用于擴(kuò)充細(xì)胞及改善嫁接的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文中提供了擴(kuò)充FC或干細(xì)胞的方法，還提供了篩選提高DOCK2表達(dá)或降低Arhgap18表達(dá)的化合物(其中任一種改善嫁接)的方法。
【專利說(shuō)明】用于擴(kuò)充細(xì)胞及改善嫁接的方法和組合物
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年9月23日提交的題目為METHODS AND COMPOSITIONS FOREXPANDING CELLS AND IMPROVING ENGRAFTMENT 的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào) 61/538，633 的優(yōu)先權(quán)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提及并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本公開(kāi)內(nèi)容一般涉及擴(kuò)充(expanding)促進(jìn)細(xì)胞(facilitating cell, FC)或干細(xì)胞的方法及改善嫁接(engraftment)的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]⑶8+/TCR-嫁接物促進(jìn)細(xì)胞(FC)增強(qiáng)造血干細(xì)胞(HSC)在MHC全異和同基因接受體兩者中的嫁接。FC是一種異質(zhì)細(xì)胞群體，主要的亞群類似于類漿細(xì)胞前體樹(shù)突細(xì)胞(p-preDC)。FC在體外增強(qiáng)HSC的集落生成，在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞，并且介導(dǎo)GVHD的預(yù)防。
[0006]發(fā)明概述
[0007]在一個(gè)方面，提供了擴(kuò)充FC的方法。此類方法包括使FC與D0CK2多肽接觸的步驟。在另一個(gè)方面，提供了擴(kuò)充干細(xì)胞(IPC ；HSC ;臍帶血等)的方法。此類方法包括使干細(xì)胞與D0CK2多肽接觸的步驟。在又一個(gè)方面，提供了在接受體中改善供體HSC嫁接的方法。此類方法包括將治療性細(xì)胞組合物移植入患者中的步驟。依照本公開(kāi)內(nèi)容，在存在D0CK2多肽的情況中擴(kuò)充和/或移植所述治療性細(xì)胞組合物。在又一個(gè)方面，提供了上調(diào)FC中的D0CK2表達(dá)的方法。所述方法包括使FC與上調(diào)D0CK2表達(dá)的鋅指核酸接觸的步驟。在一些實(shí)施方案中，D0CK2多肽是人D0CK2多肽。在一些實(shí)施方案中，D0CK2多肽是重組D0CK2融合多肽。
[0008]在一個(gè)方面，提供了篩選提高D0CK2表達(dá)的化合物的方法。所述方法包括使D0CK2表達(dá)細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；并測(cè)定D0CK2RNA或蛋白質(zhì)的量的步驟。通常，與不與所述測(cè)試化合物接觸的細(xì)胞中的D0CK2RNA或蛋白質(zhì)的量相比在存在所述測(cè)試化合物的情況中的D0CK2RNA或蛋白質(zhì)增加指示提高D0CK2表達(dá)的化合物。在一些實(shí)施方案中，D0CK2表達(dá)細(xì)胞是D0CK2表達(dá)造血細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，D0C2表達(dá)造血細(xì)胞是FC。在一些實(shí)施方案中，D0CK2表達(dá)細(xì)胞是表達(dá)重組D0CK2核酸的細(xì)胞。
[0009]在另一個(gè)方面，提供了篩選降低ArhgaplS表達(dá)的化合物的方法。所述方法包括使Arhgap 18表達(dá)細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；并測(cè)定Arhgapl8RNA或蛋白質(zhì)的量的步驟。通常，與不與所述測(cè)試化合物接觸的Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞中的Arhgapl8RNA或蛋白質(zhì)的量相比在存在所述測(cè)試化合物的情況中的Arhgapl8RNA或蛋白質(zhì)減少指示降低Arhgapl8表達(dá)的化合物。在一些實(shí)施方案中，Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞是Arhgapl8表達(dá)造血細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，Arhgapl8表達(dá)造血細(xì)胞是FC。在一些實(shí)施方案中，Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞是表達(dá)重組Arhgap 18核酸的細(xì)胞。
[0010]測(cè)定RNA量的代表性方法是Northern印跡。測(cè)定蛋白質(zhì)量的代表性方法是ELISA。[0011]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了篩選提高FC向趨化因子遷移的化合物的方法。所述方法包括如下的步驟:使FC與測(cè)試化合物接觸，其中在趨化因子附近培養(yǎng)所述FC ;并測(cè)定與尚未與所述測(cè)試化合物接觸的FC的遷移相比FC向所述趨化因子的遷移是否有升高，其中與在缺乏所述測(cè)試化合物的情況中所述FC向所述趨化因子的遷移相比在存在所述測(cè)試化合物的情況中所述FC向所述趨化因子的遷移升高指示提高FC向趨化因子遷移的化合物。在一些實(shí)施方案中，趨化因子是SDF-1。在一些實(shí)施方案中，所述方法使用Trans-well遷移。
[0012]在本文中描述的方法的一些實(shí)施方案中，F(xiàn)C是純化的。在本文中描述的方法的一些實(shí)施方案中，所述化合物選自下組:小分子、多肽、合成化合物、天然存在的化合物、抗體、抗原結(jié)合片段、和抗原。
[0013]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與主題方法和組合物所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以在主題方法和組合物的實(shí)施或測(cè)試中使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，下文描述合適的方法和材料。另外，材料、方法和實(shí)例僅為例示性的而并不意圖為限制性的。本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過(guò)提及完整并入。
[0014]附圖簡(jiǎn)述
[0015]圖1顯示了基于微陣列分析的基因表達(dá)概況。㈧差異表達(dá)基因的分級(jí)群聚。通過(guò)假發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)控制分析揭示前18種最顯著差異表達(dá)的基因，截留數(shù)值為水平1.99952#°5。每道代表一批FC樣品的表達(dá)概況。前3道顯示從NOD小鼠分離的FC的表達(dá)概況，而后3道展示來(lái)自NOR小鼠的FC的表達(dá)概況。⑶每組(NOR FC和NOD FC)的基于log2的均值信號(hào)的散布圖。(C)對(duì)來(lái)自指定小鼠品系的FC中Dock2RNA水平的定量實(shí)時(shí)RT - PCR(qRT - PCR)分析。數(shù)據(jù)代表5個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，并且數(shù)值代表相對(duì)于NOR小鼠品系標(biāo)準(zhǔn)化的倍數(shù)變化。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，從自每個(gè)品系的三只動(dòng)物收獲的骨髓細(xì)胞分選FC。對(duì)每個(gè)樣品一式三份實(shí)施qRT - PCR(對(duì)于每組為η = 5)。(D)對(duì)指定小鼠品系中D0CK2蛋白水平的高含量免疫熒光圖像分析。數(shù)據(jù)以點(diǎn)圖顯示。每個(gè)點(diǎn)代表單一小鼠。在這兩個(gè)測(cè)定法中，D0CK2+小鼠作為陰性對(duì)照使用，并且野生型Β6小鼠作為陽(yáng)性對(duì)照使用。
[0016]圖2顯示了 D0CK2+FC在功能上受損以促進(jìn)異基因和同基因接受體中的HSC嫁接。
(A)同基因模型:用500個(gè)B6KSL細(xì)胞(▲)、單獨(dú)的30，000個(gè)B6FC(_)、或與30，000個(gè)B6WT FC( ▼)或DOCI^+FC^.)混合的500個(gè)KSL細(xì)胞移植的同基因B6接受體的存活。
(B)異基因模型:用10，000個(gè)8601-213)1?1^細(xì)胞(▲)、單獨(dú)的30，000個(gè)B6WT FC( )或與30，000個(gè)B6FC( ▼)或D0CK2+FC (籲)混合的10，000個(gè)B6KSL細(xì)胞移植的異基因B10.BR(H-2k)接受體的存活。
