利用發(fā)酵法制造目標(biāo)物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用發(fā)酵法制造目標(biāo)物質(zhì)的方法，所述方法通過在含有木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)作為目標(biāo)物質(zhì)的2-酮戊二酸或其衍生物的能力、具有由木糖生成木糖酸的能力、且可賦予或增強(qiáng)木糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性及2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性的細(xì)菌，使目標(biāo)物質(zhì)在該培養(yǎng)基中生成蓄積并從該培養(yǎng)基中采集目標(biāo)物質(zhì)來制造目標(biāo)物質(zhì)。
【專利說明】利用發(fā)酵法制造目標(biāo)物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用使用微生物的發(fā)酵法制造L-氨基酸等目標(biāo)物質(zhì)的方法，詳細(xì)而言，涉及一種以木糖作為原料并通過發(fā)酵法制造目標(biāo)物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]為了通過使用細(xì)菌的發(fā)酵法制造L-氨基酸等目標(biāo)物質(zhì)，有使用野生型細(xì)菌(野生株)的方法、使用由野生株衍生的營(yíng)養(yǎng)缺陷株的方法、使用由野生株以各種藥物抗性突變株的形式衍生的代謝調(diào)節(jié)突變株的方法、使用具有營(yíng)養(yǎng)缺陷株和代謝調(diào)節(jié)突變株這兩者的性質(zhì)的菌株的方法等。
[0003]例如，L-谷氨酸主要通過使用屬于短桿菌屬、棒狀桿菌屬、微桿菌屬的所謂的棒狀桿菌型細(xì)菌的L-谷氨酸生產(chǎn)菌或它們的突變株的發(fā)酵法來制造(例如參照非專利文獻(xiàn)I)。作為利用使用其它的菌株的發(fā)酵法制造L-谷氨酸的方法，已知有使用芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、青霉菌屬等微生物的方法(例如參照專利文獻(xiàn)I)、使用假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷氏菌屬、假絲酵母屬等微生物的方法(例如參照專利文獻(xiàn)2)、使用芽孢桿菌屬、產(chǎn)氣氣桿菌(現(xiàn)在為產(chǎn)氣腸桿菌)等微生物的方法(例如參照專利文獻(xiàn)3)、使用大腸桿菌的突變株的方法(例如參照專利文獻(xiàn)4)等。另外，也公開有一種使用屬于克雷伯氏菌屬、歐文氏菌屬或泛菌屬、腸桿菌屬的微生物制造L-谷氨酸的方法(例如參照專利文獻(xiàn)5~7)。
[0004]近年來，目標(biāo)物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)使用重組DNA技術(shù)。例如通過增強(qiáng)編碼L-氨基酸生物合成系酶的基因的表達(dá)(專利文獻(xiàn)8、專利文獻(xiàn)9)、或增強(qiáng)碳源向L-氨基酸生物合成體系流入(專利文獻(xiàn)10)來提高細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)率。
[0005]歷來在利用發(fā)酵法的物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)中是使用糖類，具體而言葡萄糖、果糖、蔗糖、廢糖蜜、淀粉水解物等作為碳源，但價(jià)格較為高昂，近年來，也開展了源自植物的生物質(zhì)原料等的使用。
[0006]作為這樣的生物質(zhì)原料，目前主要使用淀粉、油脂等可食用部分的原料，但將來需要向非可食用部分原料，具體而言為纖維素/半纖維素、木質(zhì)素等轉(zhuǎn)移。非非可食用部分的纖維素/半纖維素可以經(jīng)過使用熱或酸等的前處理工藝、利用纖維素酶的糖化處理工藝等轉(zhuǎn)化為五碳糖、六碳糖等糖而用作發(fā)酵的原料(專利文獻(xiàn)11、12)。在將這樣的五碳糖、六碳糖的混合糖作為氨基酸發(fā)酵等的原料的情況下，已知大腸桿菌優(yōu)先同化葡萄糖，結(jié)果，顯示二階段增殖(兩期生長(zhǎng))，或確認(rèn)到生長(zhǎng)延遲的現(xiàn)象(非專利文獻(xiàn)2、3)。
[0007]在大腸桿菌中，已知有利用xylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶、xylB基因編碼的木酮糖激酶的木糖同化途徑，已知可導(dǎo)入到大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌中由木糖生產(chǎn)L-氨基酸(非專利文獻(xiàn)5、專利文獻(xiàn)13、非專利文獻(xiàn)7)。
[0008] 另一方面，報(bào)告在新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)或沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)中存在有不經(jīng)由這些現(xiàn)有已知的途徑、而是由木糖經(jīng)由木糖酸通過5個(gè)階段到達(dá)2-酮戍二酸的途徑(非專Caulobacter crescentus利文獻(xiàn)6)。另外，已知有在大腸桿菌中表達(dá)該途徑的例子(非專利文獻(xiàn)8、專利文獻(xiàn)14)。[0009]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)1:美國(guó)專利第3，220，929號(hào)說明書
