呼吸道感染測定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供核酸產(chǎn)品和相應(yīng)的用于篩查生物樣品存在引起呼吸道感染的微生物的方法，其使用實時PCR和在分開的孔中具有檢測探針的測試卡進(jìn)行。
【專利說明】呼吸道感染測定
[0001]本發(fā)明涉及核酸產(chǎn)品和相應(yīng)地用于篩查生物樣品存在引起呼吸道感染的微生物的方法。
[0002]呼吸道感染是全世界上最常見的人類疾病的起因(參見Murray和Lopez (1997)-Lancet，349，第1269-1276頁)。缺乏抵抗力的個體(心臟、肺、免疫系統(tǒng))、老年人和嬰兒尤其有發(fā)展嚴(yán)重的并發(fā)癥的危險。歷史上，已經(jīng)通過一組多路(multiplexed)實時(RT)PCR Taqman測定進(jìn)行呼吸道感染的快速實驗室診斷。然而，與該多路方法相關(guān)的一個顯著的問題是需要制備、運(yùn)行并且監(jiān)測平行的篩查測定。由于進(jìn)行的每個測定相對于單次測定引起消耗成本的加倍并且關(guān)于用于進(jìn)行這些測定的昂貴的設(shè)備的磨損產(chǎn)生另外的操作負(fù)擔(dān)，所以這表示不合需要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所述多路方法還產(chǎn)生與多重測定的性能相關(guān)的另外的時間和人力負(fù)擔(dān)。
[0003]因此，需要更有效的篩查系統(tǒng)。
[0004]本發(fā)明通過提供一種用于檢測單一分離樣品中存在或不存在多種引起呼吸道感染的微生物的簡單的一步測定(即，單路形式)而解決上述問題中的一種或多種。
[0005]更詳細(xì)地，本發(fā)明提供一種用于檢測樣品中存在至少六種引起呼吸道感染的微生物中的一種或多種或檢測所述樣品中不存在所述微生物的方法，所述方法包括:
[0006]A)將樣品應(yīng)用到測試卡上，其中所述測試卡包括六個分離的孔:
[0007]I)包含第一探針 的第一孔，其中所述第一探針具有包含與核酸序列GGCAATGCffG(SEQ ID NO:1)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0008]2)包含第二探針的第二孔，其中所述第二探針具有包含與核酸序列GAYGGGACCR(SEQ ID NO:2)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0009]3)包含第三探針的第三孔，其中所述第三探針具有包含與核酸序列CACCAGACAC(SEQ ID NO:3)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0010]4)包含第四探針的第四孔，其中所述第四探針具有包含與核酸序列GGTCATTGGR(SEQ ID NO:4)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0011]5)包含第五探針的第五孔，其中所述第五探針具有包含與核酸序列CACTGGGCAC(SEQ ID NO:5)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0012]6)包含第六探針的第六孔，其中所述第六探針具有包含與核酸序列RGTGTTCATT(SEQ ID NO:6)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0013]B)允許所述樣品中存在的核酸與所述孔中的探針接觸；
[0014]C)檢測其中樣品核酸已經(jīng)結(jié)合所述探針中的一種或多種的結(jié)合核酸復(fù)合物的存在；
[0015]D)其中結(jié)合核酸復(fù)合物的存在證實在所述樣品中存在來自所述六種引起呼吸道感染的微生物中的一種或多種的核酸，并且其中不存在結(jié)合核酸復(fù)合物證實在所述樣品中不存在來自所有所述六種引起呼吸道感染的微生物的核酸。
[0016]本 申請人:已經(jīng)闡明的一個重要的現(xiàn)有技術(shù)問題是提供在單一組測定條件下(即，單路形式)相互相容(即，保留準(zhǔn)確的結(jié)合特異性)的一組強(qiáng)健的探針。與本發(fā)明的方法相關(guān)的一個特別的優(yōu)點是速度。例如，本發(fā)明的方法典型地在2.5小時內(nèi)完成，優(yōu)選在2或
1.5小時內(nèi)完成。相反，現(xiàn)有的多路測定典型地花費(fèi)至少4-5小時，典型地至少5小時。
[0017]與本發(fā)明的單路(uniplex)(也稱為單一通路(singleplex))測定方法相關(guān)的另一個優(yōu)點是增加的靈敏性，其除了簡單確定樣品中存在或不存在特定病原體之外，還允許定量檢測樣品中的微生物(例如，病毒和/或細(xì)菌負(fù)荷)。
[0018]樣品中的微生物(例如,病毒和細(xì)菌)可以進(jìn)行針對每種微生物靶標(biāo)的負(fù)荷校準(zhǔn)。這允許定量樣品中每種微生物的具體負(fù)荷。有利地，本發(fā)明的這種特質(zhì)允許確定其中存在多種微生物的樣品中的主要的微生物。例如，本發(fā)明的單路測定方法允許人們確定其中存在多種病毒的樣品中的主要病毒。另外，本發(fā)明的方法允許隨時間定量檢測樣品中的病毒，當(dāng)存在特定病毒的病毒負(fù)荷的波動時，這是特別有用的。
[0019]此外，現(xiàn)有系統(tǒng)應(yīng)用在膜上進(jìn)行的雜交，而本發(fā)明的測定方法在封閉的(例如，無菌的)系統(tǒng)中進(jìn)行，由此減少污染的可能性，這提供了另一種優(yōu)點。
[0020]探針1-6分別允許靈敏檢測下述:
[0021]I)呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV A 和 B)；
[0022]2)鼻病毒(Rhinoviruses)；
[0023]3)人變性肺病毒(Human Metapneumovirus, hMPV)；
[0024]4)流感病毒 B (F u B Quad)；
[0025]5)流感病毒 A (Flu A CDC DC);和
[0026]6) H5 亞型流感病毒 A (H5FRET)。
[0027]由此，上文限定的方法提供以單路(也稱為單一通路)的測定形式檢測所述引起呼吸道感染的微生物中的任一種或多種的快速測定。類似地，所述方法提供用于以單一(單路)測定證實樣品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速測定。單路測定意指多個單個檢測孔測定中的每一個在相同的測定條件和/或基本上同時進(jìn)行。使用時，將單份樣品應(yīng)用到測試卡上，然后所述樣品聚集在每個測試孔中。
[0028]在一個實施方案中，所述方法使用包含選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針的測試卡:
[0029]7)包含第七探針的第七孔，其中所述第七探針具有包含與核酸序列TTTCCAGGGG(SEQ ID NO:7)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0030]8)包含第八探針的第八孔，其中所述第八探針具有包含與核酸序列CCGCAAGTCA(SEQ ID NO:8)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0031]9)包含第九探針的第九孔，其中所述第九探針具有包含與核酸序列TTGCCTGGTG(SEQ ID NO:9)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0032]10)包含第十探針的第十孔，其中所述第十探針具有包含與核酸序列TAARGTAGGT(SEQ ID NO:10)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0033]11)包含第十一探針的第十一孔，其中所述第十一探針具有包含與核酸序列CGGCRTCATY(SEQ ID NO:11)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0034]12)包含第十二探針的第十二孔，其中所述第十二探針具有包含與核酸序列ATARTGRTAA(SEQ ID NO:12)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0035]13)包含第十三探針的第十三孔，其中所述第十三探針具有包含與核酸序列ATAGTAATAA(SEQ ID NO:13)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；其中使用如前文所述相同的方法步驟。
[0036]在一個實施方案中，所述測試卡可以包括所述第七至第十三孔(加上相應(yīng)的探針)中的兩個以上、三個以上、四個以上、五個以上、六個以上或所有七個。
[0037]探針7-13分別允許靈敏檢測下述:
[0038]7) I 型人副流感病毒(Human parainfluenza virus typel, HPIV1)；
[0039]8) 2型人副流感病毒(HPIV2)；
[0040]9) 3型人副流感病毒(HPIV3)；
[0041]10) 4型人副流感病毒(HPIV4)；
[0042]11)人腺病毒 #2 (Human Adenoviruses#2)；
[0043]12)達(dá)菲(Tamiflu)敏感型流感病毒A H12009 ;和
[0044]13)達(dá)菲耐藥型流感病毒AH12009。
[0045]因此，上文定義的方法提供以單路形式測定檢測所述引起呼吸道感染的微生物中的任一種或多種的快速測定。類似地，所述方法提供以單路形式測定證實樣品中不存在所有所述引起呼吸道 感染的微生物的快速測定。
[0046]在一個實施方案中，所述方法使用包括選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針的測試卡:
[0047]14)包含第十四探針的第十四孔，其中所述第十四探針具有包含與核酸序列TACTGTGACA(SEQ ID NO:14)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0048]15)包含第十五探針的第十五孔，其中所述第十五探針具有包含與核酸序列YRGCGGAACC(SEQ ID NO:15)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0049]16)包含第十六探針的第十六孔，其中所述第十六探針具有包含與核酸序列TAACGAGTGT(SEQ ID NO:16)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0050]17)包含第十七探針的第十七孔，其中所述第十七探針具有包含與核酸序列CGAATGAATG(SEQ ID NO:17)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0051]18)包含第十八探針的第十八孔，其中所述第十八探針具有包含與核酸序列YTCTAAGCAT(SEQ ID NO:18)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0052]19)包含第十九探針的第十九孔，其中所述第十九探針具有包含與核酸序列TTCTAAGCAT(SEQ ID NO:19)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0053]20)包含第二十探針的第二十孔，其中所述第二十探針具有包含與核酸序列GAGTAYCTSA(SEQ ID NO:20)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0054]21)包含第二十一探針的第二十一孔，其中所述第二十一探針具有包含與核酸序列ACTGCATCCG(SEQ ID NO:21)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0055]22)包含第二十二探針的第二十二孔，其中所述第二十二探針具有包含與核酸序列TGTCACCTCT(SEQ ID NO:22)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0056]23)包含第二十三探針的第二十三孔，其中所述第二十三探針具有包含與核酸序列AGTGTGTYAC(SEQ ID NO:23)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0057]24)包含第二十四探針的第二十四孔，其中所述第二十四探針具有包含與核酸序列GAATTTCTGG(SEQ ID NO:24)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；[0058]25)包含第二十五探針的第二十五孔，其中所述第二十五探針具有包含與核酸序列TTGCCGGATG(SEQ ID NO:25)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0059]26)包含第二十六探針的第二十六孔，其中所述第二十六探針具有包含與核酸序列CAGCAACTGT(SEQ ID NO:26)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0060]27)包含第二十七探針的第二十七孔，其中所述第二十七探針具有包含與核酸序列TGCTCCAGAA(SEQ ID NO:27)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0061]28)包含第二十八探針的第二十八孔，其中所述第二十八探針具有包含與核酸序列TNGCCATTGY(SEQ ID NO:28)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0062]29)包含第二十九探針的第二十九孔，其中所述第二十九探針具有包含與核酸序列GTYCCGTGRA(SEQ ID NO:29)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0063]30)包含第三十探針的第三十孔，其中所述第三十探針具有包含與核酸序列CTGGARTCTG(SEQ ID NO:30)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0064]31)包含第三十一探針的第三十一孔，其中所述第三十一探針具有包含與核酸序列CRACTGTGTC(SEQ ID NO:31)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0065]32)包含第三十二探針的第三十二孔，其中所述第三十二探針具有包含與核酸序列GTGTCACCGC(SEQ ID NO:32)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0066]33)包含第三十三探針的第三十三孔，其中所述第三十三探針具有包含與核酸序列GAYGGRACCR(SEQ ID N O:33)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0067]其中使用如前文所述相同的方法步驟。
[0068]在一個實施方案中，所述測試卡可以包括所述第十四至第三十三孔(加上相應(yīng)的探針)中的兩個以上、三個以上、四個以上、五個以上、六個以上、七個以上、八個以上、九個以上、十個以上、十一個以上、十二個以上、十三個以上、十四個以上、十五個以上、十六個以上、十七個以上、十八個以上、十九個以上或所有二十個。所述第十四至第三十三孔(加上相應(yīng)的探針)中的一個或多個可以與所述第七至第十三孔(加上相應(yīng)的探針)中的一個或多個組合使用或替代使用。
[0069]探針14-30分別允許靈敏檢測下述:
[0070]14)呼吸道合胞病毒(RSV#2) ； (RSV#3)
[0071]15)腸病毒(Enteroviruses)；
[0072]16)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndromecoronavirus, SARS)；
[0073]17)2組冠狀病毒0043和！11^1(6?20(:43/!11^1)；
[0074]18) I 組冠狀病毒 NL63 (GP1NL63)；
[0075]19) I 組冠狀病毒 229E(GP1229E)；
[0076]20)人腺病毒；
[0077]21)牛犬細(xì)小病毒(Bocavirus)；
[0078]22)流感病毒 A (Flu A Quad)；
[0079]23)流感病毒 A H12009 (Hlsw2009)；
[0080]24)流感病毒 A N12009 (NlCFI)；
