纖維素酶的制造方法及其裝置制造方法
【專利摘要】包括以下的工序(1)～(3)的纖維素酶的制造方法，所得的纖維素酶可以在洗劑用途、淀粉的水解、和纖維素的水解等用途中有效地使用。工序(1)：使來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液通過截留分子量100,000～200,000的超濾膜進(jìn)行過濾，得到透過液，同時(shí)作為非透過液得到濃縮酶液。工序(2)：使工序(1)所得的透過液進(jìn)一步通過截留分子量5,000～50,000的第2超濾膜進(jìn)行過濾，作為非透過液得到第2濃縮酶液。工序(3)：將工序(1)和(2)所得的濃縮酶液混合，得到來源于絲狀菌的纖維素酶。
【專利說明】纖維素酶的制造方法及其裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過將來源于絲狀菌的纖維素酶成分進(jìn)行膜分離?濃縮來制造纖維素酶的制造方法及其裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]作為生物質(zhì)資源，存在淀粉、纖維素等多糖，已知通過將這樣的多糖進(jìn)行酶水解來制造葡萄糖、木糖等單糖的方法。通過這樣的多糖的分解而得的糖液作為微生物培養(yǎng)的碳源而被廣泛使用。特別是作為水解纖維素的酶已知纖維素酶。作為生產(chǎn)這樣的纖維素酶的微生物已知絲狀菌。絲狀菌通過設(shè)定為誘導(dǎo)生產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件，而作為細(xì)胞外酶產(chǎn)生大量的纖維素酶。作為這樣的絲狀菌，存在曲霉屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、木霉屬和枝頂孢霉屬等的絲狀菌，在纖維素酶的生產(chǎn)中被廣泛使用。[0003]來源于絲狀菌的纖維素酶中存在顯示各種底物特異性的酶成分。具體地，存在作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)域的纖維二糖水解酶、從纖維素分子鏈內(nèi)部開始作用而降低分子量的內(nèi)切葡聚糖酶、作用于水溶性寡糖或者纖維二糖的葡糖苷酶、和作用于半纖維素的半纖維素酶等。已知通過這樣的底物特異性不同的各酶成分協(xié)同作用于纖維素纖維，而進(jìn)行有效的纖維素分解(參照非專利文獻(xiàn)I)。另外，已知作為這樣的來源于絲狀菌的纖維素酶的各酶成分存在分子量大小不同的成分，其范圍為20~lOOkDa。
[0004]對(duì)于來源于絲狀菌的纖維素酶，與一般的酶同樣地，使用超濾膜進(jìn)行膜分離?濃縮的方法是公知的。例如，已知從絲狀菌等的微生物培養(yǎng)物或者使用了纖維素酶的纖維素水解物中，使用超濾膜將纖維素酶進(jìn)行膜分離?濃縮，并分離回收的方法(參照專利文獻(xiàn)I~3)。作為這樣的通過超濾膜而進(jìn)行膜分離.濃縮的前工序的處理，提出了使用例如陶瓷自旋過濾器(參照專利文獻(xiàn)2)、20~200 μ m孔徑的無紡布(參照專利文獻(xiàn)3)等，從微生物培養(yǎng)物或者纖維素水解物中預(yù)先除去纖維素酶水溶液所含的固體物質(zhì)的方法。但是，為了將纖維素酶的各成分進(jìn)行膜分離.濃縮，一般使用具有足以阻擋具有與應(yīng)回收的纖維素酶成分相當(dāng)?shù)姆肿恿康募?xì)孔徑.截留分子量的超濾膜。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:W02007/034999 號(hào)
[0008]專利文獻(xiàn)2:日本特開2010-221136號(hào)公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-240167號(hào)公報(bào)
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)1:七^ 口一 7 Q辭典、第6章七^ 口一 7乃生分解(七^ 口一 7學(xué)會(huì)編集、2000年)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明要解決的課題[0013]在現(xiàn)有的使用了超濾膜的絲狀菌纖維素酶的膜分離.濃縮中，超濾膜的結(jié)垢和纖維素酶成分的失活或者凝集是課題。另外，該課題的結(jié)果是超濾膜的過濾處理速度變得非常慢，或者由超濾膜得到的纖維素酶活性降低。
[0014]于是，本發(fā)明的目的是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的課題，提供使用超濾膜而將來源于木霉屬菌的纖維素酶成分有效地進(jìn)行膜分離.濃縮的方法、以及該方法的裝置。
[0015]用于解決課題的方法
[0016]本
【發(fā)明者】為了實(shí)現(xiàn)上述目的而完成了以下的[I]~[7]的發(fā)明。
[0017][I]纖維素酶的制造方法，包括以下的工序⑴~(3)， [0018]工序(I):使來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液通過截留分子量100，000~200，000的超濾膜進(jìn)行過濾，得到透過液，同時(shí)作為非透過液得到濃縮酶液，
[0019]工序(2):使工序(I)所得的透過液進(jìn)一步通過截留分子量5，000~50，000的第2超濾膜進(jìn)行過濾，作為非透過液得到第2濃縮酶液，
[0020]工序(3):將工序⑴和⑵所得的濃縮酶液混合，得到來源于絲狀菌的纖維素酶。
[0021][2]根據(jù)[I]所述的纖維素酶的制造方法，絲狀菌是木霉屬菌。
[0022][3]根據(jù)[I]或[2]所述的纖維素酶的制造方法，在工序(I)中，將來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液調(diào)整為pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4。
[0023][4]根據(jù)[I]~[3]的任一項(xiàng)所述的纖維素酶的制造方法，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液是絲狀菌培養(yǎng)液或使用了來源于絲狀菌的纖維素酶的含纖維素的生物質(zhì)的水解物。
