多級(jí)分析物檢定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供方法和設(shè)備，用于檢測在樣品中分析物(包括心肌損傷的標(biāo)志如心肌肌鈣蛋白)的兩個(gè)或者更多個(gè)閾水平的存在。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于測定患者病癥的便利的即時(shí)檢驗(yàn)試驗(yàn)，以指導(dǎo)具有成本效益的健康護(hù)理。
【專利說明】多級(jí)分析物檢定
【背景技術(shù)】
[0001]已經(jīng)開發(fā)了試驗(yàn)以檢測在體內(nèi)樣品中分析物的存在，包括以即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care)的形式,其允許健康護(hù)理從業(yè)人員迅速確定患者的病癥。這些試驗(yàn)通常涉及抗原-抗體反應(yīng)或者一些其它配體-配體受體結(jié)合事件，并可涉及放射性標(biāo)記物、酶促標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物，或者其它可檢測標(biāo)記物。許多這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)成通過以下方法進(jìn)行定性測定:檢測分析物在樣品中以指定水平或者濃度或者以高于指定水平或者濃度存在或者不存在。
[0002]然而，表明分析物在樣品中以可檢測濃度或者以高于可檢測濃度存在或者不存在的二元試驗(yàn)結(jié)果不一定向臨床醫(yī)師、患者，或者進(jìn)行試驗(yàn)的人員提供最有用的信息。例如，在患者血清中心肌肌鈣蛋白(例如，cTnl)(其為心肌損傷的標(biāo)志)的存在可指示許多病癥，或者與許多病癥相關(guān)，所述病癥包括心肌梗塞以及繼發(fā)性缺血性和非缺血性損傷如冠狀動(dòng)脈介入(coronary intervention)、心肌心包炎、敗血病、心臟創(chuàng)傷、化學(xué)療法,和腎衰竭。參見 Sharma 等人，Cardiac Troponins, J.Clin.Pathol.57:1025-1026 (2004)。因此,在血清中心肌肌鈣蛋白的存在不一定指示患者正在經(jīng)歷急性心臟事件(例如，心肌梗塞或者M(jìn)I)。此外，這種水平的不存在不一定排除急性心臟事件(例如MI)，這是因?yàn)樵谶@種事件之后歷時(shí)約4至12小時(shí)在血清中肌鈣蛋白水平增加。而重要的是測定是否肌鈣蛋白水平正在隨時(shí)間推移以與急性心臟事件一致的方式增加。[0003]能夠提供準(zhǔn)確的，半定量的，便利的，和具有成本效益的關(guān)于樣品中的分析物水平的信息(包括心肌損傷的標(biāo)志)的即時(shí)檢驗(yàn)試驗(yàn)將極大地滿足需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供用于檢測樣品中的分析物的兩種或者更多種閾水平的存在的方法和設(shè)備。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于測定患者病癥的便利的即時(shí)檢驗(yàn)試驗(yàn)，以指導(dǎo)具有成本效益的健康護(hù)理。
[0005]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供設(shè)備，其用于檢測患者樣品中的心肌損傷或者損害的標(biāo)志的至少兩個(gè)閾水平。心肌損傷或者損害的這種標(biāo)志(其包括心肌肌鈣蛋白(例如，cTnT或者cTnl)、肌紅蛋白和CK-MB)的增加的水平可指示本申請(qǐng)所述的心肌梗塞和其它急性心臟事件。所述設(shè)備可適于即時(shí)檢驗(yàn)測定，并可由健康護(hù)理專業(yè)人員或者由未經(jīng)訓(xùn)練的人員使用，以測定住院治療或者緊急護(hù)理的需要。
[0006]根據(jù)該方面,所述設(shè)備涉及橫向流動(dòng)膜(lateral flow membrane)和結(jié)合試劑以在心肌損傷或者損害的標(biāo)志(“生物標(biāo)志”)的存在下形成可檢測的復(fù)合物。所述設(shè)備包含樣品施用區(qū)，和一個(gè)或者多個(gè)與樣品施用區(qū)流體連通的流體流動(dòng)路徑。所述流體流動(dòng)路徑包含第一生物標(biāo)志捕獲區(qū)和第二生物標(biāo)志捕獲區(qū)，其可串聯(lián)地位于單個(gè)流動(dòng)路徑上或者可位于分開的流動(dòng)路徑中。所述第一捕獲區(qū)設(shè)置成可檢測地捕獲在樣品中以第一閾水平或者以高于第一閾水平存在的生物標(biāo)志，和所述第二捕獲區(qū)設(shè)置成可檢測地捕獲在樣品中以第二閾水平或者以高于第二閾水平存在的生物標(biāo)志。因此，所述設(shè)備提供用于測定或者追蹤患者中的生物標(biāo)志水平的半定量信息，并提供用于以即時(shí)檢驗(yàn)的形式測定患者病癥的多方面信息。
[0007]例如，所述設(shè)備可含有結(jié)合試劑，其用于檢測心肌肌鈣蛋白如cTnl的至少兩個(gè)閾水平。在這種實(shí)施方案中，所述第一閾水平可指示在血液循環(huán)中cTnl的存在，并可對(duì)應(yīng)于約0.04ng/mL并提供更具體的臨床評(píng)價(jià)。例如,高于此閾的cTnl水平表示,應(yīng)該監(jiān)測患者的增加的cTnl水平，其指示潛在的心臟事件。所述第二閾水平可指示急性心臟事件，并可對(duì)應(yīng)于在循環(huán)中的約0.1ng/mL cTnl。高于所述第二閾水平的cTnl水平指示急性心臟事件，例如MI。在某些實(shí)施方案中，所述設(shè)備也可提供cTnl的三種或者更多種閾水平的測定，以增強(qiáng)試驗(yàn)的敏感性和/或特異性和/或范圍，和/或提供甚至更加具體的臨床評(píng)價(jià)。
[0008]一個(gè)或多個(gè)流體流動(dòng)路徑通常由一個(gè)或者多個(gè)吸水的(bibulous)，吸收性的，和/或多孔的膜形成，并且每個(gè)流動(dòng)路徑可包含對(duì)照區(qū)，所述對(duì)照區(qū)產(chǎn)生作為成功樣品流動(dòng)的指示的可檢測信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述流體流動(dòng)路徑還可包含具有各種孔隙度的膜或者墊以過濾細(xì)胞和/或碎片，所述膜或者墊通常接近樣品施用區(qū)。在這些或者其它實(shí)施方案中，所述流體流動(dòng)路徑可包含一個(gè)或者多個(gè)容納結(jié)合試劑的試劑墊，和/或可在末端包含吸收墊以幫助驅(qū)動(dòng)樣品流動(dòng)。
[0009]所述生物標(biāo)志(例如，cTnl)是可檢測的，例如，在樣品中通過形成可捕獲的和可檢測的復(fù)合物，用第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員形成，所述第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員包含在所述設(shè)備中(例如，在試劑墊中)或者添加至樣品(例如，在預(yù)孵育步驟中)。所述第一結(jié)合成員和所述第二結(jié)合成員可為本申請(qǐng)?jiān)敿?xì)描述的免疫試劑。所述第一結(jié)合成員具有附著的或者結(jié)合的可檢測的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物可在捕獲區(qū)固定復(fù)合物之后被觀察到或者檢測到。本申請(qǐng)描述了多種適合的標(biāo)記物。所述設(shè)備可包含一個(gè)或者多個(gè)第二結(jié)合成員，以允許在特定的捕獲區(qū)捕獲或者固定復(fù)合物。具體地，每個(gè)第二結(jié)合成員在捕獲區(qū)被固定或者能夠在樣品流動(dòng)期間在特定捕獲區(qū)被固定。例如，可將至少一個(gè)第二結(jié)合成員通過抗生蛋白鏈菌素-生物素相互作用，通過抗體-抗原相互作用，或者通過互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)的寡聚核苷酸的雜交在捕獲區(qū)捕獲。所述第一和/或第二結(jié)合成員可散布性地結(jié)合在一個(gè)或多個(gè)cTnl捕獲區(qū)上游的一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)路徑中，使得樣品中的生物標(biāo)志在樣品流動(dòng)期間與第一和第二結(jié)合成員形成可捕獲和可檢測的復(fù)合物。