[0081 ] 25)季節(jié)性流感病毒A Hl (Hl季節(jié)性CFI)；[0082]26)季節(jié)性流感病毒A H3 (H3季節(jié)性CFI)；
[0083]27)流感病毒 A H5 (H5CFI)；
[0084]28)流感病毒 A H7 (H7)；
[0085]29)流感病毒 A H9 (H9a)；
[0086]30)流感病毒 A H9 (H9b)；
[0087]31) I型人副流感病毒(HPIV1#2)；
[0088]32) 3型人副流感病毒(HPIV1#3);和
[0089]33)鼻病毒 #2。
[0090]由此，上文限定的方法提供以單路形式測定檢測所述引起呼吸道感染的微生物中的任一種或多種的快速測定。類似地，所述方法提供用于以單路形式測定證實樣品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速測定。
[0091]在一個實施方案中，所述方法使用包括一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針的測試 卡，其中所述另外的探針結(jié)合(由此檢測)非典型肺炎(atypicalpneumonia)的致病因子。感染了非典型細(xì)菌性呼吸道感染的患者不與常規(guī)抗體反應(yīng)，這通常加重其病癥并且消耗健康護(hù)理資源。與非典型細(xì)菌性肺炎相關(guān)的生物體的常規(guī)實驗室鑒定可能是難的、緩慢的且昂貴的，并且因此本發(fā)明在這一點上提供顯著的改進(jìn)。由此，在該實施方案中，使用一種或多種另外的探針來檢測下述中的一種或多種:肺炎衣原體(Chlamydophila pneumoniae),嬰鳥踏衣原體(Chlamydophila psittaci),嗜肺軍團(tuán)菌(Leg1nella pneumophila),肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia)和伯氏考克斯氏體(Coxiella burnettii)。因此,在一個實施方案中,本發(fā)明的方法使用包括選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針的測試卡:
[0092]34)包含第三十四探針的第三十四孔，其中所述第三十四探針具有包含與核酸序列AATTGGCTTT(SEQ ID NO:34)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0093]35)包含第三十五探針的第三十五孔，其中所述第三十五探針具有包含與核酸序列GGAGAGTGTG(SEQ ID NO:35)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0094]36)包含第三十六探針的第三十六孔,其中所述第三十六探針具有包含與核酸序列CAGACGCTGG(SEQ ID NO:36)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0095]37)包含第三十七探針的第三十七孔，其中所述第三十七探針具有包含與核酸序列CGGCGTTTAT(SEQ ID NO:37)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0096]38)包含第三十八探針的第三十八孔，其中所述第三十八探針具有包含與核酸序列CTTGGTGTGA(SEQ ID NO:38)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0097]39)包含第三十九探針的第三十九孔，其中所述第三十九探針具有包含與核酸序列CTTGGTGTGA(SEQ ID NO:39)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0098]其中使用如前文所述相同的方法步驟。
[0099]在一個實施方案中，所述測試卡可以包括所述第三十四至第三十九孔(加上相應(yīng)的探針)中的兩個以上、三個以上、四個以上、五個以上或所有六個。所述第三十四至第三十九孔(加上相應(yīng)的探針)中的一個或多個可以與所述第十四至第三十三孔(加上相應(yīng)的探針)中的一個或多個組合使用或替代使用和/或與所述第七至第十三孔(加上相應(yīng)的探針)中的一個或多個組合使用或替代使用。[0100]探針34-39分別允許靈敏檢測下述:
[0101]34)嗜肺軍團(tuán)菌；
[0102]35)肺炎支原體；
[0103]36)肺炎支原體；
[0104]37)伯氏考克斯氏體；
[0105]38)鸚鵡衣原體；和
[0106]39)流產(chǎn)衣原體(Chlamyd1philia abortus)。
[0107]由此，上文限定的方法提供以單路形式測定檢測所述引起呼吸道感染的微生物中的任一種或多種的快速測定。類似地，所述方法提供用于以單路形式測定證實樣品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速測定。
[0108]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法使用包括選自下述的一個或多個另外的‘對照’孔和相應(yīng)的一種或多種另外的‘對照’探針的測試卡:
[0109]40)包含第四十探針的第四十孔，其中所述第四十探針具有包含與核酸序列AGATCAAGGT(SEQ ID NO:40)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0110]41)包含第四十一探針的第四十一孔，其中所述第四十一探針具有包含與核酸序列ACCTGAAGGC(SEQ ID NO:41)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0111]其中使用如前文所述相同的方法步驟。
[0112]在一個實施方案中，所述測試卡可以包括所述第四十或第四十一孔(加上相應(yīng)的探針)中的一個或兩個。可以使用備選的‘對照’探針/探針靶標(biāo)。所述‘對照’探針可以與前文所述的實施方案中的任一個組合使用。
[0113]對照探針40-41分別允許靈敏檢測下述:
[0114]40)大腸桿菌卩遼菌體 MS2 (Escherichia coli Bacter1phage MS2, MS2IC);和
[0115]41)人核糖核酸酶P基因(RNAse P)。
[0116]一種或多種‘對照’探針的存在允許(基本上同時)證實所述測定正常進(jìn)行。例如，樣品在進(jìn)行核酸提取之前摻加大腸桿菌噬菌體MS2 (MS2IC)。使用噬菌體MS2探針檢測所述樣品中的噬菌體MS2核酸允許證實單路測定所涉及的不同階段被成功完成。噬菌體MS2僅提供一種內(nèi)部對照的實例，但是任意適當(dāng)?shù)膫溥x方案可以用于本發(fā)明的方法。
[0117]在一個實施方案中，所述測試卡包括允許檢測人核糖核酸酶P基因(RNAse P)的探針。樣品中存在人RNAse P核酸指示已經(jīng)收集了人生物材料。備選地，可以使用其他人基因組標(biāo)記作為探針靶標(biāo)，并且其相應(yīng)的探針可以包括在所述測試卡上。
[0118]本發(fā)明的測定方法可以包括核酸擴(kuò)增步驟，在該情形中，本發(fā)明的每種探針與一對(正向和反向)引物組合使用-所述引物對協(xié)同擴(kuò)增靶核酸片段，然后在檢測步驟過程中該片段被所述探針識別(通過與其結(jié)合)。例如，引物If (正向)和Ir (反向)與第一探針協(xié)作，并且在實用中所有三種核酸序列都包括在第一孔中。同樣適用引物2f和2r與第二探針的組合(在第二孔內(nèi))至引物41f和41r與第四十一探針的組合(在第四十一孔內(nèi))。
[0119]在一個實施方案中，所述方法使用包括選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針的測試卡:
[0120]42)包含第四十二探針的第四十二孔，其中所述第四十二探針具有包含與核酸序列GTGCARTTYG(SEQ ID NO:338)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0121]43)包含第四十三探針的第四十三孔，其中所述第四十三探針具有包含與核酸序列YGCYTCGGAR(SEQ ID NO:339)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0122]44)包含第四十四探針的第四十四孔，其中所述第四十四探針具有包含與核酸序列CTTGTGGANC(SEQ ID NO:340)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0123]45)包含第四十五探針的第四十五孔，其中所述第四十五探針具有包含與核酸序列CATTCCATTC(SEQ ID NO:341)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0124]46)包含第四十六探針的第四十六孔，其中所述第四十六探針具有包含與核酸序列WGTGTTTGCA(SEQ ID NO:342)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0125]47)包含第四十七探針的第四十七孔，其中所述第四十七探針具有包含與核酸序列ACCACGGGAT(SEQ ID NO:343)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0126]48)包含第四十八探針的第四十八孔，其中所述第四十八探針具有包含與核酸序列GTCCTCGCTG(SEQ ID NO:344)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0127]49)包含第四十九探針的第四十九孔，其中所述第四十九探針具有包含與核酸序列GCCCGCGACG(SEQ ID NO:345)具有至少80%的序列同一性的核酸序列的核酸序列；
[0128]其中使用如前文所述相同的方法步驟。 [0129]探針42-49分別允許靈敏檢測下述:
[0130]42)腺病毒；
[0131]43) ADP17 腺病毒；
[0132]44)小 RNA 病毒；
[0133]45)流感病毒B;
[0134]46)流感病毒B;
[0135]47)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)；
[0136]48)結(jié)核分枝桿菌；
[0137]49)分枝桿菌屬(一般的)。
[0138]因此，上文定義的方法提供以單路形式測定檢測所述引起呼吸道感染的微生物中的任一種或多種的快速測定。類似地，所述方法提供以單路形式測定證實樣品中不存在所有所述引起呼吸道感染的微生物的快速測定。
[0139]引物If包含與AAGCWGGATTCTACC(SEQ ID NO:42)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物Ir包含與TCCCATTATGCCTAG(SEQ IDNO:43)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0140]引物2f包含與CCTGAATGYGGCTAA(SEQ ID NO:44)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物2r包含與CGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:45)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0141]弓丨物3f包含與ATCCCACAAAAYCAG(SEQ ID NO:46)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物3r包含與CTACACATAATAARA(SEQ ID NO:47)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0142]引物4f包含與GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO:48)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物4r包含與TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO:49)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0143]引物5f包含與CCTGTCACCTCTGAC(SEQ ID NO:50)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物5r包含與TGGACAAAKCGTCTA(SEQ ID NO:51)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0144]弓丨物6f包含與GGRTACGCTGCAGAC(SEQ ID NO:52)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物6r包含與AGTCCAGACATCTAG(SEQ ID NO:53)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0145]弓丨物If包含與ATACTCAGAGACCCA(SEQ ID NO:54)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物7r包含與ATAYTGTTGCATAGC(SEQ ID NO:55)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0146]引物8f包含與TGCTCCTGATCARCC(SEQ ID NO:56)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物8r包含與TCCCACCATRGCATA(SEQ ID NO:57)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0147]引物9f包含與TATCCTCAGAGATCC(SEQ ID NO:58)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物9r包含與ACATACTGTTGCATG(SEQ ID NO:59)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0148]引物1f包含與CTTGTACAGGARATG(SEQ ID NO:60)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物6r包含與TCCCACCATRGCATA(SEQ ID NO:61)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。 [0149]引物Ilf包含與RGTSGAYCCCATGGA(SEQ ID NO:62)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物Ilr包含與SGGYGTRCGSAGGTA(SEQ ID NO:63)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0150]引物12f包含與AGTCAAATCAGTCGA(SEQ ID NO:64)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物12r包含與CCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:65)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0151]引物13f包含與AGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO:66)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物13r包含與CCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:67)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0152]引物14f 包含與 CATCTGYTTAACAAG(SEQ ID NO:68)或GGARACATACGTGAA (SEQ ID NO:260)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物14r包含與AAGAIACTGATCCTG(SEQID NO:69)或ATTGTAYTGAACAGC (SEQ ID NO:261)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0153]引物15f包含與CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:70)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物15r包含與CGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:71)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0154]引物16f包含與TTATCCAAAATGTGA(SEQ ID NO:72)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物16r包含與GCATCACCGGATGAT (SEQ ID NO:73)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0155]引物17f包含與TTATCCTAARTGTGA(SEQ ID NO:74)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物17r包含與ATCACCACTRCTAGT(SEQ ID NO:75)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0156]引物18f包含與TTATCCCAAATGTGA(SEQ ID NO:76)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物18r包含與AGCRTCACCAGAAGT (SEQ ID NO:77)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0157]引物19f包含與CTATCCTAAGTGTGA(SEQ ID NO:78)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物19r包含與TGCATCACCAGAAGT (SEQ ID NO:79)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0158]引物20f包含與KCNTACATGCACATC(SEQ ID NO:80)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物20r包含與GGGRTTYCTRAACTT(SEQ ID NO:81)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0159]引物21f包含與CAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO:82)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物21r包含與TGTTCACTCGCCGGA(SEQ ID NO:83)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0160]引物22f包含與MGAGGTCGAAACGTA(SEQ ID NO:84)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物22r包含與CACGGTGAGCGTRAA(SEQ ID NO:85)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0161]引物23f包含與TGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO:86)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物23r包 含與ATGCTTGTCTTCTAG(SEQ ID NO:87)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0162]引物24f包含與ATCAGTTGGCTAACA(SEQ ID NO:88)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物24r包含與AGCCACTGCCCCATT (SEQ ID NO:89)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0163]引物25f包含與GCCCCCCTACAATTG(SEQ ID NO:90)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物25r包含與ATTCTGGGTTTCCTA(SEQ ID NO:91)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0164]引物26f包含與TGTTGAACGCAGCAA(SEQ ID NO:92)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物26r包含與GCAACTAGTGACCTA(SEQ ID NO:93)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0165]引物27f包含與ATGATGCMATMAAYT(SEQ ID NO:94)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物27r包含與CCATTGGAGTTTGAC(SEQ ID NO:95)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0166]引物28f 包含與 CTTCGGGGCRTCATG(SEQ ID NO:96)或 YAGYGGITACMRGA (SEQ ID NO:262)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物28r包含與CYGCATGTTTCCRTT(SEQID NO:97)或AIRAARCATGAYGCC(SEQ ID NO:263)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0167]引物29f包含與IGGYYACCARTCAAC(SEQ ID NO:98)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物29r包含與YARCATYCCATTGTG(SEQ ID NO:99)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0168]引物30f包含與YGAYCARTGCATGGA(SEQ ID NO:100)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物30r包含與GGCRACAGTIGAATA(SEQ ID NO:101)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0169]引物31f包含與GGATGGAACCGTYAA(SEQ ID NO:102)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物31r包含與TTGTTGTGACCTCAT(SEQ IDNO:103)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0170]引物32f包含與RGCTTTCAGACAAGA(SEQ ID NO:104)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物32r包含與GACCGCATGATTGAC(SEQ ID NO:105)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0171]引物33f包含與CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:106)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物33r包含與CGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:107)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0172]引物34f包含與ATGCAAGACGCTATG(SEQ ID NO:108)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物34r包含與GTCTTTCATTTGCTG (SEQ ID NO:109)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0173]引物35f包含與GTGGCAGTTGGGTCA(SEQ ID NO:110)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物35r包含與CTTGATCCGCCCACA(SEQ IDNO:111)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0174]引物36f包含與TATAAAGGCGTTGCT (SEQ ID NO:112)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物36r包含與GATGGTCGCAGACTT(SEQ IDNO:113)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。 [0175]引物37f包含與CATCGTTCCCGGCAG(SEQ ID NO:114)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物37r包含與GTTTACTAATCCCCA(SEQ ID NO:115)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0176]引物38f包含與TGGGAAGGTGCTTCA(SEQ ID NO:116)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物38r包含與CGCGGATGCTAATGG(SEQ ID NO:117)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0177]引物39f包含與TGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO:118)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物39r包含與TCCTGCGCGGATGCT(SEQ IDNO:119)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0178]引物40f包含與CTCTCCGTATTCACG(SEQ ID NO:120)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物40r包含與GACCCCACGATGAC(SEQ ID NO:121)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0179]引物41f包含與TTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:122)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物41r包含與GCTGTCTCCACAAGT(SEQ IDNO:123)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0180]引物42f包含與KCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:80)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物42r包含與GGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:81)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0181]引物43f包含與ITACATGCAYATCKC(SEQ ID NO:267)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物43r包含與 GGCRAAYTGCACCAG(SEQ IDNO:268)或GGCAMCTGCACGAG (SEQID NO:269)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0182]引物44f包含與AGATGGCGTRCCATA(SEQ ID NO:272)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物44r包含與ACTAGAGGATGGCTG(SEQ ID NO:273)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0183]引物45f包含與GCTATGAACACAGCA(SEQ ID NO:276)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物45r包含與TTGGACGTCTTCTCC(SEQ ID NO:277)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0184]引物46f包含與GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO:48)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物46r包含與TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO:49)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0185]引物47f包含與GTAACACGTGGGTGA(SEQ ID NO:280)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物47r包含與ACCGCTAAAGCGCTT (SEQ ID NO:281)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0186]引物48f包含與TTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:284)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物48r包含與GGTCGGGACGGTGAG(SEQ ID NO:285)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0187]引物49f包含與TTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:284)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物49r包含與GGTCGGGACGGTGAG(SEQ ID NO:285)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列 。
[0188]所述生物樣品典型地是已經(jīng)取自患者的樣品(即，離體和/或分離的樣品)。在一個實施方案中，可以對所述樣品進(jìn)行核酸提取步驟-常規(guī)的核酸提取方案在本領(lǐng)域中是公知的。然后將提取的核酸樣品應(yīng)用到所述測試卡上，以使其接觸每個孔(并且由此接觸所述孔內(nèi)的每條探針)。
[0189]本發(fā)明的核酸‘雜交反應(yīng)’(包含一起起作用的探針和引物)步驟典型地在50-700C (例如，55-65°C或 56-64°C或 57-63°C或 58-62°C或 59-61°C或約 60°C )的溫度進(jìn)行。所述溫度典型地保持10-30秒的時間期間(例如，15-25秒或17-23秒或19-21秒或約20秒)。如果本發(fā)明的方法中包括核酸擴(kuò)增步驟，則在每個擴(kuò)增步驟循環(huán)中優(yōu)選地包括所述‘雜交反應(yīng)’(包含在開始時過量添加的探針和引物)步驟。
