用于酶促合成羅漢果苷化合物的方法和材料的制作方法
【專利摘要】描述了用于酶促合成羅漢果苷化合物的方法和材料。
【專利說明】用于酶促合成羅漢果苷化合物的方法和材料
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2011年11月23日提交的美國序列號61/563，303的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用以其整體并入。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及酶促合成羅漢果苷(mogroside)化合物的方法和材料，并且更具體地涉及使用尿苷-5’-二磷酸(Uridine-5’-diphospho，UDP)依賴的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)糖基化羅漢果醇(mogrol)以生產(chǎn)各種羅漢果苷化合物。
【背景技術(shù)】
[0004]羅漢果苷是從羅漢果(Siraitia grosvenorii (Swingle)),也稱作羅漢果(Momordica grosvenori (Swingle))的果實(shí)分離的一類三職糖苷。所述果實(shí)的提取物商業(yè)上用作天然的增甜劑。已經(jīng)從羅漢果的果實(shí)鑒別出四種主要的化合物(羅漢果苷V、羅漢果苷IV、賽門苷I (Siamenoside I)和11_氧代羅漢果苷V)，其負(fù)責(zé)這些水果的甜味。參見圖1。羅漢果苷V是這四種化合物中最豐富的，占干果實(shí)的大約0.57% (重量/重量)，隨后是羅漢果苷IV和賽門苷I，各自含有四個(gè)葡萄糖部分(moiety)。11_氧代羅漢果苷V在C-11位具有酮基而不是羥基。參見例如Takemoto等,Yakugaku Zasshi, 103，1151-1154 ;1155-1166 ;1167-1173，(1983) ；Kasai 等，Agric.Biol.Chem.53，3347-3349 (1989)；Matsumoto, Chem.Pharm.Bull.38,2030-2032(1990)；和 Prakash,等，J.CarbohydrateChem.30,16-26(2011)。
[0005]所有的羅漢果苷共享相同的三萜核心，稱羅漢果醇。用不同數(shù)目的葡萄糖部分糖基化糖苷配基羅漢果醇以形成各種羅漢果苷化合物。羅漢果苷被認(rèn)為通過以下方式合成:從常見的三職前體角S烯合成葫蘆二烯醇(cucurbitadienol) ;P450氧化葫蘆二烯醇以產(chǎn)生糖苷配基羅漢果醇；以及使羅漢果醇糖基化以依次添加5個(gè)葡糖糖從而產(chǎn)生羅漢果苷V。參見Tang等，BMC Genomics，12，343 (2011)。中間體葫蘆二烯醇和羅漢果醇二者都存在于果實(shí)中，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)作為次要產(chǎn)物被分離。參見Ukiya等，J.Agric.Food Chem.50,6710-6715(2002)。糖苷中間體存在于11_羥基和11_氧代系列二者中，并且由于果實(shí)成熟逐漸從羅漢果苷I變成羅漢果苷V，這表明三萜核心在隨后的糖基化之前被P450酶完全氧化。然而，仍未鑒別到負(fù)責(zé)產(chǎn)生羅漢果苷的酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]在一個(gè)方面，本文特載(feature) 了生產(chǎn)羅漢果苷化合物的方法。所述方法包括將羅漢果醇與尿苷-5’ -磷酸(UDP)依賴的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)孵育以生產(chǎn)羅漢果苷化合物(例如，羅漢果苷la、漢果苷Ib或在C25-OH糖基化的羅漢果苷化合物)。所述UGT可選自73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。該UGT可重組生產(chǎn)或可處于重組體宿主的細(xì)胞裂解物中。[0007]本文還特載了生產(chǎn)羅漢果苷化合物的方法。所述方法包括將羅漢果醇與從表達(dá)UGT的重組體宿主制備的細(xì)胞裂解物接觸以生產(chǎn)羅漢果苷化合物(例如，羅漢果苷la、羅漢果苷Ib或在C25-OH糖基化的羅漢果苷化合物)。所述UGT可選自73C3、73C6、85C2、73C5和 73E1。