[0024][5]根據(jù)[I]~[4]的任一項(xiàng)所述的纖維素酶的制造方法，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液包含選自纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶中的I種以上酶成分。
[0025][6]根據(jù)[I]~[5]的任一項(xiàng)所述的纖維素酶的制造方法，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液的溫度為15~35°C的溫度范圍。
[0026][7]纖維素酶的制造裝置，該裝置包含:纖維素酶水溶液罐、與該纖維素酶水溶液罐連接的超濾膜泵、至少I個(gè)以上串聯(lián)或并聯(lián)地連接的截留分子量100，000~200，000的超濾膜、所述超濾膜的透過液保持罐、截留分子量5，000~50，000的第2超濾膜、和第2濃
縮酶液保持te。
[0027][8]根據(jù)[7]所述的纖維素酶的制造裝置，纖維素酶水溶液罐具備pH值傳感器，進(jìn)而該纖維素酶水溶液罐連接有PH值調(diào)整劑罐。
[0028]發(fā)明的效果
[0029]根據(jù)本發(fā)明，可以從來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液中將纖維素酶成分有效地進(jìn)行膜分離.濃縮。具體地，通過在工序(I)中分離回收來源于絲狀菌的纖維素酶成分的一部分，進(jìn)而將透過液所含的殘余的來源于絲狀菌的纖維素酶成分在工序(2)中回收，從而可以回收特別高的艾維素(Avicel)分解活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是顯示本發(fā)明的纖維素酶的制造方法的工序流程的附圖。
[0031]圖2是顯示將來源于木霉屬菌的纖維素酶調(diào)整到各種pH值，通過截留分子量100, 000~200，000的第I超濾膜進(jìn)行過濾，作為非透過液分離而得的濃縮酶液的利用Bioanalyzer (Agilent 社、Protein230kit)的分析結(jié)果的附圖。
[0032]圖3是顯示得到第2濃縮酶液時(shí)的超濾膜的臨界通量的附圖。
[0033]圖4是顯示實(shí)施本發(fā)明的纖維素酶的制造方法的裝置的一例的剖面圖。
[0034]圖5是顯示實(shí)施本發(fā)明的纖維素酶的制造方法的裝置的另外一例的剖面圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本發(fā)明的纖維素酶的制造方法由包含以下的工序(I)~(3)的工序構(gòu)成(圖1)。
[0036]<工序(1) >
[0037]在工序(I)中，使來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液通過截留分子量100，000~200, 000的超濾膜進(jìn)行過濾，得到透過液，同時(shí)作為非透過液得到濃縮酶液。此時(shí)，發(fā)現(xiàn)來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液所含的一部分酶成分作為截留分子量100，000~200，000的超濾膜的非透過液而被分離。另一方面，發(fā)現(xiàn)在透過側(cè)也有殘余的酶成分被分離到透過側(cè)，因而在以下的工序(2)中回收殘余的酶成分。
[0038]< 工序(2) >
[0039]在工序(2)中，使上述工序(I)所得的透過液進(jìn)一步通過截留分子量5，000~50，000的第2超濾膜進(jìn)行過濾，作為非透過液得到第2濃縮酶液。由此，可以不遺漏地回收工序(I)的透過液所含的酶成分。通過前述工序(I)的截留分子量100，000~200，000的超濾膜、和工序(2)的截留分子量5，000~50，000的超濾膜的2個(gè)階段而分離?濃縮來源于絲狀菌的纖維素酶，從而與現(xiàn)有的僅用截留分子量5，000~50，000的超濾膜進(jìn)行分離.濃縮的方法相比，可以分離更高的酶活性。
[0040]< 工序(3) >
[0041]在工序(3)中，將工序(I)所得的第I濃縮酶液與工序(2)所得的第2濃縮酶液混合，從來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液得到具有高酶活性的纖維素酶。本工序(3)所得的纖維素酶可以直接使用，也可以調(diào)整到適宜纖維素酶濃度和/或PH值而使用。
[0042]進(jìn)行，以下關(guān)于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0043]來源于絲狀菌的纖維素酶是指由絲狀菌(filamentaous fungi)產(chǎn)生的纖維素酶。作為產(chǎn)生纖維素酶的絲狀菌，可列舉木霉屬菌(Trichoderma)、曲霉屬菌(Aspergillus)、纖維單胞菌屬菌(Cellulomonas)、梭菌屬菌(Clostridium)、鏈霉菌屬菌(Streptomyces)、腐質(zhì)霉屬菌(Humicola)、枝頂孢霉屬菌(Acremonium)、祀齒菌屬菌(Irpex)、毛霉屬菌(Mucor)、籃狀菌屬菌(Talaromyces)等微生物。這些微生物在培養(yǎng)液中產(chǎn)生纖維素酶,因而可以直接將其培養(yǎng)液作為未純化的絲狀菌纖維素酶使用，另外也可以純化培養(yǎng)液，將制劑化而得的產(chǎn)物作為絲狀菌纖維素酶使用。
[0044]作為本發(fā)明中使用的來源于絲狀菌的纖維素酶，優(yōu)選為來源于木霉屬菌的纖維素酶。木霉屬菌是指分類于木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、和肉座菌屬(Hypocrea)的絲狀菌(filamentaous fungi)。另外,來源于木霉屬菌的纖維素酶是指由上述木霉屬菌在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的全部纖維素酶成分。另外，本發(fā)明中使用的纖維素酶是指具有纖維素的水解活性的酶和具有半纖維素的水解活性的酶兩者。
