與卵巢癌相關(guān)的方法和材料的制作方法
【專利摘要】本文中描述了用于診斷卵巢癌的方法。特別地，某些microRNA對(duì)于卵巢癌患者對(duì)化學(xué)療法的響應(yīng)是有用的。
【專利說明】與卵巢癌相關(guān)的方法和材料
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2011年10月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/547, 109和2012年7月 25日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/675, 449的利益，所述美國臨時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用明 確地并入本文，用于所有目的。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的聲明
[0004] 本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院（NIH/EDRN)授予的基金號(hào)U01CA152758下由美國政 府支持進(jìn)行的。美國政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005] 關(guān)于序列表的聲明
[0006] 本申請(qǐng)通過USPTO EFS-WEB服務(wù)器電子提交，如MPEP § 1730II. B. 2(a) (A)中所授 權(quán)和規(guī)定的，并且該電子提交包括電子提交的序列（SEQ ID)表。該序列表的完整內(nèi)容通過 引并入本文用于所有目的。序列表在電子地提交的.txt文件中標(biāo)識(shí)為：2012年10月11日 創(chuàng)建的 604_53324_SEQ_LIST_2012-030. txt，其大小為 3, 287 字節(jié)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0007] 本申請(qǐng)涉及醫(yī)學(xué)，特別地腫瘤學(xué)的領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及分子生物學(xué)，特別地 microRNA的領(lǐng)域。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] 卵巢癌是發(fā)達(dá)國家中婦科學(xué)癌癥相關(guān)死亡的首要原因。雖然通過改進(jìn)的減積手術(shù) (debulking surgery)和鉬-紫杉燒方案的引入在其治療上已取得進(jìn)步，但在晚期疾病中5 年總體存活率僅為29%，這主要?dú)w因于晚期的診斷和對(duì)鉬類化學(xué)療法的固有抗性和獲得性 抗性。因此,鑒定卵巢癌化療抗性（chemoresistance)的分子標(biāo)志物是至關(guān)重要的。分子 水平上的發(fā)現(xiàn)的成功翻譯將產(chǎn)生個(gè)體化治療方案，改善化學(xué)治療響應(yīng)率和避免不必要的治 療。
[0010] 特別地，上皮卵巢癌是最常見的婦科學(xué)惡性腫瘤；是高度侵襲性的并且每年引起 幾乎125, 000例死亡。盡管在檢測(cè)和細(xì)胞毒療法上取得進(jìn)展，但極低百分?jǐn)?shù)的晚期疾病患 者在初次診斷后存活5年。該疾病的高死亡率主要?dú)w因于對(duì)可獲得的療法的抗性。
[0011] MicroRNA(miR)是一類小的非編碼RNA，其調(diào)節(jié)基因表達(dá)，引起翻譯抑制、mRNA切 割或去穩(wěn)定作用。它們參與許多生理細(xì)胞過程。最重要地，不斷積累的證據(jù)表明，許多miR 在人癌癥中異常表達(dá)，并且它們的表達(dá)特征譜（profile)可對(duì)一些癌癥的分期、亞型和預(yù)后 進(jìn)行分類。
[0012] 附圖概述
[0013] 本專利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)以彩色繪制的附圖。具有彩色附圖的本專利或?qū)?利申請(qǐng)公開案的拷貝可應(yīng)要求和支付必要的費(fèi)用后由專利局提供。
[0014] 圖 1A-1D。
[0015] 圖1A.使用TLDA卡對(duì)訓(xùn)練組的分析。顯示顯著的miR。
[0016] 圖1B.鑒定的miR的圖心分析。下調(diào)的miR以綠色表示，上調(diào)的miR以紅色表示。
[0017] 圖1C.以兩個(gè)種類：非響應(yīng)者（穩(wěn)定的疾病和進(jìn)行性疾?。┖晚憫?yīng)者（完全響應(yīng) 者和部分響應(yīng)者）重新定義的訓(xùn)練組中的顯著miR。
[0018] 圖ID.訓(xùn)練組中的顯著的miR。
[0019] 圖 2A-2D。
[0020] 圖2A.用MDAH-2274對(duì)照細(xì)胞在右肋腹注射和用過表達(dá)miR-484的MDAH-2274在 左肋腹注射的小鼠的腫瘤體積。顯示了 CBDCA+Tax治療開始當(dāng)天（左圖）腫瘤的尺寸和21 天的治療后它們的增大（右圖）。
[0021] 圖2B.用SK0V-3對(duì)照細(xì)胞在右肋腹注射和用過表達(dá)miR-484的SK0V-3在左肋腹 注射的裸小鼠的體內(nèi)成像。在即將開始治療時(shí)（左圖框）和在21天的CBDCA+Tax治療后 拍攝圖像。
[0022] 圖2C. B中描述的實(shí)驗(yàn)在治療的第0天（左圖）和在7、14和21天的治療后（右 圖）的體內(nèi)EGFP熒光的定量。
[0023] 圖2D.在CBDCA+Tax治療存在的情況下表達(dá)對(duì)照（scr)或miR-484的慢病毒的瘤 內(nèi)注射的作用。在每一個(gè)圖中報(bào)告了顯著的差異，如通過非參數(shù)t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)的。當(dāng)〈0.05 時(shí)，差異被認(rèn)為是顯著的。
[0024] 圖 3A-3C。
[0025] 圖3A.左圖框：VEGFB的3' UTR中潛在miRs-484結(jié)合位點(diǎn)的比對(duì)。中間圖框：在 293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-484后VEGFB的Western印跡分析。右圖框：微管蛋白與VEGFB的表 達(dá)之間的光密度比值（densitometric ratio)。
[0026] 圖3Β·左圖框：VEGFR2的3' UTR中潛在miRs-484結(jié)合位點(diǎn)的比對(duì)。中間圖框：在 HUVEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-484后VEGFR2的Western印跡分析。右圖框：微管蛋白與VEGFR2的 表達(dá)之間的光密度比值。
[0027] 圖 3C.用混雜 miR(VEGFB cnt)或用 miR-484(VEGFB-miR-484)轉(zhuǎn)染 的包含野生型VEGFB mRNA的3' UTR的載體、用混雜miR(VEGFB-mut cnt)或用 miR-484 (VEGFB-mut-miR-484)轉(zhuǎn)染的包含突變的miR-484結(jié)合位點(diǎn)的載體、用混雜 miR(VEGFR2cnt)或用 miR-484(VEGFR2-miR-484)轉(zhuǎn)染的包含野生型 VEGFR2mRNA 的 3' UTR 的載體，以及用混雜 miR(VEGFR2-mut cnt)或用 miR-484(VEGFR2-mut-miR-484)轉(zhuǎn)染的包 含突變的miR-484結(jié)合位點(diǎn)的載體的螢光素酶測(cè)定（從左至右）。
[0028] 圖 4A-4D。
[0029] 圖4A-4B.響應(yīng)者（圖4A)和非響應(yīng)者（圖4B)的腫瘤的⑶34染色，在后者中顯 示了具有明顯的微血管形成的更高血管密度。
[0030] 圖4C.用miR-484或?qū)φ辙D(zhuǎn)導(dǎo)的SK-0V3或MDAH2774細(xì)胞的小鼠異種移植物腫瘤 的腫瘤血管計(jì)數(shù)。
[0031] 圖4D. miR-484和血管數(shù)目的回歸分析。
[0032] 圖 5A-5E。
[0033] 圖5A-5B.顯示了在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染后卵巢癌來源的細(xì)胞系（圖5A)和來源于相同細(xì) 胞系的CM培養(yǎng)基（圖5B)中的miR-484的表達(dá)。
[0034] 圖5C.與卵巢癌來源的細(xì)胞系共培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中的miR-484的水平。
[0035] 圖5D.共培養(yǎng)的用綴合有FITC的miR-484 (綠色）轉(zhuǎn)染的SK-0V3細(xì)胞和用綴合 有德克薩斯紅的⑶31抗體（紅色）染色的HUVEC的共聚集顯微鏡圖像。
[0036] 圖5E.右圖框：在來自用miR-484或EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SK-0V3細(xì)胞的CM中培養(yǎng)的 HUVEC細(xì)胞的VEGFR2表達(dá)的Western印跡分析。左圖框：微管蛋白與VEGFR2的表達(dá)之間 的光密度比值。
[0037] 圖 6A-6D。
[0038] 圖 6A. EOC 中的 miRs296 和 484 的表達(dá)。
[0039] 圖6B.表格顯示了 miR_296、484在指定的卵巢癌細(xì)胞系中的標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)水平以 及它們對(duì)于CBDCA治療的IC值（如方法部分中所述進(jìn)行評(píng)價(jià)）。
[0040] 圖 6C-6D. miR-484 和 miR-296 表達(dá)對(duì)于 MDAH-2274 (圖 6C)和 SK0V-3 (圖 6D)細(xì) 胞對(duì)CBDCA(上圖框）和泰素（下圖框）治療的體外敏感性的作用。
[0041] 圖7.在指定的條件培養(yǎng)基（CM)或?qū)φ沾嬖诘那闆r下在3D基質(zhì)膠基質(zhì)（Matrigel Matrix)上溫育20小時(shí)的HUVEC的圖像。如所顯示的，當(dāng)與來自對(duì)照細(xì)胞的CM相比較時(shí)， 來自用miR-484轉(zhuǎn)導(dǎo)的SK0V-3和MDAH2774細(xì)胞的CM減小HUVEC在3D中正確形成和維持 管狀結(jié)構(gòu)的能力。
[0042] 圖8.顯示侵襲性漿液性卵巢癌的患者數(shù)據(jù)、關(guān)于臨床結(jié)果的數(shù)據(jù)的表格。
[0043] 圖9.響應(yīng)者對(duì)難治性卵巢癌的miR表達(dá)特征。
[0044] 圖 IOA-IOD。
[0045] 圖 10A.HGS(SEQ ID NO :10)和 VEGFB(SEQ ID NO :12)的 3'UTR 中分別地潛在 miRs-296(SEQ ID N0:9)和 484(SEQ ID N0:11)結(jié)合位點(diǎn)的比對(duì)。
[0046] 圖10B.顯示了轉(zhuǎn)染后293細(xì)胞中的miRs296和484的表達(dá)。
[0047] 圖10C.左圖框，在293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRs-296和484后，HGS、VEGFB和微管蛋白的 Western印跡分析，右圖框，微管蛋白、HGS和VEGFB的表達(dá)之間的光密度比值。
[0048] 圖 10D.用混雜 miR (HGS cnt)或用 miR-296 (HGS-miR296)轉(zhuǎn)染的包含野生型 HGS 1111?隱的3'^1?的載體和用混雜111丨1?〇?5111此〇^)或用111丨1?-296〇?5111此11丨1?296)轉(zhuǎn)染的包 含突變的miR296結(jié)合位點(diǎn)的載體的螢光素酶測(cè)定。
[0049] 圖 10E.用混雜 miR (VEGFB cnt)或用 miR-484 (VEGFB-miR484)轉(zhuǎn)染的包含野生型 VEGFB mRNA 的 3' UTR 的載體和用混雜miR(VEGFBmut cnt)或用 miR-484 (VEGFBmut-miR484) 轉(zhuǎn)染的包含突變的miR484結(jié)合位點(diǎn)的載體的螢光素酶測(cè)定。
[0050] 圖 IIA-11C。
[0051] 圖11A. 30例（15例NR和15例R)人漿液性卵巢癌病例的腫瘤血管計(jì)數(shù)。
[0052] 圖11B.用miR484或?qū)φ辙D(zhuǎn)導(dǎo)的SK0V-3或MDAH2774細(xì)胞的小鼠異種移植物腫瘤 的腫瘤血管計(jì)數(shù)。
[0053] 圖11C. NR(左圖框）和R(右圖框）腫瘤的⑶34染色，在前者中顯示了具有顯著 的微血管形成的更高血管密度。
[0054] 發(fā)明概述
[0055] 在第一方面，本文中描述了診斷受試者的對(duì)化學(xué)治療干預(yù)具有抗性的卵巢癌的方 法，包括：
[0056] a)鑒定與對(duì)照表達(dá)水平相比，來自受試者的樣品中miR-484、miR-642和/或 miR-217的表達(dá)水平，和
[0057] b)如果相較于對(duì)照表達(dá)水平，受試者具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表達(dá)水平，則診斷受試者具有化療抗性卵巢癌，或
[0058] c)如果相較于對(duì)照表達(dá)水平，受試者不具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表達(dá)水平，則診斷受試者不具有化療抗性卵巢癌。
[0059] 在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括鑒定與對(duì)照表達(dá)水平相比，miR-592、 miR-302d、miR-491、miR-483-5p、miR-653、miR-181a、miR-671-3p、miR-19a 和 / 或 miR-744 的表達(dá)水平。
[0060] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括鑒定與對(duì)照表達(dá)水平相比，miR-296-5p和/或 miR-518e的表達(dá)水平。
[0061] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括鑒定miR-484、miR-642和miR-217的水平。
[0062] 在某些實(shí)施方案中，化學(xué)治療干預(yù)包括下列中的一種或多種的施用：鉬類藥物、卡 鉬(Paraplatin?)、順鉬(Platinol?)、紫杉燒、紫杉酚（Taxol?)、多西紫杉醇 (Taxotere?)、Λ 西他濱（Gemzar?)、多柔比星（Adriamycin?、Doxil?)、 依托泊苷（VepesidC·?))、長春瑞濱（Navelbine?)、伊沙匹隆（Ixempra?)、 epithelone藥物、貝伐單抗(AvaStin?)和/或苯妥帝爾。
[0063] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0064] 1)從獲自受試者的樣品反轉(zhuǎn)錄miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供特征 (signature)祀寡脫氧核糖核苷酸；
[0065] 2)將靶寡脫氧核苷酸與包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特異性探 針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交特征譜；和
[0066] 3)將步驟⑵的特征譜與對(duì)照相比較。
[0067] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括將樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特 征譜相比較。
[0068] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括將樣品雜交特征譜和與非癌樣品相關(guān)的miR水 平的數(shù)據(jù)庫、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)或表格相比較。
[0069] 在某些實(shí)施方案中，卵巢癌是漿液性上皮卵巢癌。
[0070] 在某些實(shí)施方案中，相較于對(duì)照，減少的miR-484表達(dá)確認(rèn)了化療抗性卵巢癌的 診斷。
[0071] 在另一個(gè)方面，本文中描述了確定人受試者是否具有卵巢癌的不良存活預(yù)后的方 法，包括：
[0072] a)測(cè)量人受試者的卵巢組織樣品中特征miR基因產(chǎn)物的水平，所述特征miR基因 產(chǎn)物由miR基因產(chǎn)物：miR-484、mir-642和/或miR-217組成；和
[0073] b)當(dāng)相對(duì)于無癌卵巢組織的對(duì)照樣品中的miR基因產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)水平，樣品中一個(gè) 或多個(gè)miR基因產(chǎn)物的水平的降低表明人受試者具有卵巢癌的不良存活預(yù)后時(shí)，確定人受 試者的不良存活預(yù)后。
[0074] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0075] 1)反轉(zhuǎn)錄樣品的miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供特征祀寡脫氧核苷 酸；
[0076] 2)將靶寡脫氧核苷酸與包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特異性探 針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交特征譜；和
[0077] 3)將步驟⑵的特征譜與對(duì)照相比較。
[0078] 在某些實(shí)施方案中，確定受試者的存活預(yù)后的步驟可區(qū)分漿液性卵巢癌與其它卵 巢癌。
[0079] 在某些實(shí)施方案中，確定受試者的存活預(yù)后的步驟預(yù)測(cè)對(duì)化學(xué)治療干預(yù)的響應(yīng)。
[0080] 在某些實(shí)施方案中，miR-484、miR-642和/或miR-217的特征組與分別特異于 miR-484、miR-642和/或miR-217的一個(gè)或多個(gè)探針雜交，并且相對(duì)于對(duì)照樣品，miR-484、 miR-642和/或miR-217的水平的降低的存在表明對(duì)化學(xué)治療干預(yù)的不良響應(yīng)、人患者的不 良存活預(yù)后和/或漿液性卵巢癌的存在。
[0081] 在另一個(gè)方面，本文描述了用于測(cè)定受試者的化療抗性卵巢癌的方法，所述方法 包括：
[0082] a)檢測(cè)受試者的樣品的miRNA表達(dá)特征譜，
[0083] b)將樣品的miRNA特征譜與包含非癌性卵巢細(xì)胞的對(duì)照樣品的miRNA表達(dá)特征譜 相比較，和
[0084] c)當(dāng)樣品的miRNA表達(dá)特征譜包括hsa-miR-484、hsa-miR-642和/或 hsa-miR-217中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)的統(tǒng)計(jì)上顯著的變化時(shí)，確定化療抗性卵巢癌。
[0085] 在某些實(shí)施方案中，統(tǒng)計(jì)上顯著的變化是miR-484的表達(dá)水平的降低。
[0086] 在某些實(shí)施方案中，特征microRNA包括至少：hsa-miR-484、hsa-miR-642和 hsa-miR-217〇
[0087] 在另一個(gè)方面，本文描述了用于評(píng)價(jià)患者的臨床狀況的方法，包括步驟：
[0088] a)提供患者的生物樣品，
[0089] b)測(cè)定樣品中預(yù)先確定的特征miRNA的表達(dá)水平以獲得miRNA表達(dá)特征譜，預(yù)先 確定的特征 miRNA 包括至少：hsa-miR-484、hsa-miR-642 和 / 或 hsa-miR-217，
[0090] c)將步驟（b)的miRNA表達(dá)特征譜與不同疾病包括卵巢癌特有的一個(gè)或多個(gè)參照 miRNA表達(dá)特征譜相比較，和
[0091] d)基于步驟（C)的比較評(píng)價(jià)患者的臨床狀況。
[0092] 在某些實(shí)施方案中，參照miRNA表達(dá)特征譜獲自數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)于下列 中的一個(gè)或多個(gè)：國際互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、集中式數(shù)據(jù)庫（centralized database)或分布式數(shù) 據(jù)庫（decentralized database) 〇
[0093] 在某些實(shí)施方案中，測(cè)定包括預(yù)先確定的特征miRNA的定性、定量或半定量測(cè)定。
[0094] 在某些實(shí)施方案中，測(cè)定包括核酸雜交、核酸擴(kuò)增、聚合酶延伸、測(cè)序、質(zhì)譜法或其 任意組合。
[0095] 在另一個(gè)方面，本文中描述了用于評(píng)價(jià)患者的臨床狀況的試劑盒，其包括：
[0096] a)用于測(cè)定患者的生物樣品中預(yù)先確定的特征miRNA的生物標(biāo)志物，預(yù)先確定的 特征 miRNA 包括 hsa-miR-484、hsa-miR-642 和 / 或 hsa-miR-217 中的至少一個(gè)，和
[0097] b)不同疾病包括卵巢癌特有的多個(gè)miRNA參照表達(dá)特征譜。
[0098] 在某些實(shí)施方案中，在數(shù)據(jù)庫例如國際互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、集中式數(shù)據(jù)庫或分布式數(shù) 據(jù)庫中獲得miRNA參照表達(dá)特征譜。
[0099] 在另一個(gè)方面，本文中描述了用于診斷患者的卵巢癌的試劑盒，其包括：
[0100] a)包括一種或多種檢測(cè)器的捕獲試劑，所述檢測(cè)器特異于至少一種卵巢癌診斷生 物標(biāo)志物,其中至少第一卵巢癌生物標(biāo)志物為miR-484生物標(biāo)志物，
[0101] b)檢測(cè)試劑，和
[0102] c)使用試劑盒的說明書，當(dāng)患者的生物樣品中miR-484診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水 平低于不具有卵巢癌的對(duì)照受試者的相同生物標(biāo)志物的表達(dá)水平時(shí)，將患者診斷為具有卵 巢癌。
[0103] 在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包括選自miR-642和miR-217生物標(biāo)志物的一個(gè)或 多個(gè)另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志物。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包括選自：hsa-miR-592、 hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、hsa-miR-491、hsa-miR-483_5p、 hsa-miR-653、hsa-miR-181a、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-19a 和 / 或 hsa-miR-744 的一個(gè)或 多個(gè)另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志物。
[0104] 在另一個(gè)方面，本文中描述了用于診斷卵巢癌的一組寡核苷酸或多核苷酸，所述 寡核苷酸或多核苷酸包含一組選自下列的miRNA的序列：miR-484、miR-642和miR-217,和 /或其互補(bǔ)序列。
[0105] 在另一個(gè)方面，本文中描述了用于診斷患者的卵巢癌的方法，包括：
[0106] a)檢測(cè)患者的生物樣品中至少一個(gè)診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中至少第一診 斷生物標(biāo)志物是miR-484生物標(biāo)志物，和
[0107] b)當(dāng)患者樣品中至少mir-484診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平低于源于不具有卵巢 癌的對(duì)照受試者的生物樣品的相同生物標(biāo)志物的正常表達(dá)水平時(shí)，將患者診斷為患有卵巢 癌。
[0108] 在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括檢測(cè)選自miR-642和miR-217生物標(biāo)志物 的一個(gè)或多個(gè)另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，所述方法 還包括檢測(cè)選自 hsa-miR-592、hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、 hsa-miR-491、 hsa-miR-483_5p、 hsa-miR-653、 hsa_miR-181a、 hsa-miR-671_3p、 hsa-miR-19a和/或hsa-miR-744的一個(gè)或多個(gè)另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。
