真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶并且表現(xiàn)出編碼PtaB樣蛋白之多核苷酸的表達(dá)或拷貝數(shù)提高或降低的分離的真菌細(xì)胞。還提供了用于產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的發(fā)酵方法，其包括表現(xiàn)出編碼PtaB樣蛋白之多核苷酸的表達(dá)或拷貝數(shù)提高或降低的真菌細(xì)胞。由本發(fā)明的分離的真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法所產(chǎn)生的生物質(zhì)降解酶可用于從生物質(zhì)產(chǎn)生可溶性糖的方法。
【專利說明】真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法
[0001]本申請要求2011年12月14日提交的美國臨時專利申請N0.61/570,545的優(yōu)先權(quán),其內(nèi)容在此通過引用全文并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶的真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0003]絲狀真菌用于產(chǎn)生用于多種工業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用的酶和蛋白。在用于產(chǎn)生酶的真菌中，里氏木霉(Trichoderma reesei)(紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無性型(asexual anamorph))的菌株特別突出，原因在于它們分泌大量(> 50g/L)可用于工業(yè)發(fā)酵之酶的能力。不同的團(tuán)隊已經(jīng)開發(fā)出了不同的高產(chǎn)率(和“超產(chǎn)的(hyperpiOductive) ”)木霉屬(Trichoderma)菌株系，幾乎都來源于QM6a,其為“野生型”環(huán)境菌株(Bailey和Nevalainen, 1981, Enzyme Microb.Technol.3: 153 ;Vitikainen等，2010,BMC Genomicsll:441，以及其中的參考文獻(xiàn))。報道的高產(chǎn)率菌株的實(shí)例包括QM9414(Mandels和Andreotti，1978,Process Biochemistryl3:6)，Rut_C30 (Eveleigh 和 Montenecourt,1979, Adv.App1.Microbiol.25:57)，CL847(Durand等，1988，Enzyme Microb.Technol.10:341)和M2C38 (美國專利N0.6，015，703)。高產(chǎn)率菌株用于表達(dá)生物體的內(nèi)源性酶以及異源性表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)。這樣的酶和蛋白包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、漆酶(Iaccase)和酯酶——所有這些均已經(jīng)被表達(dá)用于商業(yè)目的。仍在繼續(xù)努力以鑒定調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)產(chǎn)率的因素，從而可以作出進(jìn)一步改進(jìn)(Le Crom 等，2009，P.N.A.S.USA106:16151)。
[0004]高產(chǎn)率取決于多種因素。根據(jù)特定的菌株，碳源和給料速率(feed rate)將確定何種分泌酶的基因被誘導(dǎo)和/或抑制，以及所觀察到的生長和酶產(chǎn)生速率。碳源通過轉(zhuǎn)錄因子及其在特定給料條件下被激活或抑制的同源啟動子來發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)的表達(dá)通常由主要纖維素酶和半纖維素酶的啟動子(例如，Cel6A, Cel7A, XynlIB)或其雜合體(例如Cel7A和XynllB啟動子區(qū)域和分泌信號的雜合體(美國專利N0.6，015，703))來啟動。調(diào)節(jié)這些啟動子的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)部分地被鑒定和表征。一旦啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯，分泌依賴于特定的信號序列和細(xì)胞的分泌機(jī)構(gòu)(secretion apparatus),這兩者均被操控以提高生產(chǎn)率?？梢圆倏貜奶荚吹椒置诘乃胁襟E以通過鑒定和改變調(diào)節(jié)蛋白和控制功能級聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)來提聞生廣率。
[0005] 通過選擇碳源可以部分地控制纖維素酶和半纖維素酶的表達(dá)(Ι?πι?η等，1997, Appl.Environ.Microbiol.63:1298 ；Mach 和 Zeilinger,2003, Appl.Microbiol.Biotechnol.60:515 ;Schmoll 和 Kubicek, 2003, Acta Microbiologica et ImmunologicaHungarica50:125 ；Ahamed 和 Vermette,2009, Bioresources TechnologylOO:5979)。通常來說，纖維素和β -連接的葡寡糖(gluco-oligosaccaride)(例如纖維二糖、槐糖、龍膽二糖、昆布二糖、乳糖)誘導(dǎo)纖維素酶及其輔助酶的表達(dá)(Mandels等，1962，J.Bacteriology83:400 ；Sternberg 和 Mandels，1979, J.Bacteriology139:761 ；Foreman 等，2003，J.Biol.Chem.278:31988)。