[0045]另外，來源于木霉屬菌的纖維素酶中，更優(yōu)選來源于里氏木霉(Trichodermareesei)的纖維素酶。作為來源于里氏木霉的纖維素酶，可列舉來源于里氏木霉QM9414 (Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉 QM9123 (Trichoderma reesei QM9123)、里氏木霉 RutC-30(Trichoderma reesei Rut-30)> 里氏木霉 PC3-7(Trichodermareesei PC3-7)、里氏木霉 ATCC66589 (Trichoderma reesei ATCC66589)、里氏木霉CL-847 (Trichoderma reesei CL-847)、里氏木霉MCG77 (Trichoderma reesei MCG77)和里氏木霉MCG80 (Trichoderma reesei MCG80)的纖維素酶。另外，也可以是來源于前述的木霉屬菌，將它們的菌株通過突變劑或者紫外線照射等實(shí)施突變處理，而纖維素酶生產(chǎn)性等提高了的突變株。
[0046]木霉屬菌通過在適當(dāng)培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)而在培養(yǎng)液中分泌產(chǎn)生各種纖維素酶，因而可以從這樣的培養(yǎng)液中獲得來源于木霉屬菌的纖維素酶。這樣的培養(yǎng)液既可以未純化而直接作為來源于木霉屬菌的纖維素酶，另外也可以是將培養(yǎng)液通過公知方法純化而得的產(chǎn)物，或者進(jìn)一步制劑化而得的產(chǎn)物。作為從上述的培養(yǎng)液中將來源于木霉屬菌的纖維素酶純化、制劑化而得的產(chǎn)物使用時(shí)，也可以是添加了蛋白酶抑制劑、分散劑、溶解促進(jìn)劑和穩(wěn)定劑等除酶以外的物質(zhì)而得的產(chǎn)物。
[0047]另外，本發(fā)明中使用的來源于木霉屬菌的纖維素酶，也可以制備存在于木霉屬菌的基因組上的編碼纖維素酶成分的氨基酸序列的DNA，將其與表達(dá)載體連接，將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，作為重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)，再分離和純化而獲得。
[0048]木霉屬菌產(chǎn)生至少2種以上的內(nèi)切葡聚糖酶(內(nèi)切葡聚糖酶1、內(nèi)切葡聚糖酶II)、至少2種以上 的纖維二糖水解酶(纖維二糖水解酶1、纖維二糖水解酶II)、至少2種以上的半纖維素酶(木聚糖酶、木糖苷酶)、和I種以上的β葡糖苷酶。
[0049]纖維二糖水解酶是以從纖維素的末端部分開始水解下去為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號(hào):EC3.2.1.91記載了歸屬于纖維二糖水解酶的酶群。內(nèi)切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的中央部分開始水解為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號(hào):EC3.2.1.4記載了歸屬于內(nèi)切葡聚糖酶的酶群。外切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的末端開始水解為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號(hào):EC3.2.1.74記載了歸屬于外切葡聚糖酶的酶群。β葡糖苷酶是以作用于纖維寡糖或纖維二糖為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號(hào):EC3.2.1.21記載了歸屬于β葡糖苷酶的酶群。
[0050]木聚糖酶是以作用于半纖維素或特別作用于木聚糖為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號(hào):EC3.2.1.8記載了歸屬于木聚糖酶的酶群。木糖苷酶是以作用于木寡糖為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號(hào):EC3.2.1.37記載了歸屬于木糖苷酶的酶群。
[0051]在本發(fā)明中使用的來源于絲狀菌的纖維素酶中，也可以添加異種微生物的纖維素酶成分而強(qiáng)化特定的酶活性。例如，可以添加來源于作為絲狀菌的曲霉屬(Aspergillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、梭菌屬(Clostridium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、枝頂抱霉屬(Acremonium)、祀齒菌屬(Irpex)、毛霉屬(Mucor)、籃狀菌屬(Talaromyces)等的纖維素酶。另外，作為嗜熱菌，可以例示硫化葉菌屬(Sulofolobus)、熱原體屬(Thermoplasma)、暖枝菌屬(Caldivirgra)、熱球形菌屬(Thermosphaera)、火球菌屬(Pyrococcus)、嗜苦菌屬(Picrophilus)、暖枝菌屬(Caldivirgra)、和閃爍桿菌屬(Fervidobacterium)等微生物。
[0052]關(guān)于來源于絲狀菌的纖維素酶所含的各酶成分，可以使用公知的分離方法特定其成分。例如，通過凝膠過濾、離子交換、和二維電泳等公知方法來分離，進(jìn)行分離而得的成分的氨基酸序列分析(N末端分析、C末端分析、質(zhì)量分析)，通過與數(shù)據(jù)庫的比較來確定。
[0053]來源于絲狀菌的纖維素酶的酶活性可以通過艾維素(Avicel)分解活性、羧甲基纖維素(CMC)分解活性、纖維二糖分解活性、木聚糖分解活性、和甘露聚糖分解活性等多糖的水解活性來評(píng)價(jià)。關(guān)于艾維素(Avicel)分解活性，具有從纖維素末端部分開始水解的特征的纖維二糖水解酶或外切葡聚糖酶是顯示其活性的主要酶。另外，關(guān)于木聚糖分解活性，木聚糖酶、木糖苷酶是顯示其活性的主要酶。關(guān)于纖維二糖分解活性，主要β葡糖苷酶是顯示其活性的主要酶。CMC由全體纖維素酶發(fā)揮催化作用。這里所謂“主要”的含義是來自已知最與分解相關(guān)的表達(dá)，意味著除此以外的酶成分也參與該分解。