[0010]在一些實(shí)施方案中，所述第一捕獲區(qū)和所述第二捕獲區(qū)位于不同的，平行的或者雙向的，與樣品施用區(qū)流體連通的流動(dòng)路徑中。例如，所述設(shè)備可包含兩個(gè)、三個(gè)，或者更多的流動(dòng)路徑，每個(gè)流動(dòng)路徑設(shè)置成測定樣品中的生物標(biāo)志的不同的閾水平。在一些實(shí)施方案中，為了在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)以檢測升高的分析物水平，所述設(shè)備可包含至少第二樣品施用區(qū)，和相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)路徑。
[0011]為了在多個(gè)閾水平檢測生物標(biāo)志，通常對(duì)所述設(shè)備進(jìn)行設(shè)置。在一些實(shí)施方案中，所述第一捕獲區(qū)具有第一量的固定的捕獲劑，和所述第二捕獲區(qū)具有第二量的所述固定的捕獲劑，另外的捕獲區(qū)以此類推，以在每個(gè)捕獲區(qū)可檢測地捕獲標(biāo)志的不同閾水平。固定的捕獲劑可為，例如，抗生蛋白鏈菌素、生物素、抗體，或者天然或者人工的多核苷酸，相對(duì)的結(jié)合成員與分析物特異性的結(jié)合試劑(“所述第二結(jié)合成員”)綴合。在其它實(shí)施方案中，所述第一捕獲區(qū)包含對(duì)所述生物標(biāo)志具有第一親和性的抗體，以及所述第二捕獲區(qū)包含對(duì)所述生物標(biāo)志具有第二親和性的抗體，以在不同的閾水平可檢測地捕獲生物標(biāo)志。低親和性抗體和高親和性抗體可非散布性地與各自的捕獲區(qū)結(jié)合，或者可通過使用特異性捕獲劑如一種或多種抗生蛋白鏈菌素或者多核苷酸捕獲劑等而引導(dǎo)至特定捕獲區(qū)。例如，具有不同序列的多核苷酸捕獲劑可用于將低親和性抗體和/或高親和性抗體引導(dǎo)至特定捕獲區(qū)。
[0012]在其它實(shí)施方案中，捕獲區(qū)是連續(xù)的，閾或者相對(duì)水平通過沿著流動(dòng)路徑捕獲的可檢測免疫復(fù)合物的相對(duì)長度來識(shí)別。
[0013]在另一方面，本發(fā)明提供半定量方法，用于評(píng)價(jià)患者樣品中的心肌損傷或者損害的標(biāo)志如心肌肌鈣蛋白(例如，cTnl)的水平。所述方法包括將試驗(yàn)樣品施用至本發(fā)明設(shè)備，并在捕獲區(qū)中檢測特異性可檢測信號(hào)是否存在?；颊呖删哂屑毙孕呐K事件的一個(gè)或者多個(gè)癥狀，和/或可具有慢性心臟疾病，從而使得快速肌鈣蛋白(例如，cTnl)測定對(duì)于確定緊急介入的需要而言是潛在關(guān)鍵的。而且，患者可具有與cTnl的特定循環(huán)水平相關(guān)的慢性癥狀，例如腎臟病、在前心臟創(chuàng)傷或者外科介入，或者敗血病，使得在潛在背景水平上快速并準(zhǔn)確地檢測cTnl的升高水平的方法是理想的，以避免不必要的緊急護(hù)理的費(fèi)用。在患者樣品顯示的標(biāo)志水平在第一閾水平，但是低于第二閾水平的情況下，在約I至約10小時(shí)內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)以檢測標(biāo)志的升高水平。
[0014]例如，指示cTnl的第一閾水平的可檢測信號(hào)暗示應(yīng)針對(duì)心肌梗塞的體征和癥狀監(jiān)測患者，和在一些實(shí)施方案中，在一段時(shí)間后重復(fù)試驗(yàn)以檢測cTnl的升高水平。指示cTnl的第二閾水平的可檢測信號(hào)暗示針對(duì)潛在急性心臟事件如MI治療患者。在患者不具有用試驗(yàn)設(shè)備可檢測的cTnl水平的情況下，確定患者不經(jīng)歷急性心臟事件，或者具有低的不利結(jié)果的危險(xiǎn)。
[0015]在另 一方面，本發(fā)明提供設(shè)備和方法，其用于檢測試驗(yàn)樣品中的分析物的至少兩個(gè)閾水平。在該方面，所述分析物不需要是心肌損傷的標(biāo)志，而可為任何標(biāo)志，其在樣品中的水平可暗示超過一種醫(yī)療決策點(diǎn)(medical treatment decision point)。這種標(biāo)志可指示中風(fēng)或者腦外傷，對(duì)治療劑的變態(tài)反應(yīng)(例如，抗治療劑的IgE抗體)，或者具體疾病活動(dòng)性的量度，包括自身免疫性疾病(通過檢測自身抗體或者測定細(xì)胞因子分布)。
[0016]在此方面，所述設(shè)備通常包含樣品施用區(qū)，和一個(gè)或者多個(gè)與樣品施用區(qū)流體連通的流體流動(dòng)路徑。一個(gè)或多個(gè)流體流動(dòng)路徑包含第一分析物捕獲區(qū)和第二分析物捕獲區(qū)。第一和第二捕獲區(qū)串聯(lián)地位于單個(gè)流動(dòng)路徑上或者位于分開的流動(dòng)路徑中。所述第一分析物捕獲區(qū)包含第一量的固定的捕獲劑，以在以第一閾水平或者以高于第一閾水平存在于樣品中時(shí)直接或者間接地可檢測地捕獲分析物(例如，以可檢測的復(fù)合物形式存在)。所述第二分析物捕獲區(qū)包含第二量的固定的捕獲劑，其設(shè)置成在以第二閾水平或者以高于第二閾水平存在于樣品中時(shí)直接或者間接地可檢測地捕獲分析物(例如，以可檢測的復(fù)合物形式存在)。用于與分析物形成可檢測復(fù)合物(例如，免疫復(fù)合物)的結(jié)合試劑可在所述設(shè)備中在流體流動(dòng)路徑中存在，或者在預(yù)孵育步驟中與樣品組合。
[0017]在多個(gè)實(shí)施方案中，固定的捕獲劑是選自抗生蛋白鏈菌素-生物素、抗體-抗原，或者互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)的天然或者人工的寡聚核苷酸的結(jié)合對(duì)的一員，其中相對(duì)結(jié)合成員與用于形成復(fù)合物的結(jié)合試劑之一(例如，所述第二結(jié)合成員)綴合。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1示出本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)備。所述試驗(yàn)設(shè)備包含與橫向流動(dòng)膜流體連通的樣品施用區(qū)。圖1還示出使用連續(xù)捕獲區(qū)的實(shí)施方案。
[0019]圖2示出本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)備。所述試驗(yàn)設(shè)備包含與一個(gè)橫向流動(dòng)膜流體連通的樣品施用區(qū)，所述一個(gè)橫向流動(dòng)膜被不可滲透屏障分成兩個(gè)亞部分。
[0020]圖3示出本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)備。所述試驗(yàn)設(shè)備包含樣品施用區(qū)和試劑墊，其中的試劑墊與被屏障分開的兩個(gè)平行的，獨(dú)立的橫向流動(dòng)膜流體連通。每個(gè)橫向流動(dòng)膜包含捕獲區(qū)和對(duì)照區(qū)，并且每個(gè)橫向流動(dòng)膜的下游是吸收墊。
[0021]圖4示出本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)備。所述試驗(yàn)設(shè)備包含與單一樣品施用區(qū)流體連通的兩個(gè)獨(dú)立的橫向流動(dòng)膜。所述試驗(yàn)設(shè)備使用雙向流。
[0022]圖5示出本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)備。所述試驗(yàn)設(shè)備包含一個(gè)樣品施用區(qū)和用于檢測多個(gè)分析物的圍繞樣品施用區(qū)放射狀排列的多個(gè)橫向流動(dòng)膜，每一分析物在多個(gè)閾水平。
[0023]圖6示出包含橫向流動(dòng)膜的試驗(yàn)設(shè)備，所述橫向流動(dòng)膜包含由支撐基質(zhì)支撐的兩個(gè)串聯(lián)取向的捕獲區(qū)。所述兩個(gè)捕獲區(qū)使用高和低親和性抗體以分別檢測低和高分析物閾。所述試驗(yàn)設(shè)備設(shè)計(jì)成可檢測地捕獲相同分析物的兩個(gè)不同的濃度。
