含。
[0145]本發(fā)明人證明了如下驚人的發(fā)現(xiàn):盡管氯化鈉通常容易形成晶體，結(jié)晶磷酸鈉是不可檢測的。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含呈非晶形式存在的氯化鈉。
[0146]本發(fā)明人在本文公開了包含rhBSSL的具有特定相對(duì)量范圍內(nèi)的特定組合的賦形劑的特定制劑。如實(shí)例中證明的，此凍干制劑顯示本文已描述的一個(gè)或多個(gè)特征中的改善。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含每mg所述rhBSSL的以下物質(zhì):
[0147].甘露醇，以約2mg和約5mg之間，優(yōu)選約2.7mg和約3.1mg之
[0148]間的相對(duì)量存在；
[0149].甘氨酸，以約0.1mg和約0.4mg之間，優(yōu)選約0.2mg和約0.3mg
[0150]之間的相對(duì)量存在；
[0151].磷酸鈉，以約0.05mg和約0.15mg之間的相對(duì)量存在；及
[0152].氯化鈉，以約0.06mg和約0.18mg之間的相對(duì)量存在。
[0153]在本發(fā)明此類特定凍干制劑的優(yōu)選實(shí)施方案中:甘露醇基本呈結(jié)晶形式存在，優(yōu)選甘露醇絕大多數(shù)呈結(jié)晶形式存在；甘氨酸呈非晶形式存在；磷酸鈉呈非晶形式存在；和/或氯化鈉呈非晶形式存在。
[0154]如現(xiàn)在對(duì)普通技術(shù)人員將明顯的是，本發(fā)明的凍干制劑可以以不同的絕對(duì)量被制備，諸如以大規(guī)模制造批次制備，例如約:100g, lKg、IOKg, 100Kg、250Kg或500Kg的此類凍干制劑。然而，關(guān)于向個(gè)體諸如有需要的患者施用，可以以單次或多次此類量以任何給定的施用或施用過程被施用至個(gè)體的總計(jì)較小的量將是期望的。
[0155]因此，在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的凍干制劑的此期望的量，作為如本文描述的凍干制劑的單位劑量，其中所述rhBSSL以約Img和約500mg之間的絕對(duì)量存在于此單位劑量中。在此單位劑量的優(yōu)選實(shí)施方案中，rhBSSL以約5mg和約25mg之間的絕對(duì)量存在，且更優(yōu)選地，其中所述量選自由下列構(gòu)成的組:約8mg ;約IOmg ;約12mg ;約14mg ;和約16mg。通過此類單位劑量的應(yīng)用的非限制實(shí)例的方式，包括約25mg和50mg之間的那些單位劑量可在治療成年人囊性纖維化和/或胰腺功能不全的患者中具有效用；且包括約IOmg和20mg之間的那些單位劑量可在治療嬰兒諸如早產(chǎn)嬰兒中具有效用。在某些實(shí)施例中，諸如在“半劑量(half-dose) ”可被需要以補(bǔ)充全單位劑量的情況下，例如當(dāng)需要針對(duì)體重的準(zhǔn)確劑量諸如用于施用至早產(chǎn)和/或小嬰兒時(shí)，本發(fā)明的單位劑量可包括以約2mg和IOmg之間的絕對(duì)量，諸如選自以下的rhBSSL的量存在的rhBSSL:約4mg ;約6mg ;和約8mg。如本文所述的，普通技術(shù)人員現(xiàn)在將容易能夠依據(jù)活性rhBSSL的量，諸如由通過例如使用如本文所述的活性測定的一些酶單位(U)，表示本發(fā)明任何凍干制劑或單位劑量中rhBSSL的量。 [0156]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的單位劑量可用于和/或特別適于向早產(chǎn)的嬰兒施用。例如，所述施用可包括通過胃腸道施用液體嬰兒喂養(yǎng)品，其中在所述施用之前，所述凍干制劑的所述單位劑量已被重建成所述嬰兒喂養(yǎng)品。在某些實(shí)施方案中，所述液體嬰兒喂養(yǎng)品是基于乳汁的或基于脂肪的(例如基于乳汁或植物脂肪的)液體嬰兒喂養(yǎng)品。在特定實(shí)施方案中，液體嬰兒喂養(yǎng)品是巴氏消毒的母乳，并且在可選的實(shí)施方案中，其是嬰兒配方食品，例如在共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060中公開的。經(jīng)胃腸道施用可通過喂食，諸如通過瓶子方便地進(jìn)行?？蛇x地，施用可通過其它工具實(shí)現(xiàn)；例如，通過使用滴管、注射器、匙或浸潰的布，諸如如果嬰兒具有口的畸形則可能需要。在某些實(shí)施方案中，諸如在體重過輕、早產(chǎn)或虛弱的嬰兒的情況下，可直接通過胃、胃造口術(shù)、或十二指腸管向胃腸道進(jìn)行施用。