[0017]圖3顯示了 D0CK2+FC不能增強(qiáng)HSC在骨髓環(huán)境中的歸巢和保留。用超致死劑量(1200cGy)的TBI照射B6小鼠。在照射后24小時(shí)，用單獨(dú)的75，000個(gè)B6FC ;單獨(dú)的25，000個(gè) B6KSL 細(xì)胞；或 25，000 個(gè) B6KSL 細(xì)胞及 75，000 個(gè) B6WT FC 或 75，000 個(gè) D0CK2+FC 移植小鼠。通過(guò)在體內(nèi)歸巢后實(shí)施集落形成細(xì)胞測(cè)定法評(píng)估移植后18小時(shí)自接受體小鼠的股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞形成的集落數(shù)目。㈧與單獨(dú)的HSC組相比HSC加FC組中有顯著更多的集落。用單獨(dú)的FC移植的小鼠和僅用照射處理的小鼠作為對(duì)照使用。通過(guò)虛線連接來(lái)自相同實(shí)驗(yàn)的樣品。(B) 與野生型FC加HSC組相比，體內(nèi)同基因歸巢后FC對(duì)HSC集落形成的提升在細(xì)胞遷移受損的D0CK2+FC加HSC組中是消除的。
[0018]圖4顯示了 D0CK2+和野生型(WT)基因型含有類似分?jǐn)?shù)的類漿細(xì)胞前體樹(shù)突細(xì)胞。(A) CD8+TCR α β TCR Y δ _ 總 FC 群體中 P-preDC (B220+/CD1 lc+/CDl IbO FC 的百分比。(B)對(duì)來(lái)自 CD8+/TCRa β 7TCR Y δ _ 總 FC 群體的 B220+/CDllc+/CDllb-或 PDCA-l+/CDllcint/CDllb_門(mén)控的P-preDC的代表性FACS概況。
[0019]圖5顯示了 D0CK2+FC展現(xiàn)出在體外對(duì)趨化因子CXCL12的受損遷移和在體內(nèi)對(duì)骨髓微環(huán)境的受損歸巢。通過(guò)Transwell遷移測(cè)定法測(cè)定D0CK2缺陷FC的遷移功能，并且在移植后18小時(shí)在脾、胸腺及股骨和脛骨骨髓中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定經(jīng)CellTrackerGreen標(biāo)記的FC的計(jì)數(shù)。(A)D0CK2+FC在對(duì)α -趨化因子，即200ng/ml劑量的基質(zhì)衍生因子-1 (SDF-1)的遷移中受損。(B)FC對(duì)股骨和脛骨骨髓的歸巢在D0CK2缺陷FC中也是顯著受損的。在股骨和脛骨的骨髓中經(jīng)CellTracker Green標(biāo)記的FC的代表性流式細(xì)胞術(shù)圖。[0020]圖6顯示了 D0CK2+FC對(duì)HSC的體外向性效應(yīng)(tropic effect)。⑷若將FC與HSC 一起預(yù)先共培養(yǎng)，則D0CK2+FC擁有促進(jìn)HSC生成集落的能力，就像WT FC 一樣。在右側(cè)顯示了從這兩組生成的代表性集落(CFU-GM，CFU-M)。(B) D0CK2-/-FC在與HSC共培養(yǎng)時(shí)不能阻止HSC凋亡。骨髓⑶8+T細(xì)胞加HSC作為對(duì)照使用。在共培養(yǎng)FC與HSC后從c-Kit+/Sca-1+群體門(mén)控的7-AAD7膜聯(lián)蛋白V—活細(xì)胞的代表性FACS概況。
[0021]圖7顯示了免疫抑制性T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)和IL-10生成性Trl細(xì)胞的生成。(A)共培養(yǎng)后⑶4+⑶25+的代表性染色。(B)對(duì)⑶4+CD25_T細(xì)胞門(mén)控的胞內(nèi)IL-10的代表性染色。(OD0CK2+FC的珠攝取與WT FC對(duì)其攝取相比顯著受損。結(jié)果代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0022]圖8顯示了小分?jǐn)?shù)的FC亞群是CXCL12生成性細(xì)胞和⑶169+巨噬細(xì)胞。(A)在非照射接受體和致死照射的接受體兩者的股骨和脛骨的冷凍骨切片中顯現(xiàn)經(jīng)CellTrackerGreen標(biāo)記的FC。(B) 5% FC亞群是CXCL12生成性細(xì)胞，并且D0CK2+FC和WT B6FC之間沒(méi)有CXCL12+細(xì)胞的顯著差異。(C)3% FC是169+巨噬細(xì)胞。
[0023]圖9顯示了微陣列結(jié)果的主成分分析。每個(gè)點(diǎn)代表45，101個(gè)探針集的表達(dá)數(shù)據(jù)的線性組合，包括相對(duì)表達(dá)值和方差。表達(dá)數(shù)據(jù)集的方差是71.5%，每個(gè)紅色的點(diǎn)代表NODFC的一個(gè)樣品，而每個(gè)藍(lán)色的點(diǎn)代表NOR FC。
[0024]圖10 顯示了 D0CK2 表達(dá)的圖像分析。用 BD PathwayTM855Bioimager (BDBioscience)對(duì)突光成像以產(chǎn)生2000個(gè)細(xì)胞的蒙太奇(montage)圖像，并通過(guò)BD△?仍^^^^軟件^^了用雙重通道的分割設(shè)置和兩個(gè)輸出(核和胞質(zhì))分析圖像。使用從兩個(gè)對(duì)照(僅細(xì)胞和單獨(dú)的二抗溫育)記錄的圖像來(lái)設(shè)置成像加工的閾值水平。
[0025]圖11顯示了與單獨(dú)培養(yǎng)的HSC相比，F(xiàn)C與HSC的溫育沒(méi)有導(dǎo)致HSC中CXCR4表達(dá)的任何變化。在體外共培養(yǎng)HSC和FC后18小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量HSC中的CXCR4表達(dá)。(A) HSC未染色對(duì)照(綠線);單獨(dú)的HSC (藍(lán)線)；和與FC共培養(yǎng)的HSC (紅線)。(B)CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞的覆蓋圖。單獨(dú)的HSC (藍(lán)點(diǎn));和與FC共培養(yǎng)的HSC (紅點(diǎn))。
[0026]圖12顯示了 SDF-1存在于FC培養(yǎng)物的上清液中。在培養(yǎng)FC的100 μ I上清液中也檢出低濃度(0.2ng/ml)SDF-l。
[0027]發(fā)明詳述
[0028]本文中提供了擴(kuò)充FC或干細(xì)胞的方法，還提供了篩選提高D0CK2表達(dá)或降低Arhgap 18表達(dá)的化合物的方法。如本文中證明的，使FC或干細(xì)胞與D0CK2接觸或者提高FC或HSC中的D0CK2表達(dá)改善接受體中的供體HSC嫁接。同樣地，降低FC或干細(xì)胞中Arhgap 18的表達(dá)也應(yīng)當(dāng)改善嫁接。
[0029]擴(kuò)充干細(xì)胞的方法
[0030]提供了擴(kuò)充FC或干細(xì)胞的方法，并且其包括使FC或干細(xì)胞與D0CK2多肽接觸的步驟。FC記載于許多參考文獻(xiàn)中，包括例如US2011/0110909和Ildstad等,2011, Curr.0pin.0rgan Transplant, 16:343-4 及 Colson 等,2007, Crit.Rev.0ncol.Hematol.,61:26-43。如本文中使用的，干細(xì)胞指具有自身更新的能力，而且在某些條件下還能分化成組織或器官特異性細(xì)胞的任何類型的細(xì)胞。干細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞、和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)。干細(xì)胞可以是純化的，或者干細(xì)胞可以在生物學(xué)樣品，諸如例如骨髓或臍帶血中。如本文中使用的，“擴(kuò)充”指將培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目增加至少2倍(例如增加5倍、10倍、20倍、50倍、或100倍)。
[0031]還提供了改善接受體中的供體HSC嫁接的方法。此方法利用US2011/0110909中描述的治療性細(xì)胞組合物，其包含HSC、FC和alpha beta TCR+T細(xì)胞。依照本文中描述的方法，可以在存在D0CK2多肽的情況中擴(kuò)充此類治療性細(xì)胞組合物(例如FC、HSC)中的細(xì)胞。另外/或者，可以在存在D0CK2多肽的情況中將此類治療性細(xì)胞組合物移植到患者中。
[0032]D0CK2 (胞質(zhì)分裂 獻(xiàn)呈物(dedicator of cytokinesis) 2)多肽是秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans) Ced_5、哺乳動(dòng)物 DOCK 180 和黑腹果妮(Drosophilamelanogaster)Myoblast City(CDM)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子家族的成員。人D0CK2蛋白是1842個(gè)氨基酸，并且具有210kDa的分子量。D0CK2在造血細(xì)胞中特異性表達(dá)，并且是淋巴細(xì)胞趨化性需要的。D0CK2活化Racl和Rac2小GTP酶，推測(cè)其通過(guò)發(fā)揮鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(GEF)功能實(shí)現(xiàn)。編碼人D0CK2多肽的核酸序列可以參見(jiàn)例如GenBank登錄號(hào)NM_004946.2和BC104900.1，而編碼的人D0CK2多肽的序列可以參見(jiàn)例如GenBank登錄號(hào)NP_004937.1和 Q92608.2。