[0109] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括步驟：
[0110] a)獲得樣品，其中所述樣品包含卵巢細(xì)胞；
[0111] b)擴(kuò)增樣品的miRNA表達(dá)特征譜中的至少一個(gè)miRNA ;
[0112] c)測(cè)定樣品的miRNA表達(dá)特征譜；和
[0113] d)將樣品的miRNA表達(dá)特征譜與對(duì)照miRNA特征（包括miR-484、miR-642和 /或miR-271)相比較，其中對(duì)照miRNA特征在所述樣品的miRNA表達(dá)特征譜中的重現(xiàn) (repI ication)表明，所述樣品包含對(duì)化療性治療具有抗性的卵巢癌細(xì)胞。
[0114] 本文中還描述了診斷卵巢癌的裝置。卵巢癌診斷裝置可包括：
[0115] a)包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器的捕獲試劑，所述檢測(cè)器特異于至少miR-484、miR-642 和/或miR-217診斷生物標(biāo)志物，和
[0116] b)用于檢測(cè)患者的生物樣品中至少診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的檢測(cè)試劑，其中 當(dāng)至少一個(gè)診斷生物標(biāo)志物在患者生物樣品中的表達(dá)水平低于不具有卵巢癌的對(duì)照受試 者中的表達(dá)水平時(shí)，患者被診斷為患有卵巢癌。
[0117] 裝置的捕獲試劑可以是與診斷生物標(biāo)志物特異性相互作用的有機(jī)或無機(jī)化學(xué)藥 品、生物分子或其任何片段、同源物、類似物、綴合物或衍生物。在某些實(shí)施方案中，捕獲試 劑是蛋白質(zhì)和/或抗體，并且可被固定在固體載體上。
[0118] 本文中還描述了，區(qū)分可對(duì)利用化學(xué)治療劑的治療具有響應(yīng)的卵巢癌患者與具有 化療抗性卵巢癌的患者的診斷生物標(biāo)志物組，所述具有化療抗性卵巢癌的患者不能從利用 化學(xué)治療劑的治療受益。
[0119] 診斷生物標(biāo)志物組通?？砂?，至少用于區(qū)分這兩種類型的患者和/或鑒定患者 (其對(duì)于不良預(yù)后結(jié)果具有最高風(fēng)險(xiǎn)和/或?qū)δ壳翱捎玫幕瘜W(xué)治療干預(yù)具有不良響應(yīng)）的 化療抗性卵巢癌診斷生物標(biāo)志物。鑒定處于發(fā)生此類不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)中的患者將導(dǎo)致對(duì)卵 巢癌患者的這些亞群使用更特異性、侵入性的療法。
[0120] 在具體實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物的組合極大地增加了診斷的準(zhǔn)確性。
[0121] 在另一個(gè)廣泛方面，本文中描述了診斷受試者的與化療抗性相關(guān)的漿液性卵巢癌 的方法，包括：
[0122] a)鑒定相較于對(duì)照的相對(duì)miR-484、miR-642和/或miR-217表達(dá)，和
[0123] b)如果相較于對(duì)照，受試者具有減少的miR-484、miR-642和/或miR-217的表達(dá)， 則診斷出受試者具有與化療抗性相關(guān)的漿液性卵巢癌，或
[0124] c)如果相較于對(duì)照，受試者不具有減少的miR-484、miR-642和/或miR-217的表 達(dá)，則診斷出受試者沒有與化療抗性相關(guān)的漿液性卵巢癌。
[0125] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括鑒定相較于對(duì)照的相對(duì)miR-表達(dá)，其中步驟a) 還包括鑒定圖IC中所列的一個(gè)或多個(gè)另外的miR :miR-592, miR-302d, miR-491, miR-483-5 p, miR-653, miR-181a, miR-671-3p, miR-19a 和 miR-744。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括 鑒定相較于對(duì)照的相對(duì)miR-518e和/或296-5p表達(dá)。
[0126] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括基于診斷設(shè)計(jì)治療計(jì)劃。在某些實(shí)施方案中，所 述方法包括施用基于診斷的治療。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括，如果診斷出卵巢癌， 則施用抗-血管生成治療。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括基于診斷測(cè)定預(yù)后。
[0127] 在另一個(gè)廣泛方面，本文中提供了增強(qiáng)上皮卵巢癌患者的藥物敏感性的方法，包 括增加上皮卵巢癌患者的上皮卵巢癌細(xì)胞中的miR-484的水平。
[0128] 在某些實(shí)施方案中，通過選自基因療法、小分子或生物制品的裝置增加 miR。
[0129] 在另一個(gè)廣泛方面，本文中提供了抑制上皮卵巢癌-相關(guān)血管生成的方法，包括 增加上皮卵巢癌患者的上皮卵巢癌細(xì)胞的miR的水平。
[0130] 在某些實(shí)施方案中，通過選自基因療法、小分子或生物制劑的裝置增加 miR。
[0131] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括確定受試者的存活預(yù)后，區(qū)分漿液性卵巢癌與 其它卵巢癌。
[0132] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括確定受試者的存活預(yù)后，預(yù)測(cè)對(duì)化療干擾的響 應(yīng)性。
[0133] 在某些實(shí)施方案中，特征miR-484、miR-642和miR-217分別與特異于miR-484、 miR-642和miR-217的探針雜交，并且相對(duì)于對(duì)照樣品，miR-484、miR-642和miR-217的水 平的減少的存在表明對(duì)化療干預(yù)的不良響應(yīng)，人患者的不良存活預(yù)后和/或漿液性卵巢癌 的存在。
[0134] 在另一個(gè)廣泛方面，本文中提供了確定化療抗性卵巢癌的存在的方法，包括步 驟：
[0135] a)獲得卵巢癌細(xì)胞的樣品；
[0136] b)提取樣品的總RNA ;
[0137] c)擴(kuò)增樣品中的至少一種miRNA ;
[0138] d)測(cè)定樣品的miRNA表達(dá)特征譜；和
[0139] e)將腫瘤樣品的miRNA表達(dá)特征譜與由miR-484、miR-642和miR-271中的一個(gè) 或多個(gè)組成的miRNA特征相比較，
[0140] 其中miRNA特征在樣品的miRNA表達(dá)特征譜內(nèi)的重現(xiàn)表明卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療性治 療具有抗性。在某些實(shí)施方案中，卵巢癌包括漿液性卵巢癌。
[0141] 在另一個(gè)廣泛方面，本文中提供了，包含選自hsa-miR-484、hsa-miR-642和 hsa-miR-217的一個(gè)或多個(gè)miRNA的microRNA特征，其中這些miRNA在卵巢細(xì)胞中的減少 的表達(dá)表明卵巢細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。
[0142] 在某些實(shí)施方案中，這些miRNA中的任一個(gè)的表達(dá)的統(tǒng)計(jì)上顯著的變化表明卵巢 癌細(xì)胞具有對(duì)化療干預(yù)的抗性。
[0143] 在另一個(gè)廣泛方面，本文中提供了用于診斷卵巢癌的一組寡核苷酸或多核苷酸， 其包含一組選自下列的miRNA的序列：miR-484、miR-642和miR-217,和/或其互補(bǔ)序列。
[0144] 根據(jù)隨后的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的這些和其它目的以及有利方面（其中 的一些進(jìn)行了明確描述，而其它的未進(jìn)行明確描述）將變得顯然。
[0145] 發(fā)明詳述
[0146] 在整個(gè)本公開內(nèi)容中，通過標(biāo)識(shí)引用來引用各種公開物、專利和公開的專利說明 書。這些出版物、專利和公布的專利說明書的公開內(nèi)容通過引用并入本公開內(nèi)容以更全面 地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平。
[0147]
[0148] 應(yīng)理解，上文的一般描述和下文的詳細(xì)描述僅是示例性的，并且無意限制本教導(dǎo) 的范圍。在本申請(qǐng)中，除非明確地另有所指，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。
[0149] 當(dāng)在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語"包含"結(jié)合使用時(shí)，單詞"一個(gè)/一種（a) " 或"一個(gè)/ 一種（an) "的使用可意指"一個(gè)/ 一種"，并且其還與"一個(gè)/ 一種或多個(gè)/多 種"、"至少一個(gè)/ 一種"和"一個(gè)/ 一種或超過一個(gè)/種"的含義一致。
[0150] 同樣地，〃含有〃、〃包含〃和〃包括〃或這些根詞的修飾形式例如但不限于〃含 有（comprises) 〃、〃包含（contained) 〃和〃包括（including) 〃的使用無意是限定性的。 術(shù)語"和/或"意指，之前和之后的術(shù)語可被合并在一起或分開來考慮。為了舉例說明的 目的，但不是作為限制，"X和/或Y"可意指"X"或"Y"或"X和Y"。
[0151] 應(yīng)理解，miRNA來源于基因組序列或基因。在這方面，為簡便起見，術(shù)語〃基因〃用 于指編碼給定的miRNA的前體miRNA的基因組序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施方案可包括，參與 其表達(dá)的miRNA的基因組序列，例如啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列。
[0152] 術(shù)語〃miR〃、〃mir〃和"miRNA〃通常是指microRNA，一類能夠調(diào)節(jié)RNA翻譯的 小 RNA 分子（參見，Zeng 和 Cullen, RNA, 9(1) : 112-123, 2003 ;Kidner 和 Martienssen Trends Genet, 19(1):13-6, 2003 ；Dennis C, Nature,420(6917):732, 2002 ；Couzin J, Science298 (5602) :2296-7, 2002,其各自通過引用并入本文）。
[0153] 應(yīng)理解，miRNA來源于基因組序列或基因。在這方面，為簡便起見，術(shù)語〃基因〃用 于指編碼給定的miRNA的前體miRNA的基因組序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施方案可包括，參與 其表達(dá)的miRNA的基因組序列，例如啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列。
[0154] 術(shù)語"miRNA"通常是指單鏈分子，但在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明中應(yīng)用的分子 也可包括，與相同單鏈分子的另一個(gè)區(qū)域或與另一個(gè)核酸部分互補(bǔ)（在整個(gè)鏈的長度上 10-50 %互補(bǔ)）、大體上互補(bǔ)（在整個(gè)鏈的長度上大于50 %，但少于100 %的互補(bǔ)）或完全互 補(bǔ)的區(qū)域或另外的鏈。因此，核酸可包括，包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)或自身互補(bǔ)鏈的分子或包含 分子的特定序列的"互補(bǔ)序列"。例如，前體miRNA可具有自身互補(bǔ)區(qū)域，其多至100%的互 補(bǔ)，本發(fā)明的miRNA可與它們的靶60、65、70、75、80、85、90、95或100%互補(bǔ)或至少60、65、 70、75、80、85、90、95 或 100%互補(bǔ)。
[0155] 如本文中所用，術(shù)語〃其組合〃是指，該術(shù)語之前所列項(xiàng)的全部排列和組合。例如， 〃A、B、C或其組合〃意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一個(gè)，并且如果在特定的上下 文中順序是重要的話，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
[0156] 除非另有所指，否則技術(shù)術(shù)語按照常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中的常用術(shù) 語的定義可見于 Benjamin Lewin, Genes V，由 Oxford University Press, 1994 出 版（ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（eds·)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 BlackwellScience Ltd. ,1994 出版（ISBN0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.，1995 出版（ISBN1-56081-569-8)。
[0157] 為了有助于論述本公開內(nèi)容的各種實(shí)施方案，提供了下列具體術(shù)語的解釋：
[0158] 附加療法：與基礎(chǔ)治療組合使用以改善基礎(chǔ)治療的效果的治療。
[0159] 臨床結(jié)果：其是指，在疾病或障礙的治療后或在治療不存在的情況下患者的健康 狀態(tài)。臨床結(jié)果包括但不限于，直至死亡的時(shí)間長度的增加、直至死亡的時(shí)間長度的減少、 存活機(jī)會(huì)的增加、死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加、存活、無疾病存活、慢性疾病、轉(zhuǎn)移、晚期或侵襲性疾病、 疾病復(fù)發(fā)、死亡以及對(duì)療法的良好或不良響應(yīng)。
[0160] 對(duì)照："對(duì)照"是指用于與實(shí)驗(yàn)樣品例如獲自患者的腫瘤樣品比較的樣品或標(biāo)準(zhǔn)。
[0161] 存活的減少：如本文中所用，"存活的減少"是指，患者死亡前時(shí)間長度的減少或患 者死亡的風(fēng)險(xiǎn)的增加。
[0162] 檢測(cè)表達(dá)的水平：例如，"檢測(cè)miR或miRNA表達(dá)的水平"是指定量存在于樣品中 的miR或miRNA的量。檢測(cè)特定miR或任何microRNA的表達(dá)可使用本領(lǐng)域已知或本文中 描述的任何方法，例如通過qRT-PCR來實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)miR的表達(dá)包括，檢測(cè)miRNA的成熟形式 或與miRNA表達(dá)相關(guān)的前體形式的表達(dá)。通常地，miRNA檢測(cè)法包括序列特異性檢測(cè)，例如 通過RT-PCR。miR-特異性引物和探針可使用本領(lǐng)域已知的前體和成熟miR核酸序列來進(jìn) 行設(shè)計(jì)。
[0163] MicroRNA(miRNA):調(diào)控基因表達(dá)的單鏈RNA分子。MicroRNA在長度上通常為 21-23個(gè)核苷酸。MicroRNA從稱為pri-miRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物被加工成稱為前體（pre) -miRNA 的短莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，最后被加工成功能性成熟的microRNA。成熟的microRNA分子與一個(gè)或多 個(gè)信使RNA分子部分互補(bǔ)，并且它們的主要功能是下調(diào)基因表達(dá)。MicroRNA通過RNAi途徑 調(diào)控基因表達(dá)。
[0164] miR表達(dá)：如本文中所用，"低miR表達(dá)"和"高miR表達(dá)"是相對(duì)術(shù)語，其涉及在樣 品中發(fā)現(xiàn)的miRNA的水平。在一些實(shí)施方案中，低和高miR表達(dá)通過比較一組對(duì)照樣品與測(cè) 試樣品的miRNA水平來測(cè)定。隨后可基于樣品中miR的表達(dá)是高于（高）還是低于（低） 平均或中位miR表達(dá)水平來將低和高表達(dá)分配給每一個(gè)樣品。對(duì)于單個(gè)樣品，高或低miR 表達(dá)可通過將樣品與已知具有高或低表達(dá)的對(duì)照或參照樣品相比較，或通過與標(biāo)準(zhǔn)值比較 來測(cè)定。低和高miR表達(dá)可包括miRNA的前體或成熟形式或兩者的表達(dá)。
[0165] 受試者：如本文中所用，術(shù)語"受試者"包括人和非人動(dòng)物。進(jìn)行治療的優(yōu)選患者 是人。"患者"和"受試者"在本文中可互換使用。
[0166] 藥學(xué)上可接受的媒介物：用于本公開內(nèi)容的藥學(xué)上可接受的載體（媒介物）是 常規(guī)的° Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. ,Eastern，PA,第15版（1975)描述了適用于一種或多種治療性化合物、分子或試劑的藥 物遞送的組合物和制劑。
[0167] 預(yù)防、治療或改善疾?。?預(yù)防"疾病是指抑制疾病的完全發(fā)展。"治療"是指在疾 病或病狀開始發(fā)展后改善疾病或病狀的體征或癥狀的治療干預(yù)。"改善"是指疾病的體征或 癥狀的數(shù)目或嚴(yán)重度的減少。
[0168] 篩選：如本文中所用，"篩選"是指用于評(píng)價(jià)和鑒定影響疾病的候選試劑的方法。 microRNA的表達(dá)可使用本領(lǐng)域已知的和本文中描述的許多技術(shù)中的任一種，例如通過微陣 列分析或通過qRT-PCR來定量。
[0169] 小分子：通常具有小于約1000道爾頓，或在一些實(shí)施方案中，小于約500道爾頓的 分子量的分子，其中分子能夠在一定可測(cè)量的程度上調(diào)節(jié)靶分子的活性。
[0170] 治療：包括診斷和治療的總稱。
[0171] 治療劑：當(dāng)恰當(dāng)?shù)亟o受試者施用時(shí)能夠誘導(dǎo)期望的治療或預(yù)防作用的化合物、小 分子或其它組合物例如反義化合物、抗體、蛋白酶抑制劑、激素、趨化劑或細(xì)胞因子。
[0172] 如本文中所用，"候選試劑"是被選擇用于篩選以確定其是否可用作治療劑的化合 物。"溫育"包括用于試劑與細(xì)胞或組織相互作用的充足量的時(shí)間。"接觸"包括將試劑以 固體或液體形式與細(xì)胞或組織一起溫育。用試劑"處理/治療"細(xì)胞或組織包括將試劑與 細(xì)胞或組織接觸或一起溫育。
[0173] 治療有效量：足以在待用試劑治療的受試者或細(xì)胞中獲得期望的作用的指定的藥 物試劑或治療劑的量。試劑的有效量將取決于幾個(gè)因素，包括但不限于待治療的受試者或 細(xì)胞，以及治療性組合物的施用方式。
[0174] 在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，對(duì)照的使用是期望的。在這點(diǎn)上，對(duì)照可以是獲 自相同患者的非癌性細(xì)胞/組織樣品，或獲自健康受試者例如健康組織供者的細(xì)胞/組織 樣品。在另一個(gè)實(shí)例中，對(duì)照是從歷史值計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)。可按照本領(lǐng)域已知的任何方法獲得腫 瘤樣品和非癌性細(xì)胞/組織樣品。例如，可從已經(jīng)歷切除術(shù)的癌癥患者獲得腫瘤和非癌性 樣品，或可通過使用皮下注射針頭的提取，通過顯微解剖，或通過激光捕獲來獲得它們。對(duì) 照（非癌性）樣品可以例如從尸體器官供者或從健康供者獲得。
[0175] 有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子可通過天然加工途徑（例如，使用完整細(xì) 胞或細(xì)胞裂解物）或通過合成加工途徑（例如，使用分離的加工酶例如分離的Dicer、 Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得。要理解，還可通過生物或化學(xué)合成直接產(chǎn)生有活 性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子，而不必從miR前體加工獲得。當(dāng)在本文中通過名稱提及 microRNA時(shí)，除非另外指出，否則名稱相應(yīng)于前體和成熟形式。
[0176] 可在獲自受試者的生物樣品的細(xì)胞中測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如， 可通過常規(guī)活組織檢查技術(shù)從懷疑患有卵巢癌的受試者取出組織樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，可從受試者取出血液樣品，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離白細(xì)胞以用于DNA提取。優(yōu)選在開始放 射療法、化學(xué)療法或其它治療性治療之前，從受試者獲得血液或組織樣品。對(duì)應(yīng)的對(duì)照組織 或血液樣品或?qū)φ諈⒄諛悠房色@自受試者的未患病組織，獲自正常人個(gè)體或正常個(gè)體的群 體，或獲自對(duì)應(yīng)于受試者樣品中的大部分細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。隨后將對(duì)照組織或血液樣品與 來自受試者的樣品一起處理，以便可將受試者樣品的細(xì)胞中從給定的miR基因產(chǎn)生的miR 基因產(chǎn)物的水平與來自對(duì)照樣品的細(xì)胞的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相比較?；蛘?，可獲得參 照樣品并且將其與測(cè)試樣品分開地（例如，在不同時(shí)間）進(jìn)行處理，可將測(cè)試樣品的細(xì)胞 中從給定的miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與參照樣品的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相比 較。
[0177] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的 對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平（即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)〃上調(diào)〃或"增加"）。如本文中所用， 當(dāng)受試者的細(xì)胞或組織樣品中的miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中的相同基 因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)是增加的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品的至少一種 miR基因產(chǎn)物的水平低于對(duì)照樣品的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平（即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)〃 下調(diào)"或"減少"）。如本文中所用，當(dāng)受試者的細(xì)胞或組織樣品中從該基因產(chǎn)生的miR基 因產(chǎn)物的量少于從對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中的相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因的表達(dá)減少。可 相對(duì)于一個(gè)或多個(gè)RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定對(duì)照和正常樣品中的相對(duì)miR基因表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)可包 括例如OmiR基因表達(dá)水平，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的miR基因表達(dá)水平、受試者的未患病組織的miR 基因表達(dá)水平，或先前獲得的正常人對(duì)照群體的miR基因表達(dá)的平均水平。