[0190]如果使用核酸擴(kuò)增步驟，則該步驟典型地在90-100°C (例如，92-98°C或94-96°C或約95°C )的溫度進(jìn)行典型的0.1-10秒的時間(例如，0.5-5秒或0.7-2秒或約I秒)，接著在50-700C (例如，55-65°C或57-63°C或59-6TC或約60°C )的降低的溫度進(jìn)行10-30秒的時間(例如，15-25秒或17-23秒或19-21秒或約20秒)。如果使用核酸擴(kuò)增步驟，則所述步驟典型地包括35-55個循環(huán)(例如，40-50個循環(huán)或44-46個循環(huán)或約45個循環(huán))。在每次起始典型地使用反轉(zhuǎn)錄步驟，所述反轉(zhuǎn)錄步驟在40-60°C (例如，45-55°C或48-52°C或約50°C )的溫度進(jìn)行3-7分鐘的時間期間(例如，4-6分鐘或約5分鐘)。
[0191]在一個實施方案中，所述方法可以在應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedB1systems) 7900HT(高通量)儀器上進(jìn)行。例如，所述一起可以使用384孔測試卡(也稱為平板)RT-PCR平臺，其允許，例如，通過單一測試卡上存在的8個不同的柱平行分析8份不同的樣品-參見圖1。每個柱可以包含48個單個的靶標(biāo)孔，由此允許(對每份樣品基本上同時)篩查48種不同的引起呼吸道感染的微生物(有效地，46種引起呼吸道感染的微生物，使用兩個‘對照’孔)。備用的裝置和系統(tǒng)(包括相應(yīng)的測試卡)可商購，并且在本發(fā)明的情形中具有同等的應(yīng)用。
[0192]在一個實施方案中，所述方法使用PCR，諸如RT-PCR。
[0193]使用時，樣品(典型地是提取的核酸樣品)與2倍或5倍濃縮的緩沖液(例如，PCR緩沖液；還稱為反應(yīng)混合物)混合。例如，Χμ I樣品與相同體積(Χμ I)的2倍濃縮的緩沖液混合。然后將所述樣品(包含緩沖液)應(yīng)用到所述測試卡上(并且應(yīng)用到每個孔中)_典型地，0.1-50 μ I或0.5-30 μ I或0.5-20 μ I或0.5-10 μ I或1-5 μ I范圍內(nèi)的體積被遞送至每個孔中。優(yōu)選地，約0.5μ 1、1μ 1、2μ 1、3μ 1、4μ I或5μ I樣品(包含緩沖液)被遞送至每個孔中。
[0194]在包括柱狀排列的孔的測試卡的情形中(參見，例如，圖1)，樣品(包含緩沖液)可以僅應(yīng)用到每個柱頂部的儲庫中，然后將所述測試卡在離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)以將樣品加試劑混合物(在上文定義的體積范圍內(nèi))遞送至在每個柱中形成的每個孔中。在AB7900HT系統(tǒng)的情形中，每個孔典型地包含48個孔，因此通過離心遞送將樣品應(yīng)用至所述48個孔的每一個中。更詳細(xì)地，多至8種樣品可以分別添加到每個柱頂端的8個儲庫中(例如，使用翼形移液器(fin pipette)。參考圖1,小溝(little pods)表示分離的測定孔,其又包括相應(yīng)的探針(并且任選地包括相應(yīng)的引物)。所示的測試卡顯示其中每個通道存在48個孔(還稱為溝)的設(shè)置-使用時，通過沿著柱形通道的離心遞送每個孔典型地接收最終I μ I的反應(yīng)體積。
[0195]每個孔包括本發(fā)明的一種特定的探針類型(以及任選地相應(yīng)的引物對)。在一個實施方案中，所述探針以凍干形 式存在于其所在的孔中。由此，一旦向所述孔表面應(yīng)用液體樣品，則凍干的探針(任選地包含相應(yīng)的引物對)變得再水合，由此允許在液體介質(zhì)中進(jìn)行檢測步驟。
[0196]設(shè)計本發(fā)明的孔容納略微多于要在所述孔中進(jìn)行的測定的相關(guān)液體體積(樣品加緩沖液/反應(yīng)混合物)。每個孔是分離的，以允許單個孔中放置單種探針類型，由此允許所述方法檢測特定的目標(biāo)微生物的存在或不存在。將樣品應(yīng)用到測試卡上后，可以使用一種或多種薄膜/薄片將含有探針的所有孔密封關(guān)閉，由此防止孔間液體(以及潛在的探針)的意外遷移。本發(fā)明的孔可以放置在與測試卡相同的水平面上，但是同等地可以放置高于或低于所述平面。
[0197]與多路反應(yīng)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)排列架(battery)相比，本發(fā)明提供反應(yīng)設(shè)置操作中的時間和資源的雙重節(jié)約，并且允許整理來自多個儀器的數(shù)據(jù)。
[0198]本發(fā)明還提供用于上文所述的方法的測試卡。在一個實施方案中，所述測試卡由塑料材料制成。為了輔助使用者的目的，例如，當(dāng)在正常使用過程中使用者典型所保持的基本上水平的位置上時，所述測試卡應(yīng)該具有充分的硬度以支撐卡(包括應(yīng)用的樣品)的重量。
[0199]所述測試卡包括多個孔(任選地以柱狀形式排列以允許通過離心遞送進(jìn)行樣品上樣)，其中提供至少六個孔，并且其中第一孔包含第一探針，第二孔包含第二探針，第三孔包含第三探針，第四孔包含第四探針，第五孔包含第五探針，以及第六孔包含本發(fā)明的第六探針，如本文所定義。每個孔典型地僅包含本發(fā)明的(多個)一種特定的探針。例如，在一個實施方案中，第一探針存在于第一孔中(盡管典型地不存在于任一個其他的孔中)，并且第二探針存在于第二孔中(盡管典型地不存在于任一個其他的孔中)，等等。
[0200]每條探針可以任選地與其相應(yīng)的引物對相關(guān)聯(lián)。因此，除了第一探針，第一孔可以包含第一對相應(yīng)的正向和反向引物。每個孔典型地僅包含本發(fā)明的(多對)一對特定的引物對。例如，在一個實施方案中，第一引物對(以及第一探針)存在于第一孔中，但是典型地不存在于任一個其他的孔中，并且第二引物對(以及第二探針)存在于第二孔中，但是典型地不存在于任一個其他的孔中，等等。備選地，多于一種探針(以及任選地其相應(yīng)的引物對)可以存在于單個孔中。
[0201]每條探針可以固定在其各自的孔中-所述固定可以是永久性的(例如，通過共價連接，任選地通過任意商購的化學(xué)交聯(lián)劑引入)或暫時的(例如通過非共價鍵，諸如氫鍵，或通過離子鍵)。例如，第一探針可以固定在第一孔中，并且第二探針可以固定在第二孔中，等等。各種探針的固定使得測試卡更容易處理，提高了儲存的穩(wěn)定性，并且使探針在孔間遷移的風(fēng)險最小化。探針優(yōu)選地通過簡單吸附在孔中存在的表面上，諸如簡單吸附在孔的壁上，而固定在所述孔內(nèi)。由此，在一個實施方案中，制備含有探針的溶液，應(yīng)用到孔的表面上，任何允許干燥在所述孔的表面上。在應(yīng)用到孔表面上之前，可以向含有探針的溶液中加入常規(guī)的穩(wěn)定化合物(例如，糖)。
[0202]所述測試卡可以包括選自本文所述的第七孔至第十三孔(分別包括第七至第十三探針)的一個或多個另外的孔。例如，所述卡可以包括第七孔至第十三孔(分別包括第七至第十三探針)中的每一個。 [0203]所述測試卡可以備選地或另外包括選自本文所述的第十四孔至第三十三孔(分別包括第十四至第三十三探針)的一個或多個另外的孔。例如，所述卡可以包括第十四孔至第三十三孔(分別包括第十四至第三十三探針)中的每一個。
[0204]上述測試卡實施方案的每一個可以進(jìn)一步包括用于檢測引起非典型微生物(例如，細(xì)菌)呼吸道感染的介質(zhì)的一個或多個孔。在該實施方案中，所述測試卡可以進(jìn)一步包括選自本文所述的第三十四孔至第三十九孔(分別包括第三十四至第三十九探針)的一個或多個另外的孔。例如，所述卡可以包括第三十四孔至第三十九孔(分別包括第三十四至第三十九探針)中的每一個。
[0205]上述測試卡實施方案的每一個可以進(jìn)一步包括一個或多個‘對照’孔。在該實施方案中，所述測試卡可以進(jìn)一步包括本文所述的第四十和第四十一孔(分別包括第四十和/或第四十一探針)中的一個或兩個。
[0206]定義部分
[0207]述及至少80%的序列同一性包括(針對本文所述的每一種核酸序列和/或本文所述的每一種SEQ ID NO)至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和100%的序列同一性。
[0208]在整個本說明書中所用的單字母參考密碼意指:
[0209]A腺嘌呤
[0210]C胞嘧啶
[0211]G鳥嘌呤[0212]T胸腺嘧啶
[0213]U尿嘧啶
[0214]I 肌苷
[0215]X 肌苷
[0216]R鳥嘌呤或腺嘌呤
[0217]Y胸腺嘧啶或胞嘧啶
[0218]K鳥嘌呤或胸腺嘧啶
[0219]M腺嘌呤或胞嘧啶
[0220]S鳥嘌呤或胞嘧啶
[0221]W腺嘌呤或胸腺嘧啶
[0222]B非腺嘌呤
[0223]D非胞嘧啶 [0224]H非鳥嘌呤
[0225]V非胸腺嘧啶
[0226]N任意核酸堿基
[0227]本文所述的所有核酸序列都是以5’ -至-3’ (由左至右)方向表示。
[0228]設(shè)計本發(fā)明的探針與其存在于懷疑引起目標(biāo)呼吸道感染的微生物上的靶核酸序列雜交。優(yōu)選地，結(jié)合條件是這樣的，以提供高水平的特異性-即，探針的雜交在“嚴(yán)格條件下”發(fā)生。通常，這樣選擇嚴(yán)格條件:比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和pH的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm為其中(在限定的離子強(qiáng)度和pH) 50%的靶序列(或互補(bǔ)序列)與完美匹配的探針雜交的溫度。在這一點上，例如，本發(fā)明的探針在約0.02M以下的鹽濃度和pH7的^高于60°C，諸如約70°C。
[0229]預(yù)混合的緩沖液是商購的(例如，購自CLONTECH Laboratories, Inc.的EXPRESSHYB雜交液)，并且雜交可以按照供應(yīng)商的使用說明進(jìn)行。
[0230]篩選本發(fā)明的探針以使自我互補(bǔ)性和二聚體形成(探針-探針結(jié)合)最少化，并且進(jìn)行選擇以與人DNA具有最少的同源性。選擇方法典型地包括將候選探針序列與人DNA進(jìn)行比較，并且如果同源性大于50%，則棄用該探針。該選擇方法的目的是減少探針與污染的人DNA序列的退火，并且由此允許該測定的提高的特異性。
[0231]本文所述的任一種探針可以包含標(biāo)簽和/或標(biāo)記。例如，所述標(biāo)簽和/或標(biāo)記可以(彼此獨立地)位于靠近本文所述的探針的中間或靠近其5’或3’末端或位于其5’或3’末端，例如，位于5’末端。
[0232]因此，在帶有標(biāo)簽/標(biāo)記的探針與靶核酸雜交后，所述標(biāo)簽/標(biāo)記與所述靶核酸締合。備選地，如果使用擴(kuò)增步驟，則所述探針可以在本發(fā)明方法的過程中作為引物，并且因此所述標(biāo)簽/標(biāo)記可以隨著引物延伸結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物中。
[0233]適當(dāng)?shù)臉?biāo)記的實例包括可檢測的標(biāo)記，諸如放射性標(biāo)記或熒光或有色分子，酶標(biāo)記或生色標(biāo)記-例如，當(dāng)與探針雜交時產(chǎn)生可見顏色變化的染料。例如，所述標(biāo)記可以是洋地黃毒苷(digoxygenin)、突光素-異硫氰酸酯(FITC)、R-藻紅蛋白、Alexa532或Cy3。探針優(yōu)選地包含F(xiàn)am標(biāo)記(例如，5’Fam標(biāo)記)和/或小溝結(jié)合物(MGB)。所述標(biāo)記可以是報道分子，其被直接檢測，諸如通過暴露于膠卷或X-線膠片。備選地，所述標(biāo)記不是直接檢測的，但是可以間接檢測，例如，在兩相系統(tǒng)中。間接標(biāo)記檢測的實例是抗體與標(biāo)記的結(jié)合。
[0234]適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽的實例包括“補(bǔ)體/抗-補(bǔ)體對”。術(shù)語“補(bǔ)體/抗-補(bǔ)體對”表示在適當(dāng)條件下形成非共價締合的穩(wěn)定的配對的不相同的結(jié)構(gòu)部分。適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽的實例包括生物素和鏈霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)。例如，生物素標(biāo)簽可以用鏈霉抗生物素蛋白捕獲，所述鏈霉抗生物素蛋白可以包被到基底或支持物(如珠子(例如，磁珠)或膜)上。同樣地，鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)簽可以用生物素捕獲，生物素可以包被到基底或支持物(如珠子(例如，磁珠)或膜)上。其他示例性的補(bǔ)體/抗-補(bǔ)體對包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對等。另一種實例是與互補(bǔ)序列結(jié)合的核酸序列標(biāo)簽。后者自身可以是被預(yù)先標(biāo)記的，或可以連接到被獨立標(biāo)記的表面(例如，珠子)上。后一實施方案的實例是公知的LumineXK珠子系統(tǒng)。其他示例性的標(biāo)簽和捕獲分子對包括受體/配體對和抗體/抗原(或半抗原或表位)對。在需要補(bǔ)體/抗-補(bǔ)體對的后續(xù)解離的情形中，所述補(bǔ)體/抗-補(bǔ)體對具有例如小于19IT1的結(jié)合親和力。
[0235]本發(fā)明的探針可以用不同的標(biāo)記或標(biāo)簽來標(biāo)記，由此允許在用于本發(fā)明的方法中時分開鑒定每種探針。
[0236]可以利用任意常規(guī)方法將核酸標(biāo)簽連接到本發(fā)明的探針上(例如，連接到所述探針限定的結(jié)合區(qū)的5’末端)。備選地，本發(fā)明的核酸探針(具有預(yù)先連接的核酸標(biāo)簽)可以由商業(yè)供應(yīng)者構(gòu)建。
[0237]例如，所述樣品是臨床樣品(或來源于臨床樣品)，諸如:糞便或血液、痰、鼻和喉擦拭物、支氣管肺泡灌洗、氣管吸出物、鼻咽吸出物、肺組織樣品、腦脊液、考古學(xué)樣品。所述樣品優(yōu)選是人組織/樣品或是來源于其的樣品(例如，提取自樣品的核酸)。 [0238]如果使用擴(kuò)增步驟，則該步驟可以使用本領(lǐng)域已知的方法和平臺進(jìn)行，例如，PCR (例如，使用“快速DNA聚合酶”，生命技術(shù)(Life Technologies))，諸如實時PCR，基于塊的PCR(block-based PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，玻璃毛細(xì)管，等溫擴(kuò)增法，包括環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(rolling circle amplificat1n transcript1n mediatedamplificat1n)，基于核酸序列的擴(kuò)增，RNA技術(shù)信號介導(dǎo)的擴(kuò)增，鏈置換擴(kuò)增，等溫多置換擴(kuò)增，解旋酶依賴性擴(kuò)增，單引物等溫擴(kuò)增和環(huán)式解旋酶依賴性擴(kuò)增。
[0239]如果使用，擴(kuò)增可以使用任意擴(kuò)增平臺進(jìn)行-由此，該測定實施方案的優(yōu)點是其是獨立于并且不依賴于任何特定的儀器的平臺。
[0240]在一個實施方案中，可以使用通用擴(kuò)增步驟(例如，預(yù)檢測)來增加樣品存在的靶核酸的量。在該實施方案中，PCR擴(kuò)增引物典型地用來擴(kuò)增靶標(biāo)/包含本發(fā)明的核苷酸靶標(biāo)的互補(bǔ)核酸的大約100-400個堿基對的區(qū)域。在存在適當(dāng)?shù)木酆厦负虳NA前體(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的條件下，正向和反向引物在5’至3’方向上延伸，由此起始與靶核酸的單條鏈互補(bǔ)的新核酸鏈的合成。由此所述引物驅(qū)動靶核酸序列的擴(kuò)增，由此產(chǎn)生包含所述靶核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0241]在一個實施方案中，可以使用其中本發(fā)明的探針作為引物的擴(kuò)增步驟。在該實施方案中，所述探針(作用為引物)從其3’末端(B卩，以5’-至-’3’)方向延伸。產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)生典型地包含所述靶標(biāo)/互補(bǔ)核酸的100-400個堿基對的區(qū)域。該實施方案可以與通用擴(kuò)增步驟(諸如前文所述的步驟)聯(lián)合使用。