[0033]另外，提供了上調(diào)FC中的D0CK2表達(dá)的方法，并且其包括使FC與上調(diào)D0CK2表達(dá)的含有鋅指的多肽接觸的步驟。含有鋅指的多肽作為DNA結(jié)合蛋白(例如轉(zhuǎn)錄因子)是本領(lǐng)域中公知的，并且可以工程化改造為上調(diào)或下調(diào)基因的表達(dá)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利N0.7，985，887 ；及 Sander 等，2007，Nuc.Acid Res.，35:W599-605 ；Sander 等，2010，Nuc.Acid Res.，38:W462-8 ;及 Maeder 等，2008, Mol.Cell.，31:294-301。
[0034]篩選改善HSC嫁接的化合物
[0035]基于本文中描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供了篩選提高造血干細(xì)胞(HSC)的嫁接的化合物的方法。例如，描述了如下的方法，其中對(duì)化合物篩選那些分別在D0CK2或Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞中提高D0CK2表達(dá)或降低Arhgap 18表達(dá)的化合物。還描述了如下的方法,其中篩選化合物以鑒定那些提高FC向趨化因子遷移的化合物。
[0036]上文描述了 D0CK2多肽。Arhgapl8多肽屬于調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的Rho GTP酶活化蛋白家族。Arhgapl8活化GTP酶，其通過(guò)將它們轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的GDP結(jié)合狀態(tài)。編碼Arhgap 18多肽的核酸序列可以參見(jiàn)例如GenBank登錄號(hào)BCl11940.1和BC107416.1，并且Arhgap 18多肽的序列可以參見(jiàn)例如GenBank登錄號(hào)Q8N392.3和AAI11941.1。
[0037]本文中公開(kāi)的篩選方法通常包括使D0CK2或Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸。對(duì)于在本文中的篩選方法中使用，D0CK2或Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞可以是天然表達(dá)D0CK2或Arhgapl8的造血細(xì)胞(例如FC)或遺傳工程化改造為表達(dá)編碼D0CK2或Arhgapl8多肽的核酸的重組細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，編碼D0CK2或Arhgapl8多肽的核酸對(duì)于D0CK2或Arhgap 18表達(dá)細(xì)胞而言可以是內(nèi)源的(例如天然的)，或者編碼D0CK2或Arhgap 18多肽的核酸對(duì)于D0CK2或Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞而言可以是外源的(例如異源的)。
[0038]本文中公開(kāi)的篩選方法包括測(cè)量在存在和缺乏測(cè)試化合物的情況中的多肽量。如本文中指示的，與在缺乏測(cè)試化合物的情況中的D0CK2多肽量相比在存在測(cè)試化合物的情況中D0CK2多肽量的增加鑒定擴(kuò)充FC或干細(xì)胞的化合物。類似地，與在缺乏測(cè)試化合物的情況中的Arhgapl8多肽量相比在存在測(cè)試化合物的情況中Arhgapl8多肽量的減少鑒定擴(kuò)充FC或干細(xì)胞的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，在移植之前或期間擴(kuò)充FC或干細(xì)胞(例如HSC)導(dǎo)致改善的嫁接。
[0039]本文中描述的用于篩選化合物的許多方法高度適合于自動(dòng)化和高通量。參見(jiàn)例如W084/03564(關(guān)于化合物的高通量篩選的描述)及Farrelly等(2001，AnalyticalBiochemistry, 293:269-276)(關(guān)于篩選化合物的高通量方法的描述,所述化合物影響蛋白質(zhì)結(jié)合及經(jīng)由蛋白質(zhì)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄活化)。
[0040]多肽、編碼多肽的核酸、和重組細(xì)胞
[0041]就多肽而言，術(shù)語(yǔ)“純化的”指已經(jīng)從其天然伴隨的細(xì)胞組分分離或純化的多肽。通常，在多肽至少70% (例如至少75%，80% ,85% ,90% ,95%，或99% )(按重量計(jì))不含其天然關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)和天然存在的分子時(shí)，認(rèn)為其是“純化的”。由于化學(xué)合成的多肽本質(zhì)上與其天然伴隨的組分分離，合成的多肽是“純化的”。
[0042]可以通過(guò)已知的方法，諸如DEAE離子交換、凝膠過(guò)濾、和羥磷灰石層析從天然來(lái)源(例如細(xì)胞裂解物)純化多肽。另外，可以通過(guò)化學(xué)合成獲得純化的多肽?？梢允褂萌魏魏线m的方法，例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或HPLC分析測(cè)量多肽的純度。如下文更為詳細(xì)描述的，也可以通過(guò)表達(dá)編碼多肽的核酸獲得純化的多肽。
[0043]上文描述的多肽可以由與上文提及的GenBank登錄號(hào)有關(guān)的相應(yīng)核酸序列編碼。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，基于簡(jiǎn)并密碼，可以設(shè)計(jì)編碼相同多肽的許多不同核酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”可以指DNA分子和RNA分子及使用核苷酸類似物生成的DNA或RNA分子類似物。如本文中描述的核酸可以是單鏈或雙鏈的，其一般取決于其意圖的用途。
[0044]如本文中使用的，“分離的”核酸是與通常與分離的核酸關(guān)聯(lián)的其它核酸分開(kāi)的核酸。如此，“分離的”核酸包括但不限于不含在衍生分離的核酸的生物體的基因組中天然在核酸的一個(gè)或兩個(gè)末端側(cè)翼的序列的核酸(例如通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切核酸酶消化生成的cDNA或基因組DNA片段)。另外，分離的核酸分子可以包括工程化核酸，諸如重組或合成核酸。認(rèn)為存在于例如核酸文庫(kù)(例如cDNA，或基因組文庫(kù))或含有限制性消化的基因組DNA的凝膠(例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺)部分內(nèi)的數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)個(gè)其它核酸間的核酸不是分離的核酸。
[0045] 可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)的技術(shù)獲得分離的核酸。例如，可以使用任何方法獲得分離的核酸，所述方法包括但不限于重組核酸技術(shù)，和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。通用的PCR技術(shù)記載于例如PCR Primer:A Laboratory Manual, 1995，Dieffenbach&Dveksler編，ColdSpring Harbor Laboratory Press。重組核酸技術(shù)包括例如限制酶消化和連接,其可以用于分離核酸。分離的核酸也可以化學(xué)合成，以單一核酸或者以一系列寡核苷酸合成。
[0046]在天然存在的序列外，熟練技術(shù)人員會(huì)進(jìn)一步領(lǐng)會(huì)，可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)的方法將變化引入核酸中，由此導(dǎo)致編碼多肽的氨基酸序列的變化。例如，可以將變化引入核酸編碼序列中，在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處產(chǎn)生保守的氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲械囊粋€(gè)氨基酸殘基用具有相似特征的不同氨基酸殘基替換的取代(參見(jiàn)例如Dayhoff等，1978，于 Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 (3):345-352)。