類似地，木聚糖、木糖、木寡糖(xylo-oIigosaccharide)將誘導(dǎo)半纖維素酶及其輔助酶(Royer 和 Nakas, 1990, Appl.Environ.Microbiol.56:2535 ；Zeilinger 等，1996，J.Biol.Chem.271:25624)。葡萄糖抑制T具有功能crel基因的細(xì)胞的(半)纖維素酶表達(dá)(Ilmen等，1996,Mol.Gen.Genet.251:451) ο氮對細(xì)胞繁殖和形態(tài)具有公知的作用(Steyaert等，2010a，F(xiàn)ungal Biologyll4:179 ;2010b，Microbiologyl56:2887)，其進(jìn)而又實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)結(jié)果(Ahamed和Vermette，2009，Bioresources TechnologylOO:5979)。氮還在纖維素酶生產(chǎn)中起作用。例如，有報道稱，在含有組成性激活的氮調(diào)節(jié)因子AreA的黑曲霉(A.niger)菌株中，提高了纖維素酶的產(chǎn)生，而在釆用銨作為氮源的纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)物中培養(yǎng)的AreA喪失功能的突變體中，纖維素酶的產(chǎn)生降低(Lockinton 等，2002，F(xiàn)ungal Genet.Biol.37:190)。
[0006]已經(jīng)鑒定了數(shù)種與纖維素酶和半纖維酶基因的啟動子區(qū)域相互作用并調(diào)節(jié)其表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子(Mach 和 Zeilinger, 2003，Appl.Microbiol.Biotechnol.60:515 ；Schmoll 和 Kubicek，2003， Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica50:125 ；Kubicek 等，2009，Biotechnology for Biofue I s2:19 以及其中的參考文獻(xiàn))。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖和其他非誘導(dǎo)性碳水化合物中時，Crel(分解代謝物抑制，cataboliterepression)介導(dǎo) 碳分解代謝物抑制并阻斷纖維素酶的表達(dá)(Ilmen等，1996，Mol.Gen.Genet.251:451)。Crel的基因在高生產(chǎn)率菌株中通常是有缺陷或缺失的(Seidl等，2008，BMC Genomics9:327 ; NakaH-SetSlS 等，2009，Appl.Environ.Microbiol.75:4853)。然
而，近來的數(shù)據(jù)表明Crel還可以通過在纖維素酶和半纖維素酶表達(dá)中所涉及的其他因子在上調(diào)中起作用(Portnoy等，2011 ,Eukaryotic CelllO:262)。Xyrl (木聚糖酶調(diào)節(jié)因子，lllanase regulator)為啟動纖維素酶和半纖維素酶表達(dá)的必需轉(zhuǎn)錄激活因子(Sticker等，2006，Eukaryotic Cell5:2128 ;Stricker 等，2007，F(xiàn)EBS Letters581:3915 ；Stricker等，2008，Appl.Microbiol.Biotechnol.78:211) oAcel (纖維素酶表達(dá)激活因子，activatorof cellulase expression)已經(jīng)被鑒定為纖維素酶和木聚糖酶抑制因子(Aro等，2003，Appl.Environ.Microbiol.69:56)。相反，Ace2表現(xiàn)為在特定條件下纖維素酶表達(dá)的激活因子(Aro等，2001，J.Biol.Chem.276:24309)。Hap復(fù)合物(血紅素活化蛋白(hemeactivator protein)，根據(jù)在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中最先鑒定的同源蛋白而命名)已經(jīng)顯示與表達(dá)所需的纖維素酶啟動子中的調(diào)節(jié)區(qū)域相互作用(Zeilinger等，2001，Mol.Genet.Genom.266:56)。不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生高于基礎(chǔ)水平的纖維素酶的木霉屬菌株已經(jīng)被分離出來，推測是由于纖維素酶表達(dá)的這些全局調(diào)節(jié)因子中的一種或更多種的缺陷所導(dǎo)致(Nevalainen 和 Palva, 1978，Appl.Environ.Microbiol.35:11 ；Torigoi 等，1996，Genel73:199)。
[0007]盡管與誘導(dǎo)和抑制相關(guān)的給料選擇和轉(zhuǎn)錄因子將確定被轉(zhuǎn)錄的特定mRNA的水平，但是給料速率和特定菌株的分泌能力將確定料中有多少碳進(jìn)入了所分泌的蛋白而不是轉(zhuǎn)化成了生物質(zhì)，以及在反饋信號導(dǎo)致分泌速率消失之前有多少和多長的蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞中分泌。提高給料速率將提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)率，直至某一點(diǎn)，超過該點(diǎn)，生產(chǎn)率將陡然降低，料將主要用于制造生物質(zhì)(Pakula等，2005，Microbiologyl51:135)。在導(dǎo)致高生產(chǎn)率的條件下發(fā)酵的菌株可能受到分泌途徑能力的限制。真菌細(xì)胞對分泌途徑組分的表達(dá)提高產(chǎn)生天然響應(yīng)(Saloheimo 等，1999，Mol.Gen.Genet.262:35 ;2004，Appl.Environ.Microbiol.70:459)。