[0024]圖7示出包含兩個(gè)捕獲區(qū)的橫向流動(dòng)膜，其設(shè)計(jì)成可檢測地捕獲相同分析物的兩個(gè)不同的濃度。一個(gè)捕獲區(qū)使用高親和性抗體，每個(gè)抗體與生物素綴合。生物素與橫向流動(dòng)膜上的抗生蛋白鏈菌素結(jié)合，以固定高親和性抗體。所述第二捕獲區(qū)使用與橫向流動(dòng)膜直接結(jié)合的低親和性抗體。
[0025]圖8示出包含兩個(gè)捕獲區(qū)的橫向流動(dòng)膜，其設(shè)計(jì)成可檢測地捕獲相同分析物的兩個(gè)不同的濃度，或者兩個(gè)不同的分析物。捕獲劑為寡聚核苷酸，其中所述互補(bǔ)寡聚核苷酸固定在特定捕獲區(qū)。
[0026]圖9顯示在本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)備上運(yùn)行的多水平心肌肌鈣蛋白檢定的結(jié)果。示例性實(shí)施方案使用平行的流動(dòng)路徑和固定在捕獲區(qū)的不同量的生物素，以產(chǎn)生分析物的兩個(gè)可檢測的閾。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明提供用于檢測樣品中的分析物的兩個(gè)或者更多個(gè)閾水平的存在的方法和設(shè)備。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定患者病癥的便利的即時(shí)檢驗(yàn)試驗(yàn)，以指導(dǎo)具有成本效益的健康護(hù)理。
[0028]在體液樣品中的分析物濃度是用于疾病和其它臨床病癥的診斷或者預(yù)后的有用指示物。如本申請(qǐng)所述，在單一試驗(yàn)設(shè)備上的多個(gè)閾(即，截?cái)?水平增強(qiáng)試驗(yàn)所傳遞的信息，并提供快速評(píng)價(jià)醫(yī)療選擇的機(jī)會(huì)。而且，在多個(gè)閾水平測量一個(gè)或多個(gè)分析物可用于監(jiān)測疾病狀態(tài)或者病癥的進(jìn)展，或者用于確定病癥是否存在，這通過以下方法進(jìn)行:通過在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)測量，測量分析物水平的演變。
[0029]使用半定量試驗(yàn)如橫向流動(dòng)試驗(yàn)(lateral flow test)針對(duì)多個(gè)閾水平測量分析物濃度可特別有用，這是因?yàn)槌^一個(gè)臨床決策點(diǎn)(并因此，所得的行動(dòng)過程)可在即時(shí)檢驗(yàn)時(shí)在單一評(píng)價(jià)中解決，并可由未經(jīng)訓(xùn)練的人員實(shí)施。
[0030]在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)備和方法避免了定量分析經(jīng)常需要的麻煩的或者不便的儀器使用的需要，從而使得本發(fā)明對(duì)于例如家庭、農(nóng)村地區(qū)、救護(hù)車、飛機(jī)，和欠發(fā)達(dá)地區(qū)是理想的。本發(fā)明提供足以向無經(jīng)驗(yàn)的使用者發(fā)出需要緊急健康護(hù)理的信號(hào)的容易解釋的試驗(yàn)。
[0031]所涉及的分析物和標(biāo)志
[0032]所 述設(shè)備在某些實(shí)施方案中檢測與心肌損傷或者損害有關(guān)的分析物，其在血清中的存在指示急性心肌事件，例如心肌梗塞。這種分析物包括心肌肌鈣蛋白(例如，cTnT、cTnl，和cTnC)、肌紅蛋白，和CK-MB。心肌損傷的其它標(biāo)志描述在美國專利6，461，828中，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。所述設(shè)備可設(shè)置成檢測心肌損傷的至少一個(gè)、兩個(gè)，或者三個(gè)標(biāo)志的多個(gè)閾水平。
[0033]所述分析物可為至少一種心肌肌鈣蛋白(例如，cTnl, cTnC、cTnT)。循環(huán)心肌肌鈣蛋白的水平對(duì)于心肌損傷而言是特異性的。而且，在血清中的心肌肌鈣蛋白的水平在MI的逐步發(fā)展中隨時(shí)間推移而改變。例如，如果患者呈現(xiàn)MI樣癥狀如不穩(wěn)定胸痛和ECG的非特異性變化，但是當(dāng)癥狀最初出現(xiàn)時(shí)cTnl的血液濃度低于正常值的99%，那么受試者應(yīng)在6-9小時(shí)內(nèi)再次測試。隨時(shí)間推移cTnl的增加為心肌壞死提供更準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和特異性，并排除提高的肌鈣蛋白的非特異性原因，例如腎損傷?；谶B續(xù)試驗(yàn)cTnl的20%-30%的增加被認(rèn)為是顯著的。
[0034]在某些實(shí)施方案中，所述設(shè)備測定在患者樣品中高于多個(gè)閾水平的cTnl的存在。在心肌梗塞(MI)后的最初4-12小時(shí)，心肌肌鈣蛋白I(cTnl)增加。例如，如果受試者的循環(huán)肌鈣蛋白I水平大于約0.04ng/mL，但是小于約0.1ng/mL，則有心肌梗塞或者急性心臟事件的嫌疑，但是肌鈣蛋白I的這種水平可能是由于不同于心肌梗塞的原因所導(dǎo)致，例如腎臟病。因此，大于0.04ng/mL,但是小于0.1ng/mL的報(bào)告血液cTnl量的單一測量值可能不是確定性的。然而，如果在最初測量數(shù)小時(shí)后(例如，2-8小時(shí)后)，第二測量顯示受試者的cTnl水平大于約0.1ng/mL，則這表明受試者的肌鈣蛋白I水平隨時(shí)間推移增加，并表明MI明顯可能性更大。
[0035]因此，在涉及cTnl的具體實(shí)施方案中，將所述設(shè)備設(shè)置成檢測在患者血液或者血清中cTnl的低閾水平，所述低閾水平指示cTnl的存在。該閾可為約0.0 Ing/mL至約
0.06ng/mL，或者在某些實(shí)施方案中，為約0.04ng/mL。在這些實(shí)施方案中，所述設(shè)備也設(shè)置成同時(shí)檢測cTnl的較高閾，其指示急性心臟事件，例如MI。cTnl的較高閾在患者血液或者血清中可為約0.08ng/mL至約0.2ng/mL,或者在具體實(shí)施方案中，約0.1ng/mL。如果使用所述試驗(yàn)設(shè)備的最初測量值顯示cTnl水平大于約0.1ng/mL,那么與cTnl小于0.1ng/mL相t匕，不良事件如MI或者死亡的危險(xiǎn)為約2.2-至3.0-倍高。如果最初測量值顯示在血液或者血清中的cTnl水平小于約0.04ng/mL，那么MI可能性不高，除非試驗(yàn)在MI發(fā)展的極早期進(jìn)行。
[0036]在一些實(shí)施方案中，所述設(shè)備設(shè)置成測定循環(huán)cTnl的第三閾水平的存在。第三閾水平可為約0.2ng/mL至約0.7ng/mL(例如，約0.5ng/mL)。約0.5ng/mL或者更高的cTnl水平對(duì)MI具有高特異性。血液或者血清cTnl水平為約0.5ng/mL或者更高的受試者可能正在經(jīng)歷心肌損傷。對(duì)于在MI的急性胸痛或者其它癥狀的發(fā)作后在家庭進(jìn)行試驗(yàn)的個(gè)體，包括對(duì)于具有急性和/或慢性心臟病史的患者，和/或經(jīng)歷cTnl可存在于循環(huán)中的其它疾病如腎臟病或者先前心臟創(chuàng)傷或者介入或者心炎(心包炎或者心內(nèi)膜炎)的患者，這種三個(gè)閾水平的系統(tǒng)可為特別有意義的。在沒有其它癥狀或者指征的情況下，所述試驗(yàn)結(jié)果可提供關(guān)于需要尋求立即醫(yī)療護(hù)理的信息。[0037]在一些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)分析物通過單一試驗(yàn)設(shè)備檢測。所述兩個(gè)分析物可為MI的特異性標(biāo)志。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備包含至少一個(gè)對(duì)肌鈣蛋白I特異性的捕獲區(qū)，和對(duì)肌鈣蛋白T特異性的至少第二捕獲區(qū)。每一肌鈣蛋白的可檢測閾是使得選擇所述可檢測閾以“包括(rulein) ”MI (指示循環(huán)肌鈣蛋白的存在的低閾)，同時(shí)選擇其它可檢測閾以“排除(rule out) ”MI (指示MI或者急性心臟事件的高閾)。由于肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T 二者對(duì)MI均是特異性的，但是由不同的基因遺傳編碼，所以在橫向流動(dòng)設(shè)備上通過它的特異性捕獲區(qū)除去一個(gè)分子不會(huì)影響在所述設(shè)備上通過它的特異性捕獲區(qū)脫除的其它分子的水平。
