冷凍保存來源于多能干細胞的組織的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供冷凍保存來源于多能干細胞的組織的方法，所述方法包括以下(1)至(3)：(1)使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸，(2)將在所述第一步中與所述細胞保護溶液接觸的所述來源于多能干細胞的組織保持在冷凍保存溶液中，以及，(3)在冷卻劑存在下，冷凍保存在所述第二步中被保持在所述冷凍保存溶液中的所述來源于多能干細胞的組織。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以提供穩(wěn)定的來源于多能干細胞的組織的保存方法。
【專利說明】冷凍保存來源于多能干細胞的組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及來源于多能干細胞的組織的冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織是具有一定構(gòu)造的細胞群體的結(jié)構(gòu)，其中形狀和性質(zhì)不同的多種類型的細胞在空間上被布置成特定的模式。
[0003]例如，作為眼球的組成元件之一的視網(wǎng)膜組織是類似膜的組織，其覆蓋眼球后部的內(nèi)壁，并且視網(wǎng)膜組織具有層結(jié)構(gòu)，其中神經(jīng)細胞有規(guī)律地排列。視網(wǎng)膜含有五種類型的極大分化的神經(jīng)細胞:視細胞，雙極細胞，水平細胞，無長突細胞，和神經(jīng)節(jié)細胞。視細胞將光轉(zhuǎn)化為電信號并且信息經(jīng)由化學(xué)突觸被傳遞至雙極細胞和水平細胞。雙極細胞與無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞形成突觸連接，并且作為視神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)細胞的軸突與腦中的視覺中樞通訊。為了視網(wǎng)膜疾病的治療，病因?qū)W的研究，藥物發(fā)現(xiàn)中效力和安全性的研究，至今進行細胞移植治療等。然而，難以獲得成為所述研究的材料的、反映人生物學(xué)組織的、具有層結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜組織。
[0004]近年來，已經(jīng) 報道了通過誘導(dǎo)多能干細胞如ES細胞的分化來制備比得上活體中的視網(wǎng)膜組織的視網(wǎng)膜組織(非專利文獻I)。為了將通過多能干細胞的分化獲得的組織用于再生醫(yī)學(xué)、安全性試驗等，穩(wěn)定供應(yīng)大量具有一致品質(zhì)的組織是必要的。另一方面，通過多能干細胞的分化來制備各種組織需要給定的或較長的分化誘導(dǎo)時間，如由以下所示:例如由人ES細胞制備視網(wǎng)膜組織需要不小于3周的時間。并且，分化誘導(dǎo)的效率通常取決于分化誘導(dǎo)的處理而改變。因此，當(dāng)在使用時逐個制備這樣的組織時，實際的實踐是困難的，并且非常需要用于在分化誘導(dǎo)過程中的特定階段保存所述組織的技術(shù)。
[0005][文獻列表]
[0006][非專利文獻]
[0007]非專利文獻1:M.Eiraku 等，Nature472, p51-56 (2011): Se I f-or gan i z ingoptic-cup morphogenesis in three-dimensional culture (三維培養(yǎng)中的自組織視杯形態(tài)發(fā)生)
[0008]發(fā)明概述
[0009]發(fā)明要解決的問題
[0010]為了穩(wěn)定供應(yīng)大量的用于再生醫(yī)學(xué)、安全性和效率評估等的來源于多能干細胞的組織，急切需要開發(fā)組織的保存方法。
[0011]解決問題的方式
[0012]本發(fā)明的發(fā)明人鑒于所述情況而進行了大量研究并且發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定保存來源于多能干細胞的組織的方法，這導(dǎo)致了本發(fā)明。
[0013]因此，本發(fā)明提供以下。
[0014][I]冷凍保存來源于多能干細胞的組織的方法，所述方法包括以下(I)至(3):
[0015](I)第一步，使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸，
[0016](2)第二步，將在所述第一步中與所述細胞保護溶液接觸的所述來源于多能干細胞的組織保持在冷凍保存溶液中，
[0017](3)第三步，在冷卻劑存在下，冷凍保存在所述第二步中被保持在所述冷凍保存溶液中的所述來源于多能干細胞的組織。
[0018][2]前述[I]的冷凍保存方法，其中所述含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液是含有亞砜、鏈狀多元醇和寡糖的細胞保護溶液。
[0019][3]前述[2]的冷凍保存方法，其中所述細胞保護溶液的亞砜濃度為5至15%，鏈狀多元醇濃度為4至15%，并且寡糖濃度為5至20%。
[0020][4]前述[2]或[3]的冷凍保存方法，其中所述亞砜是二甲亞砜并且所述鏈狀多元醇是乙二醇并且所述寡糖是蔗糖。
[0021][5]前述[I]至[4]中任一項的冷凍保存方法，其中上述多能干細胞是人多能干細胞。
[0022][6]前述[I]至[5]中任一項的冷凍保存方法，其中所述組織是腦神經(jīng)組織。
[0023][7]前述[I]至[5]中任一項的冷凍保存方法，其中所述組織是視網(wǎng)膜組織。
[0024][8]前述[I]至[7]中任一項的冷凍保存方法，其中所述第三步以不小于10°C /min的降溫速率進行。
[0025][9]前述[I]至[8]中任一項的冷凍保存方法，其中所述冷卻劑是液氮。
[0026][10]前述[I]至[9]中任一項的冷凍保存方法，其中所述冷凍保存溶液是含有二甲亞砜、乙酰胺和丙二醇的冷凍保存溶液。
[0027][11]前述[10]的冷凍保存方法，其中二甲亞砜的濃度為I至4M并且乙酰胺的濃度為0.5至2M并且丙二醇的濃度為1.5至6M。
[0028][12]用于冷凍保存來源于多能干細胞的組織的細胞保護溶液，其包含亞砜和鏈狀
多元醇。