[0008]除非另有定義，否則本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬之領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。雖然以下描述了合適的方法和材料，但類似或等同于本文所述的那些方法和材料可用于實(shí)施本發(fā)明。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)均通過引用以其整體并入。在存在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅用于舉例說明的目的并且不旨在成為限制。本發(fā)明的其他特性和益處將從以下的詳細(xì)描述而明顯。根據(jù)專利法中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐， 申請人:保留
使用過渡性短語“包含”、“基本由......組成”或“由......組成”替代地保護(hù)任意公開
發(fā)明的權(quán)利。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1含有羅漢果苷V、羅漢果苷IV、賽門苷I和11-氧代羅漢果苷V的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0010]圖2是使用UGT從羅漢果醇生物合成羅漢果苷Ia和羅漢果苷Ib的描述。
[0011]圖3 含有以下 UGT 的氨基酸序列:UGT73C3、UGT73C5、UGT73C6、UGT73E1 和UGT85C2(分別為 SEQ I D NO:1_5)。
[0012]圖4是用果膠酶和/或纖維素酶孵育后從羅漢果苷V獲得的產(chǎn)物的示意圖。
[0013]發(fā)明詳述
[0014]本文提供了使用一種或更多種尿苷-5’-二磷酸(UDP)依賴的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)糖基化羅漢果醇的方法和材料。如下指出的，至少已經(jīng)鑒別了 5種使糖苷配基羅漢果醇糖基化的UGT。參見圖2。本文所鑒別的各個(gè)UGT都在糖基轉(zhuǎn)移酶家族I中。UGT73C3、73C6、85C2和73E1在C24-OH位點(diǎn)糖基化(圖2中UGT#2)，而UGT73C5在C3-OH位(圖2中UGT#1)和 C24-OH位(UGT#2) 二者糖基化。UGT73C3、73C5 和 73C6 來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)。UGT73E1 和 85C2 來自甜葉菊(Stevia rebaudiana)。UGT73C3、73C5、73C6、73E1和85C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1_5)在圖3中示出。
[0015]可使用任何合適的方法生產(chǎn)本文所述的UGT多肽。例如，可通過化學(xué)合成生產(chǎn)UGT多肽?；蛘?，可通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)使用編碼UGT多肽的異源表達(dá)載體生產(chǎn)本文所述的UGT多肽。表達(dá)載體可被引入宿主細(xì)胞(例如通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)以表達(dá)所編碼多肽，其然后可被純化?？捎糜谛∫?guī)?；虼笠?guī)模生產(chǎn)UGT多肽的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于用含有本文所述核酸分子的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或黏粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，例如細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis))。有用的表達(dá)系統(tǒng)還包括用含有本文所述核酸分子的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，以及用含有本文所述核酸分子的重組病毒表達(dá)載體(例如煙草花葉病毒)感染的或用含有本文所述核酸分子的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)。還可使用持有重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)UGT多肽，所述重組表達(dá)構(gòu)建體含有源自哺乳動物細(xì)胞基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子和巨細(xì)胞病毒啟動子)以及本文所述的核酸。UGT多肽可以具有如下討論的N末端或C末立而標(biāo)簽。