[0038]所述設(shè)備可設(shè)置成測定心肌損傷或者狀態(tài)的第二標(biāo)志如肌紅蛋白或者CK-MB的至少一個(gè)，或者多個(gè)閾水平。這種標(biāo)志描述在美國專利5，290，678中，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。
[0039]在這些和其它實(shí)施方案中，所述設(shè)備可提供心功能狀態(tài)的其它標(biāo)志如NT-proBNP、BNP、proBNP、ANP或者pro-ANP的半定量測定，這些標(biāo)志也描述在美國專利6，461，828中，將其并入本文作為參考。
[0040]在其它實(shí)施方案中，作為中風(fēng)或者其它腦外傷的測定，所述設(shè)備測定腦損傷或者創(chuàng)傷的一個(gè)或者多個(gè)標(biāo)志的多個(gè)閾水平。例如，在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)志包括以下標(biāo)志中的一個(gè)或者多個(gè):髓磷脂堿蛋白(MBP)、SlOO蛋白的β同工型(S100)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、血栓調(diào)節(jié)蛋白、呈二聚體或者四聚體形式的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1、Neurothelin,Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 ，和 P-糖蛋白。這些和其它標(biāo)志描述在美國專利6，780, 606中，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。因此，本發(fā)明提供用于隨時(shí)間推移追蹤循環(huán)水平的設(shè)備和方法，如本申請(qǐng)中對(duì)于心臟標(biāo)志所描述和例示。
[0041]在其它實(shí)施方案中，所述設(shè)備測定炎性或者免疫應(yīng)答標(biāo)志的存在，其可在暴露于藥物或者潛在抗原或者其它刺激物后監(jiān)測。這種標(biāo)志可為針對(duì)治療劑的抗體以監(jiān)測治療介入的效力或者對(duì)治療介入的反應(yīng)，或者所述標(biāo)志可為自身抗體，其指示自身免疫疾病以監(jiān)測隨時(shí)間推移的疾病活動(dòng)性(包括響應(yīng)于治療)。
[0042]通常，所述分析物可為毒素、有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)(包括免疫球蛋白)、肽(例如，肽類激素)、微生物或者其組分、維生素、代謝物、藥物(包括為治療目的而給予的藥物以及為違法目的而服用的藥物)、污染物質(zhì)、殺蟲劑或者上述任意物質(zhì)的抗體。
[0043]通常，所述樣品可為測試分析物的存在和/或濃度的任何物質(zhì)，包括生物或者環(huán)境樣品。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為體液樣品如全血液、血清、血漿、尿、汗、唾液、腦脊髓液、鼻分泌物等。在所述設(shè)備設(shè)置成檢測心肌損傷的一個(gè)或者多個(gè)標(biāo)志的情況下，在一些實(shí)施方案中樣品可為血液、血清，或者血漿。
[0044]橫向流動(dòng)試驗(yàn)
[0045]本發(fā)明的設(shè)備和方法使用橫向流動(dòng)試驗(yàn)。橫向流動(dòng)試驗(yàn)是公知的，并例如描述在美國專利6，461，828,6, 177，281,7, 390，674，和U.S.7，491，551中，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。橫向流動(dòng)試驗(yàn)通常包含樣品施用區(qū)(例如，用于施用流體樣品進(jìn)行測試)，和一個(gè)或者多個(gè)與樣品施用區(qū)流體連通的流體流動(dòng)路徑。流體流動(dòng)路徑包含第一生物標(biāo)志捕獲區(qū)和第二生物標(biāo)志捕獲區(qū)，其可串聯(lián)地位于單個(gè)流動(dòng)路徑上或者可位于分開的流動(dòng)路徑中。術(shù)語“流體連通”意味著樣品可從流動(dòng)路徑的第一組件流動(dòng)至流動(dòng)路徑的第二組件，反之亦然。第一組件與第二組件流體連通，即使存在插入組件。例如，樣品施用區(qū)、試劑區(qū)(例如，其容納檢定免疫試劑)，和包含一個(gè)或者多個(gè)捕獲區(qū)的橫向流動(dòng)膜可串聯(lián)地位于試驗(yàn)設(shè)備上，并將流體連通。所述設(shè)備還可包含一個(gè)或者多個(gè)用于分離血液細(xì)胞或者大碎片的組件，包括具有適當(dāng)孔隙度的濾器。
[0046]橫向流動(dòng)試驗(yàn)涉及橫向流動(dòng)膜和結(jié)合試劑，以在所涉及的標(biāo)志或者分析物的存在下形成可檢測復(fù)合物。復(fù)合物(例如，免疫復(fù)合物)包含對(duì)分析物具有特異性的并具有附著的或者結(jié)合的標(biāo)記物的第一試劑，以及所述第二試劑是固定的或者可捕獲的，并且也對(duì)所涉及的分析物具有特異性。結(jié)合試劑可為免疫試劑，所述免疫試劑通常為抗體或者其部分。在多個(gè)實(shí)施方案中，免疫試劑為與所涉及的分析物結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性或者二特異性抗體、嵌合抗體，或者抗體部分或者片段?？贵w可具有任何同種型，包括 IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，及其亞型。
[0047]免疫試劑還可為抗原結(jié)合抗體部分或者片段，例如Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv片段、單鏈抗體分子、由包含一個(gè)或者多個(gè)抗原結(jié)合域的免疫球蛋白分子的任何片段形成的多特異性抗體。
[0048]在結(jié)合試劑為免疫試劑的實(shí)施方案中，至少一種免疫試劑(例如，“所述第一免疫試劑”或者“所述第一結(jié)合成員”)含有可通過視覺或者儀器手段檢測的附著的或者結(jié)合的標(biāo)記物。一種或者多種標(biāo)記物可用于本發(fā)明的設(shè)備和方法中，例如，為了在視覺上區(qū)別在不同流動(dòng)路徑中的捕獲區(qū)，或者用于區(qū)別對(duì)照區(qū)。在其它實(shí)施方案中，兩種不同的標(biāo)記物用于在視覺上區(qū)別不同的分析物。適用于本發(fā)明中的各種標(biāo)記物包括通過化學(xué)或者物理手段產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記物。這種標(biāo)記物包括酶促標(biāo)記物(例如，在底物的存在下產(chǎn)生可檢測信號(hào))、色原、染料、催化劑、熒光或者熒光樣化合物和/或粒子、磁性化合物和/或粒子、化學(xué)發(fā)光化合物和/或粒子，和放射性標(biāo)記物。標(biāo)記物可與所述第一免疫試劑直接或者間接地共價(jià)或者非共價(jià)結(jié)合，所述第一免疫試劑對(duì)目標(biāo)分析物具有特異性。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記物在進(jìn)行試驗(yàn)后的至少2，至少4，至少6，或者至少8小時(shí)內(nèi)仍然可檢測，使得數(shù)小時(shí)后的重復(fù)試驗(yàn)可與所述第一結(jié)果直接對(duì)比。
[0049]通過特異性結(jié)合對(duì)相互作用，至少一種免疫試劑(例如，“所述第二免疫試劑”或者“第二結(jié)合成員”)在捕獲區(qū)被固定，或者在所述捕獲區(qū)可捕獲。示例性結(jié)合對(duì)成員包括互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)寡聚核苷酸、配體-受體、抗體-抗原，或者抗生蛋白鏈菌素-生物素。這種第二結(jié)合成員可提供用于檢測分析物的多個(gè)閾水平的基礎(chǔ)。例如，如下文更詳細(xì)的討論，捕獲區(qū)可使用相同結(jié)合對(duì)成員的不同的量或者濃度，以在不同的水平固定或者捕獲所述第二免疫試劑?？蛇x擇地，捕獲區(qū)可使用不同的免疫試劑捕獲方案，以區(qū)別對(duì)所涉及的分析物具有不同親和性的第二免疫試劑。具體地，低親和性和高親和性抗體可通過鑒別綴合的捕獲試劑來識(shí)別。