[0012]專利文獻(xiàn)2:美國(guó)專利第3，563，857號(hào)說明書
[0013]專利文獻(xiàn)3:日本特公昭32-9393號(hào)公報(bào)
[0014]專利文獻(xiàn)4:日本特開平5-244970號(hào)公報(bào)
[0015]專利文獻(xiàn)5:日本特開2000-106869號(hào)公報(bào)
[0016]專利文獻(xiàn)6:日本特開2000-189169號(hào)公報(bào)
[0017]專利文獻(xiàn)7:日本特開2000-189175號(hào)公報(bào)
[0018]專利文獻(xiàn)8:美國(guó)專利第5，168，056號(hào)說明書
[0019]專利文獻(xiàn)9:美國(guó)專利第5，776，736號(hào)說明書
[0020]專利文獻(xiàn)10:美國(guó)專利第5，906, 925號(hào)說明書
[0021]專利文獻(xiàn)11: 日本特表平9-507386號(hào)公報(bào)
[0022]專利文獻(xiàn)12:日本特表平11-506934號(hào)公報(bào)
[0023]專利文獻(xiàn)13:歐洲專利第1577396號(hào)說明書
[0024]專利文獻(xiàn)14:美國(guó)專利第7，923，226號(hào)說明書
[0025]非專利文獻(xiàn)
[0026]非專利文獻(xiàn)1:明石邦彥等著，氨基酸發(fā)酵、學(xué)會(huì)出版中心、195~215頁(yè)、1986年
[0027]非專利文獻(xiàn)2:Nichols N.N.et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.2001Jul ；56(1-2):120-125
[0028]非專利文獻(xiàn)3:Gonzalez, R., Biotechnol.Prog.2002Jan_Feb ； 18 (I): 6-20
[0029]非專利文獻(xiàn)4:Song S.et al.，J.Bacteriol.1997Nov ; 179 (22): 7025-7032
[0030]非專利文獻(xiàn)5:Tao H.，et al.，J.Bacteriol.200IMay ； 183 (10): 2979-2988
[0031]非專利文獻(xiàn)6 Stephens, C.et al., J.Bacteriol.2007Mar ；189(5):2181-2185
[0032]非專利文獻(xiàn)7:Gopinath, V.et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.2011Jul28
[0033]非專利文獻(xiàn)8:Huaiwei, L et al., Bioresour Technol.2011Aug22

【發(fā)明內(nèi)容】

[0034]發(fā)明所要解決的問題
[0035]本發(fā)明的目的在于，提供一種可在含有木糖的培養(yǎng)基中高效地生產(chǎn)L-谷氨酸等目標(biāo)物質(zhì)的微生物、及使用該微生物制造目標(biāo)物質(zhì)的方法。
[0036]解決問題的手段
[0037]本發(fā)明人以選育具有五碳糖、六碳糖同化能力的氨基酸產(chǎn)生細(xì)菌為目的，利用由木糖經(jīng)由木糖酸到2-酮戊二酸的途徑對(duì)微生物的選育進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)該途徑的微生物可高效地同化木糖，從而完成了本發(fā)明。
[0038]SP，本發(fā)明如下所述。
[0039]1.一種制造目標(biāo)物質(zhì)的方法，包括在含有木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的能力的細(xì)菌而使目標(biāo)物質(zhì)在該培養(yǎng)基中生成蓄積，并從該培養(yǎng)基收集目標(biāo)物質(zhì)，其中，[0040]所述目標(biāo)物質(zhì)為2-酮戊二酸或其衍生物，
[0041]所述細(xì)菌具有從木糖生成木糖酸的能力，且被賦予或增強(qiáng)了木糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性及2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性。
[0042]2.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌通過以能夠表達(dá)的形式導(dǎo)入分別編碼木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶的基因而被賦予或增強(qiáng)了所述酶活性。
