耐受非蛋白質(zhì)氨基酸的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了耐受生物除草劑特別是植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸包括間-酪氨酸(m-酪氨酸)氨基酸類似物和其鹽的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了用于制備該轉(zhuǎn)基因植物的手段和方法。
【專利說明】耐受非蛋白質(zhì)氨基酸的轉(zhuǎn)基因植物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及耐受生物除草劑特別是植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸包括間-酪氨酸氨基酸類似物和其鹽的轉(zhuǎn)基因植物，并涉及用于制備該轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]“化感作用(allelopathy) ”是指植物通過該植物向環(huán)境中釋放的化學(xué)物質(zhì)(化感物質(zhì)(allelochemical))對周圍的物種的影響(抑制或刺激)的術(shù)語。化感物質(zhì)通常是可在任何植物部分被合成的并可對靶生物體具有有利(正向化感作用)或不利(負(fù)面化感作用)影響的次生代謝物?；形镔|(zhì)不是化感作用(耐受)植物的代謝(即生長、發(fā)育和繁殖)所需要的，而干擾非耐受物種的重要代謝途徑，為耐受植物提供相對優(yōu)勢?；凶饔眯?yīng)在希臘時代已被意識到。數(shù)種廣泛使用的作物植物諸如小麥、水稻和黃瓜的化感作用效應(yīng)的優(yōu)勢是已知的并被使用。最近，在雜草管理方面實施這一現(xiàn)象的可能性的意識已出現(xiàn)。在其它觀察到的化感物質(zhì)中，顯示有前景的植物毒性活性的間-酪氨酸，被提議作為可能的環(huán)境友好的雜草抑制劑(Bertin C.等人，2007.Proceedings of the National Academyof Sciences of U.S.A104, 16964-16969)。
[0004]間-酪氨酸(m-Tyr)是天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸。其可通過兩種可能的合成途徑被生產(chǎn):通過多巴胺合成的通路或通過苯丙氨酸被活性氧(reactive oxygen species)的氧化。常見蛋白質(zhì)氨基酸酪氨酸(對-酪氨酸)的異構(gòu)體(isomer)m-Tyr，已在番櫻桃大戟(Euphorbia myrsinites)(驢尾大戟)和一些羊茅草物種中被發(fā)現(xiàn)。源自植物的m_Tyr被發(fā)現(xiàn)對廣泛的物種是有 毒的。以低至2 μ M的濃度添加至瓊脂介質(zhì)的m-Tyr抑制擬南芥(Arabidopsis thaliana)根的生長的50 且50 μ M的濃度完全阻止種子萌發(fā)(BertinC.等人2007，同上)。
[0005]蛋白質(zhì)中間-酪氨酸(m-Tyr)連同鄰-酪氨酸(o_Tyr)和左旋多巴(L_dopa)的出現(xiàn)已被廣泛用作針對蛋白質(zhì)造成的氧化損傷的程度的指標(biāo)。已證明，在真核細(xì)胞中，某些外源提供的氧化的氨基酸包括m-Tyr，可通過生物合成通路而不是經(jīng)由化學(xué)反應(yīng)摻入蛋白質(zhì)。因此，在許多情況下，體內(nèi)受損的氨基酸可用于蛋白質(zhì)的從頭合成是可能的。該理論被以下的發(fā)現(xiàn)支持:暴露于m-Tyr導(dǎo)致寬范圍的植物物種包括商業(yè)上重要的單子葉和雙子葉作物植物的生長抑制。已進(jìn)一步表明，m-Tyr的植物毒性是通過在蛋白質(zhì)合成期間其代替苯丙氨酸摻入蛋白質(zhì)導(dǎo)致的。
[0006]苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)屬于氨酰-tRNA合成酶(aaRS)家族，其在遺傳密碼的翻譯中起關(guān)鍵作用。aaRS確保遺傳密碼翻譯的保真度，將適當(dāng)?shù)陌被峁矁r附著至相應(yīng)的核酸接頭分子(adaptor molecule)-tRNA。aaRS是眾所周知的多樣化酶家族,在一級序列、亞基大小和低聚組織方面顯著不同。系統(tǒng)發(fā)生和結(jié)構(gòu)分析揭示了 PheRS的三種主要形式:a)異源四聚的(α β)2細(xì)菌PheRS ；b)異源四聚的(α β ) 2古細(xì)菌/真核-細(xì)胞質(zhì)PheRS ;和c)單體線粒體PheRS。
[0007]由aaRS且特別是PheRS促進(jìn)的氨?；磻?yīng)的精確度，基于氨基酸底物的精確識另O。然而，由于由數(shù)個氨基酸共享立體化學(xué)相似性，發(fā)生識別錯誤。苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)僅通過芳環(huán)的一個羥基基團(tuán)被區(qū)分，并因此Phe和Tyr之間的區(qū)分并非總是被實現(xiàn)。PheRS以1:1000的錯誤率成功地區(qū)分這些氨基酸。通過PheRS連同其它aaRS的校正活性(editing activity)確保了蛋白質(zhì)生物合成的總精確度的較高水平。校正活性與特異性位點相關(guān)，其中錯?；?misacylated)的tRNA被水解。