[0047]可以將核酸或多肽序列與另一個(gè)序列比較，并且就其百分比序列同一性而言進(jìn)行描述。在計(jì)算百分比序列同一性中，比對(duì)兩個(gè)序列，并且測(cè)定兩個(gè)序列間的核苷酸或氨基酸殘基的相同匹配的數(shù)目。用相同匹配的數(shù)目除以比對(duì)區(qū)的長(zhǎng)度(即比對(duì)核苷酸或氨基酸殘基的數(shù)目)，并且乘以100以獲得百分比序列同一性數(shù)值。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，比對(duì)區(qū)的長(zhǎng)度可以是一個(gè)或兩個(gè)序列的一部分直至最短序列的全長(zhǎng)大小。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，單一序列可以與其它序列差別比對(duì)，因此在每個(gè)比對(duì)區(qū)里可以具有不同百分比序列同一性數(shù)值。注意到百分比同一性數(shù)值通常四舍五入到最近的整數(shù)。
[0048]使用并入BLAST (基本局部比對(duì)搜索工具)程序(在萬(wàn)維網(wǎng)的ncb1.nlm.nih.gov可得到)中的由 Altschul 等(1997, Nucleic Acids Res.，25:3389-3402)描述的算法實(shí)施測(cè)定百分比序列同一性的兩個(gè)或更多個(gè)序列的比對(duì)?？梢詫?shí)施BLAST搜索以測(cè)定使用Altschul等的算法比對(duì)的第一核酸和任何其它序列或其部分之間的百分比序列同一性。BLASTN是用于比對(duì)和比較核酸序列間的同一性的程序，而B(niǎo)LASTP是用于比對(duì)和比較氨基酸序列間的同一性的程序。在利用BLAST程序來(lái)計(jì)算本發(fā)明的序列和另一個(gè)序列之間的百分比同一性時(shí)，使用相應(yīng)程序的缺省參數(shù)。
[0049]還提供了含有此類核酸的構(gòu)建體。構(gòu)建體(包括表達(dá)載體)是商品化的和/或可以通過(guò)本領(lǐng)域中常規(guī)的重 組DNA技術(shù)方法生成。含有編碼一種或多種多肽的核酸的構(gòu)建體還可以具有與此類核酸可操作連接的對(duì)于表達(dá)必需的元件，并且進(jìn)一步可以包含諸如那些編碼選擇標(biāo)志物(例如抗生素抗性基因)的，和/或那些可以用于純化多肽(例如6x His標(biāo)簽)的序列等序列。對(duì)于表達(dá)必需的元件包括指導(dǎo)并調(diào)節(jié)編碼序列表達(dá)的核酸序列。對(duì)于表達(dá)必需的元件的一個(gè)例子是啟動(dòng)子序列。對(duì)于表達(dá)必需的元件還可以包含內(nèi)含子、增強(qiáng)子序列、響應(yīng)元件、或可誘導(dǎo)元件，其調(diào)控編碼序列的表達(dá)。對(duì)于表達(dá)必需的元件可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物或病毒起源的，并且載體可以含有來(lái)自不同起源的元件的組合。如本文中使用的，可操作連接意味著啟動(dòng)子和/或其它調(diào)節(jié)元件在構(gòu)建體中相對(duì)于編碼序列以如下的方式定位，使得指導(dǎo)或調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)。許多用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括但不限于磷酸鈣沉淀、電穿孔、熱休克、脂轉(zhuǎn)染、顯微注射、和病毒介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移。
[0050]可以將本文中描述的核酸(例如在構(gòu)建體中)導(dǎo)入細(xì)胞中，從而生成重組細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“重組細(xì)胞”不僅指已經(jīng)接受核酸導(dǎo)入的特定細(xì)胞，而且還指此類細(xì)胞的后代。重組細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，核酸可以在細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌(E.coli)中，或在昆蟲(chóng)、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)?？梢宰?yōu)橹亟M體的其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0051]用于操作核酸以表達(dá)期望的多肽組合的本文中描述的方法僅僅需要本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。此類常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)記載于例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Sambrook 等，Cold Spring Harbor Press (2001);及 PCR Primer: ALaboratory Manual, 1995, Dieffenbach&Dveksler 編,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor, NY。
[0052]在篩選方法中使用的化合物
[0053]可以在本文中描述的方法中篩選許多不同化合物。代表性的化合物包括例如小分子、多肽、合成化合物、天然存在的化合物、抗體、抗原結(jié)合片段、或抗原。
[0054]可以在本文中的方法中篩選的化合物可以包括抗體。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣義使用，包括完全裝配的抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、可以結(jié)合抗原的抗體片段(包括Fab’、F’(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體)、和包含前述項(xiàng)的重組肽，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。涵蓋完整分子和/或片段的多聚體或聚集體，包括衍生化的多聚體、聚集體或片段。還涵蓋任何同種型類或亞類的抗體，包括 IgG，IgM, IgD, IgA,和 IgE，IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 和 IgA2，或任何同種異型。
[0055]另外，本文中描述的篩選方法中使用的化合物可以包括核酸(例如寡核苷酸)或其藥學(xué)可接受鹽。非限制性例子包括反義寡核苷酸、三聯(lián)體寡核苷酸、核酶/脫氧核酶(DNA酶)、小干擾RNA/RNA1、短發(fā)夾RNA、適體、核酶或誘餌(decoy)寡核苷酸。
[0056]例如，小分子文庫(kù)(例如化學(xué)文庫(kù)、天然產(chǎn)品文庫(kù))可以獲自各種商業(yè)來(lái)源，而其它類型的文庫(kù)(例如組合生成核酸或肽文庫(kù))可以使用已知方法生成。僅舉例而言，較大的化合物組合文庫(kù)可以通過(guò)W095/12608, W093/06121, W094/08051, W095/35503和TO95/30642中描述的編碼合成文庫(kù)(ESL)方法構(gòu)建。也可以通過(guò)噬菌體展示方法(參見(jiàn)例如W091/18980)生成肽文庫(kù)。要篩選的化合物也可以獲自政府或私有來(lái)源，包括例如 ChemBridge Corporation (San Diego, Calif.)的 DIVERSet E 文庫(kù)、國(guó)立癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI)自然產(chǎn)物保藏中心(Natural ProductRepository), Bethesda, Md.> NCI Open Synthetic Compound Collection ；Bethesda, Md.,或 NCI 的開(kāi)發(fā)治療學(xué)項(xiàng)目(Developmental Therapeutics Program)。
[0057]組合物和藥物組合物
[0058]本文中描述的篩選方法中鑒定的D0CK2多肽或任何化合物可以與細(xì)胞(例如FC，HSC)或細(xì)胞來(lái)源(例如骨髓，臍帶血)離體組合。在本文中描述的篩選方法之一中鑒定的D0CK2多肽或化合物的合適量會(huì)取決于許多不同因素(例如細(xì)胞類型、細(xì)胞的數(shù)目和/或密度)，并且所述量可以使用常規(guī)且公知的方法確定。另外，可以使細(xì)胞或細(xì)胞來(lái)源與本文中描述的篩選方法之一中鑒定的D0CK2多肽或化合物在從自供體收集至對(duì)接受體移植的任何時(shí)間離體接觸。