[0043]3.如上所述的方法，其中，編碼木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶的基因來源于屬于柄桿菌屬(Caulobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、草螺菌屬(Herbaspirillum)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、卓貝爾氏黃桿菌屬(Zobellia)、熱桿菌屬(Thermobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或曲霉屬(Asperillus)的微生物。
[0044]4.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌由于下述任一項(xiàng)特征而能夠從木糖生成木糖酸:
[0045](A)被賦予或增強(qiáng)了木糖脫氫酶活性、或木糖脫氫酶及木糖酸內(nèi)酯酶活性；或
[0046](B)具有能夠催化從木糖生成木糖酸的反應(yīng)的葡萄糖脫氫酶活性。 [0047]5.如上所述的方法，其中，所述葡萄糖脫氫酶以吡咯并喹啉醌作為輔酶，且所述細(xì)菌由于具有吡咯并喹啉醌生產(chǎn)能力或者由于在含有吡咯并喹啉醌的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)而具有葡萄糖脫氫酶活性。
[0048]6.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌由于以能夠表達(dá)的形式導(dǎo)入了編碼木糖脫氫酶的基因、或編碼木糖脫氫酶及木糖酸內(nèi)酯酶的基因而能夠從木糖產(chǎn)生木糖酸。
[0049]7.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌還經(jīng)過修飾而降低了 2-酮戊二酸脫氫酶的活性。
[0050]8.如上所述的的方法，其中，所述細(xì)菌還經(jīng)過修飾而降低了琥珀酸脫氫酶的活性。
[0051]9.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌為腸細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌。
[0052]10.如上所述的方法,其中，所述細(xì)菌為泛菌屬(Pantoea)細(xì)菌。
[0053]11.如上所述的方法,其中，所述細(xì)菌為Pantoea ananatis。
[0054]12.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌為埃希氏菌屬細(xì)菌。
[0055]13.如上所述的方法,其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichia coli)。
[0056]14.如上所述的方法,其中，所述細(xì)菌為棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌。
[0057]15.如上所述的方法，其中，所述細(xì)菌為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)。
[0058]16.如上所述的方法，其中，所述2-酮戊二酸衍生物為選自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、腐胺及Y -氨基丁酸的物質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1是表示利用icd基因缺陷株的源自新月柄桿菌的NXA操縱子表達(dá)株生長(zhǎng)互補(bǔ)試驗(yàn)的結(jié)果的圖41-(11?19-(11?1947141471分別表示含有2-酮戊二酸或木糖作為單一碳源的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基及El合成培養(yǎng)基。
[0060]圖2是表示表達(dá)大腸桿菌ccrNXA操縱子的大腸桿菌L-谷氨酸產(chǎn)生細(xì)菌的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)的結(jié)果的圖。
[0061]圖3是表示利用以大腸桿菌固有的木糖同化途徑缺陷株為宿主的ccrNXA操縱子表達(dá)株的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)的結(jié)果的圖。
[0062]圖4是表示利用中拷貝型載體的ccrNXA操縱子表達(dá)株的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)的結(jié)果的圖；
[0063]圖5是表示利用源自各種微生物的xylD同源基因表達(dá)株的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)的結(jié)果的圖，Atu> Hse、Amis、Aor分別表示根癌土壤桿菌、織片草螺菌(Herbaspirillumseropedicae)、米蘇里游動(dòng)放線菌(Actinoplanes missouriensis)、米曲霉；
[0064]圖6是表不利用源自各種微生物的xylX同源物表達(dá)株的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)的結(jié)果的圖，Art、Atu> Cne> Zga、Tco、Selo分別表示球形節(jié)桿菌、根癌土壤桿菌、鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)、食半乳聚糖卓貝爾氏黃桿菌(Zobellia galactanivorans)、Thermobacillus compost1、伊樂假單胞菌(Pseudomonas elodea)。