[0157]早產(chǎn)的嬰兒特別危險(xiǎn)，并因此需要精心喂養(yǎng)和治療劑的施用。因此，對(duì)用于向此類嬰兒施用的穩(wěn)定的并因此保留其經(jīng)過長時(shí)間段的治療效果的治療劑存在巨大需求。用于向此類嬰兒施用的治療劑的穩(wěn)定性的顯著或本質(zhì)變化可導(dǎo)致在治療過程中向此類嬰兒的不完全的_、過度的-或可變的-給藥；可能伴隨致命的結(jié)果。
[0158]因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如本文所述的凍干制劑，或如本文所述的單位劑量，其中所述rhBSSL包括穩(wěn)定的rhBSSL?！胺€(wěn)定的”是指當(dāng)以建議的劑量儲(chǔ)存時(shí)，該rhBSSL和/或該制劑作為整體的治療活性或潛能持續(xù)期望的時(shí)間段被保持。通過非限制性實(shí)例的方式，此類期望的時(shí)間段可以是持續(xù)至少約:3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月或更長，例如72個(gè)月:且此類建議的儲(chǔ)存溫度可以是約_18°C、+4°C、+18°C或約+22。。。
[0159]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，包含穩(wěn)定的rhBSSL的凍干制劑或單位劑量在例如儲(chǔ)存此類時(shí)期和時(shí)間段期間不容易形成聚集體。在某些此類實(shí)施方案中，聚集體是不溶性聚集體。治療制劑，即使口服給予的治療制劑且特別是給予早產(chǎn)的嬰兒的治療制劑中rhBSSL的不溶性聚集體的存在，都可對(duì)劑量并因此對(duì)治療的療效和/或安全性具有顯著影響。因此，rhBSSL的不溶性聚集體的量的減少將會(huì)是期望的，因?yàn)槠淇捎兄趓hBSSL的療效及較安全的治療用途中較少的變化。通過非限制性實(shí)例的方式，“不容易形成”聚集體包括儲(chǔ)存在+25°C下6個(gè)月后，小于約5 %，例如小于約3 %、2.5 %或2 %的rhBSSL聚集體存在。rhBSSL聚集體的量可被定量，例如，通過如本文描述的SE-HPLC?？蛇x地，聚集體形成的速率可以小于本文所述的制劑NI所示的速率。
[0160]在某些實(shí)施方案中，所述凍干制劑或單位劑量中聚集體的形成是所述凍干制劑在約0°C和約+40°C之間的溫度下儲(chǔ)存的結(jié)果；優(yōu)選地，其中所述儲(chǔ)存溫度選自由下列所構(gòu)成的組:約+5°C ;約+10°C ;約+15°C ;約+20°C ;和約+25°C。在其它實(shí)施方案中，此類聚集的形成可由表面相互作用、(UV)光、放射線、化學(xué)改性、表面活性劑的存在所致。 [0161]在某些實(shí)施方案中，當(dāng)儲(chǔ)存于+4°C、+18°C或約+22°C時(shí)，凍干制劑或單位劑量的保質(zhì)期被延長，例如直至約18個(gè)月、25個(gè)月、或72個(gè)月。
[0162]在又另一方面中，本發(fā)明涉及制備rhBSSL的凍干制劑的方法，所述方法包括以下步驟:提供適于如本文描述的、定義的或請求保護(hù)的凍干法的制劑；及凍干所述制劑。所述方法可包括以下步驟:冷凍所述適于凍干的制劑；一級(jí)干燥所述冷凍制劑；及二級(jí)干燥一級(jí)干燥的制劑。