[0029][13]前述[12]的細胞保護溶液，其還包含寡糖。
[0030]發(fā)明效果
[0031]本發(fā)明使得能夠穩(wěn)定保存來源于多能干細胞的組織。
[0032]附圖簡述
[0033]圖1是這樣的視圖，其顯示通過分化誘導(dǎo)RAX::綠色熒光蛋白(下文中，有時被稱為“GFP”)敲入人ES細胞獲得的聚集體中產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織的光場圖像。
[0034]圖2是這樣的視圖，其顯示圖1中所示的具有視網(wǎng)膜組織的聚集體的熒光圖像。
[0035]圖3是這樣的視圖，其顯示在從聚集體分離后培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的光場圖像。
[0036]圖4是這樣的視圖，其顯示圖3中所示的視網(wǎng)膜組織的熒光圖像。
[0037] 圖5是這樣的視圖，其顯示利用抗-GFP抗體、抗-ChxlO抗體、抗_Pax6抗體或抗-Brn3抗體的從聚集體分離后培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的冷凍切片的免疫染色的結(jié)果。
[0038]圖6是這樣的視圖，其顯示從聚集體分離后培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的狀態(tài)，其是，未冷凍的作為實驗的對照(A，B)，冷凍而不與細胞保護溶液接觸(C，D)，在利用含有11.0% (w/V) 二甲亞砜(DMSO)的溶液滲透處理后冷凍(E，F(xiàn))，在利用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和5.55% (w/v)乙二醇的溶液滲透處理后冷凍(G，H)，以及在利用含有11.0% (w/V) 二甲亞砜(DMSO)，5.55% (w/v)乙二醇和10% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后冷凍(I，J)。
[0039]圖7是這樣的視圖，其顯示從聚集體分離后培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的狀態(tài)，其是，未冷凍的作為實驗的對照(A，B)，在利用含有5% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后冷凍(C，D)，在利用含有10% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后冷凍(E，F(xiàn))，在利用含有20% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后冷凍(G，H)，在利用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和10% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后冷凍(I，J)，在利用含有5.55% (w/v)乙二醇和10% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后冷凍(K，L)。
[0040]圖8是這樣的視圖，其顯示從聚集體分離后培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的冷凍切片的利用抗-GFP 抗體(A，C，E)，抗-ChxlO 抗體(B)，抗-ChxlO 和抗-Pax6 抗體(D)，抗-ChxlO 和抗-TuJl抗體(F)的免疫染色的結(jié)果，所述視網(wǎng)膜組織在利用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和5.55% (w/v)乙二醇的溶液滲透處理后(A，B)以及在利用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)，5.55% (w/v)乙二醇和10% (w/v)蔗糖的溶液滲透處理后(C，D，E，F(xiàn))被冷凍。
[0041]實施發(fā)明的方式
[0042]以下詳細地說明實施本發(fā)明的方式。
[0043]在本發(fā)明中，“轉(zhuǎn)化體”是指通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的有生命的物質(zhì)如細胞的全部或部分。轉(zhuǎn)化體的實例包括原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆蟲細胞等。根據(jù)靶標，轉(zhuǎn)化體有時也被稱為轉(zhuǎn)化細胞，轉(zhuǎn)化組織，轉(zhuǎn)化宿主等。用于本發(fā)明的細胞也可以是轉(zhuǎn)化體。
[0044]用于涉及本發(fā)明的遺傳改造技術(shù)的原核細胞的實例包括屬于埃希氏菌屬(genusEscherichia),沙雷氏菌屬(genus Serratia),芽抱桿菌屬(genus Bacillus),短桿菌屬(genus Brevibacterium),棒桿菌屬(genus Corynebacterium),微桿菌屬(genusMicrobacterium),假單胞菌屬(genus Pseudomonas)等的原核細胞,具體地包括,埃希氏菌XLl-Blue，埃希氏菌XL2-Blue，埃希氏菌DHl等。這些細胞具體描述于，例如，Sambrook, J和 Russell, D.W.的 “Molecular Cloning (分子克隆)(第 3 版)”，附錄 3 (卷 3), Vectorand Bacterial strains (載體和菌株).A3.2 (Cold Spring Harbor USA2001)。
[0045]涉及本發(fā)明的“載體”是指能夠?qū)⑺璧亩嗪塑账嵝蛄修D(zhuǎn)移到目標細胞中的載體。這樣的載體的實例包括能夠在宿主細胞如原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆蟲細胞，動物個體和植物個體等中自主復(fù)制的那些，或允許整合到染色體中并且在適于多核苷酸轉(zhuǎn)錄的位置處含有啟動子的那些等等。