[0016] 本文還提供了編碼UGT多肽的分離核酸?！胺蛛x核酸”指與存在于基因組中的其他核酸分子分離開的核酸，所述其他核酸分子包括通常側(cè)面連接(flank)基因組中所述核酸之一側(cè)或兩側(cè)的核酸。本文所用的關(guān)于核酸的術(shù)語“分離的”還包括任何非天然存在的核酸序列，因?yàn)檫@樣的非天然存在的序列未在自然界中發(fā)現(xiàn)并且不具有在天然存在的基因組中的直接鄰近序列(immediately contiguous sequences)。
[0017]分離的核酸可為例如DNA分子，條件是在天然存在的基因組中在該DNA分子直接側(cè)翼通常發(fā)現(xiàn)的核酸序列之一被移除或不存在。因此，經(jīng)分離的核酸包括但不限于作為獨(dú)立于其他序列的分離分子存在的DNA分子(例如化學(xué)合成的核酸或者通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理生產(chǎn)的cDNA或基因組DNA片段)，以及并入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(例如任何副粘病毒屬、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或皰疹病毒)或并入原核生物或真核生物之基因組DNA的DNA。此外，經(jīng)分離的核酸可包括改造的核酸，例如作為雜交或融合核酸之部分的DNA分子。存在于幾百至幾百萬個(gè)另外的核酸分子(例如cDNA文庫或基因組文庫或者含有基因組DNA限制性消化的凝膠切片)內(nèi)的核酸不被認(rèn)為是經(jīng)分離的核酸。
[0018]在一些實(shí)施方案中，編碼UGT多肽的核酸序列可包括標(biāo)簽序列，其編碼設(shè)計(jì)為利于隨后操作(例如利于純化或檢測)、分泌或定位所編碼之多肽的“標(biāo)簽”。標(biāo)簽序列可插入到編碼UGT多肽的核酸序列中使得所編碼的標(biāo)簽位于UGT多肽的羧基末端或氨基末端。編碼標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、HIS標(biāo)簽和Flag?標(biāo)簽(Kodak, New Haven, CT)。標(biāo)簽的另外實(shí)例包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、造粉體肽、信號肽或分泌標(biāo)簽。
[0019]功能同源物
[0020]上述多肽的功能同源物也適合用于本文所述的方法和重組體宿主。功能同源物是具有類似于參考多肽之序列的多肽，并且其具有參考多肽的一種或更多種生物化學(xué)或生理學(xué)功能。功能同源物和參考多肽可以為天然存在的多肽，并且序列相似性可以歸因于趨同或趨異進(jìn)化事件。因此，功能同源物有時(shí)在文獻(xiàn)中被稱為同源物(homolog)或直系同源物(ortholog)或旁系同源物(paralog)。天然存在的功能同源物的變體,例如由野生型編碼序列之突變體編碼的多肽，它們自身可以是功能同源物。功能同源物還可經(jīng)所述多肽之編碼序列的位點(diǎn)定向誘變或者通過組合來自不同的天然存在多肽之編碼序列的結(jié)構(gòu)域(“結(jié)構(gòu)域交換(domain swapping)”)創(chuàng)造。用于修飾編碼本文所述功能UGT多肽之基因的技術(shù)是已知的并且尤其包括定向進(jìn)化技術(shù)、位點(diǎn)定向誘變技術(shù)和隨機(jī)誘變技術(shù)，并且可用于以期望的方式增加多肽之比活性、改變底物特異性、改變表達(dá)水平、改變亞細(xì)胞定位或修飾多肽:多肽相互作用。這樣的經(jīng)修飾多肽被認(rèn)為是功能同源物。術(shù)語“功能同源物”有時(shí)應(yīng)用于編碼功能性同源多肽的核酸。
[0021]功能同源物可以通過核苷酸和多肽序列比對的分析來鑒定。例如，在核苷酸或多肽序列的數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行查詢可鑒別UGT多肽的同源物。序列分析可包括使用UGT氨基酸序列作為參考序列的非冗余數(shù)據(jù)庫的BLAST、交互BLAST或PS1-BLAST分析。在一些情況下，氨基酸序列是從核苷酸序列推斷的。數(shù)據(jù)庫中具有大于40%序列同一性的那些多肽是候選物(candidate)，用于進(jìn)一步評估作為UGT多肽的適用性。氨基酸序列相似性允許保守的氨基酸替換，例如一個(gè)疏水殘基替換為另一個(gè)或一個(gè)極性殘基替換為另一個(gè)。如果需要，可以進(jìn)行這些候選物的手動檢查以縮小需進(jìn)一步評估的候選物的數(shù)目。可通過選擇那些表現(xiàn)出具有存在于UGT多肽之結(jié)構(gòu)域(例如保守的功能結(jié)構(gòu)域)的候選物進(jìn)行手動檢查。