[0163]在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，此方法的每個(gè)步驟都可施用如本文描述的、或定義的關(guān)于此步驟的參數(shù)進(jìn)行。例如，并如本文實(shí)施例4中更詳細(xì)陳述的，冷凍步驟可通過以約0.8V /小時(shí)的速率將適于凍干的制劑冷卻至約-50°C進(jìn)行，并且在另外的此類實(shí)施方案中，冷凍制劑可通過在_50°C下保持5小時(shí)被平衡。關(guān)于一級(jí)干燥，此步驟可通過施加約0.2mbar的真空和0°C的擱板溫度(shelf temperature)進(jìn)行,并持續(xù)約13小時(shí)和/或直到樣品的溫度接近擱板溫度，指示冰晶升華完成。二級(jí)干燥可通過降低室壓力至約0.02mbar并以約1°C /小時(shí)的速率將擱板溫度升高至約+25°C被啟動(dòng)，且二級(jí)干燥可持續(xù)約10小時(shí)，直至產(chǎn)物具有約0.8%和0.2%之間的水分含量。液體制劑的凍干可在放置于凍干室中玻璃小瓶中進(jìn)行；然后當(dāng)凍干完成時(shí)，在真空條件下用橡膠塞密封小瓶。
[0164]在相關(guān)的方面，本發(fā)明還涉及通過上文描述的方法可獲得的諸如獲自上文描述的方法的rhBSSL的凍干制劑。
[0165]為了將rhBSSL施用至個(gè)體，本發(fā)明的凍干制劑通常被重建；其被溶解在溶劑(通常是水基的)中以形成可更容易地被所述個(gè)體可生物利用的rhBSSL溶液。因此，在另外的方面，本發(fā)明涉及制備rhBSSL的重建制劑的方法，所述方法包括以下步驟:提供如本文描述的、定義的或請求保護(hù)的凍干制劑，或如本文描述的、定義的或請求保護(hù)的單位劑量；及在液體例如在諸如水基溶劑的溶劑中重建所述凍干制劑或單位劑量。
[0166]在特定的此類方法中，所得的重建制劑具有約5.9和7.9之間的pH ;優(yōu)選地，其中所述PH在約6.4和7.4之間；更優(yōu)選地，其中所述pH選自由下列構(gòu)成的組:約6.5 ;約6.6 ;約 6.7 ;約 6.8 ;約 6.9 ;約 7.0 ;約 7.1 ;約 7.2 ;和約 7.3。
[0167]在另外的此類方法中，所得的重建制劑以約2.5mg和約50mg之間的量包含所述rhBSSL ;優(yōu)選地,其中所述量在約5mg和約25mg之間；更優(yōu)選地,其中所述量選自由下列構(gòu)成的組:約 7.5mg ;約 IOmg ;約 12.5mg ;約 15mg ;約 17.5mg 和約 20mg。
[0168]本發(fā)明的某些應(yīng)用涉及提供適于向人類嬰兒施用的rhBSSL的制劑。因此，在該方法的某些實(shí)施方案中，凍干制劑或單位劑量在液體嬰兒喂養(yǎng)品中被重建，并且因此所述構(gòu)成的制劑在液體嬰兒喂養(yǎng)品中被重建。
[0169]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，液體嬰兒喂養(yǎng)品是非新鮮母乳，凍干制劑或單位劑量在其中被重建，是巴氏消毒乳汁。在其它實(shí)施方案中，母乳在例如巴氏消毒之后已被冷凍。在特定實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的母乳來自乳汁庫。乳汁庫可包括收集捐贈(zèng)的母乳、確保乳汁安全和質(zhì)量并且使其可用于有需要的嬰兒的全國性組織National MilkBank(NMB)，或1985年成立的以設(shè)置北美洲乳汁庫的建立和運(yùn)作標(biāo)準(zhǔn)并促進(jìn)北美洲乳汁庫的建立和運(yùn)作的捐贈(zèng)者母乳庫的非營利性協(xié)會(huì)Human Milk Banking Association ofNorth America (HMBANA)。
[0170]在可選的實(shí)施方案中，在嬰兒配方食品中重建冷凍制劑或單位劑量。技術(shù)人員將知曉許多市售可得的嬰兒配方食品，其包括:Enfamil?、Pregestimil?、Nutramigen?和Nutramigen AA?(所有均由 Mead Johnson 銷售或制造)；Similac?、Isomil?、Alimentum?和 EleCare?(所有均由 Abbott Laboratories, Ross division 銷售或制造)；Nestl6:世界最大的配方食品生產(chǎn)商，制造了 GoodStart?(由Nestle/Gerber Products Company銷售或制造)；Farexl?和Farex2?(由Wockhardt Nutrition銷售或制造)。對(duì)于早產(chǎn)兒，其它嬰兒配方食品例如 Similac Neosure、EntramiI Premature、Similac Special Care、Cow&Gate Nutriprem2和EntramiI Enfacare也是可用的。