[0242]檢測步驟可以通過任意已知的方式進(jìn)行。在這一點上，探針或擴(kuò)增產(chǎn)物可以被添加標(biāo)簽和/或標(biāo)記，標(biāo)簽因此檢測方法可以包括檢測所述標(biāo)簽和/或標(biāo)記。
[0243]在一個實施方案中，所述探針可以包含標(biāo)簽和/或標(biāo)記。因此，在一個實施方案中，在帶有標(biāo)簽的/標(biāo)記的探針與靶核酸雜交后，所述標(biāo)簽/標(biāo)記與所述靶核酸締合。因此，在一個實施方案中，所述測定可以包括檢測所述標(biāo)簽/標(biāo)記并且將標(biāo)簽/標(biāo)記的存在與感染性微生物核酸的存在相關(guān)聯(lián)。
[0244]在一個實施方案中，標(biāo)簽和/或標(biāo)記可以在探針的延伸過程中結(jié)合。這樣做時，擴(kuò)增產(chǎn)物被添加標(biāo)簽/標(biāo)記，并且因此測定可以包括檢測所述標(biāo)簽/標(biāo)記并且將標(biāo)簽/標(biāo)記的存在與擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、由此與感染性微生物核酸的存在相關(guān)聯(lián)。
[0245]例如，在一個實施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物可以結(jié)合標(biāo)簽/標(biāo)記(例如，通過帶有標(biāo)簽/標(biāo)記的dNTP，如生物素-dNTP)作為擴(kuò)增方法的一部分，并且所述測定可以進(jìn)一步包括使用與所述標(biāo)簽(例如，鏈霉抗生物素蛋白)互補(bǔ)的結(jié)合配偶體，其包括可檢測的標(biāo)簽/標(biāo)記(例如，熒光標(biāo)記，諸如R-藻紅蛋白)。以這種方式，擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合可檢測的標(biāo)簽/標(biāo)記(例如，突光標(biāo)記，諸如R-藻紅蛋白)。
[0246]在一個實施方案中，所述探針和/或擴(kuò)增產(chǎn)物可以包含其他的標(biāo)簽/標(biāo)記(作為補(bǔ)體成分)以允許捕獲所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0247]例如，可以使用“補(bǔ)體/抗-補(bǔ)體”配對，其中抗-補(bǔ)體捕獲成分與所述其他標(biāo)簽/標(biāo)記(補(bǔ)體成分)結(jié)合，由此允許捕獲所述探針和/或擴(kuò)增產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)摹把a(bǔ)體/抗-補(bǔ)體”配偶體的實例已經(jīng) 在本說明書的前文中描述，諸如核酸序列的互補(bǔ)對，互補(bǔ)的抗體-抗原對等?？?補(bǔ)體捕獲成分可以連接到(例如，包被到)基底或固體支持物上-適當(dāng)?shù)幕?支持物的實例包括膜和/或珠子(例如，磁珠或熒光珠)。捕獲方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，可以使用LumineXK珠子。備選地，使用磁珠可能是有利的，原因在于所述珠子(加上捕獲的、帶有標(biāo)簽/標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物)能夠使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)容易地進(jìn)行濃縮并與樣品分離。
[0248]固定提供抗-補(bǔ)體捕獲成分(或探針)的物理定位，標(biāo)簽可以起作用將捕獲成分/探針固定在需要的位置和/或促進(jìn)探針的回收或分離。支持物可以是由例如玻璃或塑料制成的剛性固體支持物，諸如珠子(例如，熒光珠或磁珠)。備選地，所述支持物可以是膜，諸如尼龍或硝基纖維素膜。3D基質(zhì)(3D matrices)也是用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)闹С治?例如，聚丙烯酰胺或PEG凝膠。支持物/平臺的固定可以通過多種常規(guī)方式實現(xiàn)。例如，在諸如尼龍膜的支持物上的固定可以通過UV交聯(lián)實現(xiàn)。備選地，生物素標(biāo)記的分子可以結(jié)合在鏈霉抗生物素蛋白包被的基底上(并且反之亦然)，并且用氨基接頭制備的分子可以固定到甲硅烷化的表面上。另一種固定方式是通過聚-T尾巴或聚-C尾巴，例如，在3’或5’末端的聚-T尾巴或聚-C尾巴。所述固定技術(shù)同等地適用于本發(fā)明的探針成分(以及引物對成分，如果存在的話)。
[0249]在一個實施方案中，本發(fā)明的探針包含核酸序列標(biāo)簽/標(biāo)記(例如，在所述探針的限定的與靶標(biāo)/互補(bǔ)核酸結(jié)合的序列的5’末端連接到每個探針上)。更詳細(xì)地，所述探針中的每一種提供有不同的核酸序列標(biāo)簽/標(biāo)記，其中所述標(biāo)簽/標(biāo)記中的每一種(特異性)結(jié)合存在于珠子表面上的互補(bǔ)核酸序列。所述不同的標(biāo)簽/標(biāo)記中的每一種與其互補(bǔ)序列對應(yīng)體結(jié)合(并且不與其他標(biāo)簽的任一種互補(bǔ)序列對應(yīng)體結(jié)合)，其互補(bǔ)序列對應(yīng)體位于獨特的可鑒定的珠子上。在這一點上，珠子是獨特的可鑒定的，例如，通過特定波長的熒光的方式鑒定。因此，使用時，本發(fā)明的探針與靶核酸(如果樣品中存在)結(jié)合。然后，在存在一種或多種標(biāo)記的dNTP (例如，生物素標(biāo)記的dNTPs，諸如生物素-dCTPs)的條件下，(只有)結(jié)合的探針可以被延伸(在3’方向)。
[0250]延伸的引物可以與針對所標(biāo)記的dNTPs的結(jié)合配偶體對應(yīng)體(例如，鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的熒光團(tuán)，諸如鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的R-藻紅蛋白)接觸，所述對應(yīng)體結(jié)合已經(jīng)結(jié)合到延伸的引物中的那些標(biāo)記的dNTPs。然后，所標(biāo)記的延伸的引物可以通過允許其與其存在于獨特的可鑒定的珠子上的核酸對應(yīng)體結(jié)合而進(jìn)行鑒定。然后，后者可以被“讀出(called) ”(例如，以通過波長發(fā)射確定存在的珠子的類型)并且可以確定引物延伸的性質(zhì)(由此確定存在的靶標(biāo)/互補(bǔ)核酸的類型)。
[0251]本發(fā)明的優(yōu)選實施方案
[0252]第一探針包含與TAGGCAATGCWGC(SEQ ID NO: 124)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0253]第二探針包含與TCYGGGAYGGGACCRACTA (SEQ ID NO: 125)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0254]第三探針包含與TCAGCACCAGACACACC (SEQ ID NO:126)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0255]第 四探針包含與TCTGGTCATTGGRGCC (SEQ ID NO:127)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0256]第五探針包含與CGCTCACTGGGCACGGT (SEQ ID NO:128)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0257]第六探針包含與AACTGRGTGTTCATTTTGT (SEQ ID NO: 129)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0258]第七探針包含與ATARTTTCCAGGGGCAAA(SEQ ID NO:130)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0259]第八探針包含與CCATCCGCAAGTCAATG (SEQ ID NO:131)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0260]第九探針包含與ATAGTTGCCTGGTGCGAA (SEQ ID NO: 132)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0261]第十探針包含與CTGATAARGTAGGTGCTT(SEQ ID NO:133)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0262]第—^一探針包含與CGCGGCRTCATYGA (SEQ ID NO:134)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0263]第十二探針包含與CCTCATARTGRTAATTAG (SEQ ID NO: 135)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0264]第十三探針包含與CCTCATAGTAATAATTAG (SEQ ID NO: 136)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0265]第十四探針包含與ATGGTACTGTGACAATGC(SEQ ID NO:137)或CACGARGGCTCCACRTAC(SEQ ID NO:286)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0266]第十五探針包含與TCTGYRGCGGAACCGACT (SEQ ID NO: 138)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0267]第十六探針包含與AGCTAACGAGTGTGCG(SEQ ID NO:139)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0268]第十七探針包含與CTTGCGAATGAATGYGC (SEQ ID NO: 140)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0269]第十八探針包含與TTGGGYTCTAAGCATGTTA (SEQ ID NO:141)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0270]第十九探針包含與TTAGGTTCTAAGCATGTCA (SEQ ID NO:142)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0271]第二十探針包含與CYTCGGAGTAYCTSAGYCC (SEQ ID NO:143)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0272]第二—^一探針包含與TCAGACTGCATCCGGTCT (SEQ ID NO: 144)具有至少 80 % 的序列同一'I"生的核酸序列。
[0273]第二十二探針包含與TCYTGTCACCTCTGAC (SEQ ID NO: 145)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0274]第二十三探針包含與ACAGAGTGTGTYACTGT (SEQ ID NO:146)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0275]第二十四 探針包含與TTGGAATTTCTGGCCC(SEQ ID NO:147)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0276]第二十五探針包含與CGTTGCCGGATGGA (SEQ ID NO:148)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0277]第二十六探針包含與CCTACAGCAACTGTTACC (SEQ ID NO: 149)具有至少80 %的序列同一'I"生的核酸序列。
[0278]第二十七探針包含與CATTGCTCCAGAAWAT(SEQ ID NO:150)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0279]第二十八探針包含與TTCTNGCCATTGYAA (SEQ ID NO:151)或 TGGTTTAGCTTCGGG (SEQID NO:255)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0280]第二十九探針包含與CAATGTYCCTGTRACACA (SEQ ID NO: 152)具有至少80 %的序列同一'I"生的核酸序列。
[0281]第三十探針包含與AARCTGGARTCTGARG(SEQ ID NO:153)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0282]第三^^一探針包含與CCTTCRACTGTGTCTCC (SEQ ID NO:154)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0283]第三十二探針包含與CACTGTGTCACCGCTCA(SEQ ID NO:155)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0284]第三十三探針包含與TCYGGGAYGGRACCRACTA (SEQ ID NO:156)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0285]第三十四探針包含與CGCTCAATTGGCTTTAACC(SEQ ID NO:157)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。[0286]第三十五探針包含與CGTGGAGAGTGTGTG (SEQ ID NO:158)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0287]第三十六探針包含與CAACAGACGCTGGCG (SEQ ID NO:159)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0288]第三十七探針包含與TGTCGGCGTTTATTGG (SEQ ID NO: 160)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0289]第三十八探針包含與CTACTTGGTGTGAYGC (SEQ ID NO:161)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0290]第三十九探針包含與CTACTTGGTGTGAYGC (SEQ ID NO: 162)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0291]第四十探針包含與TCGATAGATCAAGGTGCCT (SEQ ID NO:163)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0292]第四^^一探針包含與TTCTGACCTGAAGGCTCTG (SEQ ID NO: 164)具有至少 80 % 的序列同一'I"生的核酸序列。
[0293]第四十二探針包含與CTGGTGCARTTYGCCCG(SEQ ID NO:247)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0294]第四十三探針包含與CAGGAYGCYTCGGARTACCT (SEQ ID NO:248)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0295]第四十四探針包含與CCAYGCTTGTGGANCTTATGC(SEQ ID NO:249)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列。