[0046]在所述載體中，適于克隆的載體有時被稱為“克隆載體”。這樣的克隆載體通常具有含有多個限制酶位點的多個克隆位點。目前，有很多載體可用于相關(guān)領(lǐng)域中的基因克隆，并且它們被經(jīng)銷商以不同的名稱銷售，因為它們稍有不同(例如，多克隆位點處的限制酶的種類和序列)。例如，代表的克隆載體描述于(經(jīng)銷商也被描述)Sambix)0k，J和Russell, D.W.的“Molecular Cloning (分子克隆)(第 3 版)”，附錄 3 (卷 3), Vector andBacterial strains (載體和菌株).Α3.2 (Cold Spring Harbor USA2001),并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)目標適當(dāng)?shù)厥褂盟鼈儭?br> [0047]涉及本發(fā)明的“載體”還包括“表達載體”，“報告載體”，和“重組載體”。“表達載體”是指這樣的核酸序列，其中除了結(jié)構(gòu)基因和啟動子以外的調(diào)節(jié)其表達的各種調(diào)節(jié)元件可操作地連接于宿主細胞中。“調(diào)節(jié)元件”的實例包括終止子，選擇標記如藥物抗性基因，以及含有增強子的調(diào)節(jié)元件等。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，使用的有生命的物質(zhì)(例如，動物)的表達載體的類型和調(diào)節(jié)元件的類型可以根據(jù)宿主細胞而改變。
[0048]涉及本發(fā)明的“重組載體”的實例包括(a)用于基因組文庫篩選的λ FIX載體(噬菌體載體)，(b)用于cDNA篩選的λ ZAP載體(噬菌體載體)，(c)用于克隆基因組DNA的pBluescript II SK+/-載體，pGEM載體，pCR2.1載體(質(zhì)粒載體)，等等?！氨磉_載體”的實例包括 pSV2/neo 載體,pcDNA 載體,pUC18 載體,pUC19 載體,pRc/RSV 載體,pLenti6/V5_Dest載體，pAd/CMV/V5_DEST 載體，pDON-A1-2/neo 載體，pME1-5/neo 載體等(質(zhì)粒載體)等?！皥蟾孑d體”的實例包括PGL2載體，pGL3載體，pGL4.10載體，pGL4.11載體，pGL4.12載體，PGL4.70 載體，pGL4.71 載體，pGL4.72 載體，pSLG 載體，pSLO 載體，pSLR 載體，pEGFP 載體，pAcGFP載體，pDsRed載體等。根據(jù)前述Molecular Cloning(分子克隆)文獻可以適當(dāng)?shù)厥褂眠@些載體。
[0049]關(guān)于本發(fā)明，用于將核酸分子引入細胞中的技術(shù)的實例包括轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染等。作為此種引入技術(shù)，可以具體提及例如，描述于Ausubel F.A.等編輯(1988), Current Protocols in Molecular Biology,Wiley, New York, NY ；SambrookJ.等(1987)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版和第 3 版；ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；特干丨J , ExperimentalMedicine“transgene&expression analysis experiment method^ODOSHA C0., LTD., 1997等中的方法等。用于確認基因的胞內(nèi)引入的技術(shù)的實例包括RNA印跡分析，蛋白質(zhì)印跡分析或其他公知的常規(guī)技術(shù)等。 [0050]關(guān)于本發(fā)明，載體引入方法的實例包括轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化等(例如，磷酸鈣法，脂質(zhì)體法，DEAE-葡聚糖法，電穿孔法，使用粒子槍(基因槍)的方法等)。
[0051]本發(fā)明的冷凍保存方法是表征為包括以下(I)至(3)的冷凍保存方法:
[0052](I)第一步，使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸，
[0053](2)第二步，將在所述第一步中與所述細胞保護溶液接觸的所述來源于多能干細胞的組織保持在冷凍保存溶液中，以及，
[0054](3)第三步，在冷卻劑存在下，冷凍保存在所述第二步中被保持在所述冷凍保存溶液中的所述來源于多能干細胞的組織。
[0055]在本發(fā)明中，“干細胞”是指甚至在細胞分化后仍保持相同分化能力的細胞，并且所述細胞可以在組織損傷時再生組織。此處，干細胞可以是胚胎干細胞(ES細胞)或組織干細胞(也被稱為組織的干細胞，組織特異性干細胞或體干細胞)，或人造的多能干細胞(iPS細胞:誘導(dǎo)的多能干細胞)，但不限于此。如從上述來源于干細胞的組織細胞可以再生組織的事實理解的，已知干細胞可以分化為與活體中的細胞接近的正常細胞。
[0056]干細胞可以獲得自給定的組織，或者也可以購買市售產(chǎn)品。例如，人胚胎干細胞，KhES-1, KhES-2 和 KhES-3 可獲得自 Kyoto University 的前沿醫(yī)學(xué)研究所(Institute forFrontier Medical Sciences)。小鼠胚胎干細胞的實例包括EB5細胞等。
[0057]干細胞可以通過根據(jù)本身已知的方法培養(yǎng)來維持。例如，干細胞可以通過補充以胎牛血清(FCS)、敲除血清置換物(Knockout Serum Replacement, KSR)和LIF的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)來維持。[0058]在本發(fā)明中，“多能干細胞”是指這樣的干細胞，其可以在體外培養(yǎng)并且有能力分化成構(gòu)成除胎盤以外的活體的任何細胞(來源于三胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)的組織)(多能性)，其包括胚胎干細胞(ES細胞)?！岸嗄芨杉毎鲍@得自受精卵，克隆胚胎，再生干細胞，和組織中的干細胞。其還包括，在向體細胞中引入若干種基因后具有類似于胚胎干細胞的多能性的人工多能性的細胞(也被稱為人造多能干細胞)。多能干細胞可以通過本身已知的方法制備。制備方法的實例包括描述于Celll31(5)pp.861-872(2007)，Celll26(4)pp.663-676(2006)等中的方法。