[0059]或者，可以用藥學(xué)可接受載體配制任何此類化合物以對(duì)個(gè)體投遞。特定的配制劑會(huì)取決于多種因素，包括施用路徑、化合物的劑量和劑量時(shí)間間隔、治療個(gè)體的性別、年齡和重量、痛苦的嚴(yán)重性、和個(gè)體內(nèi)科醫(yī)生的判斷。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受載體”意圖包括與施用相容的任何賦形劑、溶劑、分散介質(zhì)、涂層材料、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等張和吸附延遲劑，等等。此類介質(zhì)和藥劑用于藥學(xué)可接受載體是本領(lǐng)域中公知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與化合物不相容，涵蓋其用途。
[0060] 用于投遞化合物的藥學(xué)可接受載體是本領(lǐng)域中公知的。參見(jiàn)例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy,University of theSciences in Philadelphia, Ed.,第 21 版,2005,Lippincott ffilliams&ffilkins ；及 The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman 編，第 12版，2001，McGraw-Hill Co。在特定配制劑中使用的藥學(xué)可接受載體的類型可以取決于各種因素，諸如例如化合物的物理和化學(xué)特性、施用路徑、和制造程序。合適的施用路徑包括例如胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下)、腹膜內(nèi)施用、和口服施用。
[0061]依照本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中完全解釋。發(fā)明會(huì)在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不限制權(quán)利要求書(shū)中描述的主題方法和組合物的范圍。
實(shí)施例
[0062]實(shí)施例1:小鼠
[0063]6 至 8 周齡 C57BL/6J(B6) [H-2b]和 B10.BR/SgSnJ(B10.BR) [H-2k]小鼠購(gòu)自 Jackson Laboratory。D0CK2+ 小鼠(B6 背景)[H_2b]已經(jīng)在別處描述(Fukui等，2001，Nature, 412:826-31)。將D0CK2+小鼠與B6小鼠回交超過(guò)五代，并且使用B6小鼠作為野生型(WT)對(duì)照。通過(guò)將雄性和雌性D0CK2+小鼠互交獲得D0CK2+同窩出生仔畜。在本研究中使用6至8周齡D0CK2+小鼠。將動(dòng)物在Cellular Therapeutics，路易斯維爾大學(xué)(University of Louisville)的動(dòng)物房中在無(wú)特定病原體條件下收容,并且依照國(guó)立健康研究所(National Institutes of Health)動(dòng)物護(hù)理指南照料。依照路易斯維爾大學(xué)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指南進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。 [0064]實(shí)施例2:HSC和FC的分詵
[0065]通過(guò)多參數(shù)、活體無(wú)菌細(xì)胞分選(FACSVantage SE和FACSAria SORP細(xì)胞分選儀，BD Biosciences)從骨髓細(xì)胞分離HSC和FC，如先前描述的(Fugier-Vivier等，2005，J.Exp.Med., 201:373-83 ；Huang 等，2008，Diabetes, 57:2360-70 ;Rezzoug 等，2008，J.1mmunol.，180:49-57)。分析用的所有下列單克隆抗體購(gòu)自BD Bioscience:干細(xì)胞抗原-1 (Sca-1)藻紅蛋白(PE)、⑶117 (c-Kit)別藻藍(lán)蛋白(APC)、⑶8 α異硫氰酸熒光素(FITC)、CDlIb FITC、B220FITC、Gr-lFITC、TCRa ^FITC, TCR y δ FITC 和 CD8 a PE。對(duì) HSC分選 c-Kit+/Sca-l7Lin_ (KSL)表達(dá)；對(duì) FC 分選 CD8 a+/TCR α β 7TCR Y δ_ 表達(dá)。使用具有范圍為90-98%的分選后純度的分選細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0066]實(shí)施例3:某閔微陣列
[0067]從自6-8周齡NOD或NOR小鼠收集的骨髓細(xì)胞分選3χ105個(gè)FC。使用Al'CturuS? PicoPure? RNA 分離試劑盒(Applied Biosystems)分離總 RNA。一式三份加工用于微陣列分析的樣品。使用2周期標(biāo)記試劑盒(Affymetrix)依照制造商的說(shuō)明標(biāo)記總RNA。將經(jīng)標(biāo)記的RNA與GeneChip?小鼠基因組4302.0陣列(Affymetrix)雜交。將
陣列清洗，并使用Affymetrix FS450流控技術(shù)站染色，并在Affymetrix GeneChip掃描儀30007G上掃描。將所得的文件輸入Partek基因組學(xué)包中進(jìn)行分析。每個(gè)GeneChip含有超過(guò)45，000個(gè)探針集，因此從6個(gè)陣列產(chǎn)生總共270，000個(gè)表達(dá)數(shù)據(jù)點(diǎn)。首先實(shí)施主成分分析(Principle component analysis, PCA)以檢查從不同陣列產(chǎn)生的數(shù)據(jù)間的關(guān)聯(lián)。然后，使用Robust Multichip Average標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，并且實(shí)施ANOVA分析以鑒定NOR FC和NODFC之間差異表達(dá)的基因。通過(guò)假發(fā)現(xiàn)率(FDR)控制分析以1.99952e_°_°5截留值選擇18種最顯著差異表達(dá)的基因，并且將其輸入Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity System)中，用于生物學(xué)解讀。
[0068]實(shí)施例4:Dock2的相對(duì)定量實(shí)時(shí)PCR
[0069]使用Arcturus? PicoPure? RNA 分離試劑盒(Applied Biosystems)從分選的IxlO5個(gè)FC提取總RNA，并將其用RQl無(wú)RNA酶的DNA酶(Promega)處理以消除污染性基因組DNA。通過(guò)NanoDrop (Thermo Scientific)測(cè)量RNA的量化,并且通過(guò)變性甲醒瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA模板的質(zhì)量。使用iScriptTMcDNA合成試劑盒(Bio-Rad)將500ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈互補(bǔ)DNA。用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)在CFX96?實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)上實(shí)施實(shí)時(shí)qPCR。使用預(yù)先設(shè)計(jì)的且生物信息學(xué)有效的引物(對(duì)于 Dock2 為 QT00146342，對(duì)于 Gapdh 為 QT01658692, QuantiTect 引物測(cè)定法，Qiagen)來(lái)實(shí)現(xiàn)約100% PCR效率，用于可靠的相對(duì)量化。用Bio-Rad CFX Manager?軟件vl.0分析結(jié)果，相對(duì)于Gapdh基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化，并且使用2_Δ Δε?法與NOR FC中的Dock2表達(dá)比較(Livak 等，2001，Methods, 25:402-8)。
[0070]實(shí)施例5 =D0CK2的免疫熒光染色
[0071]將1.5xl04個(gè)分選的FC在100 μ I MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中重懸，并使用Shandon EZ Cytofunnel 和 Shandon CytoSpin III Cytocentrifuge (Thermo Scientific)旋轉(zhuǎn)到Superfrost Plus載玻片(Thermo Scientific)上。將載玻片風(fēng)干，并且于_20°C在冷丙酮中固定5分鐘。將載玻片再次風(fēng)干，然后用PBS清洗兩次，持續(xù)2分鐘。將細(xì)胞于室溫用PBS中1%純化的酪蛋白(Roche Applied Science)封閉I小時(shí)，然后于4°C與兔多克隆抗小鼠D0CK2 (1:100, Millipore) 一起溫育過(guò)夜。將載玻片用PBS清洗兩次，持續(xù)5分鐘，然后于室溫將細(xì)胞與Alexa Fluor? 488山羊抗兔IgG (1:400，H+L，高交叉吸附，Invitrogen)一起溫育I小時(shí)。在用PBS清洗后，隨后，將細(xì)胞用DAPI (Invitrogen)復(fù)染色5分鐘，并在Vectashield介質(zhì)(Vector)中封固載玻片。