[0296]第四十五探針包含與TTYCCCATTCCATTCATTGT(SEQ ID NO:250)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0297]第四十六探針包含與CCCWGTGTTTGCAGTRGA(SEQ ID NO:251)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0298]第四十七探針包含與TAGGACCACGGGATGCA(SEQ ID NO:252)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0299]第四十八探針包含與AAGTTGTCCTCGCTGCCACTC (SEQ ID NO:253)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列。
[0300]第四十九探針包含與CAGTGCCCGCGACGGACG (SEQ ID NO:254)具有至少80%的序列同一'I"生的核酸序列。
[0301 ]引物 If 包含與 GGGWGGWGAAGCWGGATTCTACC (SEQ ID NO: 165)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物Ir包含與ACCTCTRTACTCTCCCATTATGCCTAG(SEQ ID NO:166)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0302]引物2f 包含與 CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:167)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物Ir包含與GAAACACGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:168)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0303]引物3f包含與CATCAGGTAAYATCCCACAAAAYCAG(SEQ ID NO:169)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物3r包含與GTGAATATTAARGCACCTACACATAATAARA(SEQ ID NO:170)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。[0304]引物4f 包含與 GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT(SEQ ID NO:171)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物 4r 包含與 CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT(SEQ ID NO:172)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0305]引物5f 包含與 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC(SEQ ID NO:173)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物5r包含與AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA (SEQ ID NO:174)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0306]引物6f 包含與 AGTGGRTACGCTGCAGAC(SEQ ID NO:175)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列，并且引物6r包含與GTTCAGCATTATAAGTCCAGACATCTAG(SEQ ID NO:176)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0307]引物7f包含與GCYCCTTTYATATGTATACTCAGAGACCCA(SEQ ID NO:177)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物7r包含與TGTTCTTCCAGTTACATAYTGTTGCATAGC(SEQ IDNO:178)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0308]引物8f包含與AAGTGYATGACTGCTCCTGATCARCC(SEQ ID NO:179)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物8r包含與TTGCCAATRTCTCCCACCATRGCATA(SEQ ID NO:180)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0309]引物9f 包含與 GCTCCTTTYATCTGTATCCTCAGAGATCC(SEQ ID NO:181)具有至少 80%的序列同一1注的核酸序列，并且引物9r包含與TGATCTTCCCGTCACATACTGTTGCATG(SEQ IDNO:182)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0310]引物1f 包含與 GGTTATAAGACAATTTCTTGTACAGGARATG(SEQ ID NO:183)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物1r包含與TTTGCAATRTCTCCCACCATRGCATA(SEQ IDNO:184)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0311]引物Ilf 包含與 ATGACTTTTGARGTSGAYCCCATGGA(SEQ ID NO:185)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物Ilr包含與GCCGAGAASGGYGTRCGSAGGTA (SEQ ID NO:186)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0312]引物12f 包含與 AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO:187)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物12r包含與CAGTTATCCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:188)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0313]引物13f 包含與 AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO: 189)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物13r包含與CAGTTATCCCTGCAYACACATG(SEQ ID NO:190)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0314]引物14f 包含與 GAAGGGTCMAACATCTGYTTAACAAG(SEQ ID NO:191)或GGGCAAATATGGARACATACGTGAA(SEQ ID NO:256)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物 14r 包含與 GCTWGTGGGAARAAAGAIACTGATCCTG(SEQ ID NO:192)或 TCTTTTTCTARGACATTGTAYTGAACAGC(SEQ ID NO:257)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0315]引物15f 包含與 CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:193)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物15r包含與GAAACACGGACACCCAAAGTA(SEQ ID NO:194)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0316]引物16f 包含與 ATGGGTTGGGATTATCCAAAATGTGA (SEQ ID NO:195)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物16r包含與AGCAGTTGTAGCATCACCGGATGAT (SEQ ID NO:196)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0317]引物17f 包含與 ATGGGTTGGGATTATCCTAARTGTGA (SEQ ID NO:197)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物17r包含與GCAGTAGTTGCATCACCACTRCTAGT(SEQ ID NO:198)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0318]引物18f 包含與 ATGGGTTGGGATTATCCCAAATGTGA (SEQ ID NO: 199)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物18r包含與GCTGTACTAGCRTCACCAGAAGT (SEQ ID NO:200)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0319]引物19f 包含與 ATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGA (SEQ ID NO:201)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物19r包含與GCTGTAGTTGCATCACCAGAAGT (SEQ ID NO:202)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0320]引物20f 包含與 GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:203)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物20r包含與GCCACIGTGGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:204)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0321]引物21f 包含與 CACKCCCAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO:205)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物21r包含與CCAGAGATGTTCACTCGCCGGA(SEQ ID NO:206)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0322]弓丨物22f 包含與 GAGTCTTCTAACMGAGGTCGAAACGTA (SEQ ID NO:207)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物22r包含與GGGCACGGTGAGCGTRAA(SEQ ID NO:208)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。 [0323]引物23f 包含與 TCAACAGACACTGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO:209)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物23r包含與GTTTCCCGTTATGCTTGTCTTCTAG(SEQ ID NO:210)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0324]引物24f 包含與 ATGGCATCAGTTGGCTAACA(SEQ ID NO:211)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物24r包含與ACAGCCACTGCCCCATT(SEQ IDNO:212)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0325]引物25f 包含與 GGAATAGCCCCCCTACAATTG(SEQ ID NO:213)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物25r包含與AATTCGCATTCTGGGTTTCCTA(SEQ ID NO:214)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0326]引物26f 包含與 CCTTTTTGTTGAACGCAGCAA(SEQ ID NO:215)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物26r包含與CGGATGAGGCAACTAGTGACCTA(SEQ ID NO:216)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0327]引物27f 包含與 GCCGAATGATGCMATMAAYT (SEQ ID NO:217)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物27r包含與CGCACCCATTGGAGTTTGAC(SEQ ID NO:218)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0328]引物28f包含與 TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCATG(SEQ ID NO:219)或GTNAAACTGAGYAGYGGITACAARGA (SEQ ID NO:258)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物 28r 包含與 AATRGTGCACYGCATGTTTCCRTT(SEQ ID NO:220)或GGCIAGAAGIAIRAARCATGAYGCC(SEQ IDNO:259)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列。
[0329]引物29f 包含與 TGCATIGGYYACCARTCAAC(SEQ ID NO:221)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物29r包含與GTTGCACAYARCATYCCATTGTG (SEQ ID NO:222)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0330]引物30f 包含與 AATGTGAYGAYCARTGCATGGA(SEQ ID NO:223)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物30r包含與GAGATGAGGCRACAGTIGAATA(SEQ ID NO:224)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0331]引物31f 包含與 ATTCAGACAGGATGGAACCGTYAA(SEQ ID NO:225)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物31r包含與GATACTAAGCTTTGTTGTGACCTCAT(SEQ ID NO:226)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0332]引物32f 包含與 ACCCGATTRGARGCTTTCAGACAAGA (SEQ ID NO:227)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物32r包含與CTGTTGRGACCGCATGATTGAC(SEQ ID NO:228)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0333]引物33f 包含與 CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:229)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列，并且引物33r包含與GAAACACGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO:230)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0334]引物34f 包含與 AAAGGCATGCAAGACGCTATG(SEQ ID NO:231)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物34r包含與TGTTAAGAACGTCTTTCATTTGCTG(SEQ ID NO:232)具有至少80%的序列同一 性的核酸序列。