對(duì)于所有嬰兒配方食品共有的是，它們包含作為脂酶諸如rhBSSL的底物的脂類的來源。在特定實(shí)施方案中，嬰兒配方食品具有通常與共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060的展示A中顯示的規(guī)格(specifications) 一 致、或基本如共同待審的申請W02012/052059和W02012/052060的展不A 中顯不的規(guī)格，或如由 ESPGHAN Coordinated International Expert Group (Koletzko等人，2005 ；J Ped GastroNutr41:584-599)推薦的組成(添加rhBSSL之前)。在某些實(shí)施方案中，嬰兒配方食品包含如所述展示B中所示的一種或多種成分并處于近似水平。在特別有益的實(shí)施方案中，嬰兒配方食品包含至少0.5% (總脂肪)的二十二碳六烯酸(DHA)和/或花生四烯酸(AA)，并且在另外的此類實(shí)施方案中，其中AA的濃度應(yīng)至少達(dá)到DHA的濃度，和/或如果添加二十碳五烯酸(C20:5n-3)，其濃度不超過DHA的含量。
[0171]包含從本發(fā)明儲(chǔ)存的例如在+25°C下持續(xù)9個(gè)月的凍干制劑或單位劑量重建的rhBSSL的此類液體嬰兒喂養(yǎng)品，與從現(xiàn)有技術(shù)的rhBSSL制劑(rhBSSL的水溶液)制造的液體嬰兒喂養(yǎng)品、或從不含任何填充劑或穩(wěn)定劑的凍干rhBSSL制造的液體嬰兒喂養(yǎng)品，各自均相似地在+25°C儲(chǔ)存9個(gè)月相比，預(yù)期具有較低水平的不溶性聚集體。
[0172]在特定方面，本發(fā)明涉及rhBSSL的重建制劑，包括:
[0173]⑴所述rhBSSL，以IOmg和20mg之間的絕對(duì)量存在；
[0174](ii)甘露醇，以27mg和62mg之間的絕對(duì)量存在；
[0175](iii)甘氨酸，以2mg和6mg之間的絕對(duì)量存在；且其中所述制劑在液體嬰兒喂養(yǎng)品中被重建；且所述重建制劑具有6.4和7.4之間的pH。
[0176]本發(fā)明人在本文還證明，在rhBSSL的凍干制劑中使用甘氨酸，還提供了該特定蛋白質(zhì)的此類制劑的驚人的和有益的性質(zhì)。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及甘氨酸穩(wěn)定存在于凍干制劑中的rhBSSL的用途，其中:
[0177].所述甘氨酸基本呈非結(jié)晶形式存在于所述凍干制劑中；和/或
[0178].所述甘氨酸以約0.1mg和約0.4mg/mg所述rhBSSL之間、優(yōu)選約0.2mg和約0.3mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量包含在所述凍干制劑中。
[0179]所述凍干制劑還包含不是甘氨酸的結(jié)晶填充劑，諸如結(jié)晶填充劑為甘露醇。在此方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述凍干制劑中存在的所述甘氨酸呈非晶形式存在。
[0180]在此用途的更優(yōu)選的此類實(shí)施方案中，凍干制劑還包含每mg所述rhBSSL的以下物質(zhì):
[0181].甘露醇，以約2mg和約5mg之間、優(yōu)選約2.7mg和約3.1mg之間的相對(duì)量被包含在所述凍干制劑中作為所述結(jié)晶填充劑；
[0182].磷酸鈉，以約0.05mg和約0.15mg之間的相對(duì)量被包含在所述凍干制劑中；及
[0183].氯化鈉，以約0.06mg和約0.18mg之間的相對(duì)量被包含在所述凍干制劑中。
[0184]在此用途的又另外優(yōu)選的此類實(shí)施方案中，在此類凍干制劑中:
[0185].所述甘露醇基本呈結(jié)晶形式存在；
[0186]?所述甘氨酸呈非晶形式存在； [0187].所述磷酸鈉呈非晶形式存在；且
[0188].所述氯化鈉呈非晶形式存在。