[0050]每個(gè)流動(dòng)路徑還可包含在一個(gè)或者多個(gè)捕獲/檢測區(qū)下游的一個(gè)或者多個(gè)對(duì)照區(qū)，作為成功樣品流動(dòng)的指示。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照區(qū)可具有用于捕獲或者檢測在流動(dòng)路徑的終端未結(jié)合的標(biāo)記的結(jié)合試劑的存在的工具。例如，對(duì)照區(qū)可包含固定的抗-鼠IgG，其中所述第一結(jié)合試劑(例如，標(biāo)記的免疫試劑)為鼠單克隆抗體。其它樣品流動(dòng)對(duì)照是本領(lǐng)域已知的，并可根據(jù)本發(fā)明使用。
[0051] 所述試驗(yàn)設(shè)備還可包含吸收墊，其位于橫向流動(dòng)膜下游并與橫向流動(dòng)膜流體連通，以幫助驅(qū)動(dòng)樣品流動(dòng)。這種用于橫向流動(dòng)檢定的組件也是公知的。
[0052]此外，另外的組件可用于在施用至設(shè)備之前預(yù)混合樣品和結(jié)合劑。用于這種目的的示例性組件描述在W02007/098184、W02009/014787，和W02010/132453中，將其中的每個(gè)的全部內(nèi)容并入本文作為參考。
[0053]膜基底
[0054]橫向流動(dòng)基底通常為多孔的，吸收性的，和/或吸水的基底或者膜，其允許運(yùn)輸流體樣品，例如，通過毛細(xì)作用。許多材料可用作橫向流動(dòng)基底，并且這種材料包括有機(jī)或者無機(jī)聚合物，以及天然和合成聚合物，包括但不限于，瓊脂糖類、纖維素、硝化纖維素、乙酸纖維素、其它纖維素衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物和葡聚糖共聚物、其它多糖、玻璃、硅膠、明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、人造絲、尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、與二乙烯基苯等交聯(lián)的聚苯乙烯、丙烯酸類樹脂、丙烯酸酯和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物、乙烯基化合物和丙烯酰胺的共聚物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物及其共聚物。[0055]在一個(gè)實(shí)施方案中，橫向流動(dòng)基底包含硝化纖維素，例如，纖維素的任何硝酸酯。在某些實(shí)施方案中，橫向流動(dòng)基底包含與纖維素的羧酸酯組合的硝化纖維素。
[0056]基底(例如，硝化纖維素基底)的孔徑可改變。例如，孔徑可為約Ιμπι至約20μπι，或者約8 μ m至約15 μ m,或者約10 μ m至約12 μ m。
[0057]流動(dòng)路徑的各組件可使用不同的基底材料和/或不同的孔徑，以控制流體流動(dòng)，控制試劑與基底材料散布性地結(jié)合的能力，和/或控制碎片的過濾。
[0058]在一些實(shí)施方案中可將流動(dòng)路徑的組件用封閉劑如牛血清白蛋白、全動(dòng)物血清、酪蛋白，或者脫脂奶粉(non-fat dry milk)處理。
[0059]限定至少一個(gè)流體流動(dòng)路徑的橫向流動(dòng)基底可由通常水不滲透層(例如，
Mylar?；)背襯，或者層積在通常水不滲透層(例如，Mylar? )上。然而，在一些實(shí)施方
案中，橫向流動(dòng)基底可為自支撐的。當(dāng)使用時(shí)，通常將背襯通過粘合劑固定至基質(zhì)。水不滲透背襯通常用于低厚度基底。
[0060]流體流動(dòng)路徑
[0061]通常，流體流動(dòng)路徑由至少一個(gè)樣品施用區(qū)和至少一個(gè)橫向流動(dòng)基底限定。在使用多個(gè)橫向流動(dòng)基底的情況下，多個(gè)橫向流動(dòng)基底可與相同或者不同的樣品施用區(qū)流體連通。試劑區(qū)或者墊是任選的。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備包含一個(gè)與單一樣品施用區(qū)流體連通的橫向流動(dòng)膜(圖1)。然而，本發(fā)明不限于這種構(gòu)造。例如，在其它實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備包含一個(gè)如圖2中所示的橫向流動(dòng)膜。在這種實(shí)施方案中,橫向流動(dòng)膜允許兩個(gè)流體流動(dòng)路徑，因?yàn)椴豢蓾B透屏障將所述膜分成兩個(gè)平行的亞部分。
[0063]在其它實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備包含兩個(gè)如圖3中所示的橫向流動(dòng)膜，每個(gè)限定單獨(dú)的流體流動(dòng)路徑。在這種實(shí)施方案中，在相同試驗(yàn)設(shè)備上的兩個(gè)獨(dú)立的流動(dòng)條是平行的。每個(gè)橫向流動(dòng)膜與試劑墊(例如，容納免疫試劑)流體連通，所述試劑墊(例如，容納免疫試劑)在單一樣品施用區(qū)下游，并與單一樣品施用區(qū)流體連通。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備構(gòu)造類似于圖3的構(gòu)造，不同的是不存在試劑區(qū)，并且每個(gè)橫向流動(dòng)膜與樣品施用區(qū)直接流體連通。[0064]也可使用至少兩個(gè)單獨(dú)的樣品施用區(qū)，每個(gè)樣品施用區(qū)與分開的，獨(dú)立的橫向流動(dòng)基底流體連通，其中每個(gè)橫向流動(dòng)基底限定單獨(dú)的流體流動(dòng)路徑。單獨(dú)的流體流動(dòng)路徑還可包含單獨(dú)的試劑區(qū)或者墊。所述試驗(yàn)設(shè)備可具有另外的樣品施用區(qū)(例如，三個(gè)、四個(gè)或者五個(gè)樣品施用區(qū))，每個(gè)樣品施用區(qū)對(duì)應(yīng)于在單獨(dú)的橫向流動(dòng)基底上的單獨(dú)的流體流動(dòng)路徑,或者對(duì)應(yīng)于在相同橫向流動(dòng)基底上的單獨(dú)的流體流動(dòng)路徑(例如，通過一個(gè)或者多個(gè)不可滲透屏障將橫向流動(dòng)膜分成多個(gè)亞部分)。在使用中，將測量的流體樣品體積施用至每個(gè)樣品施用區(qū)。
[0065]通過如圖4中所示定位樣品施用區(qū)，也可在單一試驗(yàn)設(shè)備中使用平行的，獨(dú)立的橫向流動(dòng)基底。在這種實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備使用雙向的流體流動(dòng)。類似地，多個(gè)橫向流動(dòng)膜可圍繞單一樣品施用區(qū)(圖5)放射狀地排列。在這種實(shí)施方案中，每個(gè)橫向流動(dòng)膜限定一個(gè)流體流動(dòng)路徑，或者通過使用一個(gè)或者多個(gè)不可滲透屏障限定多個(gè)流體流動(dòng)路徑。
[0066]在其它實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)設(shè)備包含用于多個(gè)橫向流動(dòng)基底的一個(gè)樣品施用區(qū)。在這種實(shí)施方案中，將樣品一次施用至所述試驗(yàn)設(shè)備，并且樣品施用區(qū)與每個(gè)橫向流動(dòng)基底或者流體流動(dòng)路徑流體連通(圖3，4，5)。
[0067]在某些實(shí)施方案中，所述設(shè)備具有能夠進(jìn)行兩個(gè)或者三個(gè)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，使得試驗(yàn)可歷時(shí)2至10小時(shí)進(jìn)行，以監(jiān)測增加的分析物濃度。
[0068]捕獲區(qū)