[0335]引物35f 包含與 CCTTTCGTGGCAGTTGGGTCA(SEQ ID NO:233)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物35r包含與ACTGAGCTTGATCCGCCCACA (SEQ ID NO:234)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0336]引物36f 包含與 CAAGGGCTATAAAGGCGTTGCT (SEQ ID NO:235)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物36r包含與CATGATAATTGATGGTCGCAGACTT (SEQ ID NO:236)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0337]引物37f 包含與 AATTTCATCGTTCCCGGCAG(SEQ ID NO:237)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物37r包含與GCCGCGTTTACTAATCCCCA(SEQ ID NO:238)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0338]引物38f 包含與 GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA(SEQ ID NO:239)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物38r包含與CTGCGCGGATGCTAATGG(SEQ ID NO:240)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0339]引物39f 包含與 GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO:241)具有至少 80%的序列同一性的核酸序列，并且引物39r包含與GTAGTATCCTGCGCGGATGCT(SEQ ID NO:242)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0340]引物40f 包含與 TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACG (SEQ ID NO:243)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物40r包含與GTACGGGCGACCCCACGATGAC(SEQ ID NO:244)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0341]引物41f 包含與 AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:245)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物41r包含與GAGCGGCTGTCTCCACAAGT (SEQ ID NO:246)具有至少80 %的序列同一性的核酸序列。
[0342]引物42f 包含與 GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:203)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物42r包含與GCCACIGTGGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:204)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0343]引物43f 包含與 CARTGGKCITACATGCAYATCKC (SEQ ID NO:264)具有至少 80 % 的序列同一性的核酸序列，并且引物43r包含與GCRCGGGCRAAYTGCACCAG(SEQ ID NO:265)或GCGCGGGCAAACTGCACGAG(SEQ ID NO:266)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0344]引物44f 包含與 GGTGGYAGATGGCGTRCCATA(SEQ ID NO:270)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物 44r 包含與 TCTRACAAACTTACTAGAGGATGGCTG(SEQ ID NO:271))具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0345]引物45f 包含與 ATGGTYTCAGCTATGAACACAGCA(SEQ ID NO:274)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物45r包含與TGCCAGYTTTTGGACGTCTTCTCC(SEQ ID NO:275)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0346]引物46f包含與GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT(SEQ ID NO:171)具有至少80%的序列同一性的核酸序列，并且引物 46r 包含與 CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT(SEQ ID NO:172)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0347]引物47f 包含與 CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGA (SEQ ID NO:278)具有至少 80 %的序列同一性的核酸序列，并且引物47r包含與CTCATCCCACACCGCTAAAGCGCTT (SEQ ID NO:279)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0348]引物48f 包含與 GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:282)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物48r包含與GAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAG(SEQ ID NO:283)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0349]引物49f 包含與 GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO:282)具有至少 80% 的序列同一性的核酸序列，并且引物49r包含與GAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAG (SEQ ID NO:283)具有至少80%的序列同一性的核酸序列。
[0350]序列表同源性/同一性
[0351]多種序列比對方法中的任一種可以用來確定同一性百分?jǐn)?shù)，包括但不限于，整體方法、局部方法和混合法(hybrid methods),諸如例如，片段接近法(segmentapproach methods)。確定同一性百分?jǐn)?shù)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的常規(guī)程序。整體方法從分子的開頭到末尾比對序列，并且通過加合單個堿基對的評分和通過征收缺口罰分而確定最佳比對。非限制性的方法包括，例如，CLUSTAL W，參見，例如，Julie D.Thompson 等，CLUSTAL W:1mproving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting, Posit1n-Specific Gap Penalties andWeight Matrix Choice，22 (22) Nucleic Acids Research (核酸研究)4673-4680 (1994)；和迭代細(xì)化(iterative refinement)，參見，例如，Osamu Gotoh, Significant Improvementin Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement asAssessed by Reference to Structural Alignments, 264 (4) J.Mol.B1l.(分子生物學(xué)雜志)823-838 (1996)。局部方法通過鑒別所有輸入序列所共有的一個或多個保守基序而比對序列。非限制性的方法包括，例如，匹配盒(Match-box)，參見，例如，Eric Depiereux和 Ernest Feytmans, Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the SimultaneousAlignment of Several Protein Sequences，8 (5) CAB10S501-509 (1992) ;Gibbs 取樣，參見，例如，C.E.Lawrence 等，Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategyfor Multiple Alignment, 262 (5131) Science (科學(xué))208-214 (1993) ;Align_M，參見，例如，Ivo Van WaIIe 等,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly DivergentSequences, 20 (9) B1informatics (生物信息學(xué)):1428-1435 (2004)。因此,序列同一性百分?jǐn)?shù)通過常規(guī)方法確定。參見，例如，Altschul等，Bull.Math.Bi0.48:603-16,1986以及Henikoff 和 Henikoff，Proc.Natl.Acad.ScL USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)89:10915-19,1992。
[0352]上文提供的特定序列的變體可以備選地通過引用在所述變體序列與上文提供的具體的參比序列之間不同的核苷酸數(shù)目而定義。因此，在一個實施方案中，所述序列可以包含與上文提供的具體序列在不超過2個核苷酸位置處(例如，在不超過I個核苷酸位置處)不同的核苷酸序列(或由其組成)。優(yōu)選是保守置換。
[0353]例如，關(guān)于定義的第一探針(GGCAATGCWG ；SEQ ID NO:1)的變體探針序列可以包含選自下述的核酸序列:GGCAATGCIG(SEQ ID NO:287) ；GGCAATGCAG(SEQ ID NO:288)；GGCAATGCTG(SEQ ID NO:289) ；AGGCAATGCff(SEQ ID NO:290)或 GCAATGCWGCWCC(SEQ ID NO:291)
[0354]關(guān)于定義的第二探針(GAYGGGACCR ；SEQ ID NO:2)的變體探針序列的其他實例包括:GAYGGRACCR(SEQ ID NO:292) ；GAYRGGACCR(SEQ ID NO:293) ；GATGGGACCR(SEQ ID NO:294) ；GACGGGACC R(SEQ ID NO:295) ；GAYGGGACCG(SEQ ID NO:296) ；GAYGGGACCA(SEQ ID NO:297) ；AYGGGACCRA(SEQ ID NO:298) ；GGAYGGGACC(SEQ ID NO:299) ；GAYGGGACCI(SEQ ID NO:300) -M GAIGGGACCR(SEQ ID NO:301)。
[0355]關(guān)于定義包含限定的核苷酸序列(CACCAGACAC ; SEQ ID NO: 3)的第三探針的變體序列的實例還包括:ACCAGACACA (SEQ ID NO:302) ；GCACCAGACA (SEQ ID NO:303)；CACIAGACAC (SEQ ID NO:304) ；CACCAGAIAC (SEQ ID NO:305) ；CACCffGACAC (SEQ ID NO:306)；CACCAGACffC(SEQ ID NO:307);或 CACCARACAC(SEQ ID NO:308)。
[0356]關(guān)于定義包含限定的核苷酸序列(GGTCATTGGR ；SEQ ID NO:4)的第四探針的變體的更多實例包括:GGTCATYGGR(SEQ ID NO:309) ；GGTCATTGGG(SEQ ID NO:310)；GGTCATTGGA(SEQ ID NO:311) ；GTCATTGGRG(SEQ ID NO:312) ；TGGTCATTGG(SEQ ID NO:313)；GGTCATCGGR(SEQ ID NO:314) ；RGTCATTGGR(SEQ ID NO:315) ；AGTCATTGGR(SEQ ID NO:316)；GGTIATTGGR(SEQ ID NO:317);或 GGTCATTIGR(SEQ ID NO:318)。
[0357]關(guān)于具有已經(jīng)限定的核酸序列(CACTGGGCAC:SEQ ID NO:5)的第五探針的變體探針序列的其他實例還包括:ACTGGGCACG(SEQ ID NO:319) ；TCACTGGGCA(SEQ ID NO:320)；CRCTGGGCAC(SEQ ID NO:321) ；CGCTGGGCAC(SEQ ID NO:322) ；CACTGGGIAC(SEQ ID NO:323)；CAITGGGCAC(SEQ ID NO:324) ；CACTGGRCAC (SEQ ID NO:325) ；CACTRGGCAC (SEQ ID NO:326)；或 CACYGGGCAC(SEQ ID NO:327)。
[0358]關(guān)于限定的第六探針(RGTGTTCATT ；SEQ ID NO:6)的變體探針序列的實例包括:GRGTGTTCAT (SEQ ID NO:328) ；GTGTTCATTT (SEQ ID NO:329) ；AGTGTTCATT (SEQ ID NO:330)；GGTGTTCATT(SEQ ID NO:331) ；RGTGTTIATT(SEQ ID NO:332) ；RGTRTTCATT(SEQ ID NO:333)；RGTGTTCAffT(SEQ ID NO:334) ；RGTGTffCATT(SEQ ID NO:335) ；RGTGTTCffTT(SEQ ID NO:336)；或 RGIGTTCATT(SEQ ID NO:337)。[0359]還可以使用上文提及的序列(以及上文限定的其序列變體)的片段，例如，包含本文所述的限定的序列的10，9，8，7，6，5，4，3，2或I個堿基對的片段。
[0360]實施例1-H5組攻擊
[0361]為了證實我們的測定的準(zhǔn)確性，制備包含41個孔的測試卡-所述孔分別負(fù)載有各
自的第一至第四十一探針。
[0362]我們用已知的病毒H5 流感水平組(H5influenza proficiency panel of viruses)對測試卡進(jìn)行攻擊。所用的方法包括下述步驟:50°C，5mins(RT) ;95°C，20秒；95°C，1秒x45 ;和 60°C, 20 秒。