[0054]來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液，是包含I種以上的前述的來源于絲狀菌的纖維素酶成分的水溶液。但是，在本發(fā)明中，優(yōu)選為包含多種來源于絲狀菌的纖維素酶成分的水溶液。另外，除了本來的來源于絲狀菌的纖維素酶成分之外，還可以含有來源于異種微生物的酶或者纖維素酶。
[0055]作為本發(fā)明中使用的來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液不特別限定，優(yōu)選為絲狀菌的培養(yǎng)液或者在含纖維素的生物質(zhì)中添加來源于絲狀菌的纖維素酶進(jìn)行水解而得的水解物。作為PH值調(diào)整中使用的酸， 可例示硫酸、鹽酸、乙酸、磷酸、和硝酸等，作為堿，可例示氫氧化鈉、氫氧化鉀、和氫氧化鈣等，但只要是能夠經(jīng)濟(jì)地調(diào)整到規(guī)定的PH值、且不使來源于絲狀菌的纖維素酶的酶成分失活或者凝集的酸或堿，就不特別限定。
[0056]來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液優(yōu)選為進(jìn)行選自離心分離、過濾器壓濾、干濾器過濾、深層過濾器過濾、沉降分離、凝集處理、和砂濾的I種以上的固液分離操作，調(diào)整為濁度0.1~100NTU的范圍的水溶液。濁度(Tubidity)在JIS Κ010‘工業(yè)用水試驗(yàn)方法”中定義為“濁度表示水混濁的程度，分為視覺濁度、透射光濁度、散射光濁度和積分球濁度而表示。與高嶺土標(biāo)準(zhǔn)液比較而測(cè)定時(shí)，以‘度(高嶺土)’為單位表示，與福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液比較而測(cè)定時(shí)，以‘度(福爾馬肼)’為單位表示?！?br> [0057]在本發(fā)明中，使用與高嶺土標(biāo)準(zhǔn)液相比再現(xiàn)性和穩(wěn)定性優(yōu)異的福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液，使用通過散射光測(cè)定法測(cè)定的濁度“NTU”。NTU是指“比濁法濁度單位(N印helometricTubidity Unit)”，當(dāng)濁度大于100NTU時(shí)，在后段工序(2)的利用超濾膜的過濾中成為膜結(jié)垢的重要原因。因此，優(yōu)選通過進(jìn)行前述的I種以上的固液分離操作，將濁度調(diào)整為0.1~100NTU的范圍。前述的固液分離方法可以通過公知的裝置和步驟來實(shí)施。相反，為了使?jié)岫刃∮?.1NTU,需要使用細(xì)孔徑0.05~1.0 μ m的精密過濾膜。在使用這樣的精密過濾膜時(shí)，來源于絲狀菌的纖維素酶的酶成分可能作為精密過濾膜的非透過液而被阻擋，因而濁度優(yōu)選為0.1NTU以上。
[0058]本發(fā)明中使用的超濾膜是指具有平均細(xì)孔徑0.02~0.0001 μ m的分離膜，是能主要通過分子篩的效果而將酶和/或蛋白質(zhì)等水溶性高分子化合物進(jìn)行膜分離?濃縮的分離膜。
[0059]在本發(fā)明中，使用截留分子量為100，000~200，000的第I超濾膜、和截留分子量為5，000~50，000的第2超濾膜這2種超濾膜。截留分子量(MWCO)是指，如日本膜學(xué)會(huì)編膜學(xué)實(shí)驗(yàn)'> U 第III卷人工膜編編集委員:木村尚史、中尾真一、大矢晴彥、仲川勤(共立出版、1993年)92頁有“以取溶質(zhì)的分子量為橫軸，以取阻擋率為縱軸將數(shù)據(jù)作圖而得的曲線稱為截留分子量曲線。并且將阻擋率成為90%的分子量稱為膜的截留分子量?！钡挠涊d那樣，通過測(cè)定能夠作為膜的非透過級(jí)分分離的分子量而定義其膜性能。作為確定截留分子量的方法，可以使分子量明確的各種右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品和/或蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品通過超濾膜進(jìn)行過濾，評(píng)價(jià)其阻擋率，描繪其分離曲線，從而確定截留分子量。具體地，截留分子量100，000的超濾膜，是指阻擋90%的分子量100，000的分子的超濾膜。
[0060]來源于絲狀菌的纖維素酶包含在20~IOOkDa的范圍大小不同的酶成分，預(yù)想將來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液用截留分子量100，000~200，000的第I超濾膜過濾后，不能從非透過液側(cè)回收酶成分。然而，在本發(fā)明的工序(I)中，與預(yù)想相反地，來源于絲狀菌的纖維素酶的20kDa~IOOkDa的范圍的一部分酶成分可以通過截留分子量100，000~200, 000的第I超濾膜而從非透過液側(cè)回收。如果第I超濾膜的截留分子量超過200，000,則作為非透過液被回收的酶成分量減少，因而不優(yōu)選，如果截留分子量小于100，000,則被超濾膜回收的酶成分量過度增大，因而不優(yōu)選。此外，第I超濾膜的優(yōu)選截留分子量為100，000 ~150，000。[0061]然后，在工序(2)中將工序(I)的透過液用截留分子量5，000~50，000的超濾膜進(jìn)行過濾，從而回收在工序(I)中沒有完全被回收的來源于絲狀菌的纖維素酶的酶成分。如果第2超濾膜的截留分子量小于5，000，則不僅膜的通量降低，而且回收的酶量.活性沒有較大變化，因而不優(yōu)選，如果截留分子量超過50，000，則由于工序(I)的透過液所含的來源于絲狀菌的纖維素酶成分被過濾到透過液側(cè)，因而回收的酶量.活性減少，因而不優(yōu)選。此外，第2超濾膜的優(yōu)選截留分子量為10，000~30，000。