[0022]可通過在多肽的一級氨基酸序列中進(jìn)行區(qū)域定位來鑒別保守區(qū)，所述區(qū)域是重復(fù)序列，形成一些二級結(jié)構(gòu)(例如螺旋或β折疊)，建立帶正電荷或負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)域，或者代表蛋白質(zhì)模體或結(jié)構(gòu)域。參見例如Pfam網(wǎng)站在萬維網(wǎng)(World Wide Web)上(sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janeIia.0rg/)描述的多種蛋白質(zhì)模體和結(jié)構(gòu)域的一致序列。Pfam 數(shù)據(jù)庫包括的信息描述于 Sonnhammer 等,Nucl.Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer 等，Proteins, 28:405-420 (1997)；和 Bateman 等，Nucl.Acids Res.,27:260-262(1999)。還可通過比對來自近親物種的相同或相關(guān)多肽的序列確定保守區(qū)。近親的物種優(yōu)選來自相同的科。在一些實(shí)施方案中，來自兩個(gè)不同物種之序列的比對是足夠的。
[0023]通常，表現(xiàn)出至少約40%氨基酸序列同一性的多肽可用于鑒別保守區(qū)。相關(guān)多肽的保守區(qū)表現(xiàn)出至少45%氨基酸序列同一性(例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%氨基酸序列同一性)。在一些實(shí)施方案中，保守區(qū)表現(xiàn)出至少92%、94%、96%、98%或99%氨基酸序列同一性。序列同一性可如以上所示確定。
[0024]生產(chǎn)羅漢果苷化合物的方法
[0025]可通過將羅漢果醇底物與本文所述的一種或更多種UGT多肽孵育來生產(chǎn)羅漢果苷化合物，從而導(dǎo)致羅漢果苷產(chǎn)物的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物含有多種UGT多肽使得在反應(yīng)容器中發(fā)生多種糖基化。在另一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物含有單一 UGT多肽并且發(fā)生由所述多肽催化的一種或更多種糖基化。例如，第一反應(yīng)容器可包含底物和一種或更多種UGT多肽用于產(chǎn)生中間體，其可被引入含有一種或更多種另外的UGT多肽的第二反應(yīng)容器以產(chǎn)生隨后的中間體或羅漢果苷產(chǎn)物。然后可回收在第二反應(yīng)容器中產(chǎn)生的產(chǎn)物。
[0026]各個(gè)UGT多肽可為經(jīng)純化的多肽，例如可作為含有按重量計(jì)80%、90%、95%或大于99%期望UGT的溶液添加至反應(yīng)混合物?；蛘?，UGT多肽可存在于從表達(dá)UGT之重組體宿主制備的細(xì)胞裂解物中，并且可作為用于細(xì)胞裂解物添加至反應(yīng)混合物與羅漢果醇底物孵育。
[0027]可通過從反應(yīng)容器提取樣品用于根據(jù)已經(jīng)公開之方法的分析來確定產(chǎn)物、底物和中間體的水平。
[0028]可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)從反應(yīng)容器回收羅漢果苷化合物。
[0029]本發(fā)明還將在以下實(shí)施例中描述，其不限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明之范圍。
實(shí)施例
[0030]實(shí)施例1-羅漢果苷V的純化
[0031]按照以下方式從市售羅漢果(monk fruit)提取物(PureLo來，Swanson)純化羅漢果苷V。將3瓶PureLo? (240克)溶解在水(900mL)中，然后加載到HP-20樹脂的柱上(400克樹脂)。該柱用水(2.5升)洗滌，然后還用20%甲醇-水洗滌。產(chǎn)物用甲醇洗脫。在高真空下蒸發(fā)溶劑并干燥后，獲得羅漢果苷V(2.5克，約80%純度，11-氧代羅漢果苷V是主要雜質(zhì))。
[0032]實(shí)施例2-從羅漢果苷V酶促合成羅漢果醇[0033]將羅漢果苷V(300mg)溶解在0.1M乙酸鈉緩沖液(pH4.5，IOOmL)中，并添加來自黑曲霉(Aspergillus niger)的粗制果膠酶(25mL，SigmaP2736)。將混合物在50°C攪拌48小時(shí)。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(2X100ml)萃取。有機(jī)萃取物在真空下干燥然后用制備型HPLC純化。獲得了純羅漢果醇(40mg)并通過NMR和質(zhì)譜確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。參見圖4。