[0059] 在本發(fā)明中，“胚胎干細胞(ES細胞)”是指具有自身復(fù)制能力和多能性(即，“多能性”)的干細胞，其是源自早期胚胎的多能干細胞。胚胎干細胞首先建立于1981年，并且自1989年起已被應(yīng)用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干細胞，其也被用于再生醫(yī)學(xué)。
[0060]在本發(fā)明中，“人造多能干細胞”是指通過直接重編程分化的細胞如成纖維細胞等，通過表達若干種基因如0ct3/4、Sox2、Klf4> Myc等被誘導(dǎo)而具有多能性的細胞,其在2006 年由 Yamanaka 等在小鼠細胞中建立(Takahashi K, Yamanaka S.Cell.2006,126(4)，P663-676)。在2007年，其也在人成纖維細胞中被建立，并且具有類似于胚胎干細胞的多倉泛性(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, YamanakaS.Cell.2007, 131 (5), p861_872.；Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-BourgetJ, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, ThomsonJA., Science.2007,318 (5858),pl917-1920.；Nakagawa M,Koyanagi M,TanabeK,Takahashi K, Ichisaka T,Aoi T,Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S.NatBiotechnol., 2008, 26(I), p 101-106)。
[0061]在本發(fā)明中，“分化”是指這樣的現(xiàn)象，其中在來源于單個細胞的分裂的子細胞群體中產(chǎn)生在形態(tài)上和/或功能上具有不同品質(zhì)的兩種以上類型的細胞。因此，分化中也包括這樣的過程，其中來源于本身不具有可檢測的特殊特性的細胞的細胞群體(細胞譜系)變得顯示清楚的特性如產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)等。目前通常認為，細胞分化是基因組中的特定基因群體被表達的狀態(tài)，并且細胞分化可以通過尋找導(dǎo)致此種基因表達狀態(tài)的胞內(nèi)或胞外因素或狀況來鑒別。原則上，細胞分化的結(jié)果是穩(wěn)定的，并且向其他類型的細胞分化僅格外特別地發(fā)生在動物細胞中。
[0062]在本發(fā)明中，“組織”是指細胞群體的結(jié)構(gòu)，其具有一定的構(gòu)造，其中形狀和性質(zhì)不同的多種類型的細胞在空間上被布置成特定的模式，并且本發(fā)明中的“來源于多能干細胞的組織”是指通過誘導(dǎo)多能干細胞分化獲得的細胞的聚集體，其是細胞群體的結(jié)構(gòu)，其具有一定的構(gòu)造，其中形狀和性質(zhì)不同的多種類型的細胞在空間上被布置成特定的模式。
[0063]通過誘導(dǎo)多能干細胞分化獲得的細胞的實例包括大腦神經(jīng)細胞，間腦神經(jīng)細胞，下丘腦神經(jīng)細胞，基底核神經(jīng)細胞，小腦神經(jīng)細胞，腸組織細胞，心肌細胞，胰腺細胞，肝細胞，及其先祖細胞。具體地，其可以根據(jù)以下制備:W02009/148170，J Neurosc1.2011Feb2 ；31(5):1919-33, Nat Neurosc1.20100ct ；13(10):1171-80, Cell Stem Cell.2008Nov6 ；3(5):519-32, Proc Natl Acad Sci USA.2008Augl9 ； 105 (33):11796-801,Nature.2011Feb3;470 (7332):105-9, Nat Biotechnol.2011Mar ；29(3):267-72,Cell Stem Cell.2011Feb4 ；8(2):228-40, Development.201IMar ； 138 (5):861-71,Nat Biotechnol.2006Nov ；24(11):1402-11。
[0064]在本發(fā)明中，“腦神經(jīng)組織”是指這樣的結(jié)構(gòu)，其中，在活體的大腦，間腦，中腦，小腦和后腦中，至少構(gòu)成各神經(jīng)層的多類細胞及其先祖細胞(例如，在大腦的情況中，第6層特有的Tbrl陽性細胞，第5層特有的Crip2陽性細胞，第2_3層特有的Brn2陽性細胞等)在空間上被布置成層。作為腦神經(jīng)組織的部分，可以提及視網(wǎng)膜組織?！耙暰W(wǎng)膜組織”是指這樣的視網(wǎng)膜組織，其中至少構(gòu)成活體視網(wǎng)膜中相應(yīng)的視網(wǎng)膜層的多類細胞如視細胞，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，其先祖細胞等，在空間上被布置成層。關(guān)于每種細胞，哪種細胞構(gòu)成視網(wǎng)膜的哪一層可以通過已知方法確認，所述方法是基于例如以下的表達:細胞標記物(ChxlO (雙極細胞)，L7 (雙極細胞)，Tuj I (神經(jīng)節(jié)細胞)，Brn3 (神經(jīng)節(jié)細胞)，1丐視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)(無長突細胞)，鈣結(jié)合蛋白(Calbindin)(水平細胞)，恢復(fù)蛋白(Recoverin)(視細胞)，視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)(視細胞)，RPE65 (色素上皮細胞)，Mitf (色素上皮細胞)等)。[0065]例如，視網(wǎng)膜組織可以通過分化人ES細胞制備，具體地，通過Nature472，p51-56(2011)和W02011/055855中所述的方法制備。