[0065]圖7是表示利用源自各種微生物的xylA同源物表達(dá)株的L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)的結(jié)果的圖，Hbo、Abr分別表示玻利維亞鹽單胞菌(Halomonas boliviensis)和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasil ense)。
【具體實(shí)施方式】
[0066]本發(fā)明為一種一種制造目標(biāo)物質(zhì)的方法，包括在含有木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的能力的細(xì)菌而使目標(biāo)物質(zhì)在該培養(yǎng)基中生成蓄積，并從該培養(yǎng)基收集目標(biāo)物質(zhì)，其中，
[0067]所述目標(biāo)物質(zhì)為2-酮戊二酸或其衍生物，
[0068]所述細(xì)菌具有從木糖生成木糖酸的能力，且被賦予或增強(qiáng)了木糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性及2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性。
[0069]目標(biāo)物質(zhì)為2-酮戊二酸(α-酮戊二酸、a KG)或其衍生物。作為2_酮戊二酸的衍生物，可以舉出:L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、腐胺及Y-氨基丁酸。
[0070]所謂“目標(biāo)物質(zhì)生產(chǎn)能力”是指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于本發(fā)明的細(xì)菌時(shí)具有以能夠從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收上述目標(biāo)物質(zhì)的程度產(chǎn)生上述目標(biāo)物質(zhì)的能力。優(yōu)選地，是指具有與在相同條件下培養(yǎng)的野生株或非修飾株相比，產(chǎn)生更大量的目標(biāo)物質(zhì)的能力。細(xì)菌可以具有2種以上的目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)生能力。
[0071]另外，上述目標(biāo)物質(zhì)含有游離體及/或其鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽、鉀鹽。
[0072]〈1>本發(fā)明的細(xì)菌
[0073]本發(fā)明的細(xì)菌為具有由木糖生成木糖酸的能力，且被賦予或增強(qiáng)了木糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性及2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性的細(xì)菌。
[0074]本發(fā)明的細(xì)菌可以為原本不具有木糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性及2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性，但被賦予了這些酶活性的細(xì)菌，也可以為原本具有這些酶活性，而被增強(qiáng)了這些酶活性的細(xì)菌。
[0075]由木糖生成木糖酸的能力例如可通過以下的任一者或兩者來實(shí)現(xiàn):
[0076]I)賦予或增強(qiáng)木糖脫氫酶活性；或
[0077]2)具有可催化由木糖生成木糖酸的反應(yīng)的葡萄糖脫氫酶活性。
[0078]作為符合I)的微生物，可以舉出:埃希氏菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌型細(xì)菌，作為符合2)的微生物，可以舉出:泛菌屬細(xì)菌等。
[0079]關(guān)于I)，在木糖脫氫酶活性的基礎(chǔ)上，還可以增強(qiáng)木糖酸內(nèi)酯酶。
[0080]屬于各屬的細(xì)菌在后文中描述。
[0081]由木糖生成的木糖酸可利用木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸。利用木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戍二酸半醒脫氫酶到2-酮戍二酸的途徑也稱為Weimberg途徑(J.Biol.Chem., 236:629-636)。在本說明書中，有時(shí)將Weimberg途徑及除Weimberg途徑以外通過木糖脫氫酶及/或木糖酸內(nèi)酯酶由木糖到木糖酸的途徑統(tǒng)稱為NXA(新的木糖同化)途徑。
[0082]細(xì)菌是否具有Weimberg途徑或是否導(dǎo)入有Weimberg途徑可通過測(cè)定細(xì)菌提取物的木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶的酶活性，或者確認(rèn)該細(xì)菌可同化木糖酸(在未保持Weimberg途徑的菌株中木糖酸會(huì)蓄積)來加以確定。另外，細(xì)菌是否NXA保持途徑或是否導(dǎo)入有NXA途徑可以通過在上述各酶的基礎(chǔ)上還測(cè)定木糖脫氫酶及/或木糖酸 內(nèi)酯酶的酶活性來確定。另外，這些酶活性也可以通過測(cè)定由木糖生成的木糖酸來確定。