[0008]本發(fā)明的一些發(fā)明人及同事研究了不同來源包括細(xì)菌(嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus, Tt)和大腸桿菌(Escherichia col i, Ec))及人(細(xì)胞質(zhì)(Hsct)和線粒體(Hsmt))來源的PheRS激活m-Tyr并將其附著至tRNAphe的能力(K1 ipcan, L.，等人，2009.Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A106, 11045-11048)。自由基損傷的(radical-damaged)氨基酸通過這些酶被激活，如通過ATP水解測定的。氨?；姆€(wěn)態(tài)動力學(xué)測量(由酸性凝膠電泳方法測定)未顯示tRNAphe與m-Tyr通過細(xì)菌PheRS的錯載(mischarging)(圖1)。該觀察結(jié)果作為用于校正機制效率的指示。此外，當(dāng)細(xì)菌PheRS與預(yù)裝載的m-Tyr-tRNAphe —起孵育時，m-Tyr從tRNA脫?；?，提供了所謂的反式校正活性(trans-editing activity)的證據(jù)(Ling, J.等人，2007.Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A104, 72-77)。與此相反，線粒體酶可以穩(wěn)定地合成m-Tyr-tRNAphe。HsmtPheRS不包含校正結(jié)構(gòu)域，并因此不能使非關(guān)聯(lián)(cognate)氨基酸從 tRNA 脫酸化(Roy, H.等人,2005.The Journal of biologicalchemistry280, 38186-38192 ；Kotik-Kogan, 0.等人，2005.Structured, 1799-1807)，為這些殘基摻入蛋白質(zhì)多肽鏈提供路徑。tRNAphe氨?；膭恿W(xué)參數(shù)分析表明，通過HsmtPheRS附著的m-Tyr的催化效率(keat/Km)只比正確的氨基酸低5倍，主要是由于較高的Km值。線粒體PheRS對m-Tyr的相對高的催化活性和缺乏校正活性可以解釋m_Tyr具有對植物的極大的毒性作用。在植物中，超過150種蛋白質(zhì)在線粒體和葉綠體中表達(dá)，且存在于植物細(xì)胞器中的單體苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)與人類線粒體PheRS非常相似。因此，m_Tyr代替Phe摻入至細(xì)胞器蛋白質(zhì)導(dǎo)致大量損傷的蛋白質(zhì)，因此降低細(xì)胞活力。m-Tyr對哺乳動物細(xì)胞的中等毒性可以通過在這些細(xì)胞中線粒體僅編碼13種蛋白質(zhì)的事實來解釋。
[0009]減少除草劑的使用已成為保持可持續(xù)農(nóng)業(yè)和景觀管理中的顯著目標(biāo)。在發(fā)展用于雜草控制的可有效取代危險化學(xué)品的使用的生物和有機方法中存在不斷的努力。與此同時，采取分子遺傳學(xué)方法和/或采用天然產(chǎn)物努力實現(xiàn)用于保護(hù)作物植物免受植物毒性化合物損害的手段和方法。
[0010]例如，國際PCT申請公布號W0/2005/077171公開了用于通過用一種或多種氨基酸包衣或引發(fā)種子以賦予對除草劑的耐受性，保護(hù)植物免受除草劑傷害和損傷的方法，所述除草劑破壞了用除草劑處理的植物的氨基酸的生產(chǎn)。
[0011]m-Tyr對植物的顯著毒性而對真菌、哺乳動物或細(xì)菌的降低的作用，導(dǎo)致其開發(fā)作為生物除草劑。美國專利申請公布號20080261815公開了使用來自羊茅草物種的間-酪氨酸化合物抑制雜草生長并增強非雜草植物的生長的方法，并且還公開了鑒定具有除草劑性質(zhì)的植物的方法。使用間-酪氨酸作為生物除草劑的不足是，其不僅對雜草而且對作物植物都是有毒的。
[0012]對將高效實現(xiàn)用于產(chǎn)生耐受植物毒性化感物質(zhì)例如非蛋白質(zhì)氨基酸包括間-酪氨酸的轉(zhuǎn)基因植物特別是作物植物或觀賞植物的手段存在公認(rèn)的需求。
[0013]發(fā)明概述[0014]本發(fā)明提供了用于賦予轉(zhuǎn)基因植物耐受植物生長介質(zhì)中存在的植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸的手段和方法。本發(fā)明還提供了耐受植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸特別是間-酪氨酸(m-Tyr)和其鹽的轉(zhuǎn)基因植物。
[0015]本發(fā)明部分基于以下意外的發(fā)現(xiàn):在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)菌苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)，特別是當(dāng)PheRS在線粒體和/或葉綠體中表達(dá)時，賦予了植物對間-酪氨酸的耐受性。該耐受性是由于引入的細(xì)菌PheRS水解錯?；膍-Tyr-tRNAphe并阻止非蛋白質(zhì)氨基酸摻入蛋白質(zhì)的能力。
[0016]因此，根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了包含至少一種含有編碼氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一種外源多核苷酸的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，該aaRS或其片段包含能夠水解被非蛋白質(zhì)氨基酸類似物錯酰化的tRNA的校正模塊，其中該植物耐受非蛋白質(zhì)氨基酸類似物和其鹽。