[0069]本申請(qǐng)所述的設(shè)備和方法使用至少兩個(gè)捕獲區(qū)，用于區(qū)別分析物的兩個(gè)閾水平。至少兩個(gè)捕獲區(qū)可串聯(lián)地排列在單一流動(dòng)路徑上，或者可在單獨(dú)的流動(dòng)路徑中，每個(gè)捕獲區(qū)設(shè)計(jì)成捕獲分析物的不同的可檢測閾濃度。
[0070]一種多個(gè)捕獲區(qū)實(shí)施方案在圖6中示出。圖6示出在具有支撐基質(zhì)的橫向流動(dòng)膜上的流體流動(dòng)路徑的側(cè)視圖。橫向流動(dòng)膜包含兩個(gè)串聯(lián)取向的捕獲區(qū)，其中一個(gè)捕獲區(qū)使用高親和性捕獲配體(例如，抗體)，而所述第二捕獲區(qū)使用不同的低親和性捕獲配體(例如，抗體)。親和性的差異允許在相同試驗(yàn)設(shè)備上捕獲不同的量的相同分析物，由此在不同的閾水平檢測分析物。如圖6中所示，具有不同親和性的抗體(其對(duì)應(yīng)于所述第二免疫試劑)可固定在各自的捕獲區(qū)。在圖6中提供的實(shí)施方案也可在具有多個(gè)流體流動(dòng)路徑的試驗(yàn)設(shè)備上實(shí)施，所述多個(gè)流體流動(dòng)路徑存在于一個(gè)或者多個(gè)橫向流動(dòng)膜上。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)“高親和性”捕獲區(qū)存在于一個(gè)流體流動(dòng)路徑中，以及“低親和性”捕獲區(qū)存在于第二流體流動(dòng)路徑中。這種設(shè)計(jì)避免了在所述第一捕獲區(qū)損耗分析物的可能性，這種損耗可歪曲在下游第二捕獲區(qū)的結(jié)果。任選地，流體流動(dòng)路徑在單一基底上由不可滲透屏障形成；和/或可存在于單獨(dú)的橫向流動(dòng)基底上。
[0071] 具有高親和性抗體的捕獲區(qū)捕獲并保留較大量的分析物，并因此與具有低親和性捕獲抗體的捕獲區(qū)相比，在較低分析物濃度顯示可視信號(hào)。在這種設(shè)計(jì)中，通過使用超過兩種抗體親和性，捕獲區(qū)的數(shù)目可容易地?cái)U(kuò)展至超過兩個(gè)?？贵w可直接沉積或者通過結(jié)合劑如BSA或者IgG或者氨基葡聚糖或者抗體所綴合的其它蛋白質(zhì)分子沉積。這種結(jié)合劑可幫助增強(qiáng)信號(hào)，這是由于在結(jié)合劑上抗體的增加的密度，或者因?yàn)榻Y(jié)合劑可對(duì)基質(zhì)材料具有較強(qiáng)相互作用，或者因?yàn)殒I合形成“系鏈(tether) ”，其通過減少位阻允許抗體的較大親和力或者結(jié)合能力。[0072]在其它實(shí)施方案中，所述第二免疫試劑中的至少一種不固定在它的捕獲區(qū)，而是與將它引導(dǎo)至特定捕獲區(qū)的結(jié)合部分綴合。這種結(jié)合相互作用用于在樣品流動(dòng)期間“分類”高親和性和低親和性免疫試劑，并且這種結(jié)合部分包含生物素/抗生蛋白鏈菌素或者互補(bǔ)寡聚核苷酸(或其衍生物)。
[0073]例如，如圖7中所示，固定在低閾捕獲區(qū)中的捕獲試劑為抗生蛋白鏈菌素，其捕獲生物素綴合的免疫試劑(例如，所述第二結(jié)合成員)。低親和性抗體可直接固定在高閾捕獲區(qū)。圖7中所示的抗生蛋白鏈菌素/生物素相互作用可任選取代有本申請(qǐng)所述的其它結(jié)合對(duì)，例如互補(bǔ)寡聚核苷酸，包括衍生物如PRNA和本申請(qǐng)所述的其它結(jié)合對(duì)。這些捕獲區(qū)還可在一個(gè)流體流動(dòng)路徑上串聯(lián)取向，或者位于單獨(dú)的流體流動(dòng)路徑上。
[0074]捕獲區(qū)可使用多種特異性結(jié)合相互作用以捕獲或者固定含有分析物的可檢測免疫復(fù)合物，以及這些相互作用包括抗原/抗體、生物素/抗生物素蛋白、碳水化合物/凝集素、互補(bǔ)寡聚核苷酸(包括吡喃糖基RNA或者DNA，或者其它寡聚核苷酸衍生物)、受體/配體分子(包括激素/激素受體)、酶/輔因子，或者特異性蛋白質(zhì)相互作用，和金屬/螯合劑。
[0075]在某些實(shí)施方案中，寡聚核苷酸在一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)與橫向流動(dòng)基底的表面直接或者間接地(例如，通過化學(xué)連接體)結(jié)合，互補(bǔ)寡聚核苷酸與用于捕獲免疫復(fù)合物的免疫試劑綴合(參見圖8)。然后，不同的捕獲順序提供區(qū)別具有不同分析物親和性的不同的抗體試劑的基礎(chǔ)。
[0076]在一些實(shí)施方案中，寡聚核苷酸選自DNA、RNA、DNA-RNA雜交物、包含鎖定核酸的寡聚核苷酸、吡喃糖基-RNA (pRNA)、吡喃糖基-DNA (pDNA)、2’ -O-甲基寡聚核苷酸，和5’ -5’倒置寡聚核苷酸。使用寡聚核苷酸試劑捕獲寡聚核苷酸綴合物描述在美國專利申請(qǐng)公開2005/0208576中，將其并入本文作為參考。
[0077]互補(bǔ)寡聚核苷酸可具有相同或者相似的雜交效率，并與高和低親和性抗體綴合或者連接，由此提供區(qū)別分析物的不同閾水平的基礎(chǔ)。參見圖8。因?yàn)檩^高親和性抗體在較大程度上與分析物復(fù)合，所以較高親和性抗體已經(jīng)結(jié)合的區(qū)將捕獲并保留較大量的分析物，并因此與捕獲較低親和性抗體的區(qū)相比，在較低樣品分析物濃度顯示可視信號(hào)。
[0078]可選擇地，在每個(gè)捕獲區(qū)中相同特異性結(jié)合對(duì)成員的濃度可改變(例如，固定)，以允許捕獲不同的目標(biāo)分析物水平。因此，具有相對(duì)較高固定試劑濃度的區(qū)捕獲更多分析物并在較低分析物濃度產(chǎn)生陽性信號(hào)。例如，抗生蛋白鏈菌素可以以0.lmg/mL至約IOmg/mL，或者0.1至5mg/mL的濃度施用至捕獲區(qū)，由此形成不同的捕獲區(qū)，其具有在分析物的存在下形成的生物素綴合和標(biāo)記的免疫復(fù)合物的不同的可檢測閾。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)設(shè)備包含具有單一流體流動(dòng)路徑的單一橫向流動(dòng)膜，所述單一流體流動(dòng)路徑包含串聯(lián)捕獲區(qū)(參見，例如，圖7和8)。在這種實(shí)施方案中，在所述第一捕獲區(qū)中發(fā)生高親和性捕獲結(jié)合的情況下，尤其是當(dāng)分析物在試驗(yàn)樣品中以低濃度存在時(shí)，可能發(fā)生以下情況:樣品中的分析物的顯著部分將捕獲在所述第一捕獲區(qū)上。例如，在橫向流動(dòng)免疫檢定的典型捕獲區(qū)中，Imm x5mm的捕獲區(qū)可保留約I μ g，或者約6皮摩爾的捕獲 IgG (Brown (2009).Antibodies: Key to a Robust Lateral Flow Immunoassay.1nLateral Flow Tmmunoassay, edited by Wong and Tse, Humana Press, New York, p.60)。因此，包含0.04ng/mL濃度的cTnl的100 μ L樣品(1.5xl(T16摩爾分析物)可被一個(gè)捕獲區(qū)完全耗盡，這是因?yàn)椴东@分子以超過IO4倍過量存在。
[0080]類似地，對(duì)于NT-proBNP，在單一試驗(yàn)設(shè)備上的多個(gè)截?cái)嘀祵橛杏玫?，因?yàn)榕R床決策點(diǎn)為約125pg/mL和約450pg/mL(其分別為對(duì)在75歲以下和75歲和高于75歲的個(gè)體推薦的CHF決策閾值)。這些濃度在100 μ L樣品中分別對(duì)應(yīng)于1.5χ10_15和5.4χ10_15摩爾分析物。樣品中的分析物將受捕獲區(qū)影響，其保留約10_12摩爾分析物分子。因此，對(duì)于這種分析物，不考慮在橫向流動(dòng)設(shè)備上的分析物損耗的串聯(lián)捕獲區(qū)將為不實(shí)際的。
[0081 ] 在某些實(shí)施方案中，所述設(shè)備構(gòu)造利用了分析物損耗現(xiàn)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，橫向流動(dòng)試驗(yàn)設(shè)備通過將多個(gè)捕獲區(qū)層積為連續(xù)的行或者區(qū)域形成，或者通過將捕獲區(qū)層積為由在試驗(yàn)?zāi)ど铣练e的捕獲部分形成的連續(xù)區(qū)域形成。隨著分析物和試劑反應(yīng)并沿著設(shè)備遷移并與捕獲分子結(jié)合，將分析物從遷移溶液除去。然后，可檢測捕獲區(qū)域的數(shù)目或者捕獲區(qū)域的長度與最初存在于樣品中的分析物分子的數(shù)量直接相關(guān)，并由此，這些實(shí)施方案能夠擴(kuò)展設(shè)備的定量范圍。根據(jù)這種實(shí)施方案的設(shè)備像儀表(gauge) —樣用于檢測分析物水平，并對(duì)于擴(kuò)展檢定范圍特別有用。