[0363]參見表1 (見下)，預(yù)測的Ct結(jié)果顯示在左側(cè)列，并且測試卡結(jié)果顯示在最右側(cè)列。在實時PCR測定中，陽性反應(yīng)通過熒光信號的累積進(jìn)行檢測。Ct(循環(huán)閾值(cyclethreshold))值定義為熒光信號超過閾值(即，超過背景水平)所需要的循環(huán)數(shù)。
[0364]測試卡的結(jié)果正確地指明所有的樣品。顯著地，測試卡探針正確地指明樣品G*中的達(dá)菲抗藥性/敏感 性混合物，并且兩種H5N1分離株正確地響應(yīng)所有三種相關(guān)的探針。測試卡探針還正確地將所有樣本分型為H1/H3季節(jié)性和Hlv2009，所有其他探針的結(jié)果是陰性的。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測樣品中存在至少六種引起呼吸道感染的微生物中的一種或多種或檢測所述樣品中不存在所述引起呼吸道感染的微生物的單路方法，所述方法包括: A)將樣品應(yīng)用到測試卡上，其中所述測試卡包括六個分離的孔: 1)包含第一探針的第一孔，其中所述第一探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與核酸序列GGCAATGCWG(SEQ ID NO:1)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 2)包含第二探針的第二孔，其中所述第二探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與核酸序列GAYGGGACCR(SEQ ID NO:2)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 3)包含第三探針的第三孔，其中所述第三探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與核酸序列CACCAGACAC(SEQ ID NO:3)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 4)包含第四探針的第四孔，其中所述第四探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與核酸序列GGTCATTGGR(SEQ ID NO:4)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 5)包含第五探針的第五孔，其中所述第五探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與核酸序列CACTGGGCAC(SEQ ID NO:5)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 6)包含第六探針的第六孔，其中所述第六探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與核酸序列RGTGTTCATT (SEQ ID NO:6)具有至少90%的序列同一性的核酸序列； B)允許所述樣品中存在的核Ife與所述孔中的探針接觸； C)檢測其中樣品核酸已經(jīng)結(jié)合所述探針中的一種或多種的結(jié)合核酸復(fù)合物的存在； 其中結(jié)合核酸復(fù)合物的存在證實在所述樣品中存在來自所述六種引起呼吸道感染的微生物中的一種或多種的核酸，并且其中不存在結(jié)合核酸復(fù)合物證實在所述樣品中不存在來自所有所述六種引起呼吸道感染的微生物的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試卡包括選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針: 7)包含第七探針的第七孔，其中所述第七探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQID NO:7的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 8)包含第八探針的第八孔，其中所述第八探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQID NO:8的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 9)包含第九探針的第九孔，其中所述第九探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQID NO:9的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 10)包含第十探針的第十孔，其中所述第十探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 11)包含第十一探針的第十一孔，其中所述第十一探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 12)包含第十二探針的第十二孔，其中所述第十二探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 13)包含第十三探針的第十三孔，其中所述第十三探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述測試卡包括所述另外的第七至第十三孔以及相應(yīng)的第七至第十三另外的探針中的每一種。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述測試卡包括選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針: 14)包含第十四探針的第十四孔，其中所述第十四探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 15)包含第十五探針的第十五孔，其中所述第十五探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 16)包含第十六探針的第十六孔，其中所述第十六探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:16的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 17)包含第十七探針的第十七孔，其中所述第十七探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:17的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 18)包含第十八探針的第十八孔，其中所述第十八探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:18的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 19)包含第十九探針的第十九孔，其中所述第十九探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:19的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 20)包含第二十探針的第二十孔，其中所述第二十探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 21)包含第二十一探針的第二十一孔，其中所述第二十一探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:21的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 22)包含第二十二探針的第二十二孔，其中所述第二十二探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 23)包含第二十三探針的第二十三孔，其中所述第二十三探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 24)包含第二十四探針的第二十四孔，其中所述第二十四探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:24的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 25)包含第二十五探針的第二十五孔，其中所述第二十五探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:25的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 26)包含第二十六探針的第二十六孔，其中所述第二十六探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:26的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 27)包含第二十七探針的第二十七孔，其中所述第二十七探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:27的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 28)包含第二十八探針的第二十八孔，其中所述第二十八探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 29)包含第二十九探針的第二十九孔，其中所述第二十九探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:29的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 30)包含第三十探針的第三十孔，其中所述第三十探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:30的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 31)包含第三十一探針的第三十一孔，其中所述第三十一探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:31的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 32)包含第三十二探針的第三十二孔，其中所述第三十二探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:32的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列；33)包含第三十三探針的第三十三孔，其中所述第三十三探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:33的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述測試卡包括所述另外的第十四至第三十三孔以及相應(yīng)的第十四至第三十三另外的探針中的每一種。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述測試卡包括選自下述的一個或多個另外的孔和相應(yīng)的一種或多種另外的探針: 34)包含第三十四探針的第三十四孔，其中所述第三十四探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:34的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 35)包含第三十五探針的第三十五孔，其中所述第三十五探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:35的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 36)包含第三十六探針的第三十六孔，其中所述第三十六探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:36的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 37)包含第三十七探針的第三十七孔，其中所述第三十七探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:37的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 38)包含第三十八 探針的第三十八孔，其中所述第三十八探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:38的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 39)包含第三十九探針的第三十九孔，其中所述第三十九探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:39的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述測試卡包括所述另外的第三十三至第三十九孔以及相應(yīng)的第三十三至第三十九另外的探針中的每一種。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述測試卡包括選自下述的一個或多個另外的對照孔和相應(yīng)的一種或多種另外的對照探針: 40)包含第四十探針的第四十孔，其中所述第四十探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:40的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列； 41)包含第四十一探針的第四十一孔，其中所述第四十一探針具有核酸序列，所述核酸序列包含與SEQ ID NO:41的核酸序列具有至少90%的序列同一性的核酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述測試卡包括所述另外的第四十或第四十一孔以及相應(yīng)的第四十或至四十一另外的探針中的一個或兩個。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法在檢測之前包括核酸擴(kuò)增步驟。
11.用于根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法的測試卡，其中所述測試卡包括多個孔，其中提供至少六個孔，并且其中第一孔包括前述權(quán)利要求限定的本發(fā)明的所述第一探針，第二孔包括前述權(quán)利要求限定的本發(fā)明的所述第二探針，第三孔包括前述權(quán)利要求限定的本發(fā)明的所述第三探針，第四孔包括前述權(quán)利要求限定的本發(fā)明的所述第四探針，第五孔包括前述權(quán)利要求限定的本發(fā)明的所述第五探針，并且第六孔包括前述權(quán)利要求限定的本發(fā)明的所述第六探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的測試卡，其還包括另外的第七至第十三孔中的一個或多個(優(yōu)選全部)，其中所述孔包含各自的第七至第十三探針。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的測試卡，其還包括另外的第十四至第三十三孔中的一個或多個(優(yōu)選全部)，其中所述孔包含各自的第十四至第三十三探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項所述的測試卡，其還包括另外的第三十四至第三十九孔中的一個或多個(優(yōu)選全部)，其中所述孔包含各自的第三十四至第三十九探針。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項所述的測試卡，其還包括另外的第四十和第四十一孔中的一個或兩個(優(yōu)選兩個)，其中所述孔包含各自的第四十和第四十一探針。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一項所述的測試卡，其中所述探針固定在各自的孔的表面上；優(yōu)選其中所述探 針以吸附在所述各自的孔的表面上的凍干形式存在。
【文檔編號】C12Q1/70GK104039981SQ201280060710
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月9日
【發(fā)明者】馬丁·柯倫 申請人:英國衛(wèi)生部