[0178] 獲自受試者的樣品的miR基因產(chǎn)物的水平相對(duì)于對(duì)照樣品的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的 水平的改變（即，增加或減少）表明受試者存在卵巢癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品的至 少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對(duì)照樣品的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，測(cè)試樣品的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平低于對(duì)照樣品的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平。
[0179] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自本文中的表格和附圖中顯示的 miR基因產(chǎn)物。
[0180] 樣品的miR基因產(chǎn)物的水平可使用適合用于檢測(cè)生物樣品的RNA表達(dá)水平的任何 技術(shù)來測(cè)量。用于測(cè)定生物樣品（例如，細(xì)胞、組織）中的RNA表達(dá)水平的適當(dāng)技術(shù)（例如， Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交）對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。在特定的實(shí)施 方案中，使用Northern印跡分析檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可通過在核酸 提取緩沖液存在的情況下進(jìn)行勻漿，接著進(jìn)行離心來從細(xì)胞純化總的細(xì)胞RNA。沉淀核酸， 然后通過用DNA酶處理和沉淀來除去DNA。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在瓊脂糖凝膠上通過凝膠電 泳分離RNA分子，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾器。然后通過加熱將RNA固定在濾器上。使 用適當(dāng)標(biāo)記的與所述RNA互補(bǔ)的DNA或RNA探針進(jìn)行特定RNA的檢測(cè)和定量。參見，例如， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter7,其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0181] 用于給定的miR基因產(chǎn)物的Northern印跡雜交的適當(dāng)探針（例如，DNA探針、 RNA探針）可從本文的表中提供的核酸序列產(chǎn)生，并且包括但不限于，與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物 具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的互補(bǔ)性的探針，以及與目標(biāo) miR基因產(chǎn)物完全互補(bǔ)的探針。用于制備標(biāo)記的DNA和RNA探針的方法以及用于其與靶核 苷酸序列的雜交的條件描述于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J. Sambrook 等 人，eds.，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, ChapterslO 和 11，其公 開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0182] 例如，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、 14C或35S ;重金屬；能夠用作已標(biāo)記的 配體的特異性結(jié)合對(duì)成員的配體（例如，生物素、抗生物素蛋白或抗體）；熒光分子；化學(xué) 發(fā)光分子；酶等來標(biāo)記核酸探針。
[0183] 可通過 Rigby 等人（1977)，J. Mol. Biol. 113:237-251 的切口平移法或 Fienberg 等人（1983) ,Anal. Biochem. 132:6-13的隨機(jī)引物法（其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本 文）將探針標(biāo)記至高比放射性（specific activity)。后者是選擇用于從單鏈DNA或從RNA 模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的方法。例如，按照切口平移法通過用高放射性的 核苷酸置換預(yù)先存在的核苷酸，可能制備具有大大超過IO 8Cpm/微克的比放射性的32P-標(biāo) 記的核酸探針。然后可通過將雜交濾器暴露于照相膠片來進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測(cè)。暴 露于雜交濾器的照相膠片的光密度掃描提供了 miR基因轉(zhuǎn)錄物水平的精確測(cè)量。使用另一 個(gè)方法，可通過計(jì)算機(jī)化的成像系統(tǒng)例如可從Amersham Biosciences, Piscataway, NJ獲得 的 Molecular Dynamics400_B2D Phosphorimager 定量 miR 基因轉(zhuǎn)錄物水平。
[0184] 當(dāng)不能進(jìn)行DNA或RNA探針的放射性核素標(biāo)記時(shí)，可使用隨機(jī)引物法將類似物例 如dTTP類似物5- (N- (N-生物素基-ε -氨基己?；?3-氨基烯丙基）脫氧尿苷三磷酸摻 入探針分子?？赏ㄟ^與結(jié)合生物素的蛋白質(zhì)例如偶聯(lián)至熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶的抗 生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和抗體（例如抗生物素抗體）反應(yīng)來檢測(cè)生物素化的探針 寡核苷酸。
[0185] 除了 Northern和其他RNA雜交技術(shù)外，可使用原位雜交技術(shù)來測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄物的 水平。該技術(shù)需要比Northern印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，其包括將整個(gè)細(xì)胞置于顯微鏡蓋玻片 上和用含有放射性標(biāo)記的或另外標(biāo)記的核酸（例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測(cè)細(xì)胞的核 酸含量。該技術(shù)特別適合用于分析來自受試者的組織活組織檢查樣品。原位雜交技術(shù)的實(shí) 施在美國專利5, 427, 916 (其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文）中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。 用于給定的miR基因產(chǎn)物的原位雜交的適當(dāng)探針可從本文的表中提供的核酸序列產(chǎn)生，并 且包括但不限于，與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或99%的互補(bǔ)性的探針，以及與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物完全互補(bǔ)的探針，如上文中描述的。
[0186] 細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)數(shù)目還可通過對(duì)miR基因轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)擴(kuò)增經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物來進(jìn)行測(cè)定。可通過與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)例 如來自存在于相同樣品中的"持家"基因的mRNA的水平相比較來定量miR基因轉(zhuǎn)錄物的 水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的合適的"持家"基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (G3TOH)。用于進(jìn)行定量和半定量RT-PCR的方法以及其變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公 知的。
[0187] 在一些情況下，可能期望同時(shí)測(cè)定樣品中多個(gè)不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在 其他情況下，可能期望測(cè)定與癌癥關(guān)聯(lián)的所有已知miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估數(shù) 百種miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平非常費(fèi)時(shí)并且需要大量的總RNA (例如，對(duì) 于每一個(gè)Northern印跡需要至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。
[0188] 為了克服這些限制，可構(gòu)建以微芯片形式（即，微陣列）存在的寡核苷酸文庫，該 文庫包含特異于一組miR基因的一組（或特征）寡核苷酸（例如，寡脫氧核苷酸）探針。使 用該微陣列，可通過逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，將它們與微陣列上的探針（寡 核苷酸）雜交以產(chǎn)生雜交或表達(dá)特征譜來測(cè)定生物樣品中多個(gè)microRNA的表達(dá)水平。然 后將受試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品的雜交譜比較，從而確定在卵巢癌細(xì)胞中具有改變的表 達(dá)水平的microRNA。如本文中所使用的，"探針寡核苷酸"或"探針寡脫氧核苷酸"是指能 夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸。"靶寡核苷酸"或"靶寡脫氧核苷酸"是指待檢測(cè)（例如， 通過雜交）的分子。"miR-特異性探針寡核苷酸"或"特異于miR的探針寡核苷酸"是指具 有選擇用于與特定miR基因產(chǎn)物或特定miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷 酸。
[0189] 特定樣品的"表達(dá)特征譜"或"雜交特征譜"本質(zhì)上是樣品的狀態(tài)指紋；雖然兩種 狀態(tài)可能具有相似表達(dá)的任何特定基因，但同時(shí)評(píng)價(jià)大量基因允許產(chǎn)生對(duì)于細(xì)胞的狀態(tài)是 獨(dú)特的基因表達(dá)特征譜。即，正常組織可與癌細(xì)胞相區(qū)別，并且在癌細(xì)胞類型內(nèi)，可確定不 同的預(yù)后狀態(tài)（例如，良好的或不良的長期存活希望）。通過比較不同狀態(tài)的卵巢細(xì)胞的表 達(dá)特征譜，獲得關(guān)于在這些狀態(tài)的每一個(gè)狀態(tài)中為重要的（包括基因的上調(diào)或下調(diào)）基因 的信息。在癌細(xì)胞或正常細(xì)胞中差異表達(dá)的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá) 允許以許多方法使用該信息。例如，可評(píng)估特定的治療方案（例如，確定化療藥物是否改善 特定患者的長期預(yù)后）。類似地，可通過將患者樣品與已知的表達(dá)特征譜比較來進(jìn)行或確認(rèn) 診斷。此外，這些基因表達(dá)特征譜（或個(gè)體基因）允許篩選抑制miR或疾病表達(dá)特征譜或 將不良預(yù)后特征譜轉(zhuǎn)變成更好的預(yù)后特征譜的藥物候選物。
[0190] 因此，本發(fā)明提供了診斷受試者是否患有癌癥或處于發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的方法， 該方法包括逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將靶寡脫氧 核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交特征譜， 和將受試樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜比較，其中至少一種miRNA的信 號(hào)的改變表不受試者患有卵巢癌或處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，微陣列 包含人miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸。
[0191] 可從基因特異性寡核苷酸探針（所述探針從已知的miRNA序列產(chǎn)生）制備微陣 列。對(duì)于各miRNA，陣列可包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種探針包含活性成熟序列，而另 一種探針特異于miRNA的前體。陣列還可包含可用作雜交嚴(yán)格條件的對(duì)照的對(duì)照，例如與 人直系同源物只相異于少數(shù)幾個(gè)堿基的一個(gè)或多個(gè)小鼠序列。還可將來自兩個(gè)物種的tRNA 或其它RNA(例如，rRNA、mRNA)印制在微芯片上，從而為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對(duì)穩(wěn)定 的陽性對(duì)照。還可將用于非特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)合適的對(duì)照包含在微芯片上。為了該 目的，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性選擇序列。
[0192] 可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)制備微陣列。例如，在位置C6上對(duì)合適長度例如 40個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行5' -胺修飾，并且使用可商購獲得的微陣列系統(tǒng)例如 GeneMachine 0mniGridTM100Microa;rraye;r 和 Amersham CodeLink? 活化的載玻片進(jìn)行印 制。通過用標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡聚物。在第一 鏈合成后，使RNA/DNA雜交物變性以降解RNA模板。然后將所制備的標(biāo)記的靶cDNA在雜交 條件（例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中進(jìn)行18小時(shí)，然后在37°C下于0. 75X TNT 中清洗40分鐘）下與微陣列芯片雜交。在陣列上的其中固定的探針DNA識(shí)別樣品中的互 補(bǔ)靶cDNA的位置上，發(fā)生雜交。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記陣列上的其中發(fā)生結(jié)合的確切位置，從 而允許自動(dòng)檢測(cè)和定量。輸出信號(hào)由一列雜交事件組成，其標(biāo)示了特定cDNA序列的相對(duì)豐 度，從而標(biāo)示了患者樣品中相應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對(duì)豐度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記的cDNA 寡聚物是從生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過使用例如鏈霉抗生物素 蛋白-Alexa647綴合物直接檢測(cè)包含生物素的轉(zhuǎn)錄物來處理微陣列，和使用常規(guī)掃描方法 掃描微陣列。陣列上的各點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中相應(yīng)的miR的豐度成比例。
[0193] 使用陣列對(duì)于miRNA表達(dá)的檢測(cè)具有幾個(gè)有利方面。第一，可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上鑒 定相同樣品中的數(shù)百個(gè)基因的整體表達(dá)。第二，通過寡核苷酸探針的仔細(xì)設(shè)計(jì)，可鑒定成 熟分子和前體分子的表達(dá)。第三，與Northern印跡分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2.5yg總RNA可提供可重現(xiàn)的結(jié)果。數(shù)目相對(duì)有限的miRNA(每物種數(shù)百個(gè)）允許對(duì)數(shù)個(gè) 物種構(gòu)建共同的微陣列，其中對(duì)每一物種使用不同的寡核苷酸探針。這樣的工具允許分析 各已知的miR在不同條件下的跨物種表達(dá)。
[0194] 除了用于特定miR的定量表達(dá)水平測(cè)定外，包含相應(yīng)于miRNome的大部分（優(yōu)選 整個(gè)miRNome)的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于進(jìn)行miR基因表達(dá)特征譜分 析，以分析miR的表達(dá)模式?？墒共煌膍iR特征與已建立的疾病標(biāo)記關(guān)聯(lián)或直接與疾病 狀態(tài)關(guān)聯(lián)。
[0195] 按照本文中描述的表達(dá)特征譜分析法，對(duì)來自懷疑患有癌癥（例如卵巢癌）的受 試者的樣品的總RNA進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄以提供一組與樣品中的RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的靶寡脫氧核 苷酸。然后將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供 樣品的雜交特征譜。結(jié)果是顯示樣品中miRNA的表達(dá)模式的樣品的雜交特征譜。雜交特征 譜包括來自靶寡脫氧核苷酸（其來自樣品）與微陣列中的miRNA-特異性探針寡核苷酸結(jié) 合的信號(hào)。所述譜可記錄為結(jié)合的存在或不存在（信號(hào)對(duì)〇信號(hào)）。更優(yōu)選地，記錄的譜包 括來自各雜交的信號(hào)的強(qiáng)度。將所述譜與從正常的（例如，非癌性）對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交 特征譜相比較。信號(hào)的改變表示受試者中存在癌癥或易于發(fā)生癌癥。
[0196] 用于測(cè)量miR基因表達(dá)的其他技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，其包括用于 測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄和降解的速率的各種方法。
[0197] 本發(fā)明還提供了，測(cè)定具有卵巢癌的受試者的預(yù)后的方法，包括測(cè)量來自受試者 的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，所述miR基因產(chǎn)物與卵巢癌的特定預(yù)后（例 如，良好或積極預(yù)后，不良或不利預(yù)后）相關(guān)。根據(jù)這些方法，相較于對(duì)照樣品的對(duì)應(yīng)miR 基因產(chǎn)物的水平，測(cè)試樣品中與特定預(yù)后相關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的改變表明受試者患 有具有特定預(yù)后的卵巢癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物與不利（S卩，不良）預(yù)后相關(guān)。 不利預(yù)后的實(shí)例包括但不限于，低存活率和快速疾病進(jìn)展。
[0198] 在某些實(shí)施方案中，如下測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平：逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者 的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將該靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性 探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交特征譜，然后將受試樣品的雜交特 征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較。
[0199] 不希望受任何一個(gè)理論束縛，據(jù)信，細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)miR基因產(chǎn)物的水平的改 變可導(dǎo)致這些miR的一個(gè)或多個(gè)期望的靶的失調(diào)，這可導(dǎo)致卵巢癌的形成。因此，改變miR 基因產(chǎn)物的水平（例如，通過降低在卵巢癌細(xì)胞中被上調(diào)的miR的水平，通過升高在卵巢癌 細(xì)胞中被下調(diào)的miR的水平）將改善化療抗性卵巢癌的癥狀。
[0200] 因此，本發(fā)明包括治療受試者的卵巢的方法，其中至少一種miR基因產(chǎn)物在受試 者的細(xì)胞（例如，卵巢癌細(xì)胞）中失調(diào)（例如，下調(diào)、上調(diào)）。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品 (例如，卵巢癌樣品）中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對(duì)照樣品中的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物 的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品（例如，卵巢癌樣品）中至少一種miR基因產(chǎn)物的 水平低于對(duì)照樣品中的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在卵巢 癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，所述方法包括施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，或其分離 的變體或生物活性片段，以便患者的癌細(xì)胞的增殖被抑制。例如，當(dāng)miR基因產(chǎn)物在受試者 的癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可抑制癌細(xì)胞的增殖。 給受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物可以與在癌細(xì)胞中被下調(diào)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物 (例如，本文的表中顯示的miR基因產(chǎn)物）相同，或可以是其變體或生物活性片段。
[0201] 如本文中所定義的，miR基因產(chǎn)物的〃變體〃是指，與對(duì)應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物具 有少于100 %的同一性并且具有對(duì)應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)生物活性的miRNA。 此類生物活性的實(shí)例包括但不限于，靶RNA分子的表達(dá)的抑制（例如，抑制靶RNA分子的翻 譯，調(diào)節(jié)靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工）和與卵巢相關(guān)的細(xì)胞過程（例如， 細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡）的抑制。這些變體包括物種變體和由于miR基因的一個(gè)或 多個(gè)突變（例如，置換、缺失、插入）而產(chǎn)生的變體。在某些實(shí)施方案中，變體與對(duì)應(yīng)野生型 miR基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
[0202] 如本文中所定義的，miR基因產(chǎn)物的〃生物活性片段〃是指，具有對(duì)應(yīng)野生型miR 基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)生物活性的miR基因產(chǎn)物的RNA片段。如上文中所述，此類生物活 性的實(shí)例包括但不限于，靶RNA分子的表達(dá)的抑制和與卵巢癌相關(guān)的細(xì)胞過程的抑制。在 某些實(shí)施方案中，生物活性片段在長度上為至少約5、7、10、12、15或17個(gè)核苷酸。在具體 的實(shí)施方案中，可將分離的miR基因產(chǎn)物與一種或多種另外的抗癌治療組合來給受試者施 用。適當(dāng)?shù)目拱┲委煱ǖ幌抻冢瘜W(xué)療法、激素療法、放射療法以及組合（例如，放化 療）。