[0072]實(shí)施例6:HSC和/或FC移棺
[0073]對(duì)于同基因移植，用來(lái)自銫源(Nordion)的950cGy總體身體照射(TBI)使B6接受體條件化，并且在照射后6小時(shí)通過(guò)尾靜脈注射與500個(gè)B6KSL細(xì)胞±30，000個(gè)B6WT或D0CK2+FC—起移植。對(duì)于異基因移植，將用950cGy TBI條件化的B10/BR接受體與10，000個(gè)B6KSL細(xì)胞±30，000個(gè)B6WT或D0CK2+FC —起移植。隨時(shí)間追蹤反映嫁接的百分比存活。
[0074]實(shí)施例7:體內(nèi)歸巢
[0075]用超致死劑量(1200cGy)TBI照射B6小鼠。在24小時(shí)后，通過(guò)尾靜脈注射給小鼠移植25，000個(gè)B6KSL細(xì)胞±75，000個(gè)B6WT或D0CK2+FC。在細(xì)胞注射后18小時(shí)從接受體小鼠的股骨和脛骨收獲骨髓細(xì)胞，并且將其在300 μ I IMEM培養(yǎng)基中重懸，用于集落形成細(xì)胞測(cè)定法。
[0076]實(shí)施例8:FC和HSC的體外共培養(yǎng) [0077]將10，000個(gè)B6KSL細(xì)胞單獨(dú)或在存在45，000個(gè)B6FC或D0CK2+FC的情況中在96孔細(xì)胞培養(yǎng)簇(具有蓋的U瓶，Costar)中在長(zhǎng)期培養(yǎng)基(LTCM)中溫育18小時(shí)，所述長(zhǎng)期培養(yǎng)基(LTCM)由MEM培養(yǎng)基、20%馬血清(Invitrogen)、10_6mol/L氫化可的松(Sigma-Aldrich) >50 μ Μβ -疏基乙醇(Sigma-Aldrich)、50U/ml 青霉素、50 μ g/ml 鏈霉素(Invitrogen)組成。在共培養(yǎng)后，收集細(xì)胞樣品，用于凋亡測(cè)定法和集落形成細(xì)胞測(cè)定法。
[0078]實(shí)施例9:集落形成細(xì)胞測(cè)定法
[0079]對(duì)于來(lái)自體內(nèi)歸巢或體外的樣品，將FC:HSC共培養(yǎng)物在300μ I IMEM培養(yǎng)基中收集,并與 5ml 甲基纖維素培養(yǎng)基(MethoCult GF-M3434, Stem Cell Technologies)混合，并使用具有16號(hào)鈍圓末端針的無(wú)菌一次性Iml注射器(Stem Cell Technologies)分散到四個(gè)35-mm皿(1.1ml/每皿)中。在7天溫育后，集落的計(jì)數(shù)和表征由沒(méi)有告知組信息的個(gè)體盲化實(shí)施。
[0080]實(shí)施例10:凋亡測(cè)定法
[0081]將共培養(yǎng)后的細(xì)胞樣品用c-Kit APC和Sca-1PE抗體再染色30分鐘，然后與膜聯(lián)蛋白 V-FITC (BD Bioscience)和 7-氛基放線菌素 D (7-AAD, Molecular Probes) 一起溫育15分鐘。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)中的膜聯(lián)蛋白V和7-AAD的染色樣式測(cè)定細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡。
[0082]實(shí)施例U:免瘡抑制件Trea和Trl的體外牛成
[0083]將5x10s 個(gè) WT B6 或 B10.BR 脾 CD4+CD25T 細(xì)胞與 IxlO5 個(gè) WT FC 或 D0CK2+FC以5:1比率在U底96孔板中一起溫育長(zhǎng)達(dá)6天。對(duì)于IL-1O的胞內(nèi)染色，在收獲前用PMA(20ng/ml)和伊屋諾霉素(ionomycin) (I μ g/ml)刺激細(xì)胞。將共培養(yǎng)物收獲，并且分析從未處理 CD4+CD25T1 細(xì)胞的免疫抑制性 CD4+CD25+Foxp3+Treg 和 CD4+CD251L_10+Trl 細(xì)胞的生成。WT⑶4+⑶25_脾細(xì)胞培養(yǎng)物僅充當(dāng)陰性對(duì)照。在將FC與珠一起溫育3小時(shí)后評(píng)估WT和D0CK2+FC對(duì)經(jīng)APC標(biāo)記的聚苯乙烯珠(BD Biosciences)的吞噬。
[0084]實(shí)施例12 =DOCI^zzzFC的亞群分析
[0085]將自B6WT或D0CK2+小鼠的骨髓細(xì)胞分離的分選的FC與Fe受體阻斷劑一起溫育，之后用抗 CD3，CDllb，CDllc，B220，NKl.l，DX5，CD14，Gr-l，CD19(BDBiosciences), PDCA-1 (eBioscience)和 CD169(AbD Serotec)染色。用 FACS Diva? 軟件(BD Biosciences)進(jìn)行的BD LSR II多色流式細(xì)胞術(shù)用于數(shù)據(jù)采集和分析。
[0086]實(shí)施例13:Transwell i千移測(cè)定法
[0087]將分選的1.5x10s個(gè)FC在300 μ I遷移培養(yǎng)基(具有0.5% BSA的RPM1-1640培養(yǎng)基)中重懸，并于37°C平衡10分鐘，并且通過(guò)采用具有5 μ m孔聚碳酸酯膜，6.5mm直徑插入物的Transwell? 24孔板(Corning Life Sciences)實(shí)施趨化性測(cè)定法。使實(shí)驗(yàn)孔在下室中充滿60(^1含有50?-1(200叩/1111) (Millipore)的遷移培養(yǎng)基。具有或沒(méi)有上部插入物，但是僅在下室中接受遷移培養(yǎng)基的孔分別稱為被動(dòng)細(xì)胞遷移對(duì)照和細(xì)胞加載對(duì)照。對(duì)于每組，將100 μ 1(0.5x105FC)的細(xì)胞懸浮液等分試樣添加至具有上部插入物的兩個(gè)孔和沒(méi)有插入物的一個(gè)孔。在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中放置24孔板達(dá)3小時(shí)后，從下室收集細(xì)胞，并且用排除細(xì)胞碎片的調(diào)節(jié)閾值通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur, BD Biosciences)分選每孔的細(xì)胞數(shù)目。從向含有SDF-1的遷移培養(yǎng)基遷移的細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目(在扣除向單獨(dú)的遷移培養(yǎng)基遷移的細(xì)胞的數(shù)目后)與加載細(xì)胞的總數(shù)的比率計(jì)算細(xì)胞遷移的百分比。
[0088]實(shí)施例14:FC的細(xì)朐追蹤
[0089] 給非照射的B6 接受:體移植用 2.5ymol/L CellTracker?GreenCMFDA(Invotrgen)標(biāo)記的1.5xl05個(gè)B6WT或D0CK2+FC。在移植前分別通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞存活力和染色效率。在移植后18小時(shí)在脾、胸腺及股骨和脛骨的骨髓中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)施經(jīng)CellTracker?Green CMFDA標(biāo)記的FC的計(jì)數(shù)。對(duì)于骨切片觀察，照射的B6接受體也用作接受體。將股骨和脛骨收獲，并在10% EDTA/Tris-HCl (pH7.4)中脫鈣6天。然后，將脫鈣的骨用最佳的切割溫度(Tissue-Tek)冷凍保護(hù)，用恒冷切片機(jī)制成切片(10 μ m),封固到 Superfrost Plus 載玻片(Thermo Scientific)上。在用 PBS 清洗后，隨后，將切片用DAPI (Invitrogen)復(fù)染色5分鐘，并將載玻片在Vectashield介質(zhì)(Vector)中封固。使用Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡和Leica Application SuiteAdvanced Fluorescence 軟件對(duì)經(jīng) CellTracker?Green CMFDA 標(biāo)記的 FC 成像。
[0090]實(shí)施例15:SDF-1ELISA和朐內(nèi)染色
[0091]將150，000個(gè)來(lái)自B6或D0CK2+小鼠的FC在LTCM中在96孔細(xì)胞培養(yǎng)簇(具有蓋的V瓶，Costar)中培養(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)的FC固定，并用胞內(nèi)染色緩沖液(BioLegend，SanDiego, CA)透化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，使用 SDF-1APC 抗體(R&D Systems, Minneapolis, MN)檢測(cè)SDF-1陽(yáng)性FC。收集上清液，并依照制造商的方案實(shí)施SDF-1的ELISA (R&DSystems, Minneapolis, MN)。