[0017]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“耐受非蛋白質(zhì)氨基酸類似物”指的是轉(zhuǎn)基因植物在以顯著抑制相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植物生長的濃度包含非蛋白質(zhì)氨基酸類似物的生長介質(zhì)中生長的能力。根據(jù)某些實施方案，生長抑制表現(xiàn)為以下的至少一種:減小的根長、減小的根徑(rootradical)、減小的根質(zhì)量、減小的植株高度、植物組織形態(tài)或顏色的異常變化、減小的植物芽(shoot)質(zhì)量和/或芽數(shù)，和其任何組合。根據(jù)一些實施方案，分離的非蛋白質(zhì)氨基酸類似物或包含其的組合物被添加至生長介質(zhì)。根據(jù)其它實施方案，非蛋白質(zhì)氨基酸類似物從產(chǎn)生其的植物分泌至 生長介質(zhì)。
[0018]根據(jù)某些實施方案，非蛋白質(zhì)氨基酸類似物是間-酪氨酸(m-Tyr)化合物，且aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
[0019]根據(jù)某些實施方案，m-Tyr化合物具有式I的結(jié)構(gòu)式或其鹽:
[0020]式1:
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包含至少一個包含編碼氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一種外源多核苷酸的細(xì)胞，所述aaRS或其片段包括能夠水解被非蛋白質(zhì)氨基酸類似物錯?；膖RNA的校正模塊，其中所述植物耐受所述非蛋白質(zhì)氨基酸類似物和其鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物生長在以顯著抑制相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物生長的濃度包含所述非蛋白質(zhì)氨基酸或其鹽的介質(zhì)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中生長抑制表現(xiàn)為以下的至少一種:減小的根長、減小的根徑、減小的根質(zhì)量、減小的植株高度、植物組織形態(tài)或顏色的異常變化、減小的植物芽質(zhì)量、減小的植物芽數(shù)，和其任何組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述非蛋白質(zhì)氨基酸類似物是間-酪氨酸(m-Tyr)化合物,且所述aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述m-Tyr化合物具有式I的結(jié)構(gòu)式或其鹽:
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述m-Tyr化合物具有式II的結(jié)構(gòu)式:
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述PheRS是包含2個PheRS-α和2個PheRS-β鏈的異源四聚的細(xì)菌PheRS。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述細(xì)菌PheRS選自由以下構(gòu)成的組:大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)PheRS 和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)PheRS。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述大腸桿菌PheRS-α由具有SEQIDNO:1中列出的核酸序列的多核苷酸編碼，且所述大腸桿菌PheRS-β由具有SEQ ID Ν0:2中列出的核酸序列的多核苷酸編碼。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述大腸桿菌PheRS-α包含SEQID NO: 3中列出的氨基酸序列，且所述大腸桿菌PheRS-β包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述嗜熱棲熱菌PheRS-α包含SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列，且所述嗜熱棲熱菌PheRS-β包含SEQ ID Ν0:6中列出的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中編碼所述aaRS或其片段的所述多核苷酸還包含編碼選自由以下構(gòu)成的組的靶向肽的核酸序列:線粒體靶向肽和葉綠體靶向肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包含編碼所述aaRS或其片段的還包含編碼線粒體靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸，與編碼所述aaRS或其片段的還包含編碼葉綠體靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸的組合。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述線粒體靶向肽和所述葉綠體靶向肽的每一個都由具有SEQ ID N0:7中列出的核酸序列的多核苷酸編碼。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述線粒體靶向肽和所述葉綠體靶向肽的每一個都包括SEQ ID N0:8中列出的氨基酸序列。