[0066]在本發(fā)明中，“冷凍保護溶液”是指冷凍保護劑和溶劑的混合物?！袄鋬霰Ｗo劑”是這樣的物質(zhì)，其在細胞的冷凍保存期間被加入以防止由冷凍所致的多種失調(diào)，試圖盡可能多地保持細胞的功能和存活率?？梢蕴峒袄鋬霰Ｗo溶液，并且其與細胞保護溶液具有相同含義，因為其在冷凍期間保護細胞。
[0067]在本發(fā)明中，細胞保護溶液(冷凍保護溶液)含有亞砜和鏈狀多元醇作為冷凍保護劑，并且優(yōu)選地含有亞砜、鏈狀多元醇和寡糖。具體地，例如，亞砜如二甲亞砜(DMSO)等；鏈狀多元醇如乙二醇、甘油，丙二醇(propanediol),丙二醇(propylene glycol), 丁二醇，聚乙二醇等，并且優(yōu)選地還含有寡糖如蔗糖，海藻糖，乳糖，棉子糖等。需要時，可以加入酰胺化合物如乙酰胺等，percoll, ficoll70, ficoll70000,聚乙烯吡咯燒酮等。
[0068]溶劑的實例包括緩沖劑如鹽水，PBS, EBSS, HBSS等，用于培養(yǎng)細胞、組織等的培養(yǎng)基如 DMEM, GMEM, RPMI 等，血清，血清替代物(Knock Out Serum Replacement:Invitrogen),它們的混合物等。
[0069]在本發(fā)明中，亞砜在細胞保護溶液(冷凍保護溶液)中的終濃度為，例如，5至15% (w/v),優(yōu)選為 9 至 13% (w/v),更優(yōu)選為約 11% (w/v)。
[0070]在本發(fā)明中，鏈狀多元醇在細胞保護溶液(冷凍保護溶液)中的終濃度為，例如，4M 15% (w/v),優(yōu)選為 4.5%至 8% (v/v),更優(yōu)選為約 5.5% (v/v)。
[0071]在本發(fā)明中，寡糖在細胞保護溶液(冷凍保護溶液)中的終濃度為，例如，5至20% (w/v),優(yōu)選為 8 至 12% (w/v),更優(yōu)選為約 10% (w/v)。
[0072]在本發(fā)明中，“冷凍保存溶液”是指用于冷凍保存來源于多能干細胞的組織的介質(zhì)。作為冷凍保存溶液，也可以使用市售產(chǎn)品如細胞BANKERl，lplus，2，3(JUJI FIELDINC.), TC-Protector (DS Pharma Biomedical C0., Ltd.),人 ES/iPS 細胞用冷凍介質(zhì)(Freezing Medium for human ES/iPS Cells)(Reprocell Incorporated),無 DMSOCryoScarless(CryoScarless DMSO free)(BioVerde), StemCell Keep (BioVerde), EFS 溶液(NK system)等。
[0073]冷凍保存溶液可以是冷凍保護劑和溶劑的混合物。作為冷凍保護劑和溶劑，可以提及上述那些。
[0074]本發(fā)明中的冷凍保存溶液優(yōu)選含有二甲亞砜、乙酰胺和丙二醇。
[0075]在本發(fā)明中，二甲亞砜在冷凍保存溶液的濃度優(yōu)選為I至4M，乙酰胺的濃度優(yōu)選為0.5至2M，并且丙二醇的濃度優(yōu)選為1.5至6M。
[0076]本發(fā)明的冷凍保存方法的第一步是在冷凍前使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸的步驟。
[0077]在上述第一步中，使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸。
[0078]為了“使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸”，可以將來源于多能干細胞的組織轉(zhuǎn)移到含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液中，或者可以將含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液添加到來源于多能干細胞的組織。
[0079]將來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸的時間為，例如，Imin至180min,優(yōu)選為5min至60min,更優(yōu)選為15min至30min。來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸的溫度為，例如，-10°C至40°C，優(yōu)選為(TC至25°C，更優(yōu)選為(TC至8°C。
[0080]在上述第一步中在接觸系統(tǒng)中來源于多能干細胞的組織的密度(例如，來源于多能干細胞的組織在細胞保護溶液中的密度)為(例如，基于聚集體的數(shù)目)約I至1000個聚集體/mL，優(yōu)選為I至100個聚集體/mL。每個聚集體的細胞數(shù)為約IO3至IO6個細胞。
[0081]用于接觸細胞保護溶液的細胞培養(yǎng)容器不受特別限制，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定。所述容器的實例包括燒瓶，組織培養(yǎng)燒瓶，盤，培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)皿，多盤(multidish),微板,微孔板,微孔,多板(multiplate),多孔板,室載玻片(chamber slide),盤碟(schale),試管,碟,培養(yǎng)袋和滾瓶(roller bottle)。
[0082]本發(fā)明的冷凍保存方法的第二步是將與細胞保護溶液接觸的來源于多能干細胞的組織保持在冷凍保存溶液中的步驟。
[0083]在上述第二步中，在所述第一步中與細胞保護溶液接觸的來源于多能干細胞的組織被保持在冷凍保存溶液中。
[0084]在上述第二步中在細胞保存溶液中來源于多能干細胞的組織的密度為，例如基于聚集體的數(shù)目，約I至1000個聚集體/mL，優(yōu)選為I至100個聚集體/mL。每一個聚集體的細胞數(shù)為約IO3至IO6個細胞。
[0085]本發(fā)明的冷凍保存方法的第三步是在冷卻劑存在下，冷凍保存被保持在冷凍保存溶液中的來源于多能干細胞的組織的步驟。
[0086]作為用于“冷凍保存”組織等的方法，若干方法是已知的。代表性的冷凍保存方法是，例如，涉及以0.1至10°C/min的緩慢速率長時間冷凍的方法。該方法可以使用儀器、工具等如程序冷凍機、BICELL (NIHON FREEZER C0., LTD.)等進行。