[0092]實(shí)施例16:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0093]除非另外指示，所有結(jié)果以均值土SD表示。用GraphPad Prism5軟件(GraphPadSoftware Inc., San Diego CA)實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于兩組,通過(guò)2尾不配對(duì)Student t檢驗(yàn)比較正態(tài)分布。使用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較非正態(tài)取樣。使用時(shí)序檢驗(yàn)(log-ranktest)分析Kaplan-Meier存活曲線。認(rèn)為小于0.05的P值是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0094]實(shí)施例17:基因微陣列分析揭示了 D0CK2表達(dá)在具有受損功能的FC中是下調(diào)的。
[0095]先前的研究證明了來(lái)自易感糖尿病的非肥胖糖尿病性(NOD)小鼠的FC是功能受損的，而那些來(lái)自同類正常(NOR)小鼠的FC是功能性的(Huang等，2008，Diabetes, 57:2360-70)。實(shí)施基因微陣列分析以比較NOD FC與NORFC。對(duì)陣列數(shù)據(jù)的PCA分析顯示了每組內(nèi)的三份樣品緊密聚簇在一起，表達(dá)數(shù)據(jù)集的方差為71.5%，而來(lái)自NOR FC的樣品與NOD FC明顯分開(kāi)(圖8)，指示微陣列數(shù)據(jù)的質(zhì)量就重復(fù)性而言是卓越的，并且NOR FC中的全局表達(dá)樣式不同于NOD FC。在ANOVA分析后，在熱圖中顯示了一批18種基因，其通過(guò)來(lái)自總數(shù)45，101個(gè)探針集的FDR控制分析揭示(圖1A)。在這18種基因中，胞質(zhì)分裂獻(xiàn)呈物2(D0CK2)鑒定為具有最顯著差異的基因(NOD FC對(duì)NOR FC，倍數(shù)變化-21，P = L 04xl0_7)。ARHGAP18表達(dá)也是前18種最顯著差異的基因之一(NOD FC對(duì)NOR FC，倍數(shù)變化+18，P = 7.61x10〃)。D0CK2和ARHGAP18兩者存在于調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞遷移中已知的小GTP酶活化途徑中。NOR FC對(duì)NOD FC的均值log2表達(dá)數(shù)值的散布圖比較也證明了兩種感興趣基因。顯示了 D0CK2表達(dá)是下調(diào)的，而ARHGAP18是上調(diào)的(圖1B)。這些數(shù)據(jù)提示了細(xì)胞遷移中涉及的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可與FC的受損促進(jìn)功能有關(guān)。
[0096]為了驗(yàn)證D0CK2表達(dá)的微陣列數(shù)據(jù)，實(shí)施定量實(shí)時(shí)RT-PCR (qRT-PCR)以比較NORFC和NOD FC之間的D0CK2RNA表達(dá)。如由定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)(MIQE)指南出版物的最小信息提示的(Bustin等，2009, Clin.Chem.，611-22),通過(guò)熔解曲線分析和瓊脂糖凝膠分析確認(rèn)基于SYBR Green的qRT - PCR的特異性。與NOR FC相比，NOD FC中的D0CK2RNA表達(dá)降低1.67倍(圖1C)。然后，在從單獨(dú)小鼠分選的FC中實(shí)施D0CK2蛋白的免疫熒光染色，并且運(yùn)行高含量圖像分析(圖9)。觀察到在FC細(xì)胞離心涂片器樣品中的2000個(gè)細(xì)胞的高含量圖像分析中，NOR FC比NOD FC具有更高百分比的D0CK2陽(yáng)性細(xì)胞(圖1D)。從這兩個(gè)測(cè)定法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)確認(rèn)來(lái)自微陣列分析的觀察結(jié)果，即NOD FC具有顯著的D0CK2表達(dá)缺乏。
[0097]實(shí)施例18:FC需要D0CK2來(lái)介導(dǎo)體內(nèi)促講
[0098]利用FC功能的同基因和異基因模型兩者來(lái)測(cè)定D0CK2對(duì)于體內(nèi)FC功能是否是至關(guān)重要的。在同基因模型中(Grimes等，2004，Exp.Hematol.,32:946-54)(其中HSC數(shù)目是有限的)，發(fā)現(xiàn)D0CK2對(duì)于FC功能是至關(guān)重要的。將500個(gè)B6KSL細(xì)胞分選，并單獨(dú)或與B6WT FC或與D0CK2+FC —起移植到消融的B6接受體中。與WT B6FC相比，與HSC —起施用D0CK2+FC導(dǎo)致顯著受損的后果(圖2A)。類似地，在異基因模型中測(cè)試D0CK2+FC時(shí)，F(xiàn)C功能是顯著受損的(圖2B)。如預(yù)期的，F(xiàn)C自身在任一種模型中沒(méi)有展現(xiàn)出再生能力(圖2A和2B)。對(duì)于這兩種模型，用D0CK2+FC及HSC得到的結(jié)果沒(méi)有顯著不同于單獨(dú)的HSC(圖2A和2B)?？傊@些數(shù)據(jù)證明了 D0CK2在FC功能中至關(guān)重要的作用。
[0099]實(shí)施 例19 =D0CK2^FC在其增強(qiáng)HSC歸巢和沉淀的能力上是顯著受損的。
[0100]認(rèn)為骨髓小生境內(nèi)HSC的歸巢和沉淀是嫁接的重要前提。因此，通過(guò)使用體內(nèi)同基因歸巢模型，接著進(jìn)行CFC測(cè)定法評(píng)估D0CK2+FC是否不能提升HSC歸巢和保留。從在單獨(dú)的FC或單獨(dú)的條件化情況中移植的小鼠收獲的骨髓細(xì)胞沒(méi)有生成集落。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)在超致死劑量的TBI后沒(méi)有留下接受體HSC，并且FC自身沒(méi)有體內(nèi)再生能力。值得注意地，與僅用HSC移植的小鼠收獲的骨髓細(xì)胞相比，從用HSC和FC移植的小鼠收獲的骨髓細(xì)胞形成顯著更高數(shù)目的集落(圖3A)。然而，與用B6WT FC和HSC移植的小鼠相比，反映接受體骨髓內(nèi)功能性供體HSC保留的集落形成在D0CK2+FC與HSC共移植時(shí)是顯著降低的(圖3B)，這提示了 D0CK2+FC在骨髓微環(huán)境內(nèi)不能增強(qiáng)HSC規(guī)程和沉淀。
[0101]實(shí)施例20 =DOCI^zzzFC與WT B6FC具有類似的亞群概況
[0102]為了解決D0CK2+FC的受損功能不是由于FC亞群概況的差異所致的可能性，測(cè)定先前表征為 FC 的亞群(Fugier-Vivier 等,2005, J.Exp.Med., 201:373-83 ； Kaufman等，1994，Blood, 84: 2436-46)。D0CK2+FC 和 WT FC 之間在亞群概況(P-preDC B220+/CDllc+/CDlIF 或 PDCA-1+/CD1 lcint/CDllb)方面沒(méi)有顯著差異(圖 4)。
[0103]實(shí)施例21 =D0CK2^FC展現(xiàn)出受損的對(duì)SDF-1的體外遷移和受損的對(duì)骨髓微環(huán)境的體內(nèi)歸巢
[0104]趨化因子受體CXCR4在HSC歸巢中發(fā)揮樞要的作用。然后，測(cè)定FC對(duì)HSC歸巢的影響是否由提高HSC中CXCR4表達(dá)的FC介導(dǎo)。在體外共培養(yǎng)HSC和FC后18小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HSC中的CXCR4表達(dá)。與單獨(dú)培養(yǎng)的HSC相比，F(xiàn)C與HSC的一起溫育沒(méi)有導(dǎo)致HSC中CXCR4表達(dá)的任何變化(圖10)。先前的研究提示了 FC和HSC之間的細(xì)胞:細(xì)胞相互作用對(duì)于FC促進(jìn)(facilitation)是必需的。因此，調(diào)查了 D0CK2+FC在遷移方面是否是受損的。通過(guò)Transwell遷移測(cè)定法測(cè)定D0CK2+FC的趨化性，并且對(duì)非照射的B6接受體移植FC后18小時(shí)在脾、胸腺及股骨和脛骨骨髓中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)計(jì)算經(jīng)CellTracker Green標(biāo)記的FC。D0CK2+FC在對(duì)α -趨化因子，即200ng/ml劑量的基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1，CXCL12)的遷移中顯著受損(圖5A)。胸腺中沒(méi)有檢出經(jīng)CellTrackerGreen標(biāo)記的FC。向脾歸巢的D0CK2+FC的數(shù)目與WT B6FC相當(dāng)。然而，F(xiàn)C對(duì)股骨和脛骨骨髓的歸巢在D0CK2+FC中是顯著受損的(圖5B)。