[0203] 激素療法是用于不能耐受化學(xué)療法或不能從化學(xué)療法得到幫助的患者的選擇。激 素療法藥物包括他莫昔芬(Nolvadex?)，和芳香酶抑制劑例如來曲唑（Femara?)、 阿那曲唑(Arimidex?)和依西美坦(Aromasin?)。
[0204] 基于MicroRNA的治療和診斷可改善卵巢癌的治療并且可涉及療法的組合。在治 療卵巢癌中，可使用鉬類藥物例如卡鉬(Parap I a t i η?)或順鉬(p I a t i no】。其它 治療可包括紫杉燒，例如紫杉酚(Taxol?)或多西紫杉醇(Taxotere?)。目前，紫杉酚 是最常用作與鉬類藥物組合的初始療法的藥物。
[0205] 使用的其它藥物可以是：吉西他浪（Gemzar?)、多柔比星 (Adriamycin⑧，Doxi 1?)、依托泊苷（Vepesid?)、長春瑞濱 (Navelbine?)、伊沙匹?。↖xempra?)和其它印itheione藥物、貝伐單抗 (Ava s t in?)和苯妥帝爾。
[0206] 本發(fā)明的實(shí)施方案可基于腫瘤對(duì)選擇的治療的響應(yīng)性的預(yù)測(cè)和指示，用于選擇 適當(dāng)?shù)乃幬镆约岸ㄖ苹颊叩闹委?。例如，貝伐單?Ava s t i η?)靶向血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)，參與癌細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)。VEGFB和VEGFR2途徑受miR-484和miR-296-5p影響。 MicroRNA測(cè)量可用于預(yù)測(cè)藥物功效和化療抗性。
[0207] 當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被上調(diào)時(shí)，所述方法包括給受試者施 用有效量的抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，以便卵巢癌細(xì)胞的增殖被抑制。此 類化合物在本文中稱為miR基因表達(dá)-抑制化合物。適當(dāng)?shù)膍iR基因表達(dá)-抑制化合物 的實(shí)例包括但不限于，本文中描述的那些化合物（例如，雙鏈RNA、反義核酸和酶促RNA分 子）。在具體的實(shí)施方案中，可將miR基因表達(dá)-抑制化合物與一種或多種另外的抗癌治療 組合來給受試者施用。適當(dāng)?shù)目拱┲委煱ǖ幌抻诨瘜W(xué)療法、放射療法及其組合（例如， 放化療）。
[0208] 如本文中所使用的，術(shù)語"治療"、"醫(yī)治"和"療法"是指改善與疾病或病況例如卵 巢癌相關(guān)的癥狀，包括預(yù)防或延遲疾病癥狀的發(fā)作，和/或減少疾病或病況的癥狀的嚴(yán)重 度或頻率。術(shù)語"受試者"和"個(gè)體"在本文中定義為包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但不限 于靈長類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他?？?、羊科、馬科、犬 科、貓科、嚙齒目或鼠科物種。在優(yōu)選實(shí)施這群中，動(dòng)物是人。
[0209] 如本文中所使用的，分離的miR基因產(chǎn)物的"有效量"是足以在患有卵巢癌的受試 者中抑制癌細(xì)胞增殖的量。通過考慮因素例如受試者的大小和體重、疾病侵入的程度、受試 者的年齡、健康和性別、施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容 易地確定對(duì)給定的受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。
[0210] 例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量。腫瘤塊 的大致重量可通過計(jì)算腫瘤塊的大致體積來測(cè)定，其中1立方厘米的體積大致等于1克?；?于腫瘤塊的重量的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可在約10-500微克/克的腫瘤塊的范圍 內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，有效量可以為至少約10微克/克的腫瘤塊，至少約60微克/克的 腫瘤塊或至少約100微克/克的腫瘤塊。
[0211] 分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可基于待治療的受試者的大致或估計(jì)的體重。優(yōu) 選，如本文中所描述的，胃腸外或腸內(nèi)施用這樣的有效量。例如，對(duì)受試者施用的分離的miR 基因產(chǎn)物的有效量可在大約5-3000微克/kg體重、大約700-1000微克/kg體重的范圍內(nèi) 或大于大約1000微克/kg體重。
[0212] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對(duì)給定的受試者施用分離的miR基因 產(chǎn)物的合適的給藥方案。例如，可對(duì)受試者施用一次（例如，作為單次注射或沉積 (deposition))miR基因產(chǎn)物?？蛇x擇地，可以每天1次或2次對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物， 進(jìn)行大約3至大約28天,特別地大約7至大約10天的時(shí)期。在特定的給藥方案中，每天I 次施用miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行7天。當(dāng)給藥方案包括多次施用時(shí)，應(yīng)理解，對(duì)受試者施用的miR 基因產(chǎn)物的有效量可包括在整個(gè)給藥方案中施用的基因產(chǎn)物的總量。
[0213] 如本文中使用的，"分離的"miR基因產(chǎn)物是合成的或通過人工介入從天然狀態(tài)改 變或取出的miR基因產(chǎn)物。例如，合成的HliR基因產(chǎn)物，或部分或完全從其天然狀態(tài)的共存 材料分離的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是"分離的"。分離的HliR基因產(chǎn)物可以以大體上純化的形 式存在，或可以存在于已將所述miR基因產(chǎn)物遞送入其中的細(xì)胞中。因此，有意地被遞送至 細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是"分離的"miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前 體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是"分離的"分子。根據(jù)本發(fā)明，本文中描述的分離的 miR基因產(chǎn)物可用于制造用于治療受試者（例如，人）的卵巢癌的藥物。
[0214] 分離的miR基因產(chǎn)物可使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方 法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞 磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成RNA分子或合成試劑的 提供商包括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. ) > Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, U. S. A.) > Glen Research(Sterling，VA，U. S. A. )、ChemGenes(Ashland，MA，U. S. A.)和 Cruachem(Glasgow, UK) 〇
[0215] 可選擇地，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組環(huán)形或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn) 物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適的啟動(dòng)子包括例如U6或HlRNA pol III啟動(dòng)子序列或巨 細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì) 粒還可包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或可調(diào)控的啟動(dòng)子。
[0216] 可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。還 可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞并且在其中直接表達(dá)。下面更詳細(xì)地論 述重組質(zhì)粒將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
[0217] miR基因產(chǎn)物可從分開的重組質(zhì)粒表達(dá)，或它們可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后通過合適的加工系統(tǒng)（包 括但不限于癌細(xì)胞中現(xiàn)有的加工系統(tǒng)）將該前體分子加工成功能性miR基因產(chǎn)物。其他合 適的加工系統(tǒng)包括例如體外果蠅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)（例如，如屬于Tuschl等人的美國公開專 利申請(qǐng)2002/0086356中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文）和大腸桿菌RNA 酶ΙΠ 系統(tǒng)（例如，如屬于Yang等人的美國公開專利申請(qǐng)2004/0014113中所描述的，其全 部公開內(nèi)容通過引用合并入本文）。
[0218] 適合用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇、用于將核酸序列插入質(zhì)粒以表達(dá) 基因產(chǎn)物的方法以及將重組質(zhì)粒遞送至目的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之 內(nèi)。參見，例如，Zeng 等人（2002)，]?〇16(311131'06119:1327-1333;1\18(*1(2002)，恥七· Biotechnol, 20:446-448 ;Brummelkamp 等人（2002)，Science296:550-553 ;Miyagishi 等 人（2002) ,Nat. Biotechnol. 20:497-500 ;Paddison 等人（2002) ,Genes Dev. 16:948-958; Lee 等人（2002) ,Nat. Biotechnol. 20: 500-505;和 Paul 等人（2002) ,Nat. Biotechnol. 20:505-508,其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0219] 在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV立即早期啟動(dòng)子 (intermediate-early promoter)控制下編碼miR前體RNA的序列。如本文中所使用的， "在啟動(dòng)子的控制下"是指編碼miR基因產(chǎn)物的核酸序列位于啟動(dòng)子的3'端，以便啟動(dòng)子可 起始miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
[0220] miR基因產(chǎn)物還可從重組病毒載體表達(dá)。預(yù)期miR基因產(chǎn)物可從兩個(gè)分開的重組 病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病 毒載體表達(dá)的RNA或所述RNA可在癌細(xì)胞中直接表達(dá)。下面更詳細(xì)地論述重組病毒載體將 miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
[0221] 本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RNA序列的任何 合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括但不限于U6或HlRNA pol III啟動(dòng)子序列，或巨細(xì)胞病 毒啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載 體還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或可調(diào)控的啟動(dòng)子。
[0222] 可使用能夠接受miR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如，來源于腺病毒 (AV)、腺伴隨病毒（AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒（例如，慢病毒（LV)、彈狀病毒（Rhabdoviruses)、鼠 白血病病毒）、皰疹病毒等的載體?？赏ㄟ^用來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型 化載體或通過置換不同的病毒衣殼蛋白（如果合適）來改變病毒載體的趨向性。
[0223] 例如，可用來自水泡性口膜炎病毒（VSV)、狂犬病病毒（rabies)、埃博拉病毒 (Ebola)、莫科拉病毒（Mokola)等的表面蛋白假型化本發(fā)明的慢病毒載體?？赏ㄟ^對(duì)載體 進(jìn)行工程改造以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來制備本發(fā)明的AAV載體，使之靶向不同的細(xì) 胞。例如，表達(dá)血清型2型基因組上的血清型2型衣殼的AAV載體稱為AAV2/2。AAV2/2載 體中的該血清型2型衣殼基因可用血清型5型衣殼基因替換，從而產(chǎn)生AAV2/5載體。用于 構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)；參見，例 如，Rabinowitz，J.E·，等人（2002)，J. Virol. 76:791-801，其全部公開內(nèi)容通過引用合并 入本文。
[0224] 適合用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、用于將用于表達(dá)RNA的核酸序列插 入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法和表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收在本領(lǐng) 域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。參見，例如，Dornburg (1995) ,Gene Therap. 2:301-310 ;Egl itis (1988)，Biotechniques6:608-614 ;MiIler(1990)，Hum. Gene Therap. 1:5-14 ;和 Anderson(1998)，Nature392:25-30,其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0225] 特別合適的病毒載體是來源于AV和AAV的載體。用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適的 AV載體、用于構(gòu)建重組AV載體的方法以及用于將載體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于Xia等 人（2002)，Nat.Biotech. 20:1006-1010,其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。用于表達(dá) miR基因產(chǎn)物的合適的AAV載體、用于構(gòu)建重組AAV載體的方法以及用于將載體遞送至靶 細(xì)胞的方法描述于 Samulski 等人（1987)，J. Virol. 61:3096-3101 ;Fisher 等人（1996)，J. Virol, 70:520-532 ;Samulski 等人（1989)，J. Virol. 63:3822-3826 ;美國專利 5, 252, 479 ; 美國專利5, 139,941 ;國際專利申請(qǐng)W094/13788 ;和國際專利申請(qǐng)W093/24641，其全部公開 內(nèi)容通過引用合并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含CMV立即早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV 載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。
[0226] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包含在人U6RNA啟動(dòng)子控制下的 與PolyT終止序列有效連接的編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文中所使用的，"與polyT 終止序列有效連接"是指編碼有義或反義鏈的核酸序列以5'方向與polyT終止信號(hào)緊密鄰 接。在從載體轉(zhuǎn)錄miR序列的過程中，polyT終止信號(hào)用于終止轉(zhuǎn)錄。
[0227] 在本發(fā)明的治療方法的其他實(shí)施方案中，可對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制 miR表達(dá)的化合物。如本文中所使用的，"抑制miR表達(dá)"是指治療后miR基因產(chǎn)物的前體 和/或有活性的成熟形式的產(chǎn)量低于治療前產(chǎn)生的量。通過使用例如本文中論述的測(cè)定 miR轉(zhuǎn)錄物水平的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定miR的表達(dá)在癌細(xì)胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表達(dá)的水平上（即，通過抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄）或 在加工的水平上（例如，通過抑制miR前體至成熟的活性miR的加工）發(fā)生。
[0228] 如本文中所使用的，抑制miR表達(dá)的化合物的"有效量"是足以在患有癌癥（例如， 卵巢癌）的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖的量。通過考慮因素，例如受試者的大小和體重、疾 病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對(duì)給定的受試者施用的抑制miR表達(dá)的化合物的有效量。
[0229] 例如，抑制表達(dá)的化合物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量，如本文中 描述的。抑制miR表達(dá)的化合物的有效量還可基于待治療的受試者的大致體重或估計(jì)的體 重,如本文中描述的。
[0230] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于給給定的受試者施用抑制miR表達(dá)的化合 物的適當(dāng)給藥方案，如本文中描述的。
[0231] 用于抑制miR基因表達(dá)的適當(dāng)?shù)幕衔锇p鏈RNA(例如短的或小的干擾RNA 或"siRNA"）、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這些化合物的每一種可靶向給定的miR 基因產(chǎn)物并干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(dá)（例如，通過抑制翻譯，通過誘導(dǎo)切割和/或降解）。
[0232] 例如，給定的miR基因的表達(dá)可通過用分離的雙鏈RNA( "dsRNA"）分子誘導(dǎo)miR 基因的RNA干擾來抑制，所述雙鏈RNA分子與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90%、例 如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定的實(shí)施方案中，dsRNA分 子是"短的或小干擾RNA"或" siRNA"。
[0233] 用于本方法的siRNA包括長度大約17個(gè)核苷酸至大約29個(gè)核苷酸、優(yōu)選長度大 約19至大約25個(gè)核苷酸的短雙鏈RNA。siRNA包含通過標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick堿基配對(duì)相互 作用（在下文中"堿基配對(duì)"）退火在一起的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包含大 體上與靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)包含的核酸序列同一的核酸序列。
[0234] 如本文中所使用的，siRNA中與靶mRNA內(nèi)包含的靶序列"大體上同一"的核酸序列 是與靶序列同一的核酸序列或與靶序列相異于1或2個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的有義 和反義鏈可包括兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子或可包括其中兩個(gè)互補(bǔ)部分堿基配對(duì)并且通過 單鏈"發(fā)夾結(jié)構(gòu)"區(qū)域共價(jià)連接的單個(gè)分子。
[0235] siRNA還可以是與天然存在的RNA相異于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和 /或改變的經(jīng)改變的RNA。這樣的改變可包括非核苷酸材料的添加，例如至siRNA的末端或 至siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸的添加，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修飾或用脫氧核 糖核苷酸對(duì)siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。
[0236] siRNA的一條或兩條鏈還可包含3'懸突。如本文中所用的，"3'懸突"是指從雙 鏈RNA鏈的3' -末端延伸的至少一個(gè)未配對(duì)的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，siRNA包 含至少一個(gè)長度為1至大約6個(gè)核苷酸（其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸）、長度為1 至大約5個(gè)核苷酸、長度為1至大約4個(gè)核苷酸或長度為大約2至大約4個(gè)核苷酸的3'懸 突。在特定的實(shí)施方案中，3'懸突存在于siRNA的兩條鏈上，且其長度為2個(gè)核苷酸。例 如，siRNA的各條鏈可包含二胸苷酸（"TT"）或二尿苷酸（"uu"）的3'懸突。
[0237] siRNA可通過化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文對(duì)分 離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 屬于Gewirtz的美國公開專利申請(qǐng)2002/0173478和屬于Reich等人的美國公開專利申請(qǐng) 2004/0018176,這兩者的全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0238] 給定的miR基因的表達(dá)還可通過反義核酸抑制。如本文中所使用的，"反義核酸" 是指通過RNA-RNA，RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變靶 RNA的活性。適合用于本方法的反義核酸是通常包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列互 補(bǔ)的核酸序列的單鏈核酸（例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸（PNA))。反義核酸可 包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)或95-100%互補(bǔ)的核 酸序列。本文的表中提供了特定人miR基因產(chǎn)物的核酸序列。不希望受任何理論束縛，據(jù) 信，反義核酸激活RNA酶H或降解miR基因產(chǎn)物/反義核酸雙鏈體的另一種細(xì)胞核酸酶。
[0239] 反義核酸還可包含對(duì)核酸主鏈或?qū)μ呛蛪A基部分（或它們的等價(jià)物）的修飾，從 而增加靶特異性、核酸酶抗性、遞送或與分子的功效相關(guān)的其他性質(zhì)。此類修飾包括膽固醇 部分、雙鏈體插入劑例如吖啶或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。