[0082]在連續(xù)捕獲區(qū)域的情況中，具有可視標(biāo)記物的捕獲區(qū)的部分將與最初存在于樣品中的分析物的數(shù)量直接相關(guān)。以此方式，分析物的量可以以半定量的，像溫度計(jì)一樣的方式測量(參見圖1)。
[0083]標(biāo)記物
[0084]至少一種免疫試劑或者結(jié)合成員具有可檢測部分(例如，標(biāo)記物)。示例性標(biāo)記物包括微粒標(biāo)記物，例如膠體金屬粒子如金、膠體非金屬粒子如硒或者碲、染色的或者著色的粒子如染色的塑料、染色的浸潰膠乳粒子、有機(jī)聚合物膠乳粒子和脂質(zhì)體、納米球、著色的珠粒、聚合物微囊，或者含有直接可見物質(zhì)的其它囊泡等。
[0085]至于不直接檢測標(biāo)記物(例如，用裸眼)的檢定，可使用熒光標(biāo)記物如熒光素、銪、花青，或者alexa染料、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、突光能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記物、突光量子點(diǎn)、順磁標(biāo)記物、使用電流(用直流電壓或者振蕩外加電壓)或者碳納米管檢測方法的電化學(xué)標(biāo)記物。
[0086]例如，可檢測分子包括但不限于熒光團(tuán)以及本領(lǐng)域已知的其它可檢測分子，例如描述在Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R.Lakowicz (Editor), PlenumPub Corp,第二版(Julyl999)和 Richard P.Hoagland 的 Molecular Probes Handbook 的第六版中，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。
[0087]直接可視標(biāo)記包括染料浸潰的膠乳或者其它粒子的摻入，其與用于與抗體綴合的金粒子相比具有更多官能團(tuán)，或者比金更可見。在某些實(shí)施方案中，使用銀包覆的金粒子，其可將信號(hào)增強(qiáng)一個(gè)或者二個(gè)數(shù)量級(jí)。使用量子點(diǎn)或者納米球作為比色標(biāo)記物也可增強(qiáng)信號(hào)。使用較大金粒子(例如，大于標(biāo)準(zhǔn)40nm直徑的粒子)也可提供增強(qiáng)的敏感性。
[0088]帶有標(biāo)記物的特異性結(jié)合對(duì)成員可在捕獲/檢測區(qū)上游與橫向流動(dòng)膜散布性地結(jié)合。在這些實(shí)施方案中，當(dāng)樣品在橫向流動(dòng)膜上沿著流體流動(dòng)路徑遷移時(shí)，它遇到一個(gè)或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的特異性結(jié)合對(duì)成員，并且分析物(如果在樣品中存在的話)結(jié)合帶有標(biāo)記物的特異性結(jié)合對(duì)成員。分析物-特異性結(jié)合對(duì)成員-標(biāo)記物復(fù)合物進(jìn)一步遷移至捕獲區(qū)，并結(jié)合捕獲結(jié)合對(duì)成員。然后可將過量標(biāo)記物洗掉。
[0089]本發(fā)明提供如上所述的設(shè)備，用于檢測一種分析物的多個(gè)水平、多個(gè)分析物，或者多個(gè)分析物的多個(gè)水平。為了檢測試驗(yàn)分析物的存在，必須將分析物標(biāo)記，使得它可視化?？梢暬稍谑褂猛?部讀數(shù)儀器的情況下或者不使用外部讀數(shù)儀器的情況下發(fā)生。
[0090]在某些實(shí)施方案中，所述設(shè)備使用外部讀數(shù)器以提供客觀結(jié)果。在各種實(shí)施方案中，讀數(shù)器可提供顯示的，可打印的，或者可下載的結(jié)果。使用外部讀數(shù)器可為有利的，使得可使用具有較大敏感性的標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物。
[0091]讀數(shù)器還提供通信能力(例如，經(jīng)因特網(wǎng)、電纜、無線電，或者GSM等)的選項(xiàng)，以在出現(xiàn)需要緊急行動(dòng)的特定結(jié)果時(shí)自動(dòng)通知健康護(hù)理或者緊急健康護(hù)理專業(yè)人員，或者可連接至機(jī)構(gòu)的健康記錄以儲(chǔ)存試驗(yàn)記錄。讀數(shù)器還提供各種內(nèi)存選項(xiàng)，以獲得(例如，通過字母數(shù)字輸入或者通過自動(dòng)條碼讀取)操作者ID和患者ID，以及用于詳細(xì)病史的試驗(yàn)結(jié)果的日期和時(shí)間。
[0092]實(shí)施例
[0093]通過參考以下的說明性實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0094]實(shí)施例1 -評(píng)價(jià)用于檢測心肌肌鈣蛋白I的存在的二水平試驗(yàn)設(shè)備
[0095]在具有四個(gè)串聯(lián)捕獲區(qū)的橫向流動(dòng)試驗(yàn)設(shè)備中，施用包含10ng/mL cTnl的樣品。超過一半分析物被所述第一線(參見圖9和下表1)消耗。
[0096]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測在患者樣品中的心肌損傷標(biāo)志的至少兩個(gè)閾水平的設(shè)備，其包含: 樣品施用區(qū)； 一個(gè)或者多個(gè)流體流動(dòng)路徑，其由一個(gè)或者多個(gè)橫向流動(dòng)基底形成，并與所述樣品施用區(qū)流體連通； 第一標(biāo)志捕獲區(qū)和第二標(biāo)志捕獲區(qū)，其中所述第一和第二捕獲區(qū)串聯(lián)地位于單個(gè)流動(dòng)路徑上或者位于分開的流動(dòng)路徑中； 其中所述第一捕獲區(qū)設(shè)置成當(dāng)標(biāo)志以第一閾水平或者高于第一閾水平存在于所述樣品中時(shí)，可檢測地捕獲所述標(biāo)志，并且所述第二捕獲區(qū)設(shè)置成當(dāng)標(biāo)志以第二閾水平或者高于第二閾水平存在于所述樣品中時(shí)，可檢測地捕獲所述標(biāo)志。
2.權(quán)利要求1的設(shè)備，其中所述標(biāo)志為心肌肌鈣蛋白。
3.權(quán)利要求2的設(shè)備，其中所述心肌肌鈣蛋白為cTnl。
4.權(quán)利要求3的設(shè)備，其中所述第一閾水平對(duì)應(yīng)于所述患者樣品中的約0.04ng/mlcTnl。
5.權(quán)利要求3或者4的設(shè)備，其中所述第二閾水平對(duì)應(yīng)于所述患者樣品中的約0.1ng/ml cTnl。
6.權(quán)利要求1-5中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述流體流動(dòng)路徑由一個(gè)或者多個(gè)吸水性膜或者吸收性膜形成。
7.權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其還在每個(gè)流動(dòng)路徑中包含對(duì)照區(qū)以指示樣品流動(dòng)。
8.權(quán)利要求1-7中的任一項(xiàng)的設(shè)備,其還包含第一標(biāo)志-結(jié)合成員，所述第一標(biāo)志結(jié)合成員具有附著的可檢測標(biāo)記物。
9.權(quán)利要求8的設(shè)備，其還包含至少一個(gè)第二標(biāo)志結(jié)合成員，每個(gè)第二標(biāo)志結(jié)合成員固定在捕獲區(qū)，或者具有可被所述捕獲區(qū)捕獲的部分。
10.權(quán)利要求9的設(shè)備，其中至少一個(gè)第二結(jié)合成員可通過抗生蛋白鏈菌素-生物素相互作用，通過抗體-抗原相互作用，或者通過互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)寡聚核苷酸的雜交捕獲。
11.權(quán)利要求8-10中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述第一和第二結(jié)合成員為抗體或者其抗原結(jié)合部分。