[0034]實(shí)施例3-從羅漢果苷V酶促合成羅漢果醇3-0-葡糖苷(羅漢果苷Ia)和羅漢果醇24-0-葡糖苷(羅漢果苷Ib)
[0035]將羅漢果苷V(300mg)溶解在0.1M乙酸鈉緩沖液(pH4.5，100ml)中，并添加來自黑曲霉(Aspergillus niger)的粗制果膠酶(25mL, Sigma P2736)。將混合物在50°C攪拌
6.5小時(shí)。將所述反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(2X 100ml)萃取。有機(jī)萃取物在真空下干燥然后用制備型HPLC純化。獲得了純羅漢果苷Ia(ll.0mg)和羅漢果苷Ib (8.0mg)。其結(jié)構(gòu)通過NMR和質(zhì)譜確認(rèn)。參見圖4。
[0036]實(shí)施例4-體外UGT篩選和反應(yīng)
[0037]進(jìn)行羅漢果醇與一組230種UGT酶的體外反應(yīng)并且用LC-MS分析產(chǎn)物。體外UGT反應(yīng)混合物包括4X Tris緩沖液、羅漢果醇(250 μ Μ) ,UDP-葡萄糖(750 μ Μ)和1%堿性磷酸酶。向反應(yīng)物添加5 μ I的各種經(jīng)部分純化的UGT酶或粗制酶提取物，并且用水將反應(yīng)體積補(bǔ)足50 μ I。將反應(yīng)在滅菌的96孔板中進(jìn)行并在30°C孵育過夜。孵育后，向各個(gè)反應(yīng)添加25 μ L的DMSO并且將反應(yīng)板離心5分鐘。從每個(gè)孔取出40 μ L樣品并過濾，并用于LC-MS分析。
[0038]發(fā)現(xiàn)UGT73C3、73C6和85C2將所有的羅漢果醇底物轉(zhuǎn)化成羅漢果苷lb。UGT73C5制造羅漢果苷Ia和Ib 二者。在與UGT73E1的反應(yīng)中，雖然該反應(yīng)未完全，但發(fā)現(xiàn)羅漢果苷Ib是主要產(chǎn)物，伴隨一種新的糖基化羅漢果醇(既不是羅漢果苷Ia也不是Ib ;準(zhǔn)確的質(zhì)量顯示為羅漢果苷I，推測由在C25-OH上的糖基化事件導(dǎo)致)。
[0039]其他實(shí)施方案
[0040] 應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)的描述進(jìn)行描述，但前述描述旨在舉例說明并不限制本發(fā)明的范圍，其由所附權(quán)利要求書的范圍限定。其他方面、益處和修飾在以下權(quán)利要求書之范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.生產(chǎn)羅漢果苷化合物的方法，所述方法包括將羅漢果醇與尿苷-5’- 二磷酸(UDP)依賴的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)孵育以生產(chǎn)羅漢果苷化合物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述羅漢果苷化合物是羅漢果苷la。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述羅漢果苷化合物是羅漢果苷lb。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述羅漢果苷化合物在C25-OH被糖基化。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述UGT選自:73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。
6.生產(chǎn)羅漢果苷 化合物的方法，所述方法包括將羅漢果醇與從表達(dá)UGT之重組體宿主制備的細(xì)胞裂解物接觸以生產(chǎn)羅漢果苷化合物。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述羅漢果苷化合物是羅漢果苷la。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述羅漢果苷化合物是羅漢果苷lb。
9.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述羅漢果苷化合物在C25-OH被糖基化。
10.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述UGT選自:73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。
【文檔編號】C12P33/00GK103958693SQ201280057518
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月23日
【發(fā)明者】劉耀權(quán), 李正燁, 莫妮卡·哈雷 申請人:埃沃爾瓦公司