[0189]在某些實(shí)施方案中，甘氨酸的此用途提供了具有提高的穩(wěn)定性的rhBSSL制劑。因此，在特定實(shí)施例中，所述rhBSSL的所述穩(wěn)定通過形成所述rhBSSL的聚集體的速率被表征。例如，所述聚集體的形成是所述凍干制劑在約0°C和+40°C之間的溫度下儲(chǔ)存的結(jié)果；優(yōu)選地，其中所述儲(chǔ)存溫度選自由下列構(gòu)成的組:約+5°C ;約+10°C ;約+15°C ;約+20°C ;和約 +25 0C ο
[0190]因此，在相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及減少和/或最小化存在于液體嬰兒喂養(yǎng)品中的rhBSSL的不溶性聚集體的形成的方法，所述方法包括以下步驟:提供:如本文描述的、定義的或請求保護(hù)的凍干制劑或單位劑量；及在液體嬰兒喂養(yǎng)品中重建所述凍干制劑或單位劑量。
[0191]在此方法的某些實(shí)施方案中，制劑或單位劑量被直接添加至液體嬰兒喂養(yǎng)品并在其中溶解。在可選的實(shí)施方案中，凍干制劑或單位劑量首先被溶解在第一液體(例如水)中，然后將其加入液體嬰兒喂養(yǎng)品。
[0192]在此方法的其它實(shí)施方案中，此方法被實(shí)踐:以增加存在于所述嬰兒喂養(yǎng)品的溶液中的活性rhBSSL相對(duì)于不溶性聚集體的量的量；和/或減少不同液體嬰兒喂養(yǎng)品之間的rhBSSL效力的可變性。
[0193]表征本發(fā)明的制劑和/或組合物的一個(gè)重要方法是rhBSSL聚體程度的確定。因此，本發(fā)明一個(gè)另外的方面涉及確定rhBSSL聚集的減少的方法，所述方法包括以下步驟:提供如本文描述的、定義的或請求保護(hù)的凍干制劑或單位劑量；儲(chǔ)存所述凍干制劑或單位劑量；并在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定所述凍干制劑或所述單位劑量中所述rhBSSL的高分子量百分比HMW)的水平，從而確定所述rhBSSL的聚集水平。rhBSSL聚集的程度和/或水平可通過任何合適的方法被確定和/或被定量，例如通過SE-HPLC檢測rhBSSL的％ HMW水平，如例如在本文實(shí)施例中描述的。[0194]在優(yōu)選的此類方法中，所述方法包括以下步驟:確定所述凍干制劑在+5°C儲(chǔ)存18個(gè)月后是否包括小于約3.5%、3.0%、2.5%、2.25%、2.0%、1.75%或1.5%的所述rhBSSL的HMW種類，如通過SE-HPLC確定的。
[0195]被理解的是，將本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)用于特定問題或環(huán)境，根據(jù)本文包含的教導(dǎo)，將在具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的人員的能力之內(nèi)。本文引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和出版物在此通過引用以其整體并入。本發(fā)明的制劑和組合物的實(shí)例和其制備或使用的代表性方法、用途或過程在下文呈現(xiàn)。
實(shí)施例
[0196]下面的示例，包括所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和實(shí)現(xiàn)的結(jié)果，也說明了本發(fā)明多種目前特定的實(shí)施方案，并被提供僅用于說明的目的，且不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明。
[0197]實(shí)施例1:實(shí)驗(yàn)AH7507
[0198]實(shí)驗(yàn)設(shè)置:使用具有2個(gè)中心點(diǎn)的全因子2水平設(shè)計(jì)(22)，研究了結(jié)晶填充劑和任選非晶穩(wěn)定劑對(duì)rhBSSL的凍干制劑的性質(zhì)的影響。以各種組合和量的賦形劑被用于制備7個(gè)具有復(fù)I中展示的組成的凍干制劑。加入溫度作為用于待被儲(chǔ)存18個(gè)月的樣品的因子設(shè)計(jì)的第三因子(在+5°C和+25°C下儲(chǔ)存18個(gè)月)，且樣品還在+40°C下儲(chǔ)存9個(gè)月的較短時(shí)期。在儲(chǔ)存期間定期從多種凍干制劑中取樣，并使用尺寸排阻高效液相色譜法(SE-HPLC)、粉末X-射線衍射(PXRD)和其它技術(shù)研究。