[0083]在本發(fā)明中，所謂木糖酸脫水酶(xylonate dehydratase)是可逆地催化以下反應(yīng)的酶(EC4.2.1.82),也稱為 D-木-糖醒酸脫水酶(D-xylo-aldonate dehydratase)、D-木糖酸脫水酶(D-xylonate dehydratase)和D-木糖酸水裂合酶(D-xylonatehydro-lyase)。
[0084]D-木糖酸一2-脫氫-3-脫氧-D-木糖酸+H2O
[0085]木糖酸脫水酶活性例如可以通過以下操作測(cè)定:在混合D-木糖酸溶液和受試試樣使其反應(yīng)后，加入包含I %鹽酸氨基脲(semicarbazide hydrochloride)水溶液和1.5%乙酸鈉水溶液的反應(yīng)停止液而停止反應(yīng)，測(cè)定稀釋液的250nm處的吸收(Dahms, A.S.，etal., Methods Enzymol.1982 ；90Pt E:302-5)。
[0086]在本發(fā)明中，所謂2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶(2-keto-3_deoxy-xylonatedehydratase)為可逆地催化以下的反應(yīng)的酶(EC4.2.1.-)。
[0087]2-脫氫-3-脫氧-D-木糖酸一2-酮戊二酸半醛+H2O
[0088]2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性例如可以通過以下操作測(cè)定:在混合作為底物的2-酮-3-脫氧木糖酸溶液和受試試樣使其反應(yīng)后，測(cè)定2-酮-3-脫氧木糖酸的減少。
[0089]在本發(fā)明中，所謂2-酮戊二酸半醛脫氫酶(2-酮戊二酸半醛脫氫酶)為可逆地催化以下的反應(yīng)的氧化還原酶(EC1.2.1.26)。
[0090]2-酮戊二酸半醛+NAD⑵一2-酮戊二酸+NAD⑵H
[0091]2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性例如可通過測(cè)定NAD(P)的還原來測(cè)定活性。例如可以通過在焦磷酸(pH8.5)、NAD(P)和受試試樣的混合液中加入2-酮戊二酸半醒，并測(cè)定340nm處的吸收，來測(cè)定該酶的活性(Adams，E.，et al, (1967) J.Biol.Chem.242，1802-1814)。
[0092]木糖脫氫酶(D-木糖-1-脫氫酶、D-xylosel-dehydrogenase)為戍糖和葡糖醒酸的相互轉(zhuǎn)化酶之一，是可逆地催化以下反應(yīng)的氧化還原酶(EC1.1.1.175)。
[0093]D-木糖 +NAD (P) + — D-木糖酸內(nèi)酷 +NAD (P) H+H+
[0094]D-木糖-1-脫氫酶活性例如可以通過以下的操作測(cè)定:混合木糖、受試試樣及NAD(P)使其反應(yīng)，測(cè)定 340nm 處的吸收(Stephens, C.et al.，J.Bacteriol.，2007，189(5):181-2185)。
[0095]新月柄桿菌的木糖脫氫酶可催化D-木糖一木糖酸的活性。
[0096]在本發(fā)明中,所謂木糖酸內(nèi)酯酶(xylonolactonase)為可逆地催化以下的反應(yīng)的酶(EC3.1.1.68)。
[0097]D-木糖酸內(nèi)酯一D-木糖酸
[0098]木糖酸內(nèi)酯酶活性例如可以通過混合木糖酸內(nèi)酯和受試試樣使其反應(yīng)，利用氧肟酸鹽法定量殘留的木糖酸內(nèi)酯來測(cè)定(Appl.Microbiol.Biotechnol.,29:375-379，1988 ；Appl.Microbiol., Biotechnol., 27:333-336，1988)。
[0099]編碼木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶各酶的基因只要 是具有Weimberg途徑的微生物的即可，例如可以舉出:源自屬于柄桿菌屬(Caulobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、土壤桿菌(Agrobacterium)屬、草螺菌屬(Herbaspirillum)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、卓貝爾氏黃桿菌屬(Zobellia)、熱桿菌屬(Thermobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)等的細(xì)菌、或?qū)儆谇箤?Aspergillus)的絲狀真菌等微生物的基因。
[0100]作為柄桿菌屬細(xì)菌，可以舉出新月柄桿菌。
[0101]作為新月柄桿菌，已知有CB-15株、CB-13株，分別作為ATCC19089、ATCC33532保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址P.0.Boxl549Manassas, VA20108,美國(guó))。另外，也可使用 NA-1000 株(J.Bacteriol.，192: 3678-88 (2010) )、K31 菌株。
[0102]新月柄桿菌CB15株、NAlOOO株、K31株的基因組序列分別登錄為GeneBankAccession Nos.AE005673、CPOO1340,CP000927。