[0062]超濾膜(高分子膜)的分離特性由被稱為功能層的致密層的細(xì)孔徑?jīng)Q定。作為工序(I)和工序(2)中使用的超濾膜的功能層的原材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚-1，1-二氟乙烯(PVDF)、再生纖維素、纖維素、纖維素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烴、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、和聚四氟乙烯等原材料，但由于再生纖維素、纖維素和纖維素酯受到來源于木霉屬菌的纖維素酶的分解，因而優(yōu)選使用以PES、PVDF等合成高分子化合物作為功能層的原材料的超濾膜。
[0063]通過超濾膜進(jìn)行過濾時(shí)的pH值條件，優(yōu)選在本發(fā)明的工序(I)中將來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液調(diào)整為pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4。此外，在本發(fā)明中，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液已經(jīng)處于pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4的范圍時(shí)，看作調(diào)整至了該范圍。作為工序(I)中調(diào)整PH值而通過超濾膜進(jìn)行過濾的效果，具有可以增大能夠作為非透過液回收的濃縮酶液所含的酶成分量這樣的效果。
[0064]此外，由于pH值條件而酶或者蛋白質(zhì)的超濾膜的透過性變化是公知的，可以說由于溶解于水溶液中的酶或者蛋白質(zhì)的表面帶電狀態(tài)變化而水溶液中的表觀分子量變化是其重要原因。然而，這樣的表觀分子量變化的條件和程度由于各酶成分所特有的氨基酸序列和立體結(jié)構(gòu)、以及在溶解于水溶液中的各酶之間發(fā)生的相互作用等各種重要原因而變化也是公知的。在來源于絲狀菌的纖維素酶的情況下，由于各酶成分在各pH值條件下的表觀上的分子量的變化、或者溶解了多種來源于絲狀菌的纖維素酶的各酶成分的水溶液中的各個(gè)酶成分的會(huì)合狀態(tài)不明，因而關(guān)于由PH值變化造成的來源于絲狀菌的纖維素酶的各酶成分的超濾膜的透過性的變化當(dāng)然也不明。
[0065]工序⑴和工序⑵中通過超濾膜進(jìn)行過濾時(shí)的溫度條件，只要是酶不失活或者凝集的溫度范圍就不限定，優(yōu)選15~35°C的范圍。特別是如果溫度超過35°C，則有時(shí)作為絲狀菌纖維素酶的酶成分的一部分的分子量小于40kDa的酶成分的、具有木聚糖酶或者內(nèi)切葡聚糖酶的任一酶活性的成分凝集。
[0066]工序(I)的利用超濾膜的過濾速度只要是能夠?qū)⒚缸钃踉诜峭高^液側(cè)的范圍，就不特別限定，優(yōu)選為0.5~Sm/天。如果小于0.5m/天，則成為降低來源于絲狀菌的纖維素酶的阻擋率的重要原因。另一方面，如果過濾速度超過Sm/天，則有時(shí)引起超濾膜的膜間壓差的顯著增加和膜的急劇結(jié)垢。
[0067]另一方面，工序(2)中使用的超濾膜由于對(duì)應(yīng)于來源于絲狀菌的纖維素酶的分子量，因而由于過濾速度而對(duì)來源于絲狀菌的纖維素酶的阻擋率的影響少，只要考慮膜的結(jié)垢而確定過濾速度即可，優(yōu)選為0.1~4m/天。
[0068]此外，過濾速度(m/天)，可以通過對(duì)具有某特定的膜面積(m2)的超濾膜，將作為過濾對(duì)象的來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液進(jìn)行過濾，測(cè)定所得的通量(m3/小時(shí))，通過下式(式I)算出。
[0069]過濾速度( m/天)=通量(m3/小時(shí))X 24+膜面積(m2)..?(式I)。
[0070]在工序(I)和工序(2)中，作為超濾膜的非透過液得到的濃縮酶液的濃度優(yōu)選為I~100g/L的范圍。如果濃度超過100g/L，則非透過側(cè)的膜分離.濃縮酶液的粘度升高，有時(shí)引起過濾速度的急劇降低。另一方面，如果濃度小于lg/L，則作為膜分離?濃縮酶液過于稀薄，從濃縮酶液的使用上的原因考慮，不能說是充分的濃度。
[0071]工序(I)和工序2中使用的超濾膜，可以使用平膜型、螺旋型、管狀型和中空絲型等適宜方式的超濾膜。
[0072]特別是工序(I)中使用的來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液也可能包含固體物質(zhì)等，因而優(yōu)選對(duì)膜結(jié)垢耐性強(qiáng)的分離膜。即，優(yōu)選外壓式中空絲超濾膜。中空絲膜是指內(nèi)部形成空洞、在其內(nèi)側(cè)或者外側(cè)具有功能層的分離膜。特別在本發(fā)明中，優(yōu)選能夠從中空絲膜的外側(cè)使過濾原水透過，在中空絲膜的內(nèi)側(cè)得到濾液的外壓式中空絲膜。外壓式中空絲膜與內(nèi)壓式相比，具有對(duì)固體物質(zhì)造成的膜結(jié)垢的耐性強(qiáng)，另外，清洗也容易這樣的特征。
[0073]另一方面，工序(2)中使用的超濾膜也可以是任一方式。特別優(yōu)選每單位體積具有高的膜面積的螺旋型。在本發(fā)明中，由于將工序(I)所得的透過液在工序(2)中使用，因而還具有工序(2)的過濾速度提高、另外能夠抑制膜結(jié)垢這樣的效果。
[0074]具體地，可列舉DESAL社的G-5型、G-1O型、G-20型、G-50型、PW型和HWS UF型、KOCH 社的 HFM-180、HFM-183、HFM-251、HFM-300、HFM-116, HFM-183、HFM-300、HFK-131、HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P 和 MPS-U20S、Synder 社的 SPEl、SPE3、SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、SPV50和S0W30、旭化成株式會(huì)社制的“V ^，口一開'”(注冊(cè)商標(biāo))UF系列、日東電工株式會(huì)社制的NTR7410、和NTR7450等。