[0240] 反義核酸可通過化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文 對(duì)分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測(cè)的示例性方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力 之內(nèi)；參見，例如，Stein和Cheng(1993)，Science261:1004以及屬于Woolf等人的美國專 利5, 849, 902,其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0241] 給定的miR基因的表達(dá)還可通過酶促核酸（enzymatic nucleic acid)抑制。如 本文中所使用的"酶促核酸"是指包含與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的底物結(jié)合區(qū) 并且能夠特異性切割miR基因產(chǎn)物的核酸。酶促核酸底物結(jié)合區(qū)可以例如與miR基因產(chǎn)物 中的連續(xù)核酸序列50-100 %互補(bǔ)、75-100 %互補(bǔ)或95-100 %互補(bǔ)。酶促核酸還可包括在堿 基、糖和/或磷酸基團(tuán)上的修飾。用于本方法的示例性酶促核酸是核酶。
[0242] 酶促核酸可通過化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上 文對(duì)分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性 方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995)，Nucl. Acids Res. 23:2092-96 ;Hammann 等人 (1999)，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31 ;以及屬于Cech等人的美國專利 4, 987, 071，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0243] 至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一種用于抑制miR表達(dá)的化合物的施用將在患有癌 癥（例如，卵巢癌）的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖。如本文中所使用的，"抑制癌細(xì)胞的增 殖"是指殺死細(xì)胞或永久性或暫時(shí)地阻止或減緩細(xì)胞的生長。如果受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目 在施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物后保持恒定或減少，那么可推斷癌細(xì)胞 增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加但腫瘤生長的速度下降，則也可推斷癌細(xì)胞增殖 被抑制。
[0244] 受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞數(shù)目可通過直接測(cè)量或通過對(duì)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤塊的大 小的估計(jì)來確定。例如，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目可通過免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)或經(jīng)設(shè) 計(jì)用于檢測(cè)癌細(xì)胞的特征表面標(biāo)記的其他技術(shù)來測(cè)量。
[0245] 可通過適合用于將此類化合物遞送至受試者的癌細(xì)胞的任何方法來對(duì)受試者施 用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物。例如，可通過適合于用此類化合物或用包 含編碼此類化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法來施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR 表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表 達(dá)的化合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0246] 用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括例如核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或 前核（pronucleus)的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移和由親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo) 的核酸遞送、基因槍或微粒加速、磷酸鈣沉淀以及由病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
[0247] 例如，細(xì)胞可用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)移化合物例如D0TAP(N-[1_(2,3-二油酰氧基）丙 基]-N, N, N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或等價(jià)物例如LIP0FECTIN進(jìn)行 轉(zhuǎn)染。使用的核酸的量對(duì)于實(shí)施本發(fā)明不是至關(guān)重要的；可接受的結(jié)果可用〇. 1-100微克 核酸/105個(gè)細(xì)胞來獲得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大約0. 5微克質(zhì)粒載體/105 個(gè)細(xì)胞的比例。
[0248] 還可通過任何合適的腸內(nèi)或胃腸外施用途徑對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或 抑制miR基因表達(dá)的化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)施用途徑包括例如口服、直腸 或鼻內(nèi)給藥。合適的胃腸外施用途徑包括例如血管內(nèi)給藥（例如，靜脈內(nèi)團(tuán)注（bolus injection)、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)團(tuán)注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和至脈管系統(tǒng)內(nèi)的導(dǎo)管滴注）；組織外 周（peri-tissue)和組織內(nèi)注射（例如，腫瘤外周和腫瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下 注射）；皮下注射或沉積，包括皮下輸注（例如通過滲透泵）；對(duì)目的組織的直接施用，例如 通過導(dǎo)管或其他安置裝置（例如，視網(wǎng)膜丸劑（retinal pellet)或栓劑或包含多孔的、無 孔的或凝膠狀材料的植入物）；以及吸入。特別適合的施用途徑是注射、輸注和至腫瘤內(nèi)的 直接注射。
[0249] 在本方法中，miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物可以以裸露的RNA形 式、與遞送試劑一起或以包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的核酸 (例如，重組質(zhì)?；虿《据d體）的形式對(duì)受試者進(jìn)行施用。合適的遞送試劑包括例如Mirus Transit TKO 親脂試劑、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚陽離子（例如，多聚賴 氨酸）和脂質(zhì)體。
[0250] 包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載 體、以及用于將此類質(zhì)粒和載體遞送至癌細(xì)胞的技術(shù)在本文中進(jìn)行了論述和/或在領(lǐng)域是 公知的。
[0251] 在特定的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體用于將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物 (或包含編碼它們的序列的核酸）遞送至受試者。脂質(zhì)體還可增加基因產(chǎn)物或核酸的血 液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)通常 包括中性的或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常通過考慮因素例如期 望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期來進(jìn)行指導(dǎo)。已知許多用于制備脂質(zhì)體的方 法，例如如 Szoka 等人（1980)，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 ;和美國專利 4, 235, 871、 4, 501，728、4, 837, 028和5, 019, 369 (其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文）中所描述的方 法。
[0252] 用于本方法的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。結(jié)合癌細(xì)胞中普遍 的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。
[0253] 用于本方法的脂質(zhì)體還可進(jìn)行修飾以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（"MMS"）和網(wǎng)狀 內(nèi)皮系統(tǒng)（"RES"）清除。此類經(jīng)修飾的脂質(zhì)體在表面具有調(diào)理作用-抑制部分或所述部 分被整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用-抑制 部分和配體。
[0254] 用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用-抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的巨大 的親水聚合物。如本文中所使用的，抑制調(diào)理作用的部分，當(dāng)其通過化學(xué)或物理方式（例如 通過將脂溶性錨嵌入膜本身或通過與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)的直接結(jié)合）附著至膜時(shí)，與脂質(zhì) 體膜"結(jié)合"。此類抑制調(diào)理作用的親水聚合物形成了顯著減少脂質(zhì)體被MMS和RES吸收的 保護(hù)性表面層；例如，如美國專利4, 920, 016中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入 本文。
[0255] 適合于修飾脂質(zhì)體的抑制調(diào)理作用的部分優(yōu)選是具有大約500至大約40, 000道 爾頓，更優(yōu)選大約2, 000至大約20, 000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚 合物包括聚乙二醇（PEG)或聚丙二醇（PPG)或其衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG 或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線性的、分支的 或樹枝狀聚酰胺；聚丙烯酸；多元醇，例如與羧基或氨基化學(xué)連接的聚乙烯醇和聚木糖醇， 以及神經(jīng)節(jié)苷脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GMl。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚 物也是合適的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚乙二胺、聚 乙烯胺或多聚核苷酸的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物還可以是包含氨基酸或羧酸的 天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、褐藻酸、 角叉菜膠（carrageenan);胺化的多糖或低聚糖（線性或分支的）；或羧基化的多糖或低聚 糖，例如與具有所得的羧基的連接的碳酸的衍生物反應(yīng)的多糖或低聚糖。優(yōu)選，抑制調(diào)理作 用的部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為"PEG化脂 質(zhì)體"。
[0256] 可通過許多熟知的技術(shù)中的任一種將抑制調(diào)理作用的部分結(jié)合至脂質(zhì)體膜。例 如，可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)可溶性錨結(jié)合，然后再與膜結(jié)合。 類似地，可使用Na(CN)BH 3和溶劑混合物（例如以30:12比例的四氫呋喃和水）在60°C下 通過還原胺化作用，用硬脂酰胺脂質(zhì)可溶性錨衍生葡聚糖（dextran)聚合物。
[0257] 用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保持更長時(shí)間。 因此，此類脂質(zhì)體有時(shí)稱為"隱形（stealth)"脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體在通過多孔或"滲 漏"微脈管系統(tǒng)飼喂的組織中積累。因此，由此類微脈管系統(tǒng)缺陷表征的組織例如實(shí)體瘤 (例如，卵巢癌）將有效地積累這些脂質(zhì)體；參見Gabizon,等人（1988)，？1*〇(^似1:1^〇3(1· Sci.，U. S.A.，18:6949-53。此外，減少的通過RES的吸收通過阻止脂質(zhì)體在肝和脾中的大 量積累來降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適合用 于將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物（或包含編碼它們的序列的核酸）遞送至 腫瘤細(xì)胞。
[0258] 可在將它們給受試者施用之前，按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)將miR基因產(chǎn)物或miR基 因表達(dá)-抑制化合物配制為藥物組合物，有時(shí)稱為"藥物"。因此，本發(fā)明包括用于治療卵 巢癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或 其分離的變體或生物活性片段，以及藥學(xué)上可接受的載體。在具體的實(shí)施方案中，至少一種 miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于與適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞相比，在卵巢癌細(xì)胞中具有降低的表達(dá)水平的miR 基因產(chǎn)物。
[0259] 描沭
[0260] 盡管在檢測(cè)和細(xì)胞毒療法上取得進(jìn)展，但極低百分?jǐn)?shù)的晚期疾病患者在初次診斷 后存活5年。該疾病的高死亡率主要?dú)w因于對(duì)可獲得的療法的抗性。
[0261] 考慮到卵巢腫瘤的不良預(yù)后（主要?dú)w因于晚期診斷和對(duì)化學(xué)療法的低響應(yīng)），本 發(fā)明人現(xiàn)已鑒定了治療響應(yīng)性的預(yù)測(cè)標(biāo)志物和增強(qiáng)對(duì)治療的敏感性的新型分子靶。
[0262] 本文中描述了可用于鑒定對(duì)常規(guī)化學(xué)療法具有響應(yīng)的那些患者和有效地從 抗-血管生成化合物的添加受益的那些患者（從而也降低了治療成本并改善了藥物的效 力）的miR的分子特征。
[0263] 此外，數(shù)據(jù)顯示，除非VEGFB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也被阻斷，否則使用單獨(dú)的抗-VEGFA抗體進(jìn) 行的對(duì)VEGF的阻斷在卵巢癌患者中是沒有用的?？蛇x擇地，小的化合物例如靶向VEGFRl和 2受體的功能化納米顆粒可在該患者中用作改變卵巢癌的預(yù)后和治療的過程的有效療法。 實(shí)施例
[0264] 本發(fā)明的某些實(shí)施方案定義于本文的實(shí)施例中。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例，雖然顯示 了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是僅以舉例說明的方式給出。根據(jù)上述論述和這些實(shí)施例，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行各種改變和變動(dòng)，以使其適合各種用途和條件。
[0265] 實(shí)施例1
[0266] 方法
[0267] 在倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)研究并且所有患者給出他們的知情同意后，本發(fā)明人獲得了 198份卵巢的侵襲性漿液性癌的樣本。關(guān)于臨床結(jié)果的數(shù)據(jù)獲自患者的記錄。按照RECIST 指導(dǎo)，將對(duì)初始化學(xué)療法的響應(yīng)分類為完全響應(yīng)（CR)、部分響應(yīng)（PR)、穩(wěn)定的疾?。⊿D)和 進(jìn)行性疾?。≒D)。
[0268] miR表達(dá)特征分析和數(shù)據(jù)確認(rèn)
[0269] 使用包含總共 676 個(gè)獨(dú)特測(cè)定的 TaqMaH? Array Human MicroRNA Set v2. 0 對(duì)訓(xùn)練組（86個(gè)樣品）進(jìn)行miR表達(dá)特征分析。使用TaqMan? MicroRNA測(cè)定對(duì)驗(yàn)證組 (112樣品）驗(yàn)證差異表達(dá)的miR。
[0270] 統(tǒng)計(jì)分析
[0271] 使用用于基因表達(dá)的相對(duì)定量的比較CT(A ACt)法在Data Assist ver. I. 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA)上分析 TaqMan 低密度陣列卡（TLDA)和 RT-PCR數(shù)據(jù)。對(duì)于每一個(gè)樣品，平均miRNA表達(dá)值被計(jì)算為小于35的Ct值的平均值?；?于它們對(duì)第一化學(xué)療法的響應(yīng)或其它臨床參數(shù)標(biāo)記樣品。使用R軟件將單因素方差分析用 于鑒定差異表達(dá)的miRNA。全局中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（Global median normalization)用于TLDA 卡的表達(dá)分析。miR-16和miR-191，訓(xùn)練組中最恒定的miRNA中的兩個(gè)，用作內(nèi)源對(duì)照用于 驗(yàn)證組的RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)化。所有數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值土SEM。非響應(yīng)者對(duì)響應(yīng)者（對(duì)照）之 間的統(tǒng)計(jì)上顯著的差異性通過使用不成對(duì)學(xué)生雙尾t檢驗(yàn)來確定。P〈0. 05的值被認(rèn)為是統(tǒng) 計(jì)上顯著的。使用與用于圖形輸出的JavaTreeView組合的Cluster進(jìn)行圖心分析。
[0272] 表達(dá)miR-484和miR-296的卵巢癌細(xì)胞系的產(chǎn)生
[0273] 使用System Biosciences (SBI, USA)miR前體構(gòu)建體（其包含特異性miR和 copEGFP熒光標(biāo)志物的雙重表達(dá)）在293FT細(xì)胞系（Invitrogen)中產(chǎn)生表達(dá)miR-484的慢 病毒，用于簡單鑒定和監(jiān)控對(duì)于轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)是陽性的細(xì)胞。
[0274] 卵巢癌細(xì)胞系的生長和對(duì)卡鉬+泰素治療的易感性的體內(nèi)分析
[0275] 將兩個(gè)方法用于評(píng)價(jià)miR-484表達(dá)對(duì)體內(nèi)化學(xué)敏感性的作用：1)注射MDAH-2774 細(xì)胞混雜-miR (右肋腹）或miR-484 (左肋腹）和SK0V-3混雜-miR (右肋腹）或miR-484 (左 肋腹），通過每周腹膜內(nèi)施用卡鉬（15mg/kg) +泰素（5mg/kg)2次，持續(xù)3周來進(jìn)行處理。通 過測(cè)徑器測(cè)量和/或通過使用Ivis Lumina, Caliper Lifesciences的GFP可視化來追蹤腫 瘤生長。2)與卡鉬（15mg/kg) +泰素（5mg/kg)腹膜內(nèi)處理結(jié)合的表達(dá)混雜miR(右肋腹） 或miR484(左肋腹）的慢病毒的直接瘤內(nèi)遞送。
[0276] RNA提取方法
[0277] 按照制造商的方案，使用 High Pure FFPE RNA Micro 試劑盒（Roche Applied Science Mannheim Germany)從石錯(cuò)包埋的組織（FFPE)中分離用于低密度陣列分析的總 RNA。在提取后，使用 NanoDrop 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Inc. ,USA)定量總 RNA。
[0278] 使用 TaQMan? Array Human MicroRNA Set Cards ν2· 0 進(jìn)行的 MicroRNA 表達(dá) 特征分析
[0279] 使用 TaqMan? Array Human MicroRNA Set ν2· 0 (預(yù)先構(gòu)造的 2 個(gè)微流體卡組， A和B，包含特異于人microRNA的676個(gè)獨(dú)特測(cè)定）對(duì)訓(xùn)練組進(jìn)行MiR表達(dá)特征分析。此 夕卜，每一個(gè)陣列包含4個(gè)對(duì)照測(cè)定，3個(gè)選擇的候選內(nèi)源對(duì)照測(cè)定和一個(gè)陰性對(duì)照測(cè)定。該 陣列組需要使用Megaplex? RT引物、Human Pool Set ν2·0來進(jìn)行microRNA反轉(zhuǎn)錄。將 所有樣品的濃度調(diào)整至最低限樣品（15ng/ul)。為了增加靈敏度，在實(shí)時(shí)PCR之前，包括使 用Megaplex? PreAmp引物、Human Pool Set v2. 0的任選的預(yù)擴(kuò)增步驟。
[0280] miR反轉(zhuǎn)錄
[0281] 對(duì)于 miRNA 的 cDNA 合成，使用與用于 TaqMan Array Human A 和 B 卡（Applied Biosystems)的莖-環(huán) Megaplex? Primer Pools 組合的 miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems)反轉(zhuǎn)錄RNA，從而允許同時(shí)反轉(zhuǎn)錄676個(gè)miRNA和內(nèi)源對(duì)照。簡而言之，分別地 對(duì)于每一個(gè)卡A和B，在7· 5μ 1的總反應(yīng)體積中用Megaplex RT引物（IOx)、dNTP (IOOmM)、 MultiScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶（50U/μ 1)、RT 緩沖液（IOx)、MgCl2(25mM)和 RNA 酶抑制劑（20U/ul) 補(bǔ)充3ul的總RNA(45ng/ul)。在冰上溫育5分鐘后，使用下列RT方案：40個(gè)循環(huán)的（16°C， 2min ;42°C，1分鐘；和50°C，Is)，隨后在85°C進(jìn)行最終的逆轉(zhuǎn)錄酶滅活5min。
[0282] cDNA的預(yù)擴(kuò)增
[0283] 對(duì)于每一個(gè)卡 A 和 B，在 25 μ I PreAmp 反應(yīng)中，使用 Applied Biosystems'TaqMan PreAmp 預(yù)混合物（IOx)和Megaplex PreAmp 引物（IOx)預(yù)擴(kuò)增Megaplex RT產(chǎn)物（2· 5 μ 1)。 預(yù)擴(kuò)增循環(huán)條件如下：在95°C進(jìn)行l(wèi)Omin，在55°C進(jìn)行2min，和在72°C進(jìn)行2min，隨后進(jìn)行 12 個(gè)循環(huán)的（95°C，15s;和 60°C，4min)。
[0284] 實(shí)時(shí) qPCR.