[0105]實(shí)施例22 AOCI^zzzFC能夠促講HSC集落形成，佰是不能陽(yáng).lh HSC體外凋亡。
[0106]然后，測(cè)試了 FC中的D0CK2缺陷是否影響FC促進(jìn)HSC集落形成并阻止HSC體外凋亡的能力。在將FC與HSC直接混合且不需要FC歸巢時(shí)，D0CK2+FC和WT B6FC之間在集落形成方面沒(méi)有顯著差異(圖6A)。然而，在與HSC共培養(yǎng)時(shí)，D0CK2+FC在阻止HSC凋亡方面是受損的(圖6B)。
[0107]實(shí)施例23 =D0CK2^FC完全喪失在體外誘導(dǎo)Treg和Trl細(xì)胞的能力
[0108]先前發(fā)現(xiàn)了 FC在體外和在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)。最近的研究證明了 D0CK2+DC是抗原攝取和呈遞缺陷的。因此，評(píng)估D0CK2+FC是否可以誘導(dǎo)Ireg和Trl免疫抑制細(xì)胞。如預(yù)期，WT FC在體外誘導(dǎo)⑶4+⑶25+FoxP3+T,eg和IL-10生成性Trl細(xì)胞的生成，而D0CK2缺陷完全消除FC誘導(dǎo)TMg和Trl細(xì)胞生成的能力(圖7A，B)。此外，D0CK2+FC對(duì)珠的攝取與WT FC對(duì)其的攝取相比顯著受損(圖7C)。
[0109]實(shí)施例24:小分?jǐn)?shù)的FC亞群是CXCL12牛成件細(xì)朐和0)16^巨噬細(xì)朐
[0110]通過(guò)在非照射的接受體和致死照射的接受體兩者的股骨和脛骨的冷凍骨切片中鑒定經(jīng)CellTracker Green標(biāo)記的FC確認(rèn)FC對(duì)骨髓小生境的歸巢(圖8A)。這些數(shù)據(jù)提示了對(duì)骨髓小生境的歸巢可以是FC功能的前提。富含CXCL12 (SDF-1)的網(wǎng)狀(CAR)細(xì)胞、血管周間充質(zhì)細(xì)胞(Nestin+)和骨髓⑶169+巨噬細(xì)胞是HSC血管周小生境的推定組分。存在有SDF-1方面呈陽(yáng)性的5% FC，且D0CK2+FC和WT B6FC之間沒(méi)有顯著差異(圖8B)。還在培養(yǎng)的FC的100 μ I上清液中檢出低濃度(0.2ng/ml)的SDF-1 (圖11)。另外，發(fā)現(xiàn)了3% FC是169+巨噬細(xì)胞(圖8C)。
[0111]應(yīng)當(dāng)理解，雖然主題的方法和組合物在本文中已經(jīng)結(jié)合許多不同方面進(jìn)行了描述，各個(gè)方面的前述描述意圖例示而非限制主題方法和組合物的范圍。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
[0112]公開(kāi)了方法和組合物，所述方法和組合物可以用于公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)物，可以與公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)物結(jié)合使用，可以用于制備公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)物，或者是公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)物。本文中公開(kāi)了這些和其它材料，并且應(yīng)當(dāng)理解，公開(kāi)了這些方法和組合物的組合、子集、相互作用、組，等等。也就是說(shuō)，雖然可以不明確公開(kāi)具體提及這些組合物和方法的每個(gè)不同個(gè)體和集合組合和置換，在本文中明確涵蓋并描述每種。例如，若公開(kāi)并描述主題的特定組合物或特定方法并且討論許多組合物或方法，則明確涵蓋組合物和方法的每種組合和置換，除非明確相反指示。同樣地，還明確涵蓋并公開(kāi)這些的任何子集或組合。
【權(quán)利要求】
1.一種擴(kuò)充FC的方法，其包括下列步驟: 使所述FC與D0CK2多肽接觸。
2.一種擴(kuò)充干細(xì)胞(IPC ;HSC ;臍帶血等)的方法，其包括下列步驟: 使所述干細(xì)胞與D0CK2多肽接觸。
3.一種在接受體中改善供體HSC的嫁接的方法，其包括下列步驟: 將治療性細(xì)胞組合物移植到患者中， 其中在存在D0CK2多肽的情況中擴(kuò)充和/或移植所述治療性細(xì)胞組合物。
4.一種上調(diào)FC中的D0CK2表達(dá)的方法，其包括下列步驟: 使FC與上調(diào)D0CK2表達(dá)的鋅指核酸接觸。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述D0CK2多肽是人D0CK2多肽。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述D0CK2多肽是重組D0CK2融合多肽。
7.一種篩選提高D0C K2表達(dá)的化合物的方法，其包括下列步驟: 使D0CK2表達(dá)細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；并 測(cè)定D0CK2RNA或蛋白質(zhì)的量， 其中與不與所述測(cè)試化合物接觸的細(xì)胞中的D0CK2RNA或蛋白質(zhì)的量相比在存在所述測(cè)試化合物的情況中的D0CK2RNA或蛋白質(zhì)增加指示提高D0CK2表達(dá)的化合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述D0CK2表達(dá)細(xì)胞是D0CK2表達(dá)造血細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述D0CK2表達(dá)造血細(xì)胞是FC。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述DOCK2表達(dá)細(xì)胞是表達(dá)重組DOCK2核酸的細(xì)胞。
11.一種篩選降低Arhgapl8表達(dá)的化合物的方法,其包括下列步驟: 使Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；并 測(cè)定Arhgapl8RNA或蛋白質(zhì)的量， 其中與不與所述測(cè)試化合物接觸的Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞中的Arhgapl8RNA或蛋白質(zhì)的量相比在存在所述測(cè)試化合物的情況中的Arhgap 18RNA或蛋白質(zhì)減少指示降低Arhgap 18表達(dá)的化合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述Arhgapl8表達(dá)細(xì)胞是Arhgapl8表達(dá)造血細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述Arhgapl8表達(dá)造血細(xì)胞是FC。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述Arhgap18表達(dá)細(xì)胞是表達(dá)重組Arhgap18核酸的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)的方法，其中使用Northern印跡測(cè)定RNA的量。
16.權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)的方法，其中使用ELISA測(cè)定蛋白質(zhì)的量。
17.—種篩選提高FC向趨化因子遷移的化合物的方法，其包括下列步驟: 使FC與測(cè)試化合物接觸，其中在趨化因子附近培養(yǎng)所述FC ;并 測(cè)定與尚未與所述測(cè)試化合物接觸的FC的遷移相比FC向所述趨化因子的遷移是否有升高，其中與在缺乏所述測(cè)試化合物的情況中所述FC向所述趨化因子的遷移相比在存在所述測(cè)試化合物的情況中所述FC向所述趨化因子的遷移升高指示提高FC向趨化因子遷移的化合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述趨化因子是SDF-1。
19.權(quán)利要求17的方法,其中所述方法使用Trans-well遷移。
20.權(quán)利要求7至19中任一項(xiàng)的方法，其中所述FC是純化的。
21.權(quán)利要求7至20中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物選自下組:小分子、多肽、合成化合物、天然存在的化合物、抗體、抗原結(jié)合片段、和抗原。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103958668SQ201280057653
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月23日
【發(fā)明者】S.T.伊爾德斯塔德, M.J.埃利奧特 申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)公司