[0087]作為快速冷凍保存方法，可以提及涉及應(yīng)用當(dāng)晶性液體或氣體快速固化時在不超過玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在不結(jié)晶的情況下發(fā)生的玻璃化現(xiàn)象的方法。該方法的優(yōu)越之處在于:提前浸入高濃度的保存溶液中的組織，胚胎和卵可以通過簡單的玻璃化操作在短時間內(nèi)被穩(wěn)定地冷凍保存。
[0088] 此處，快速冷凍保存方法是生物學(xué)樣品的冷凍方法，其包括將樣品投入冷卻劑如液氮等中。例如，可以提及涉及將來源于多能干細胞的組織和冷凍保存溶液置于冰上的冷凍管中，并且利用鑷子將前述冷凍管浸入冷卻劑中的方法。從將來源于多能干細胞的組織保持在冷凍保存溶液中到將其投入冷卻劑中的時間優(yōu)選地盡可能地短，其為30秒內(nèi)，優(yōu)選為在10秒內(nèi)。
[0089]將用于本發(fā)明的“冷卻劑”優(yōu)選為能夠?qū)е录毎ＡЩ睦鋮s劑，并且通?？梢栽?20°C以下，優(yōu)選在_80°C以下，更優(yōu)選在_150°C以下使用冷卻劑。
[0090]冷卻劑的具體實例包括液氮,氮衆(zhòng)(slush nitrogen),液氦,液體丙烷,和乙燒楽；(ethane sluch)，優(yōu)選的是液氮和氮漿。氮漿是通過將液氮保持在減壓下從而將液氮溫度降低至-205至-210°C而獲得的氮,液氮溫度在常壓下低于_196°C (Huang等，Human Reproduction, Vol.20, N0.1, pp.122-128 (2005))。當(dāng)將氮漿用作冷卻劑時，通過玻璃化的保存可以通過儀器如 Vit_Master?(IMT, Nes Ziona, Israel)等進行。
[0091]在冷卻劑存在下冷凍保存的降溫速率為，例如，不小于10°C /min，優(yōu)選不小于30°C /min,更優(yōu)選不小于50°C /min,特別優(yōu)選不小于100°C /min。
[0092]在冷卻劑存在下冷凍保存以從環(huán)境溫度達到理想的冷凍保存溫度(例如，對于液氮為-196°C )所需的時間為,例如,在5min內(nèi)，更優(yōu)選地在3min內(nèi)，進一步優(yōu)選地在Imin內(nèi)。
實施例
[0093]以下更詳細地說明本發(fā)明的實施例。 [0094](RAX敲入人ES細胞的建立)
[0095]制備人ES細胞系，其具有敲入RAX基因座的GFP，RAX是視網(wǎng)膜先祖細胞的標記基因之一。
[0096]特異性地切割人ES細胞系(KhES-1:由Kyoto University建立的人ES細胞系)的基因組DNA上的RAX基因的鋅指核酸酶(ZFN)購買自Sigma Aldrich。使用分散為單個細胞的人ES細胞，通過電穿孔法將編碼ZFN的mRNA和包含GFP和藥物選擇標記物新霉素抗性基因的敲入載體共轉(zhuǎn)染到其中，并且將細胞涂板于用絲裂霉素C處理過的新霉素抗性小鼠成纖維細胞上。在涂板后的次日向培養(yǎng)基加入G418，并進行藥物選擇。挑取獲得的抗性克隆的菌落然后培養(yǎng)，并且然后通過PCR法和DNA印跡法選擇敲入細胞，導(dǎo)致RAX::GFP敲入人ES細胞系的建立。
[0097](將RAX敲入人ES細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜組織)
[0098]使用建立的RAX::GFP敲入人ES細胞，誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜組織。
[0099]根據(jù)“Ueno，M.等 PNAS2006, 103 (25)，9554-9559 ” “Watanabe, K.等 NatBiotech2007, 25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1)并用于實驗。
[0100]使用添加有20 % KSR(敲除血清替代物(Knockout Serum Replacement)；Invitrogen) ,0.lmM2-疏基乙醇，5 至 10ng/ml bFGF 等的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen)作為培養(yǎng)基。為了通過漂浮培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜組織，將ES細胞在0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)中分散為單個細胞，并且以9 X IO3個細胞/非細胞粘附性96孔培養(yǎng)板(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE)的孔漂浮在150 μ I分化培養(yǎng)基中，以允許聚集體的快速形成，聚集體在37°C，5% CO2下培養(yǎng)。
[0101]作為用于其的分化培養(yǎng)基，使用無血清培養(yǎng)基(添加有20%KSR、Y27632等的G-MEM培養(yǎng)基)。從培養(yǎng)第2天起，將Matrigel加入到培養(yǎng)物中。在分化誘導(dǎo)開始后，從大約第12天起，通過熒光顯微鏡觀察聚集體中的GFP的表達并且，在大約第14天，表達GFP的神經(jīng)上皮樣結(jié)構(gòu)在聚集體周圍形成(圖1、圖2)。在從第18天到第30天期間，利用鑷子將神經(jīng)上皮樣結(jié)構(gòu)與聚集體分離，并且隨后在加入胎牛血清和視黃酸后在非粘附性塑料盤(schale)中進行培養(yǎng)(圖3，圖4)。制備切片，并且通過熒光免疫染色法分析分化的狀態(tài)(圖5)。例如，顯示的是，自分化誘導(dǎo)開始起40天后的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)由表達RAX基因的GFP陽性細胞構(gòu)成，并且在GFP陽性細胞中，Pax6( —種視網(wǎng)膜先祖細胞標記基因陽性細胞)，ChxlO (—種雙極細胞標記基因陽性細胞)，和Brn3( —種神經(jīng)節(jié)細胞標記基因陽性細胞)被布置成層從而形成視網(wǎng)膜組織(圖5)。
[0102]比較例I (冷凍保存通過誘導(dǎo)分化人ES細胞獲得的視網(wǎng)膜組織)