[0285] 對(duì)于每一個(gè)卡A和B，用75 μ 1的0. Ix TE pH8. O稀釋25ul PreAmp反應(yīng)。對(duì)于每 一個(gè)卡，在900 μ 1的總體積中制備PCR擴(kuò)增反應(yīng)物，其包含450 μ 1的TaqMan2x通用PCR預(yù) 混合物、w/o UNG(Applied Biosystems)、441 μ 1的不含核酸酶的水和9 μ 1稀釋的PreAmp 產(chǎn)物。將100 μ 1的PCR反應(yīng)混合物分別加載至卡A和B的每一個(gè)端口。在專門的容器中 離心卡A和Β。以1200rpm進(jìn)行2次1分鐘的旋轉(zhuǎn)離心。密封陣列A和Β，將其分別裝載 在ABI Prism7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems)上。循環(huán)條件如下：在50°C進(jìn) 行2min，在94. 5°C進(jìn)行10分鐘，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的（在97°C進(jìn)行30s和在59. 7°C進(jìn)行 Imin)。在 ABI Prism7900HT 序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems)上進(jìn)行所有 PCR 反應(yīng)。 使用SDS軟件V. 2. 1，使用自動(dòng)化基線設(shè)置和0. 2的閾值計(jì)算原始Ct值。
[0286] TaqMail? Array Human MicroRNA Set Cards v2. 0 數(shù)據(jù)驗(yàn)證
[0287] 使用TaqMan MicroRNA測(cè)定對(duì)驗(yàn)證組進(jìn)行差異表達(dá)的miR的確認(rèn)。將單管TaqMan MicroRNA測(cè)定用于在Applied Biosystems實(shí)時(shí)PCR儀上檢測(cè)和定量成熟microRNA。所有 試劑、引物和探針獲自 Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA)。利用 RNU44和RNU48進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。按照制造商的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)PCR。在GeneAmp PCR9700熱循環(huán)儀（Applied Biosystems)中運(yùn)行所有RT反應(yīng)，包括無模板對(duì)照和RT負(fù)對(duì) 照。使用ABI Prism7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems)定量基因表達(dá)水平。以 一式三份進(jìn)行比較實(shí)時(shí)PCR，包括無模板對(duì)照。使用比較Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。
[0288] 用于細(xì)胞和CM中的成熟miRNA的實(shí)時(shí)PCR
[0289] 利用Trizol (Invitrogen)從細(xì)胞分離總RNA和按照用于液體樣品的制造商說 明書利用High Pure miRNA Isolation試劑盒（Roche)分離總RNA。通過單管TaqMan MicroRNA測(cè)定評(píng)估成熟miR。將細(xì)胞中的miR表達(dá)針對(duì)RNU44和RNU48標(biāo)準(zhǔn)化。所有逆 轉(zhuǎn)錄酶（RT)反應(yīng)，包括無模板對(duì)照和RT負(fù)對(duì)照在GeneAmp PCR9600熱循環(huán)儀（Applied Biosystems)中運(yùn)行。
[0290] 除非另外指出，否則以一式三份測(cè)試每一個(gè)樣品。從培養(yǎng)基樣品分離MicroRNA。 在DNA酶處理（Ambion)后，利用NanoDrop(Thermo Scientific)測(cè)定RNA濃度。在血清中， 將樣品針對(duì)U6snRNA (Applied Biosystems)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，如所顯示的。由于U6是不一致的， 因此將靶miRNA的表達(dá)水平直接針對(duì)總RNA (本發(fā)明人先前在miR-296-5p和miR-484不存 在的情況下在非條件化培養(yǎng)基中測(cè)定的）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0291] miRNA的過表達(dá)和Western印跡
[0292] 對(duì)于 miR-296 和 miR-484 的過表達(dá)，使用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)將 IOOnM 的 pre-miR-296、pre-miR-484 和 pre-陰性對(duì)照-2 (Ambion)轉(zhuǎn)染入 HEK293 和 HUVE 細(xì)胞。24hr后，收集細(xì)胞，將其在含有蛋白酶抑制劑混合物（Roche Diagnostic)的RIPA緩 沖液中進(jìn)行裂解。使用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定染料試劑濃縮物（Bio-Rad)測(cè)量總細(xì)胞裂解物 的蛋白質(zhì)濃度，將35 μ g的細(xì)胞裂解物在SDS-PAGE凝膠（Bio-Rad)上進(jìn)行分離，隨后轉(zhuǎn)移 至硝酸纖維素，隨后利用ECL檢測(cè)試劑（Denville Scientific)進(jìn)行可視化。使用下列一抗： 小鼠單克隆抗-Hgs (1:1000, Enzo Life Science)、兔多克隆抗-VEGF 受體 2 (1:1000, Cell Signaling Technology)、小鼠單克隆抗-VEGF-B (1:200, Santa Cruz Biotechnology)、小 鼠單克隆抗-a-微管蛋白（I :2000, Sigma)。
[0293] 螢光素酶miRNA靶受體測(cè)定
[0294] 使用下列引物PCR擴(kuò)增人HGS和VEGFB基因的3' UTR :
[0295] HGS Fw5' -GCT CTA GAC CCA GGC CAT GCT CAC GTC CGG AGT MC ACT AC-3'（SEQ ID NO :1)和
[0296] HGS Rw5'-GCT CTA GAG AAA TAC ATT TTA TTA TCG CTG TAC CAT TCT GGG G-3'（SEQ ID NO :2);
[0297] VEGFB Fw5'-TCT AGA GTG CCG GAA GCT GCG AAG GTG-3'（SEQ ID NO :3)和
[0298] VEGFB Rw5'-TCT AGA CAG GGT TGG GGG TCA CAG TTC-3'（SEQ ID NO :4)
[0299] 并通過使用緊在螢火蟲螢光素酶的終止密碼子下游的Xbal位點(diǎn)將其插入pGL3對(duì) 照載體（Promega)，從而產(chǎn)生p3' UTR-HGS和p3' UTR-VEGFB質(zhì)粒。使用QuikChange定點(diǎn)誘 變?cè)噭┖校⊿tratagene, San Diego, CA),將這些構(gòu)建體用于產(chǎn)生p3'-UTRmut-HGS,引物：
[0300] Fw ：5'-CAC AAT GAC ACC TCC CCG AGC CTC TGC AGG GGC CTC TCT CGG CAG CCA CA-3'（SEQ ID NO :5);
[0301] Rw ： 5'-GCT CGG GGA GGT GTC ATT GTG ACA CCA CAG CCA GCT CAC AGT GCG GCC AG-3'（SEQ ID NO :6)，和
[0302] p3' -UTRmut-VEGFB 質(zhì)粒，引物：
[0303] Fw : 5'-AGT GGG GGA ACA AAG AGG TAA AAA ACA GCC AAG C-3'（SEQ ID NO : 7);
[0304] Rw : 5'-GCT TGG CTG TTT TTT ACC TCT TTG TTC CCC CAC T-3'（SEQ ID NO :8)。
[0305] 通過使用 Lipofectamine2000(Invitrogen)，利用 1 μ g 的 p3'UTR-HGS 或 p3' UTR-VEGFB 和利用 p3' UTRmut-HGS 或 p3' UTRmut-VEGFB 質(zhì)粒以及 0. 1 μ g 的海腎螢光素 酶表達(dá)構(gòu)建體pRL-TK (Promega)和IOOnM miRNA或?qū)φ涨绑w轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后 24h收集細(xì)胞，按照制造商的說明書，利用Dual Luciferase測(cè)定（Promega)進(jìn)行測(cè)定。以 一式三份進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0306] 血管密度的免疫組織化學(xué)和評(píng)估
[0307] 切取腫瘤切片（2 μ m厚），用于福爾馬林固定和石蠟包埋，包埋樣品的脫蠟通過梯 度乙醇來實(shí)現(xiàn)。按照制造商的說明書使用抗⑶34-抗。使用Chalkley目鏡法評(píng)估血管密度 (⑶34+)。由兩個(gè)觀察者在共聚焦顯微鏡下以低放大率掃描整個(gè)切片。鑒定了 3個(gè)具有最高 血管密度的區(qū)域（血管熱點(diǎn)（hot-spot))。在高放大倍數(shù)（x400)下，將25-點(diǎn)Chalkley-目 鏡計(jì)數(shù)線用于每一個(gè)熱點(diǎn)，并進(jìn)行定向以允許最大數(shù)目的點(diǎn)命中在血管上或血管內(nèi)。3次計(jì) 數(shù)的平均值代表腫瘤的血管密度。
[0308] 表達(dá)miR-484的卵巢癌細(xì)胞系的產(chǎn)生
[0309] 通過磷酸I丐轉(zhuǎn)染，在293FT細(xì)胞系（Invitrogen)中產(chǎn)生表達(dá)miR-484的慢病 毒。為此目的，使用System Biosciences(SBI，USA)miR前體構(gòu)建體（其包含特異性miR和 copGFP熒光標(biāo)志物的雙重表達(dá)），以簡單鑒定和監(jiān)控對(duì)于轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染是陽性的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 后72小時(shí)收集包含病毒的條件培養(yǎng)基，將其用于轉(zhuǎn)導(dǎo)上皮卵巢癌細(xì)胞系（EOC)。特別地，用 表達(dá)單獨(dú)的GFP的病毒（在下文中稱為空載體）或表達(dá)GFP和miR-484的前體的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) SK0V-3和MDAH-2774,隨后監(jiān)控它們的熒光表達(dá)。
[0310] 表達(dá)miR-484的卵巢癌細(xì)胞系對(duì)卡鉬+泰素處理的體外易感性
[0311] 為 了測(cè)定 EOC 細(xì)胞系的 IC5。，將 MDAH2774、SK0V-3、T0V21G、T0V112D、0VCAR8 和 IGROV以1000個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板在96孔板（以一式六份）中，24小時(shí)后，在無血清培 養(yǎng)基中用遞增劑量的卡鉬（CBDCA)(范圍從l-150mg/ml)或泰素（TAX)(范圍從1-200ηΜ)處 理6小時(shí)。在除去藥物后，將細(xì)胞在PBS中洗滌，并在血清存在的情況下溫育另外4天。按 照制造商的說明書使用MTS測(cè)定（SIGMA)評(píng)估細(xì)胞活力。報(bào)導(dǎo)的IC 5tl值代表至少3個(gè)獨(dú)立 實(shí)驗(yàn)的平均值。為了評(píng)估m(xù)iR-484對(duì)體外藥物敏感性的作用，將表達(dá)親代，混雜和miR-484 的細(xì)胞涂板在96孔板（1000個(gè)細(xì)胞/孔）中，用指定劑量的CBDCA和TAX進(jìn)行處理。如上 所述，在4天后評(píng)價(jià)活力。
[0312] 對(duì)用從表達(dá)miR-484的卵巢癌細(xì)胞系收集的條件培養(yǎng)基刺激的HUVEC細(xì)胞的管形 成測(cè)定
[0313] 用125ml的基質(zhì)膠（BD，非生長因子減少8-10ug/ul)填充48孔板的孔，讓其在 37°C固化1小時(shí)。隨后將重懸浮于200ml培養(yǎng)基中的HUVEC細(xì)胞（ATCC，IxlO 5)平鋪在基 質(zhì)膠層上，隨時(shí)間過去監(jiān)控管樣結(jié)構(gòu)的形成。時(shí)間推移視頻顯微鏡（Leica)用于產(chǎn)生該過 程的影片，每5分鐘收集圖像，直至20小時(shí)。用于重懸浮內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基為：1_用于內(nèi) 皮細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，用作陽性對(duì)照；2-低血清培養(yǎng)基（2% )，用作陰性對(duì)照；3-來自用混 雜-miR或miR-484轉(zhuǎn)導(dǎo)的SK0V-7或MDAH-2774的條件培養(yǎng)基（+2%血清）。
[0314] 表達(dá)miR-484的卵巢癌細(xì)胞系的生長和對(duì)卡鉬+泰素處理的易感性的體內(nèi)分析.
[0315] 用IOOul包含I. 5xl06個(gè)MDAH-2774細(xì)胞混雜-miR(右肋腹）或miR-484(左肋 腹）的PBS在兩個(gè)背側(cè)面皮下注射無胸腺雌性裸小鼠（8只/組）。
[0316] 用SK0V-3進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，除了注射2.2xl06個(gè)細(xì)胞外。當(dāng)腫瘤塊變得可見時(shí)， 開始利用CBDCA(15mg/kg)和Tax(5mg/kg)進(jìn)行處理。遞送在200ul PBS中稀釋的藥物， 每周腹膜內(nèi)注射2次，進(jìn)行4周。每周利用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤塊2次，進(jìn)行4周。此外，使小 鼠麻醉，通過探測(cè)使用的卵巢癌細(xì)胞表達(dá)的GFP熒光標(biāo)志物，利用Ivis Lumina，Caliper Lifesciences對(duì)腫瘤塊成像，每周一次，進(jìn)行4周。隨后殺死小鼠，切取腫瘤塊，將其包含在 OCT中以待進(jìn)一步分析。
[0317] 結(jié)果
[0318] 漿液性卵巢癌中與化療抗性相關(guān)的miR表達(dá).
[0319] 為了確定miR是否可用于預(yù)測(cè)漿液性卵巢癌（EOC)的化療抗性，分析676個(gè)miR的 表達(dá)。如圖IA中顯示的，鑒定了能夠區(qū)分4個(gè)不同組的具有23個(gè)差異表達(dá)的miR的響應(yīng)特 征。圖心的聚類分析（圖1B)顯示，EOC樣品可分類為兩個(gè)主要種類：一種為完全和部分響 應(yīng)者，進(jìn)一步標(biāo)記為響應(yīng)者；另一種為穩(wěn)定的和進(jìn)行性疾病，標(biāo)記為非響應(yīng)者。這兩個(gè)種類 用于進(jìn)一步細(xì)化響應(yīng)特征和定義12個(gè)miRNA (圖1C)。同樣地，將來自第二患者組群的112 個(gè)EOC樣品用于驗(yàn)證響應(yīng)miRNA(圖1D)。在12個(gè)初始鑒定的miR中，3個(gè)miR顯示在非響 應(yīng)者腫瘤中被下調(diào)：miR-484 (P-值=0.0007)、miR-642(p-值=0.041)和 miR-217(p-值 =0· 046)。
[0320] miR-484表達(dá)不改變對(duì)卡鉬和泰素的體外敏感性
[0321] 在6個(gè)不同的上皮卵巢癌細(xì)胞系中評(píng)價(jià)miR-484表達(dá)水平（圖6A-6B)。盡管用遞 增濃度的卡鉬（CBDCA)和泰素（Tax)處理細(xì)胞2或4小時(shí)，但它們的IC 5tl與miR-484的內(nèi) 源水平無關(guān)，如4天后通過MTS測(cè)定評(píng)價(jià)的。此外，miR-484在MDAH-2274和SK-0V3細(xì)胞 系中的過表達(dá)未顯著地影響它們對(duì)CBDCA和Tax的體外敏感性（圖6C和6D)。
[0322] miR-484在化療抗性的獲得中的作用
[0323] 由于484的水平在細(xì)胞系之間非常相似，因此，將過表達(dá)對(duì)照-miR(混雜）或 miR-484的MDAH-2774和SK-0V3細(xì)胞用于在體內(nèi)概述非響應(yīng)者表型和確定miR是否以背 景依賴性方式影響卵巢癌的化學(xué)敏感性。使用還編碼EGFP-蛋白的慢病毒載體以跟蹤體 內(nèi)腫瘤生長。將細(xì)胞（1.5xl0 6)皮下接種在裸小鼠的左（miR-484-MDAH-2774)和右肋腹 (EGFP-MDAH-2774)中，并使其生長15天。在該時(shí)間點(diǎn)上，在6/8的小鼠中，由表達(dá)miR-484 的細(xì)胞形成的腫瘤體積大于在表達(dá)對(duì)照EGFP的細(xì)胞中觀察到的腫瘤體積，這表明原發(fā)性 腫瘤的生長未受miR表達(dá)影響（圖2A)。
[0324] 在CBDCA和Tax治療后，1只小鼠無響應(yīng)，并且被排除在研究之外。其它7只 小鼠的分析顯示，對(duì)照腫瘤在治療結(jié)束時(shí)相對(duì)于第〇天它們的尺寸增加約6倍（范圍為 2. 3-17. 7)。在相同小鼠中，表達(dá)miR-484的腫瘤僅增加1.3倍（范圍為0.8-1. 8)，顯示對(duì) 藥物敏感得多（與對(duì)照相比）（圖2A)。
[0325] 通過使用能夠檢測(cè)EGFP熒光的體內(nèi)成像系統(tǒng)，SK-0V3細(xì)胞的分析確認(rèn)，miR-484 的表達(dá)不影響原發(fā)性腫瘤的生長但顯著增加對(duì)治療的敏感性（圖2B和2C)。
[0326] 在裸小鼠中比SK0V-3生長更快的MDAH-2774細(xì)胞用于檢查miR的體內(nèi)施用是否 可改變EOC對(duì)CBDCA+Tax治療的敏感性。使親代MDAH-2774細(xì)胞在裸小鼠的肋腹生長2周， 隨后用表達(dá)EGFP-對(duì)照miR的慢病毒在右肋腹以及用表達(dá)EGFP-miR-484的慢病毒在左肋 腹注射小鼠。兩天后，利用CBDCA+Tax每周2次處理小鼠（進(jìn)行3周），并且1周后重復(fù)病 毒的瘤內(nèi)注射。21天后，評(píng)價(jià)腫瘤生長。令人驚訝地，在6/6案例中，miR-484增加對(duì)藥物的 敏感性，這表明，其表達(dá)能夠在體內(nèi)調(diào)節(jié)上皮卵巢癌的對(duì)⑶BCA和Tax的抗性（圖2A-2D)。
[0327] miR-484調(diào)控血管生成因子的表達(dá)。
[0328] miR-484參與血管生成因子的調(diào)控。miR-484靶向能夠直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長和 遷移的血管內(nèi)皮生長因子B(VEGFB)以及牽涉正常和病理血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)的所有方面 的血管內(nèi)皮生長因子2 (VEGFR2/KDR)。螢光素酶和western印跡分析確認(rèn)，miR-484調(diào)節(jié) VEGFB和VEGFR2的內(nèi)源水平（圖3A-3C)。
[0329] 使用抗-CD34抗體評(píng)估30例人漿液性卵巢癌（15個(gè)響應(yīng)者/15個(gè)非響應(yīng)者）和 28例小鼠異種移植物腫瘤[14個(gè)來自Sk-0v3,并且14個(gè)來自MDAH-2774 (7個(gè)用miR-484轉(zhuǎn) 導(dǎo)，和7個(gè)用GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)）]的血管密度，并且通過Chalkley目鏡法進(jìn)行評(píng)價(jià)。在人腫瘤中，平 均微血管密度為30±1. 17(范圍為9-54)(對(duì)于響應(yīng)者）和68±1.6(范圍為15-114)(對(duì)于 非響應(yīng)者）（P = 〇.〇〇〇〇〇〇2);在小鼠中，其為9±5. 5(范圍為1-18)(對(duì)于SK-0V3-miR484)、 23±12(范圍為 5-37)(對(duì)于 SK-0V3-EGFP) (p = 0· 0004)和 10±6· 2(范圍為 4-22)(對(duì) 于 MDAH-2774-miR484)、17±8· 9(范圍為 5-28)(對(duì)于 MDAH-2774-EGFP) (ρ = 0· 0009)(圖 4A-4C)。
[0330] 斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示，血管數(shù)目與miR表達(dá)之間具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性（r = -0. 8, ρ =I. 56E-07)，這表明，這些腫瘤的敏感性歸因于它們的微血管品質(zhì)（asset)，其受miR調(diào)控 驅(qū)動(dòng)（圖4D)。
[0331] 為了確認(rèn)mir-484-介導(dǎo)的血管品質(zhì)的調(diào)節(jié)，通過Western印跡分析用miR-484或 scr-載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDAH-2774或SK-0V3細(xì)胞系的VEGFB表達(dá)。將HUVEC細(xì)胞在獲自轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM)中培養(yǎng)。時(shí)間推移視頻顯微技術(shù)顯示，當(dāng)將HUVEC細(xì)胞在3D 基質(zhì)膠上培養(yǎng)6小時(shí)時(shí)，來自scr-MDAH-2774或SK-0V3細(xì)胞的CM能夠誘導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的形 成。當(dāng)使用來自過表達(dá)miR-484的MDAH-2774或SK-0V3的CM時(shí)，該作用被減弱，并且當(dāng)將 細(xì)胞在CM存在的情況下培養(yǎng)20hr時(shí)，該作用被消除（圖7)。