[0075]工序⑴和工序⑵的超濾可以是死端過濾(正向過濾)或者錯(cuò)流過濾(切向流過濾)的任一種。死端過濾(正向過濾)是相對(duì)于超濾膜的膜面垂直地施加壓力，從非透過側(cè)向透過側(cè)過濾的方法。另一方面，錯(cuò)流過濾(切向流過濾)是通過泵或者氣泡等產(chǎn)生相對(duì)于作為過濾方向的膜面平行的流(錯(cuò)流或者切向流)，一邊除去在超濾膜表面形成的堆積槽一邊過濾的方法。通過該錯(cuò)流(或者切向流)，可以抑制超濾膜的膜結(jié)垢。特別是在工序(I)中使用外壓式中空絲時(shí)，優(yōu)選死端過濾。另外在工序(I)和工序(2)中使用螺旋型、平膜型時(shí)，優(yōu)選錯(cuò)流過濾。
[0076]當(dāng)工序(I)中使用的超濾膜是外壓式中空絲超濾膜時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行使透過液間歇地從透過側(cè)通液到非透過側(cè)的逆洗操作。通過該逆洗操作可以使在超濾膜的膜表面堆積的固體物質(zhì)或者酶等的堆積物剝離。即，通過本操作，可以抑制超濾膜在過濾時(shí)堵塞，從而可以長時(shí)間穩(wěn)定地實(shí)施過濾處理。本操作在通過超濾膜進(jìn)行過濾時(shí)或者過濾結(jié)束時(shí)等進(jìn)行即可。作為進(jìn)行本操作的時(shí)間選擇，可以在超濾膜的過濾壓差增大是進(jìn)行，或者與壓差無關(guān)地以一定間隔進(jìn)行等，優(yōu)選后者。
[0077]工序(I)或者工序(2)的作為超濾膜的非透過液得到的濃縮酶液，優(yōu)選通過曝氣和/或溶液循環(huán)而以膜面線速度I~200cm/秒的范圍發(fā)生錯(cuò)流，從而回收濃縮酶液。另外此時(shí)，還可以在使前述的逆洗操作連續(xù)或者間歇地進(jìn)行的同時(shí)，使前述錯(cuò)流發(fā)生，從而得到濃縮酶液。
[0078]本發(fā)明所得的纖維素酶可以利用其保有的催化活性，而在食品用途、洗劑、清洗劑、環(huán)境凈化劑、肥料用途、飼料用途、化妝品用途、藥物用途等中使用。[0079]本發(fā)明所得的纖維素酶可以廣泛地在含纖維素的生物質(zhì)的水解中使用。含纖維素的生物質(zhì)是至少包含纖維素或半纖維素的物質(zhì)。具體是甘蔗渣、玉米秸、玉米棒、柳枝稷、稻秸、麥秸、樹木、木材、廢建材、報(bào)紙、舊紙、和紙漿等。這些含纖維素的生物質(zhì)包含高分子芳香族化合物木質(zhì)素和/或半纖維素等雜質(zhì)，但可以作為前處理使用酸、堿和加壓熱水等將木質(zhì)素和/或半纖維素部分分解，將所得的含纖維素的生物質(zhì)作為纖維素利用。水解的條件設(shè)定為來源于絲狀菌的纖維素酶的最適反應(yīng)條件即可，優(yōu)選處理溫度40~60°C、處理pH值3~7、和含纖維素的生物質(zhì)固體成分濃度0.1~30%。通過設(shè)定為上述的最適反應(yīng)條件范圍，可以最大限度地發(fā)揮生物質(zhì)水解效率。該水解處理可以以分批式進(jìn)行，也可以以連續(xù)式進(jìn)行。通過這樣的酶處理得到的水解物包含葡萄糖、木糖等單糖成分，因而可以作為乙醇、乳酸等的發(fā)酵原料糖使用。
[0080]使用本發(fā)明所得的纖維素酶時(shí)，還可以加入氧化酶、還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶等具有其他功能的酶成分支持酶劑。特別是作為這樣的具有其他功能的酶成分，可以添加來源于不限于絲狀菌的所有生物的酶成分、通過基因重組而生產(chǎn)的酶成分而使用。
[0081]關(guān)于用于實(shí)施本發(fā)明的裝置，作為其實(shí)施方式使用圖4和圖5進(jìn)行說明。圖4和圖5是顯示實(shí)施本發(fā)明的裝置的一例的剖面圖。
[0082]在圖4的裝置中，涉及使用螺旋元件型的截留分子量100，000~200，000的超濾
膜的裝置。來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液保持在纖維素酶水溶液罐I中。為了在本罐I內(nèi)進(jìn)行PH值調(diào)整，而在罐內(nèi)設(shè)置pH值傳感器2，檢出的pH值信號(hào)被送達(dá)pH值調(diào)整泵3。pH值調(diào)整泵3與包含酸或堿的pH值調(diào)整劑罐4連接，將pH值調(diào)整劑送液至纖維素酶水溶液罐I。纖維素酶水溶液罐I介由超濾膜泵6而與截留分子量100，000~200，000的超濾膜8連接。
[0083]在圖4的裝置中，截留分子量100，000~200，000的超濾膜8連接成樹狀結(jié)構(gòu)，但不特別限定。另外，截留分子量100，000~200，000的超濾膜8的透過液與透過液保持罐10連接。截留分子量100，000~200，000的超濾膜8的非透過液作為第I濃縮酶液而被回收。作為非透過液的濃縮酶液只要能夠獲得必要充分的分離.濃縮，則可以直接作為第I濃縮酶液回收，也可以為了獲得更充分濃縮倍率而連接至纖維素酶水溶液罐I使其循環(huán)。[0084]關(guān)于截留分子量100，000~200，000的超濾膜的透過液，進(jìn)一步用平均截留分子量5，000~50，000的第2超濾膜進(jìn)行分離.濃縮。透過液保持罐10介由閥11和超濾膜泵12與截留分子量5，000~50，000的超濾膜13連接。截留分子量5，000~50，000的超濾膜13可以如圖4所示連接成樹狀結(jié)構(gòu)。截留分子量5，000~50，000的超濾膜13的非透過液作為濃縮酶液被回收。濃縮酶液被回收至第2濃縮酶液保持罐14，透過液被回收至第2透過液保持罐15。
[0085]圖5的裝置是作為截留分子量100，000~200，000的超濾膜8使用外壓式中空絲超濾膜時(shí)的實(shí)施方式。使用外壓式中空絲超濾膜時(shí)，具備產(chǎn)生用于清洗中空絲膜表面的氣泡的壓縮機(jī)7和用于使用截留分子量100，000~200，000的超濾膜8的透過液進(jìn)行膜的逆清洗的逆洗泵9。此外與圖4的裝置相同。
[0086]實(shí)施例
[0087]以下列舉實(shí)施例具體說明本發(fā)明。但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0088](參考例I)木霉屬菌的培養(yǎng)液的調(diào)制方法