[0103]以不小于100°C /min的降溫速率冷凍保存通過分化誘導(dǎo)獲得的視網(wǎng)膜組織。
[0104]將添加有2M 二甲亞砜(DMSO)，IM乙酰胺和3M丙二醇(DAP213)的DMEM/F12培養(yǎng)基用作冷凍保存溶液。從培養(yǎng)板將約10個視網(wǎng)膜組織收集在15ml聚丙烯管中，之后除去上清并加入200 μ I的冷凍保存溶液，并將視網(wǎng)膜組織與冷凍保存溶液一起轉(zhuǎn)移到冷凍管。利用鑷子將冷凍管立即浸入液氮中，并且以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存。將冷凍管保存在_150°C的冷凍機中直至解凍。
[0105]將冷凍管從_150°C的冷凍機中取出，并將在37°C水浴中提前溫?zé)嶂?7°C的培養(yǎng)基加入到冷凍管以解凍組織。將混合物分配至15ml管中，并且將視網(wǎng)膜組織置于溫?zé)嶂?7°C的培養(yǎng)基(IOml)中，之后除去上清。將組織用PBS(IOml)洗滌并將其加入至含有培養(yǎng)基(添加有N2、10% FBS,視黃酸等的DMEM/F12培養(yǎng)基)(視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基)的漂浮培養(yǎng)皿，并在37°C培養(yǎng)。從解凍次日起進行顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察，并將上皮結(jié)構(gòu)的細胞存活狀態(tài)和外觀與未進行冷凍保存的視網(wǎng)膜組織的那些進行比較(圖6A、B)，并且核對冷凍保存成功與否。
[0106]結(jié)果，幾乎所有細胞死亡，并且觀察到很多死亡的細胞的碎片。幾乎沒有觀察到GFP的表達。因此，證明僅僅以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存不導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織的冷凍保存(圖6C、D)。
[0107]比較例2 (通過在冷凍保護劑(11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)中進行滲透處理后冷凍來冷凍保存通過誘導(dǎo)人ES細胞的分化獲得的視網(wǎng)膜組織)
[0108]在冷凍前，在含有二甲亞砜(DMSO)作為冷凍保護劑的溶液中對通過誘導(dǎo)分化獲得的視網(wǎng)膜組織進行滲透處理，并且以不小于100°c /min的降溫速率進行冷凍保存。
[0109]從培養(yǎng)板將約10至20個視網(wǎng)膜組織收集在15ml聚丙烯管中，之后除去上清并且加入預(yù)先在冰水冷卻的含有冷凍保護劑的溶液(Iml)，并將混合物在冰水靜置15min至30min。作為含有冷凍保護劑的溶液，使用添加有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)的前述視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基。除去含有冷凍保護劑的溶液，加入DAP213 (200 μ I)作為冷凍保存溶液，并將視網(wǎng)膜組織與冷凍保存溶液一起轉(zhuǎn)移至冷凍管。利用鑷子將冷凍管立即浸入液氮中，并且以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存。將冷凍管保存在_150°C的冷凍機中直至解凍。[0110]當(dāng)在使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)作為冷凍保護劑的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基滲透處理后以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存時，與不進行冷凍的對照相t匕，表達RAX的視網(wǎng)膜組織急劇減少(圖6E，F(xiàn))。
[0111]實施例1 (通過在利用冷凍保護劑(11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和5.55% (w/v)乙二醇)滲透處理后冷凍來冷凍保存通過誘導(dǎo)人ES細胞的分化獲得的視網(wǎng)膜組織)
[0112]以與比較例2相同的方式進行，不同之處在于使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和5.55% (w/v)乙二醇(EG)作為冷凍保護劑的溶液對通過分化誘導(dǎo)獲得的視網(wǎng)膜組織進行滲透處理。
[0113]當(dāng)在使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和5.55% (w/v)乙二醇(EG)的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基進行冷凍保護劑滲透處理后以不小于100°c /min的降溫速率進行冷凍保存時，相對于使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基的前述冷凍保護劑滲透處理，表達RAX 的視網(wǎng)膜組織的保存性質(zhì)得到提高(圖6G，H)，并且發(fā)現(xiàn)層結(jié)構(gòu)得以保持(圖8A，B)。
[0114]實施例2 (通過在利用冷凍保護劑(11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO), 5.55% (w/v)乙二醇(EG)和10% (w/v)蔗糖)進行滲透處理后冷凍來冷凍保存通過誘導(dǎo)人ES細胞的分化獲得的視網(wǎng)膜組織)
[0115]以與比較例2相同的方式進行，不同之處在于使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)，5.55% (w/v)乙二醇(EG)和10% (w/v)蔗糖作為冷凍保護劑的溶液對通過分化誘導(dǎo)獲得的視網(wǎng)膜組織進行滲透處理。