[0103]源自新月柄桿菌CB15株、NAlOOO株及K31株的各酶的基因在Genebank中以下述的基因符號(hào)登錄。
[0104]表1
[0105]
【權(quán)利要求】
1.一種制造目標(biāo)物質(zhì)的方法，包括在含有木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的能力的細(xì)菌而使目標(biāo)物質(zhì)在該培養(yǎng)基中生成蓄積，并從該培養(yǎng)基收集目標(biāo)物質(zhì)，其中， 所述目標(biāo)物質(zhì)為2-酮戊二酸或其衍生物， 所述細(xì)菌具有從木糖生成木糖酸的能力，且被賦予或增強(qiáng)了木糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶活性及2-酮戊二酸半醛脫氫酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)菌通過以能夠表達(dá)的形式導(dǎo)入分別編碼木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶的基因而被賦予或增強(qiáng)了所述酶活性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，編碼木糖酸脫水酶、2-酮-3-脫氧木糖酸脫水酶及2-酮戊二酸半醛脫氫酶的基因來源于屬于柄桿菌屬(Caulobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、草螺菌屬(Herbaspirillum)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、卓貝爾氏黃桿菌屬(Zobellia)、熱桿菌屬(Thermobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或曲霉屬(Asperillus)的微生物。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌由于下述任一項(xiàng)特征而能夠從木糖生成木糖酸: (A)被賦予或增強(qiáng)了木糖 脫氫酶活性、或木糖脫氫酶及木糖酸內(nèi)酯酶活性；或 (B)具有能夠催化從木糖生成木糖酸的反應(yīng)的葡萄糖脫氫酶活性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述葡萄糖脫氫酶以吡咯并喹啉醌作為輔酶，且所述細(xì)菌由于具有吡咯并喹啉醌生產(chǎn)能力或者由于在含有吡咯并喹啉醌的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)而具有葡萄糖脫氫酶活性。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述細(xì)菌由于以能夠表達(dá)的形式導(dǎo)入了編碼木糖脫氫酶的基因、或編碼木糖脫氫酶及木糖酸內(nèi)酯酶的基因而能夠從木糖產(chǎn)生木糖酸。
7.如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌還經(jīng)過修飾而降低了2-酮戊二酸脫氫酶的活性。
8.如權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌還經(jīng)過修飾而降低了琥珀酸脫氫酶的活性。
9.如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌為腸細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述細(xì)菌為泛菌屬(Pantoea)細(xì)菌。
11.如權(quán)利要求10所述的方法,其中，所述細(xì)菌為Pantoeaananatis。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述細(xì)菌為埃希氏菌屬細(xì)菌。
13.如權(quán)利要求12所述的方法,其中,所述細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)。
14.如權(quán)利要求9所述的方法,其中,所述細(xì)菌為棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌。
15.如權(quán)利要求14所述的方法,其中，所述細(xì)菌為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)。
16.如權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述2-酮戊二酸衍生物為選自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L -精氨酸、L-瓜氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、腐胺及Y -氨基丁酸的物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK103930557SQ201280055558
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月11日
【發(fā)明者】西尾陽(yáng)介, 山本洋子, 山田和輝, 橫田康介 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社