[0089]木霉屬菌的培養(yǎng)液通過以下的方法調(diào)制。
[0090][前培養(yǎng)]
[0091]以玉米浸潰液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、酒石酸銨0.37% (w/vol)、硫酸銨0.14(w/vol)、磷酸二氫鉀0.2% (w/vol)、氯化鈣二水合物0.03% (w/vol)、硫酸鎂七水合物 0.03% (w/vol)、氯化鋅 0.02% (w/vol)、氯化鐵(III)六水合物 0.01% (w/vol)、硫酸銅(II)五水合物0.004 % (w/vol)、氯化錳四水合物0.0008% (w/vol)、硼酸0.0006 %(w/vol)、和七鑰酸六銨四水合物0.0026% (w/vol)的方式添加至蒸懼水中，將IOOmL加入500mL帶擋板的三角燒瓶中，在121 °C的溫度下高壓釜滅菌15分鐘。放冷后，添加與其分別在121 °C的溫度下高壓釜滅菌15分鐘的PE-M和Tween80各0.01% (w/vol)。在該前培養(yǎng)培養(yǎng)基中接菌里氏木霉ATCC66589使其為I X IO5個(gè)/mL，以28°C的溫度、72小時(shí)、180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，作為前培養(yǎng)(振蕩裝置=TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。
[0092][主培養(yǎng)]
[0093]以玉米浸潰液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、纖維素(艾維素)10% (w/vol)、酒石酸銨0.37% (w/vol)、硫酸銨0.14% (w/vol)、磷酸二氫鉀0.2% (w/vol)、氯化鈣二水合物0.03% (w/vol)、硫酸鎂七水合物0.03% (w/vol)、氯化鋅0.02% (w/vol)、氯化鐵
(III)六水合物0.01% (w/vol)、硫酸銅(II)五水合物0.004% (w/vol)、氯化猛四水合物0.0008% (w/vol)、硼酸 0.0006% (w/vol)、和七鑰酸六銨四水合物 0.0026% (w/vol)的方式添加至蒸餾水中，將2.5L加入5L容量的攪拌廣口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121°C的溫度下高壓釜滅菌15分鐘。放冷后，添加與其分別在121°C的溫度下高壓釜滅菌15分鐘的PE-M和TWeen80各0.1 %，接種250mL預(yù)先通過上述的方法在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行了前培養(yǎng)的里氏木霉ATCC66589。然后，在28°C的溫度、87小時(shí)、300轉(zhuǎn)/分鐘、通氣量Ivvm的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，離心分離后，將上清進(jìn)行膜過濾($ ') 社制的f 'J力y 7°”_GV、材質(zhì):PVDF)。將該前述條件下調(diào)整的培養(yǎng)液作為來源于木霉屬菌的纖維素酶水溶液，在以下的實(shí)施例中使用。
[0094](參考例2)糖濃度的測(cè)定
[0095]糖液所含的葡萄糖和木糖濃度，在下述所示的HPLC條件下通過與標(biāo)準(zhǔn)品的比較來定量。
[0096]柱:LunaNH2 (Phenomenex 社制)
[0097]移動(dòng)相乙腈=25:75(流速0.6mL/分鐘)
[0098]反應(yīng)液:無
[0099]檢出方法:RI (差示折射率)
[0100]溫度:30°C。
[0101](參考例3)纖維素酶的活性測(cè)定方法
[0102]纖維素酶活性分為(I)艾維素(Avicel)分解活性、(2)纖維二糖分解活性和(3)木聚糖分解活性的3種分解活性，通過以下步驟對(duì)活性進(jìn)行測(cè)定評(píng)價(jià)。
[0103](I)艾維素(Avicel)分解活性
[0104]相對(duì)于酶液(在規(guī)定條件下調(diào)制)，添加艾維素(Avicel) ^ 社制)lg/L和乙酸鈉緩沖液(pH值5.0) IOOmM,在50°C的溫度下一邊旋轉(zhuǎn)混合24小時(shí)一邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，將管離心分離，測(cè)定其上清成分的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度依照參考例2所記載的方法測(cè)定。艾維素(Avic el)分解活性將生成的葡萄糖濃度(g/L)直接作為活性值。
[0105](2)纖維二糖分解活性
[0106]相對(duì)于酶液添加纖維二糖(和光純藥)500mg/L和乙酸鈉緩沖液(pH值5.0) IOOmM,在50°C的溫度下一邊旋轉(zhuǎn)混合0.5小時(shí)一邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，將管離心分離，測(cè)定其上清成分的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度依照參考例2所記載的方法測(cè)定。纖維二糖分解活性將生成的葡萄糖濃度(g/L)直接作為活性值。
[0107](3)木聚糖分解活性
[0108]相對(duì)于酶液,添加木聚糖(Birch wood xylan、和光純藥)10g/L和乙酸鈉緩沖液(pH值5.0) IOOmM,在50°C—邊旋轉(zhuǎn)混合4小時(shí)一邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，將管離心分離，測(cè)定其上清成分的木糖濃度。木糖濃度依照參考例2所記載的方法測(cè)定。木糖分解活性將生成的木糖濃度(g/L)直接作為活性值。
[0109](參考例4)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定