[0116]當(dāng)在使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)，5.55% (w/v)乙二醇(EG)和 10%(w/v)蔗糖的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基進行冷凍保護劑滲透處理后以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存時，可與未進行冷凍保存的視網(wǎng)膜組織相比的狀態(tài)得到保持，而與未進行冷凍保存的視網(wǎng)膜組織相比，GFP表達的強度稍弱。保存性質(zhì)非常好(圖61，J)，并且層結(jié)構(gòu)也得以保持(圖8C，D，E)。
[0117]比較例3 (通過在利用冷凍保護劑(蔗糖)滲透處理后冷凍來冷凍保存通過誘導(dǎo)人ES細胞的分化獲得的視網(wǎng)膜組織)
[0118]使用分別添加有5%蔗糖、添加有10%蔗糖、添加有20%蔗糖、添加有5.55% EG和10%蔗糖、以及添加有11% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和10% (w/v)蔗糖作為冷凍保護劑滲透溶液的前述視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基，通過與上述那些類似的方法進行冷凍和解凍。
[0119]當(dāng)在使用僅添加有蔗糖作為冷凍保護劑滲透溶液的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基進行滲透處理后以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存時，在5% (w/v) ,10% (w/v)和20%(w/v)中的任意濃度，與未進行冷凍的對照(圖7A，B)相比，解凍后的細胞存活性質(zhì)相當(dāng)差，并且?guī)缀鯖]有觀察到GFP表達(圖7C，D，E，F(xiàn)，G，H)。并且，當(dāng)在使用含有5.55% (w/v)EG和10% (w/v)蔗糖的視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)基進行滲透處理后以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存時，與未進行冷凍的對照相比，解凍后的細胞存活性質(zhì)相當(dāng)差，并且?guī)缀鯖]有觀察到GFP表達(圖7K，L)。當(dāng)在使用含有11.0% (w/v) 二甲亞砜(DMSO)和10% (w/v)蔗糖的進行滲透處理后以不小于100°C /min的降溫速率進行冷凍保存時，與未進行冷凍的對照相比，解凍后的細胞存活性質(zhì)是差的并且GFP表達弱，并且以可以與未進行冷凍的對照相比的狀態(tài)保存是不可能的(圖71，J)。[0120]工業(yè)實用性
[0121]根據(jù)本發(fā)明，可以提供來源于多能干細胞的組織的保存方法。
[0122]本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?011-258208(申請日:2011年11月25日)，所述日本申請 的內(nèi)容完整地結(jié)合于此。
【權(quán)利要求】
1.冷凍保存來源于多能干細胞的組織的方法，所述方法包括以下(I)至(3): (1)第一步，使來源于多能干細胞的組織與含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液接觸， (2)第二步，將在所述第一步中與所述細胞保護溶液接觸的所述來源于多能干細胞的組織保持在冷凍保存溶液中，以及 (3)第三步，在冷卻劑存在下，冷凍保存在所述第二步中被保持在所述冷凍保存溶液中的所述來源于多能干細胞的組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍保存方法，其中所述含有亞砜和鏈狀多元醇的細胞保護溶液是含有亞砜、鏈狀多元醇和寡糖的細胞保護溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的冷凍保存方法，其中所述細胞保護溶液的亞砜濃度為5至15%，鏈狀多元醇濃度為4至15%，并且寡糖濃度為5至20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或 3所述的冷凍保存方法，其中所述亞砜是二甲亞砜并且所述鏈狀多元醇是乙二醇并且所述寡糖是蔗糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的冷凍保存方法，其中所述多能干細胞是人多能干細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的冷凍保存方法，其中所述組織是腦神經(jīng)組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的冷凍保存方法，其中所述組織是視網(wǎng)膜組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的冷凍保存方法，其中所述第三步以不小于IO0C /min的降溫速率進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的冷凍保存方法，其中所述冷卻劑是液氮。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的冷凍保存方法，其中所述冷凍保存溶液是含有二甲亞砜、乙酰胺和丙二醇的冷凍保存溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的冷凍保存方法，其中二甲亞砜的濃度為I至4M并且乙酰胺的濃度為0.5至2M并且丙二醇的濃度為1.5至6M。
12.用于冷凍保存來源于多能干細胞的組織的細胞保護溶液，其包含亞砜和鏈狀多元醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細胞保護溶液，其還包含寡糖。
【文檔編號】C12N5/0789GK103958669SQ201280058085
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月25日
【發(fā)明者】安藤覺, 中野德重, 笹井芳樹, 永樂元次 申請人:住友化學(xué)株式會社, 獨立行政法人理化學(xué)研究所