[0199]表1AH7507的凍干制劑的凍干粉末中rhBSSL和賦形劑的量。
[0200]
【權(quán)利要求】
1.一種適于凍干的制劑，所述制劑包含: (i)重組人膽鹽刺激脂酶(rhBSSL)； (?)結(jié)晶填充劑 '及 (iii)非晶穩(wěn)定劑，所述非晶穩(wěn)定劑是與所述結(jié)晶填充劑不同的化學(xué)實(shí)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述非晶穩(wěn)定劑選自由下列構(gòu)成的組:L-精氨酸；L-組氨酸；L-脯氨酸；L-丙氨酸；和甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制劑，其中所述非晶穩(wěn)定劑是甘氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述非晶穩(wěn)定劑以IOmM和IOOmM之間的濃度存在。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述非晶穩(wěn)定劑以35mM和50mM之間的濃度存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述結(jié)晶填充劑是甘露醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述結(jié)晶填充劑以IOOmM和400mM之間的濃度存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求7 所述的制劑，其中所述結(jié)晶填充劑以180mM和210mM之間的濃度存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的制劑,其中所述rhBSSL以lmg/mL和35mg/mL之間的濃度存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制劑,其中所述rhBSSL以10mg/mL和15mg/mL之間的濃度存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制劑，所述制劑包含: (i)以10mg/mL和15mg/mL之間的濃度存在的rhBSSL； (ii)以180mM和2IOmM之間的濃度存在的甘露醇；及 (iii)以35mM和50mM之間的濃度存在的甘氨酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的制劑，所述制劑具有6.3和7.5之間的pH值。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的制劑，所述制劑還包含以2mM和20mM之間的磷酸鹽濃度存在的磷酸鈉。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的制劑，所述制劑還包含以5mM和50mM之間的氯化物濃度存在的氯化鈉。
15.一種凍干制劑，所述凍干制劑是通過根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的制劑的凍干可獲得的。
16.一種rhBSSL的重建制劑，所述重建制劑包含: ⑴以IOmg和20mg之間的絕對(duì)量存在的所述rhBSSL ； (?)以27mg和62mg之間的絕對(duì)量存在的甘露醇； (iii)以2mg和6mg之間的絕對(duì)量存在的甘氨酸；且 其中所述制劑在液體嬰兒喂養(yǎng)品中被重建；且所述重建制劑具有6.4和7.4之間的pH。
17.甘氨酸用于穩(wěn)定凍干制劑中存在的rhBSSL的用途，所述凍干制劑還包含不是甘氨酸的結(jié)晶填充劑，其中所述甘氨酸基本呈非結(jié)晶形式存在于所述凍干制劑中；和/或所述凍干制劑以0.2mg/mg所述rhBSSL和0.3mg/mg所述rhBSSL之間的相對(duì)量包含所述甘氨酸。
【文檔編號(hào)】A23C9/152GK104023742SQ201280053920
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月26日
【發(fā)明者】威廉·?？? 申請人:瑞典孤兒比奧維特魯姆有限公司