[0332] 總而言之，這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了，EOC細(xì)胞的miR-484表達(dá)能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞形成血管 樣結(jié)構(gòu)和支持血管樣結(jié)構(gòu)形成的能力。然而，不希望受理論束縛，本發(fā)明人現(xiàn)于本文中相 信，VEGFB的miR-484調(diào)控在瘤細(xì)胞上是可能的，但為了調(diào)節(jié)VEGFR2, miR必須直接對(duì)腫瘤 相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞施加其作用。
[0333] 為了確定由EOC產(chǎn)生的miR-484是否釋放進(jìn)入局部微環(huán)境，和隨后進(jìn)入其中其到 達(dá)其靶的內(nèi)皮細(xì)胞，共培養(yǎng)HUVEC和過表達(dá)miR-484-EGFP或混雜miR-EGFP的卵巢癌細(xì)胞 來源的細(xì)胞系。miR-484-EGFP在MDAH-2774和SK-0V3中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致其表達(dá)相對(duì)于對(duì) 照增加至少2倍（圖5A)。
[0334] miR-484在穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞來源的細(xì)胞系的CM中增加（圖5B)。在過表 達(dá)miR-484的細(xì)胞系存在的情況下培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中，miR-484的水平相對(duì)于對(duì)照增加 0.2倍至5倍（圖5C)。數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌來源的細(xì)胞系與HUVEC細(xì)胞之間的直接接觸不是 必需的，因?yàn)楣才囵B(yǎng)實(shí)驗(yàn)是通過將癌細(xì)胞涂板在孔中和將HUVEC涂板在transwell中（或 反之亦然，無顯著差異）來進(jìn)行的。這些數(shù)據(jù)共同地顯示，miR-484由瘤細(xì)胞分泌至局部微 環(huán)境中，并在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)入HUVEC細(xì)胞（圖OT)。
[0335] 此外，當(dāng)將HUVEC與過表達(dá)對(duì)照和miR-484的SK-0V3共培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，僅后者能 夠顯著減少VEGFR2在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)（圖5E)。
[0336] 過表達(dá)miR-484的卵巢癌細(xì)胞較不能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的體外再組織和在小鼠中 的新血管形成。VEGFRl和2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的協(xié)同作用是卵巢癌生長和藥物敏感性所必需 的。
[0337] 實(shí)施例2
[0338] 響應(yīng)者對(duì)難治性卵巢癌的miR表達(dá)特征。
[0339] 為了研究miR是否是預(yù)測(cè)卵巢癌化療抗性，分析訓(xùn)練組的676個(gè)miR的表達(dá)。在卡 A的381個(gè)靶miR和卡B的295個(gè)靶miR中，分別有364個(gè)（96% )和240個(gè)（81% )在至 少一個(gè)樣品中被擴(kuò)增。在所有樣品中僅17個(gè)來自卡A的祀和55個(gè)來自卡B的祀是未確定 的（Ct = 40)。如圖9中所示，鑒定了能夠區(qū)分R與NR漿液性癌的16個(gè)差異表達(dá)的miR。 在手術(shù)結(jié)果和/或腫瘤分級(jí)方面未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)上顯著的miR(數(shù)據(jù)未顯示）。隨后在驗(yàn)證組中 驗(yàn)證差異表達(dá)的miR。在最初鑒定的16個(gè)miR中，有3個(gè)miR在兩個(gè)組中差異表達(dá)，其中的 2個(gè)在R腫瘤中被下調(diào)（miR-296-5p和miR-518e)并且1個(gè)被上調(diào)（miR-484)(圖9)。這 3個(gè)miR能夠并足以區(qū)分這兩個(gè)組。
[0340] miR-296和miR-484表達(dá)不改變對(duì)CBDCA和Tax的體外敏感性。
[0341] 為了確定miR在藥物抗性發(fā)展中的作用，評(píng)價(jià)6個(gè)不同的上皮卵巢癌細(xì)胞系（EOC) 的miR-484和miR-296的表達(dá)水平。雖然miR-484在所有細(xì)胞系中可容易地被檢測(cè)到，但 miR-296在MDAH-2774和T0V-112D中幾乎不表達(dá)。盡管用遞增濃度的CBDCA和Tax處理細(xì) 胞2或4小時(shí)，但它們的IC 5tl與miR-484或296的內(nèi)源水平無關(guān)，如4天后通過MTS測(cè)定評(píng) 價(jià)的。此外，miR-484和296在MDAH-2274和SK0V-3細(xì)胞系中的過表達(dá)未顯著影響它們對(duì) CBDCA和Tax的體外敏感性。
[0342] miR-484在化療抗性的獲得中的作用
[0343] 由于miR-296以極低水平在EOC中表達(dá)，并且miR-484的水平在細(xì)胞系間是極其 相似的，因此將過表達(dá)對(duì)照-miR (混雜的）或miR-484的MDAH-2774和SK0V-3細(xì)胞用于概 括體內(nèi)R表型和確定miR是否以背景依賴性方式影響卵巢癌的化學(xué)敏感性。使用還編碼 EGFP-蛋白的慢病毒載體以在體內(nèi)跟蹤腫瘤生長。將細(xì)胞（1.5xl06)皮下接種至裸小鼠的 左肋腹（miR-484-MDAH-2774)和右肋腹（EGFP-MDAH-2774)，讓其生長15天。在該時(shí)間點(diǎn) 上，在6/8的小鼠中，由表達(dá)miR-484的細(xì)胞形成的腫瘤體積大于在表達(dá)對(duì)照EGFP的細(xì)胞 中觀察到的腫瘤體積，這表明原發(fā)性腫瘤的生長未受miR表達(dá)的影響。
[0344] 在CBDCA和Tax治療后，1只小鼠無響應(yīng)，并且被排除在研究之外。其它7只 小鼠的分析顯示，對(duì)照腫瘤在治療結(jié)束時(shí)相對(duì)于第〇天它們的尺寸增加約6倍（范圍為 2. 3-17. 7)。在相同小鼠中，表達(dá)miR-484的腫瘤僅增加1.3倍（范圍為0.8-1. 8)，顯示對(duì) 藥物敏感得多（與對(duì)照相比）。通過使用能夠檢測(cè)FEGP熒光的體內(nèi)成像系統(tǒng)，SK-0V3細(xì)胞 的分析確認(rèn)，miR-484的表達(dá)不影響原發(fā)性腫瘤的生長，但顯著增加對(duì)治療的敏感性。
[0345] 在裸小鼠中比SK0V-3生長更快的MDAH-2774細(xì)胞用于檢查miR的體內(nèi)施用是否 可改變EOC對(duì)CBDCA+Tax治療的敏感性。使親代MDAH-2774細(xì)胞在裸小鼠的肋腹生長2周， 隨后用表達(dá)EGFP-對(duì)照miR的慢病毒在右肋腹以及用表達(dá)EGFP-miR-484的慢病毒在左肋 腹注射小鼠。兩天后，利用CBDCA+Tax每周2次處理小鼠（進(jìn)行3周），并且1周后重復(fù)病 毒的瘤內(nèi)注射。21天后，評(píng)價(jià)腫瘤生長。令人驚訝地，在6/6案例中，miR-484增加對(duì)藥物 的敏感性，這表明，其表達(dá)能夠在體內(nèi)調(diào)節(jié)上皮卵巢癌的對(duì)⑶BCA和Tax的抗性。
[0346] miR-484和miR-296調(diào)節(jié)血管生成因子的表達(dá)
[0347] miR-484(和在較低的程度上，miR-296)在體內(nèi)但非在體內(nèi)在EOC細(xì)胞的化學(xué)敏感 性方面具有作用，這表明它們作用于腫瘤微環(huán)境，而非以細(xì)胞自主方式起作用。兩種miR都 參與血管生成因子的調(diào)節(jié)。螢光素酶和western印跡分析確認(rèn)，miR-296和miR-484分別 調(diào)節(jié)HGS和VEGFB的內(nèi)源水平（圖10B-10E)。
[0348] 使用抗-⑶34抗體評(píng)估30例人漿液性卵巢癌（15個(gè)R/15個(gè)NR)和28例小鼠異 種移植物腫瘤[14個(gè)來自Skov-3,并且14個(gè)來自MDAH-2774 (7個(gè)用miR-484轉(zhuǎn)導(dǎo)，和7個(gè) 用GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)）]的血管密度，并且通過Chalkley目鏡法進(jìn)行評(píng)價(jià)。在人腫瘤中，平均微血管 密度為30 (范圍為9-54)(對(duì)于R)和68 (范圍為15-114)(對(duì)于NR) (P = 〇.〇〇〇〇〇〇2);在小 鼠中，其為 9(范圍為 1-18)(對(duì)于 SK0V-3-miR484)、23(范圍為 5-37)(對(duì)于 SK0V-3-EGFP) (p = 0· 04)和 10(范圍為 4-22)(對(duì)于 MDAH-2774-miR484)、17(范圍為 5-28)(對(duì)于 MDAH-2774-EGFP) (p = 0. 01)(圖11A-11C)，這表明，這些腫瘤的敏感性歸因于它們的微 血管品質(zhì)（asset),其受miR調(diào)控驅(qū)動(dòng)。為了確認(rèn)mir-484-介導(dǎo)的血管品質(zhì)的調(diào)節(jié)，通 過Western印跡分析用miR-484或scr-載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDAH-2774或SK0V-3細(xì)胞系的 VEGFB表達(dá)，其被下調(diào)（數(shù)據(jù)未顯示）。將HUVEC細(xì)胞在獲自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM) 中培養(yǎng)。時(shí)間推移視頻顯微技術(shù)顯示，當(dāng)將HUVEC細(xì)胞在3D基質(zhì)膠上培養(yǎng)6小時(shí)時(shí)，來自 scr-MDAH-2774或SK0V-3(數(shù)據(jù)未顯示）細(xì)胞的CM能夠誘導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的形成。當(dāng)使用來自 過表達(dá)miR-484的MDAH-2774或SK0V-3的CM時(shí)，該作用被減弱，并且當(dāng)將細(xì)胞在CM存在 的情況下培養(yǎng)20hr時(shí)，該作用被消除?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了，EOC細(xì)胞的miR-484表 達(dá)能影響內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)和支持血管樣結(jié)構(gòu)形成的能力。
[0349] miR-484調(diào)節(jié)VEGFB的表達(dá)，并因此調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中分泌的配體的量，然而，調(diào) 節(jié)受體的水平的miR-296必須直接對(duì)腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞施加其作用。然而,不希望受理論 束縛，本發(fā)明人現(xiàn)于本文中相信，由EOC細(xì)胞產(chǎn)生的miR-296被釋放進(jìn)入局部微環(huán)境，尤其 是在藥物治療之后，并且隨后進(jìn)入其在其中靶向HGS的內(nèi)皮細(xì)胞，從而最終調(diào)節(jié)VEGFR2信 號(hào)傳導(dǎo)。為了確認(rèn)這一點(diǎn)，將HUVEC和過表達(dá)miR-296-EGFP或混雜miR-EGFP的EOC細(xì)胞共 培養(yǎng)。miR-296-EGFP在不同EOC細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致其表達(dá)相對(duì)于對(duì)照增加至少2倍。 在過表達(dá)miR-296的EOC細(xì)胞的CM中發(fā)現(xiàn)miR-296。在過表達(dá)miR296的EOC細(xì)胞存在的 情況下培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中，miR296的水平相對(duì)于對(duì)照增加1倍至11倍。這些數(shù)據(jù)顯示， EOC與HUVEC細(xì)胞之間的直接接觸不是必需的，因?yàn)楣才囵B(yǎng)實(shí)驗(yàn)是通過將EOC涂板在孔中和 將HUVEC涂板在transwell中（或反之亦然，無顯著差異）來進(jìn)行的。這些數(shù)據(jù)共同地顯 示，miR-296由EOC細(xì)胞分泌至局部微環(huán)境中，并在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)入HUVEC細(xì)胞。此外，當(dāng)將 HUVEC與過表達(dá)對(duì)照和miR-296的EOC細(xì)胞在蓋玻片上共培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，僅后者能夠顯著 增加 VEGFR2在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)。這在所有測(cè)試的細(xì)胞中一致地重現(xiàn)。
[0350] 實(shí)施例3
[0351] 試劑盒
[0352] 可將本文中描述的任何組合物包括在試劑盒中。在非限定性實(shí)例中，將用于分離 miRNA、標(biāo)記miRNA和/或使用陣列評(píng)價(jià)miRNA群體的試劑包括在試劑盒中。試劑盒還可包 括用于產(chǎn)生或合成miRNA探針的試劑。試劑盒從而可在適當(dāng)?shù)娜萜餮b置中包括，用于通過 摻入標(biāo)記的核苷酸或未標(biāo)記的核苷酸（隨后對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記）而標(biāo)記miRNA的酶。其還可包 括一種或多種緩沖液，例如反應(yīng)緩沖液、標(biāo)記緩沖液、洗滌緩沖液或雜交緩沖液、用于制備 miRNA探針的化合物，和用于分離miRNA的組分。其它試劑盒可包括，用于制備包含與miRNA 互補(bǔ)的寡核苷酸的核酸陣列的組分，從而可包括例如固體載體。
[0353] 對(duì)于任何試劑盒實(shí)施方案，包括陣列，可存在包含與本文中描述的任一個(gè)miR的 全部或部分同一或互補(bǔ)的序列的核酸分子。
[0354] 可將試劑盒的組分包裝在含水介質(zhì)中或以凍干形式包裝。試劑盒的容器裝置通常 包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其它容器裝置（可將組分置于其中，和優(yōu)選 地適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行等分）。當(dāng)試劑盒中存在超過一種組分（可將標(biāo)記試劑和標(biāo)記包裝在一起） 時(shí)，試劑盒通常還包括可將另外的組分分開地置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然 而，可將組分的不同組合包含在小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常還包括用于包含核酸的裝置， 和經(jīng)密封用于商業(yè)銷售的任何其它試劑容器。此類容器可包括，將期望的小瓶保留在其中 的注射或吹模塑料容器。
[0355] 當(dāng)在一種和/或多種液體溶液中提供試劑盒的組分時(shí)，液體溶液是水溶液，且無 菌水溶液是一種優(yōu)選溶液。可包含在試劑盒中的其它溶液是用于從混合樣品分離和/或富 集miRNA的那些溶液。
[0356] 然而，可以以干粉形式提供試劑盒的組分。當(dāng)試劑和/或組分以干粉形式提供時(shí)， 可通過添加適當(dāng)?shù)娜軇┲亟ǚ蹌?。預(yù)期還可在另一個(gè)容器裝置中提供溶劑。試劑盒還可包 括，有助于分離標(biāo)記的miRNA的組分。試劑盒還可包括,保持或維持miRNA或保護(hù)其免受降 解的組分。所述組分可以是不含RNA酶的或被保護(hù)免受RNA酶降解。
[0357] 此外，試劑盒通常還可在適當(dāng)?shù)难b置中包括，用于每一種單獨(dú)的試劑或溶液的不 同容器。試劑盒還可包括使用試劑盒組分以及使用未包括在試劑盒中的任何其它試劑的說 明書。說明書可包括可應(yīng)用的變型。預(yù)期此類試劑是本發(fā)明試劑盒的實(shí)施方案。此外，試 劑盒不限于上文中列出的特定項(xiàng)目，并且可包括用于操作或表征miRNA的任何試劑。
[0358] 還預(yù)期，在miRNA陣列的背景中論述的任何實(shí)施方案可更普遍地用于本發(fā)明的篩 選或特征分析方法或試劑盒中。換言之，描述可包括在特定陣列中的試劑的任何實(shí)施方案 可更普遍地在miRNA特征分析的背景中實(shí)施，而不必涉及陣列本身。
[0359] 還預(yù)期，任何試劑盒、陣列或其它檢測(cè)技術(shù)或工具，或任何方法可用于表征這些 miRNA的任一種。此外，還預(yù)期，在miRNA陣列的背景中論述的任何實(shí)施方案可在本發(fā)明的 方法中實(shí)施（利用或不利用陣列形式）；換言之，可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)， 在本發(fā)明的任何方法中篩選或評(píng)價(jià)miRNA陣列中的任何miRNA。陣列形式對(duì)于待進(jìn)行的篩 選和診斷方法不是必需的。
[0360] 還涉及將miRNA陣列用于治療、預(yù)后或診斷應(yīng)用的試劑盒以及這樣的用途。試劑 盒可包括miRNA陣列，以及關(guān)于陣列上miRNA的標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)化miRNA特征譜的信息。此外， 在某些實(shí)施方案中，還可將對(duì)照RNA或DNA包括在試劑盒中。對(duì)照RNA可以是可用作陽性 對(duì)照用于標(biāo)記和/或陣列分析的miRNA。此外，樣品可以是血液或組織。
[0361] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表征卵巢癌的試劑盒包括用于miR-484、miR-642和/或 miR-217的至少一個(gè)檢測(cè)探針。在某些實(shí)施方案中，試劑盒為寡核苷酸陣列的形式或包含寡 核苷酸陣列。
[0362] 本文中還提供了，用于診斷卵巢癌和/或預(yù)測(cè)卵巢癌的化療抗性的試劑盒，其包 括：
[0363] a)包括用于測(cè)定miR-484的表達(dá)水平的成對(duì)的核苷酸引物和檢測(cè)試劑的miR-484 定量試劑盒，
[0364] b)包括用于測(cè)定miR-642的表達(dá)水平的成對(duì)的核苷酸引物和檢測(cè)試劑的miR-642 定量試劑盒，
[0365] c)包括用于測(cè)定miR-217的表達(dá)水平的成對(duì)的核苷酸引物和檢測(cè)試劑的miR-217 定量試劑盒，和
[0366] d)可編程物體，其被提供用于輸入miR-484、miR-642和miR-217的表達(dá)水平以進(jìn) 行體外診斷卵巢癌的方法。
[0367] 本文還提供了在試劑盒中用作診斷生物標(biāo)志物的miR-484、miR-642和/或 miR-217的用途?？墒褂貌东@試劑檢測(cè)患者的生物樣品中這些診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平， 隨后將其與健康受試者的相同生物標(biāo)志物的參照值相比較。用于與檢測(cè)的值相比較的參照 值可以是針對(duì)對(duì)于疾病是陽性的患者，對(duì)于疾病是陰性的患者或兩者而確定的值?；颊叩?生物樣品中所述生物標(biāo)志物的至少一個(gè)、二個(gè)和/或全部的表達(dá)水平相對(duì)于參照值的變化 表明患者患有還是未患有疾病。
[0368] 捕獲試劑可以是與診斷生物標(biāo)志物特異性相互作用的任何有機(jī)或無機(jī)化學(xué)藥品、 生物分子或其任何片段、同源物、類似物、綴合物或衍生物。在某些實(shí)施方案中，捕獲試劑是 特異性檢測(cè)診斷生物標(biāo)志物小組中的診斷生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)或抗體。在其它實(shí)施方案 中，捕獲試劑是結(jié)合生物標(biāo)志物寡核苷酸RNA或DNA的寡核苷酸。在某些其它實(shí)施方案中， 可將捕獲試劑偶聯(lián)至固體載體。在某些實(shí)施方案中，來自患者的生物樣品是組織、生物液 體，包括但不限于全血、血漿、血清、淚液、唾液、粘液、腦脊髓液或尿液。
[0369] 此外，在某些實(shí)施方案中，所述方法還可包括，檢測(cè)患者的生物樣品中的另外的生 物標(biāo)志物的表達(dá)水平的步驟。如本文中所用，另外的生物標(biāo)志物包括但不限于診斷小組中 現(xiàn)在已知的或以后發(fā)現(xiàn)的診斷生物標(biāo)志物,和評(píng)價(jià)這些生物標(biāo)志物的檢測(cè)的表達(dá)水平相對(duì) 于參照值的變化，以將患者診斷為具有所述疾病。
[0370] 在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包括捕獲試劑，所述捕獲試劑包含a)特異于至少一 個(gè)診斷生物標(biāo)志物的一種或多種檢測(cè)器,其中生物標(biāo)志物為miR-484 ;b)檢測(cè)試劑，和c)使 用試劑盒將患者診斷為具有卵巢癌（當(dāng)患者的測(cè)試樣品中至少miR-484診斷生物標(biāo)志物的 表達(dá)水平低于無卵巢癌對(duì)照受試者的相同生物標(biāo)志物的表達(dá)水平時(shí)）的說明書。
[0371] 試劑盒還可包括，可將患者的生物樣品與其比較的適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫?duì)照。試劑 盒還可包括，針對(duì)對(duì)于所述疾病是陽性的疾病患者，對(duì)于所述疾病是陰性的患者或兩者的 表達(dá)而確定的參照值的范圍。
[0372] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定至少可能響應(yīng)于化療干預(yù)和/或具有來自 疾病的不利結(jié)果的卵巢癌患者的診斷方法、試劑盒和裝置。將來自患者身體的樣品經(jīng)歷檢 測(cè)至少一個(gè)或多個(gè)與卵巢癌相關(guān)的生物標(biāo)志物的測(cè)定。每一個(gè)生物標(biāo)志物具有常規(guī)可測(cè)定 的截止點(diǎn)，其通過手工或計(jì)算機(jī)輔助測(cè)定區(qū)分卵巢癌與對(duì)照。
[0373] 在具體實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物結(jié)果的組合極大地增加了診斷的準(zhǔn)確性。