12.權(quán)利要求7-11中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述結(jié)合成員散布性地結(jié)合在一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)上游的一個(gè)或多個(gè)流動(dòng)路徑中。
13.權(quán)利要求1-12中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述第一捕獲區(qū)和所述第二捕獲區(qū)在平行的或者雙向的流動(dòng)路徑中。
14.權(quán)利要求13的設(shè)備，其包含三個(gè)或者更多流動(dòng)路徑，每個(gè)流動(dòng)路徑設(shè)置成用于檢測不同的標(biāo)志閾水平。
15.權(quán)利要求14的設(shè)備，其中所述第一捕獲區(qū)具有第一量的固定的捕獲劑，和所述第二捕獲區(qū)具有第二量的所述固定的捕獲劑。
16.權(quán)利要求15的設(shè)備，其中所述捕獲劑為抗生蛋白鏈菌素、生物素、抗體，或者多核苷酸。
17.權(quán)利要求14的設(shè)備，其中所述第一捕獲區(qū)包含對(duì)cTnl具有第一親和性的抗體，和所述第二 cTnl捕獲區(qū)包含對(duì)cTnl具有第二親和性的抗體。
18.權(quán)利要求14的設(shè)備，其中所述第一捕獲區(qū)包含具有第一序列的單鏈寡聚核苷酸或者寡聚核苷酸衍生物，和所述第二捕獲區(qū)包含具有第二序列的單鏈寡聚核苷酸或者寡聚核苷酸， 其中所述第二結(jié)合成員具有附著的互補(bǔ)寡聚核苷酸或者寡聚核苷酸衍生物，以分別將高親和性和低親和性結(jié)合成員直接固定至所述第一和第二捕獲區(qū)。
19.權(quán)利要求14的設(shè)備，其中所述第一捕獲區(qū)包含對(duì)所述標(biāo)志具有第一親和性的固定的免疫試劑，和所述第二捕獲區(qū)包含固定的抗生蛋白鏈菌素，其中對(duì)所述標(biāo)志具有第二親和性的第二免疫試劑具有附著的生物素。
20.權(quán)利要求14的設(shè)備，其中所述第一和第二捕獲區(qū)是連續(xù)的，和標(biāo)志閾由沿著所述連續(xù)捕獲區(qū)結(jié)合的可檢測標(biāo)志的長度限定，由此擴(kuò)展所述檢測的范圍。
21.用于評(píng)價(jià)樣品中的心肌損傷的標(biāo)志水平的半定量方法，所述方法包括: 將試驗(yàn)樣品施用至權(quán)利要求1-20中的任一項(xiàng)的試驗(yàn)設(shè)備， 在一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)中檢測可檢測信號(hào)的存在或者不存在。
22.權(quán)利要求21的方法，其中指示所述標(biāo)志的第一閾水平的可檢測信號(hào)暗示第一決策，和指示所述第二閾水平的可檢測信號(hào)暗示第二決策。
23.權(quán)利要求21或者22的方法，其中所述患者具有心肌梗塞的一個(gè)或者多個(gè)癥狀。
24.權(quán)利要求22或者23的方法，其中cTnl的第一閾水平暗示應(yīng)歷經(jīng)1_10小時(shí)的時(shí)段針對(duì)心肌梗塞的體征和癥狀監(jiān)測所述患者病癥。
25.權(quán)利要求24的方法，其中cTnl的第二閾水平暗示應(yīng)針對(duì)潛在的心肌梗塞治療患者。
26.權(quán)利要求24的方法，其中在1-10小時(shí)內(nèi)重復(fù)所述方法以檢測升高的cTnl水平。
27.權(quán)利要求21-26中的任一項(xiàng)的方法，其中所述患者具有慢性心臟疾病，或者與循環(huán)cTnl的可檢測水平相關(guān)的其它病癥。
28.權(quán)利要求21-27中的任一項(xiàng)的方法，其中所述試驗(yàn)在家庭或者在即時(shí)檢驗(yàn)處實(shí)施。
29.用于檢測試驗(yàn)樣品中的分析物的至少兩個(gè)閾水平的設(shè)備，所述設(shè)備包含: 樣品施用區(qū)； 一個(gè)或者多個(gè)流體流動(dòng)路徑，其由一個(gè)或者多個(gè)橫向流動(dòng)基底形成，并與所述樣品施用區(qū)流體連通； 第一分析物捕獲區(qū)和第二分析物捕獲區(qū)，其中所述第一和第二捕獲區(qū)串聯(lián)地位于單個(gè)流動(dòng)路徑上或者位于分開的流動(dòng)路徑中； 其中所述第一分析物捕獲區(qū)包含一定量的第一固定的結(jié)合成員，以當(dāng)分析物以第一閾水平或者高于第一閾水平存在于所述樣品中時(shí)，直接或者間接地可檢測地捕獲所述分析物，和 其中所述第二分析物捕獲區(qū)包含一定量的第二固定的結(jié)合成員，其設(shè)置成當(dāng)分析物以第二閾水平或者高于第二閾水平存在于所述樣品中時(shí)，直接或者間接地，可檢測地捕獲所述分析物，其中所述第一和第二固定的結(jié)合成員為相同或者不同的。
30.權(quán)利要求29的設(shè)備，其中所述流體流動(dòng)路徑由一個(gè)或者多個(gè)吸水性或者吸收性膜形成。
31.權(quán)利要求29或者30的設(shè)備，其還在每個(gè)流動(dòng)路徑中包含對(duì)照區(qū)以指示樣品流動(dòng)。
32.權(quán)利要求29-31中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其還包含第一和第二分析物-結(jié)合成員，所述第一分析物結(jié)合成員具有附著的可檢測標(biāo)記物，和所述第二分析物結(jié)合成員具有可由所述固定的結(jié)合成員捕獲的部分。
33.權(quán)利要求32的設(shè)備，其中所述第二分析物結(jié)合成員可通過抗生蛋白鏈菌素-生物素相互作用，通過抗體-抗原相互作用，或者通過互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)寡聚核苷酸的雜交捕 獲
34.權(quán)利要求32的設(shè)備，其中所述分析物結(jié)合成員為抗體或者其抗原-結(jié)合部分。
35.權(quán)利要求32的設(shè)備，其中所述分析物結(jié)合成員散布性地結(jié)合在一個(gè)或多個(gè)分析物捕獲區(qū)上游的一個(gè)或者多個(gè)流動(dòng)路徑中。
36.權(quán)利要求29-35中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述第一分析物捕獲區(qū)和所述第二分析物捕獲區(qū)在平行的或者雙向的流動(dòng)路徑中。
37.權(quán)利要求29-36中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其中所述固定的結(jié)合劑為抗生蛋白鏈菌素、生物素、抗體，或者多核苷酸。
38.權(quán)利要求29-37中的任一項(xiàng)的設(shè)備，其包含三個(gè)或者更多流動(dòng)路徑，每個(gè)流動(dòng)路徑設(shè)置成用于檢測不同的分析物閾水平。
39.權(quán)利要求38的設(shè)備，其中所述分析物為cTnl和/或NT-proBNP。
40.用于評(píng)價(jià)樣品中的分析物水平的半定量方法，所述方法包括: 將試驗(yàn)樣品施用至權(quán)利要求29-39中的任一項(xiàng)的試驗(yàn)設(shè)備， 在一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)中檢測信號(hào)的存在或者不存在。
41.權(quán)利要求40的方法，其中指示分析物的第一閾水平的可檢測信號(hào)暗示第一決策，和指示所述第二閾水平的可檢測信號(hào)暗示第二決策。
42.權(quán)利要求40的方法，其中作為事件或者病癥的指示，所述分析物在樣品中歷經(jīng)I小時(shí)至一周的時(shí)段升高。
43.權(quán)利要求42的方法，其中將所述方法重復(fù)至少一次。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK103917638SQ201280054618
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月8日
【發(fā)明者】E.布倫南, C.李, A.貝倫基 申請(qǐng)人:Nexus Dx股份有限公司