16.一種由根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的植物種子，其中所述種子用于培育包含編碼具有校正模塊的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一種外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述校正模塊能夠水解被非蛋白質(zhì)氨基酸類似物錯?；膖RNA，其中所述轉(zhuǎn)基因植物耐受所述非蛋白質(zhì)氨基酸類似物和其鹽。
17.—種組織培養(yǎng)物，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物的至少一個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或源自其的原生質(zhì)體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組織培養(yǎng)物，其中所述組織培養(yǎng)物再生包含編碼具有校正模塊的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一種外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述校正模塊能夠水解被非蛋白質(zhì)氨基酸類似物錯酰化的tRNA，所述轉(zhuǎn)基因植物耐受所述非蛋白氨基酸類似物和其鹽。
19.一種用于生產(chǎn)耐受植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸類似物或其鹽的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)用編碼包含校正模塊的氨酰tRNA合成酶aaRS或其片段的至少一種外源多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述校正模塊能夠水解非蛋白質(zhì)氨酰化的tRNA;及(b)再生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞為耐受所述植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸類似物或其鹽的轉(zhuǎn)基因植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述非蛋白質(zhì)氨基酸類似物是間-酪氨酸(m-Tyr)化合物,且所述aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述PheRS是包含2個PheRS-α和2個PheRS-β鏈的異源四聚的細(xì)菌PheRS。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)菌PheRS選自由以下構(gòu)成的組:大腸桿菌(E.coli)PheRS和嗜熱棲熱菌PheRS。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述大腸桿菌PheRS-a由具有SEQID N0:1中列出的核酸序列的多核苷酸編碼，且所述大腸桿菌PheRS-β由具有SEQ ID Ν0:2中列出的核酸序列的多核苷酸編碼。
24.根據(jù)權(quán)利 要求22所述的方法，其中所述嗜熱棲熱菌PheRS-a包括SEQID N0:5中列出的氨基酸序列，且所述嗜熱棲熱菌PheRS-β包括SEQ ID Ν0:6中列出的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中編碼所述aaRS或其片段的所述多核苷酸還包含編碼選自由以下構(gòu)成的組的靶向肽的核酸序列:線粒體靶向肽和葉綠體靶向肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物細(xì)胞被編碼所述aaRS或其片段的還包含編碼線粒體靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸，與編碼所述aaRS或其片段的還包含編碼葉綠體靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸的組合轉(zhuǎn)化。
27.根據(jù)權(quán)利要求25-26中任一項所述的方法，其中所述線粒體靶向肽和所述葉綠體靶向肽的每一個都由具有SEQ ID N0:7中列出的核酸序列的多核苷酸編碼。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述線粒體靶向肽和所述葉綠體靶向肽的每一個都包含SEQ ID N0:8中列出的氨基酸序列。
29.一種由根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物耐受所述植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物生長在以顯著抑制相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物生長的濃度含有所述非蛋白質(zhì)氨基酸或其鹽的介質(zhì)中。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物毒性非蛋白質(zhì)氨基酸是間-酪氨酸(m-Tyr)化合物。
【文檔編號】C12N9/00GK103946376SQ201280053924
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月3日
【發(fā)明者】馬克·薩夫羅, 利龍·克利普肯, 因巴爾·梅蒙, 伊加爾·菲納羅夫 申請人:耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司