[0374] 已在本文中廣泛地和一般性地描述了本發(fā)明的方法和試劑盒。落在一般性公開內(nèi) 容內(nèi)的每一個(gè)更窄范圍和下位分類也形成本發(fā)明的一部分。這還包括，具有從一般性內(nèi)容 中除去任何主題的前提或排除性限制的本發(fā)明的一般性描述，無論除去的內(nèi)容在本文中是 否被明確地提及。
[0375] 實(shí)施例4
[0376] 陣列的制備和篩選
[0377] 本文中還提供了，miRNA陣列的制備和用途，所述陣列是核酸分子（探針）的有序 的巨陣列（macroarray)或微陣列，所述核酸分子與多個(gè)miRNA分子或前體miRNA分子完 全或幾乎完全互補(bǔ)或同一，并且被以空間上分離的組織方式置于載體材料上。巨陣列通常 是已將探針點(diǎn)印在其上的數(shù)張硝酸纖維素或尼龍。微陣列更密集地放置核酸探針，從而可 將多達(dá)10, 000個(gè)核酸分子安放在通常1至4平方厘米的區(qū)域中。微陣列可通過將核酸分 子例如基因、寡核苷酸等點(diǎn)印在基質(zhì)上或在基質(zhì)上原位制造寡核苷酸序列來制造。點(diǎn)印的 或制造的核酸分子可以以多達(dá)每平方厘米約30個(gè)或更高，例如多達(dá)每平方厘米約100或甚 至1000個(gè)非同一核酸分子的高密度基質(zhì)模式應(yīng)用。微陣列通常使用涂覆的玻璃作為固體 載體，與過濾陣列的基于硝酸纖維素的材料不同。通過使用miRNA-互補(bǔ)核酸樣品的有序陣 列，可跟蹤每一個(gè)樣品的位置并使其與原始樣品相聯(lián)系。其中將多種獨(dú)特的核酸探針穩(wěn)定 地與固體載體的表面結(jié)合的多種不同的陣列裝置對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。用 于陣列的有用基質(zhì)包括尼龍、玻璃和硅。陣列可以以許多不同的方式變化，包括平均探針長 度、探針的序列或類型、探針與陣列表面之間的鍵的性質(zhì)（例如共價(jià)或非共價(jià)的）等等。本 文中描述的標(biāo)記和篩選方法以及陣列在其實(shí)用性上不限于任何參數(shù)，除了探針檢測(cè)miRNA 以外；因此，可將方法和組合物與多種不同類型的miRNA陣列一起使用。在某些實(shí)施方案 中，miR基因產(chǎn)物包括一種或多種本文中描述的miR。
[0378] 微陣列
[0379] 微陣列可包括獲自已知的或預(yù)測(cè)的miRNA序列的寡核苷酸探針。針對(duì)每一個(gè) miRNA，陣列可包含不同的寡核苷酸探針，例如一個(gè)包含有活性的成熟序列，另一個(gè)特異于 miRNA的前體。陣列還可包含對(duì)照，例如與人直系同源物相異僅在于數(shù)個(gè)堿基的一個(gè)或多個(gè) 序列，其可用作雜交嚴(yán)格度條件的對(duì)照。還可以包括病毒miRNA或從生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè) 的推定的miRNA。此外，其還可以在微陣列上包括，用于非特異性雜交的適當(dāng)?shù)膶?duì)照。
[0380] 在某些實(shí)施方案中，使用固相核酸生物芯片陣列（特別是微陣列）進(jìn)行核酸雜交， 或原位雜交，或其中核酸擴(kuò)增法是實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)或定量實(shí)時(shí)PCR (qRT-PCR)。
[0381] 在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括固相核酸生物芯片陣列，特別是微陣列，或用于 miRNA測(cè)定的一組珠粒。
[0382] 在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括用于進(jìn)行基于雜交和任選地?cái)U(kuò)增例如PCR、RT-PCR 或qRT-PCR的核酸檢測(cè)的裝置。
[0383] 本文中還描述了用于診斷癌癥的成組的寡核苷酸或多核苷酸，其包含至少2個(gè)， 優(yōu)選至少3、5、10個(gè)或全部的指定的miRNA的序列和/或此類序列的互補(bǔ)序列。
[0384] 方法
[0385] 本文中還描述了，用于評(píng)估與患者的癌癥相關(guān)的臨床狀況的方法。在一個(gè)實(shí)施方 案中，用于體外診斷卵巢癌的方法包括：
[0386] a)獲得受試者的樣品；
[0387] b)測(cè)定作為卵巢癌生物標(biāo)志物的一個(gè)或多個(gè)miRNA和內(nèi)部對(duì)照RNA的表達(dá)水平；
[0388] c)計(jì)算作為卵巢癌生物標(biāo)志物的一個(gè)或多個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)水平；
[0389] d)通過使用一個(gè)或多個(gè)變量計(jì)算預(yù)測(cè)模型，其中所述變量包括作為卵巢生物標(biāo)志 物的一個(gè)或多個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)水平和任選地卵巢癌的一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子；和，
[0390] e)利用預(yù)測(cè)模型計(jì)算疾病風(fēng)險(xiǎn)概率，其中如果疾病風(fēng)險(xiǎn)概率大于0. 5,則受試者 被診斷為患有卵巢癌。
[0391] 在某些實(shí)施方案中，在用于體外診斷卵巢癌的方法中，作為卵巢癌生物標(biāo)志物的 一個(gè)或多個(gè)miRNA獲自用于選擇用作疾病診斷生物標(biāo)志物的miRNA的方法，其包括：
[0392] a)獲得受試者的樣品，其中所述受試者包含患有所述疾病的人和未患所述疾病的 人；
[0393] b)測(cè)定候選miRNA和內(nèi)部對(duì)照RNA在所述樣品中的表達(dá)水平；
[0394] c)計(jì)算候選miRNA的相對(duì)表達(dá)水平；
[0395] d)利用一個(gè)或多個(gè)變量計(jì)算預(yù)測(cè)模型，其中所述變量包括一個(gè)或多個(gè)候選miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平和任選地所述疾病的一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子；和
[0396] e)利用預(yù)測(cè)模型計(jì)算疾病風(fēng)險(xiǎn)概率、敏感性和特異性，其中具有最高敏感性和最 高特異性的一個(gè)或多個(gè)候選miRNA被選擇為所述疾病的診斷生物標(biāo)志物。在某些實(shí)施方案 中，風(fēng)險(xiǎn)因子是卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)因子。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)miRNA選自miR-484、 miR-642 和 miRNA-217。
[0397] 在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)miRNA用作參照參數(shù)，用于評(píng)價(jià)卵巢癌治療的效 果和篩選抗卵巢癌的藥物。
[0398] 在某些實(shí)施方案中，miR-484在卵巢癌患者與正常健康受試者之間具有顯著不同 的表達(dá)水平。
[0399] 在某些實(shí)施方案中，通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定一種或多種miRNA和內(nèi)部對(duì)照RNA 的表達(dá)水平，并將其表達(dá)為循環(huán)閾值（Ct)。
[0400] 根據(jù)專利法規(guī)的條款，本發(fā)明的運(yùn)行原理和模式已在其優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)行了解 釋和舉例說明。然而，必須理解，除了明確解釋和舉例說明的之外，可以以其他方式實(shí)施本 發(fā)明而不背離其精神或范圍。
[0401] 本文中對(duì)任何文獻(xiàn)的引用不意味著承認(rèn)，任何此類文獻(xiàn)是相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)水平。關(guān) 于日期的所有記載或關(guān)于這些文獻(xiàn)內(nèi)容的陳述基于 申請(qǐng)人:可獲得的信息，并且不構(gòu)成對(duì)這 些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
[0402] 雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進(jìn)行各 種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改動(dòng)來 使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。因此，本發(fā)明無意限定于本 文中公開的用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案；相反地，本發(fā)明意欲包括落在權(quán)利要求書范 圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
【權(quán)利要求】
1. 一種診斷受試者中的對(duì)化療干預(yù)具有抗性的卵巢癌的方法，包括： a) 鑒定與對(duì)照表達(dá)水平相比，受試者的樣品中miR-484、miR-642和/或miR-217的表 達(dá)水平，和 b) 如果相較于對(duì)照表達(dá)水平，所述受試者具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表達(dá)水平，則診斷所述受試者具有化療抗性卵巢癌，或 c) 如果相較于對(duì)照表達(dá)水平，所述受試者不具有降低的miR-484、miR-642和/或 miR-217表達(dá)水平，則診斷所述受試者不具有化療抗性卵巢癌。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)還包括，鑒定與對(duì)照表達(dá)水平相比，miR-592、 miR-302d、miR-491、miR-483-5p、miR-653、miR-181a、miR-671-3p、miR-19a 和 / 或 miR-744 的表達(dá)水平。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)還包括，鑒定與對(duì)照表達(dá)水平相比，miR-296-5p和 /或miR-518e的表達(dá)水平。
4. 權(quán)利要求1的方法，其包括鑒定miR-484、miR-642和miR-217的表達(dá)水平。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述化療干預(yù)包括下列的一種或多種：鉬類藥物、卡鉬 (ParapIat in?)、順鉬（Platinol?)、紫杉燒、紫杉酚（Taxo 1?)、多西紫杉醇 (Taxotere?)、S西他濱（Gemzar?)、多柔比星（Adriamycin?、Doxi 1?)、 依托泊苷（Vepesid?)、長春瑞濱（Navelbine?)、伊沙匹隆（Ixempra?)、 6口：11：1161〇116藥物、貝伐單抗（入乂&81；11]^)和/或苯妥帝爾。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟（a)包括： 1) 反轉(zhuǎn)錄樣品的miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸； 2) 將所述靶寡脫氧核苷酸與包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特異性探 針寡核苷酸的微陣列雜交以提供所述測(cè)試樣品的雜交特征譜；和 3) 將步驟（2)的特征譜與對(duì)照相比較。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中步驟3)包括，將所述樣品雜交特征譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的 雜交特征譜相比較。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中步驟3)包括，將所述樣品雜交特征譜與和非癌樣品相關(guān)的 miR水平的數(shù)據(jù)庫、統(tǒng)計(jì)資料或表格相比較。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述卵巢癌是漿液性上皮卵巢癌。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中相較于對(duì)照，降低的miR-484表達(dá)確認(rèn)化療抗性卵巢癌的 診斷。
11. 一種確定人受試者是否具有卵巢癌的不良存活預(yù)后的方法，包括： a) 測(cè)量所述人受試者的卵巢組織樣品中的特征miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平，所述特征 miR基因產(chǎn)物由miR基因產(chǎn)物：miR-484、miR-642和/或miR-217組成；和 b) 當(dāng)相較于無癌卵巢組織的對(duì)照樣品中的miR基因產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)表達(dá)水平，所述樣品的 一個(gè)或多個(gè)所述miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的降低表明人受試者具有卵巢癌的不良存活預(yù) 后時(shí)，確定所述人受試者的不良存活預(yù)后。
12. 權(quán)利要求12的方法，其中步驟（a)包括： 1) 反轉(zhuǎn)錄所述樣品的miR-484、miR-642和/或miR-217RNA以提供一組靶寡脫氧核苷 酸； 2) 將所述靶寡脫氧核苷酸與包含miR-484、miR-642和/或miR-217miRNA-特異性探 針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供所述測(cè)試樣品的雜交特征譜；和 3) 將步驟（2)的特征譜與對(duì)照相比較。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中確定所述受試者的存活預(yù)后的步驟（b)區(qū)分漿液性卵巢 癌與其它卵巢癌。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中確定所述受試者的存活預(yù)后的步驟（b)預(yù)測(cè)對(duì)化療干預(yù) 的響應(yīng)。
15. 權(quán)利要求11的方法，其中所述miR-484、miR-642和/或miR-217分別與特異于 miR-484、miR-642和/或miR-217的一個(gè)或多個(gè)探針雜交，并且相對(duì)于對(duì)照樣品，miR-484、 miR-642和/或miR-217的表達(dá)水平的下降的存在表明，對(duì)化療干預(yù)的不良響應(yīng)，人患者的 不良存活預(yù)后和/或漿液性卵巢癌的存在。
16. 用于確定受試者的化療抗性卵巢癌的方法，所述方法包括： a) 檢測(cè)來自所述受試者的樣品的miRNA表達(dá)特征譜， b) 將所述樣品的miRNA特征譜與包含非癌性卵巢細(xì)胞的對(duì)照樣品的miRNA表達(dá)特征譜 相比較，和 c) 當(dāng)所述樣品的miRNA表達(dá)特征譜包括hsa-miR-484、hsa-miR-642和/或 hsa-miR-217中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)上顯著的變化時(shí)，確定化療抗性卵巢癌。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中步驟（c)的統(tǒng)計(jì)上顯著的變化是miR-484的表達(dá)水平的 降低。
18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述卵巢癌包括漿液性上皮卵巢癌。
19. 權(quán)利要求16的方法，其中所述microRNA表達(dá)特征譜包括至少：hsa-miR-484、 hsa-miR-642 和 hsa-miR-217。
20. -種用于評(píng)估患者的臨床狀況的方法，包括步驟： a) 提供來自所述患者的生物樣品， b) 測(cè)定所述樣品中預(yù)先確定的特征miRNA的表達(dá)水平以獲得miRNA表達(dá)特征譜，所述 預(yù)先確定的特征 miRNA 包括至少：hsa-miR-484、hsa-miR-642 和 / 或 hsa-miR-217， c) 將步驟（b)的表達(dá)水平與包括卵巢癌的不同疾病特有的一個(gè)或多個(gè)參照miRNA表達(dá) 特征譜相比較，和 d) 基于步驟（c)的比較評(píng)估所述患者的臨床狀況。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中步驟（c)中的參照miRNA表達(dá)特征譜獲自數(shù)據(jù)庫，所述數(shù) 據(jù)庫發(fā)現(xiàn)于下列中的一個(gè)或多個(gè)：國際互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、集中式數(shù)據(jù)庫或分布式數(shù)據(jù)庫。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中步驟（b)中的測(cè)定包括，預(yù)先確定的miRNA的組的定性、 定量或半定量測(cè)定。
23. 權(quán)利要求20的方法，其中步驟（b)中的測(cè)定包括，核酸雜交、核酸擴(kuò)增、聚合酶延 伸、測(cè)序、質(zhì)譜法或其任何組合。
24. -種用于評(píng)估患者的臨床狀況的試劑盒，其包括： a)用于測(cè)定來自患者的生物樣品中預(yù)先確定的特征miRNA的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物， 所述預(yù)先確定的特征miRNA包括hsa-miR-484、hsa_miR-642和/或hsaniR-217中的至少 一個(gè)，和 b)包括卵巢癌的不同疾病特有的多個(gè)miRNA參照表達(dá)特征譜。
25. 權(quán)利要求24的試劑盒，其中在數(shù)據(jù)庫例如國際互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、集中式數(shù)據(jù)庫或分 布式數(shù)據(jù)庫中獲得miRNA參照表達(dá)特征譜。
26. -種用于診斷患者的卵巢癌的試劑盒，其包括： a) 包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器的捕獲試劑，所述檢測(cè)器特異于至少一個(gè)卵巢癌診斷生物標(biāo) 志物，其中至少第一卵巢癌生物標(biāo)志物為miR-484生物標(biāo)志物， b) 檢測(cè)試劑，和 c) 使用試劑盒診斷患者的說明書，當(dāng)來自所述患者的生物樣品中miR-484診斷生物標(biāo) 志物的表達(dá)水平低于不具有卵巢癌的對(duì)照受試者中相同生物標(biāo)志物的表達(dá)水平時(shí)，將患者 診斷為具有卵巢癌。
27. 權(quán)利要求26的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)選自miR-642和miR-217生物標(biāo)志物的 另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志物。
28. 權(quán)利要求26的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)選自下列的另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志 物：hsa-miR-592、hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、hsa-miR-491、 hsa-miR-483_5p、hsaniR-653、hsa_miR-181a、hsa-miR-671_3p、hsa_miR-19a 和 / 或 hsa_miR-744〇
29. 用于診斷卵巢癌的一組寡核苷酸或多核苷酸，其包含選自下列的一組miRNA的序 列：miR-484、miR-642和miR-217,和/或其互補(bǔ)序列。
30. -種用于診斷患者的卵巢癌的方法，其包括： a) 檢測(cè)來自所述患者的生物樣品中至少一個(gè)診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中至少第 一診斷生物標(biāo)志物是miR-484生物標(biāo)志物，和 b) 當(dāng)所述患者樣品的至少mir-484診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平低于源于不具有卵巢 癌的對(duì)照受試者的生物樣品的相同生物標(biāo)志物的正常表達(dá)水平時(shí)，將所述患者診斷為患有 卵巢癌。
31. 權(quán)利要求30的方法，還包括檢測(cè)選自miR-642和miR-217生物標(biāo)志物的一個(gè)或多 個(gè)另外的卵巢癌診斷生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。
32. 權(quán)利要求30的方法，還包括檢測(cè)選自下列的一個(gè)或多個(gè)另外的卵巢癌診斷生物標(biāo) 志物的表達(dá)水平：hsa-miR-592、hsa-miR-484、hsa-miR-217、hsa-miR-642、hsa_miR-302d、 hsa-miR-491、hsa-miR-483_5p、hsa-miR-653、hsa_miR-181a、hsa-miR-671_3p、 hsa_miR-19a 和 / 或 hsa_miR-744〇
33. 權(quán)利要求31的方法，其包括步驟： a) 獲得所述樣品，其中所述樣品包含卵巢細(xì)胞； b) 從所述樣品擴(kuò)增miRNA表達(dá)特征譜中的至少一個(gè)miRNA ; d) 測(cè)定所述樣品的miRNA表達(dá)特征譜；和 e) 將所述樣品的miRNA表達(dá)特征譜與包括miR-484、miR-642和/或miR-271的對(duì)照 miRNA特征相比較， 其中所述對(duì)照miRNA特征在所述樣品的miRNA表達(dá)特征譜中的重現(xiàn)表明，所述樣品包 含對(duì)化療性治療具有抗性的卵巢癌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104364390SQ201280058623
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日
【發(fā)明者】C·M·克羅斯, A·維克馳歐尼 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)