[0110]蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定使用Pierce BCA Protein Assay Kit,依照該Kit的規(guī)程進(jìn)行。將白蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Albumin standard) (2mg/mL)進(jìn)行連續(xù)稀釋并同樣地測(cè)定而制作蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過將標(biāo)準(zhǔn)曲線與目的樣品進(jìn)行比色來定量。
[0111](參考例5)利用截留分子量100，000的超濾膜的來源于木霉屬菌的纖維素酶水溶液的膜分尚.濃縮
[0112]將上述參考例I所調(diào)制的來源于木霉屬菌的纖維素酶稀釋至3.5g/L，對(duì)其使用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)制pH值2、pH值3、pH值4、pH值5、pH值6、pH值7、pH值8、pH值9、pH值10、pH值11、和pH值12 (pH值2~12)的水溶液。pH值調(diào)整后，再測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果為3.5g/L左右，因而將這些pH值調(diào)整后的纖維素酶水溶液的蛋白質(zhì)濃度視為3.5g/L，實(shí)施以下評(píng)價(jià)。
[0113]將所述pH值調(diào)整后的來源于木霉屬菌的纖維素酶水溶液(pH值2~12)各20mL，使用截留分子量 100，000 的超濾膜(Sartorius 社制 “VIVASPIN” 20、100，000MWC0、PES、有效膜面積6cm2)，通過死端過濾進(jìn)行濃縮直至非透過液的液量為0.5mL (溫度25°C、離心力6000g)。為了測(cè)定濃縮液的蛋白質(zhì)的量和纖維素酶活性，一邊測(cè)定回收的濃縮液的質(zhì)量，一邊加RO水并定容至作為初始質(zhì)量的20g(20mL)。將此作為非透過液，在以下分析中使用。另外關(guān)于透過液，不將超濾膜的透過液進(jìn)行特別的稀釋等處理，直接作為透過液進(jìn)行以下分析。
[0114]非透過液和透過液的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定通過上述參考例4記載的方法進(jìn)行。另外，對(duì)于前述的非透過液和透過液，使用Bioanalyzer (Agilent社、Protein230kit)進(jìn)行電泳。將所得的電泳結(jié)果示于圖2。在圖2中,在pH值2~10的任一 pH值下,均能確認(rèn)由來源于木霉屬菌的纖維素酶纖維二糖水解酶產(chǎn)生的帶，但判明了依賴于木霉屬纖維素酶水溶液的PH值而各帶有濃淡。特別是判明了在pH值3、pH值4和pH值5下，纖維二糖水解酶(CBH)的帶濃度濃(圖2)，在超過pH值6的情況或者pH值2的情況下，各個(gè)纖維二糖水解酶的帶濃度傾向于變薄。另外可以確認(rèn)該結(jié)果與用Bioanalyzer算出的纖維二糖水解酶濃度相比傾向完全一致。結(jié)果示于表1。
[0115]表1
【權(quán)利要求】
1.纖維素酶的制造方法，包括以下的工序(I)~(3)， 工序(I):使來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液通過截留分子量100，000~200，000的超濾膜進(jìn)行過濾，得到透過液，同時(shí)作為非透過液得到濃縮酶液， 工序(2):使工序(1)所得的透過液進(jìn)一步通過截留分子量5，000~50，000的第2超濾膜進(jìn)行過濾，作為非透過液得到第2濃縮酶液， 工序⑶:將工序⑴和⑵所得的濃縮酶液混合，得到來源于絲狀菌的纖維素酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶的制造方法，絲狀菌是木霉屬菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的纖維素酶的制造方法，在工序(I)中，將來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液調(diào)整為pH值2.6~5.4或pH值8.6~9.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的纖維素酶的制造方法，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液是絲狀菌培養(yǎng)液或使用了來源于絲狀菌的纖維素酶的含纖維素的生物質(zhì)的水解物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)所述的纖維素酶的制造方法，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液包含選自纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶中的I種以上酶成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的纖維素酶的制造方法，來源于絲狀菌的纖維素酶水溶液的溫度為15~35°C的溫度范圍。
7.纖維素酶的制造裝置,該裝置包含:纖維素酶水溶液罐、與該纖維素酶水溶液罐連接的超濾膜泵、至少1個(gè)以上串聯(lián)或并聯(lián)地連接的截留分子量100，000~200，000的超濾膜、所述超濾膜的透過液保持罐、截留分子量5，000~50，000的第2超濾膜、和第2濃縮酶液保持te。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的纖維素酶的制造裝置，纖維素酶水溶液罐具備pH值傳感器，進(jìn)而該纖維素酶水溶液罐連接有pH值調(diào)整劑罐。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103958678SQ201280057111
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月21日
【發(fā)明者】栗原宏征, 山田勝成 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社