通過分泌途徑中所涉及的基因有意地過表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)分泌的提高(Kruszewska 等，1999, Appl.Environ.Microbiol.65:2382 ；2008, Acta BiochimicaPolonica55:447)。最后，分泌應(yīng)激可以導(dǎo)致分泌途徑中的蛋白錯誤折疊，其將激活未折疊的蛋白響應(yīng)(unfolded protein response, UPR),進(jìn)而下調(diào)分泌蛋白的表達(dá)(Saloheimo等，2003, Molecular Microbiology 47:1149 ;Valkonen 等，2004, Mol.Genet.Genom.272:443)。木霉屬中的另外的響應(yīng)(分泌應(yīng)激下的抑制(repression under secretion stress,RESS))進(jìn)一步下調(diào)分泌蛋白的表達(dá)(Pakula 等，2003, Mol.Genet.Genom.272:443)。
[0008]文獻(xiàn)中已經(jīng)報道了由突變引起的、不能產(chǎn)生纖維素酶的木霉屬分離物。Torigoi等(1996)先前已經(jīng)表征了通過對QM6a進(jìn)行UV輻照獲得的四種纖維素酶缺陷的木霉菌屬突變體(QM9136、QM9977、QM9978和QM9979) ((Mandels等，1971)。當(dāng)用槐糖或纖維素誘導(dǎo)時，所有所描述的突變體都無法產(chǎn)生可檢出的cel5A、cel6A、cel7A和cel7B轉(zhuǎn)錄物。這些突變體中的一種(QM9979)無法產(chǎn)生纖維素，這與其不能攝取纖維素酶二糖誘導(dǎo)劑相關(guān)，并且通過功能分析假設(shè)其攜帶缺陷/突變的β_糖苷通透酶(Kubicek等，1993)。然而，沒有描述所涉及的特定基因的身份和所涉及突變的性質(zhì)。
[0009]本發(fā)明基于對編碼多肽之基因的鑒定，所述多肽參與對絲狀真菌長時間發(fā)酵之后出現(xiàn)的可遺傳的纖維素酶缺陷表型的發(fā)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。所鑒定的基因還調(diào)節(jié)該真菌耐受能夠?qū)崿F(xiàn)高生產(chǎn)率之不利(aggressive)發(fā)酵環(huán)境的能力。本文中所公開的是用于修飾或調(diào)整真菌細(xì)胞的手段，以通過降低或提高基因的表達(dá)來滿足不同酶產(chǎn)生條件的特定要求。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶的真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法。
[0012]第一方面， 本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶并且包含拷貝數(shù)或表達(dá)提高的編碼多肽之多核苷酸的分離的真菌細(xì)胞，所述多肽與該所述分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞相比表現(xiàn)出與SEQ ID NO:1具有約40%至100%的同一性或者與SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11 或 SEQID NO:14的氨基酸序列具有約50%至約100%的同一性。
[0013]在一個實(shí)施方案中，所述真菌細(xì)胞與所述分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞相比包含拷貝數(shù)或表達(dá)提高的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下任意一種雜交:(i)SEQ ID NO:2的多肽編碼序列；(ii)包含SEQ ID NO:2之多肽編碼序列的基因組DNA序列；和(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈，其中高嚴(yán)格條件是在5XSSPE、0.3% SDS、200 μ g/mL經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA和50%甲醛胺中在42°C下預(yù)雜交和雜交12至24小時，雜交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分鐘。
[0014]在另一實(shí)施方案中，所述真菌細(xì)胞是以下的物種:木霉屬(Trichoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、曲霉屬(Aspergillus)、鍵刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)、脈抱菌屬(Neurospora)、毛殼菌屬(Chaetomium)、枝頂抱菌屬(Acremonium)、小叢殼屬(Glomerella)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、側(cè)抱霉屬(Sporotrichum)、梭抱殼屬(Thielavia)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、棒囊殼屬(Corynascus)、木節(jié)霉屬(Ctenomyces)、輪枝抱菌屬(Verticillium)、蟲草屬(Cordyceps)、叢赤殼屬(Nectria)或大角間座殼屬(Magnaporthe)。例如，所述真菌細(xì)胞可以是:里氏木霉(T.reesei)、紅褐肉座菌(H.jecorina)、黑曲霉(A.niger)、煙曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.0rzyae)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、尖孢鐮刀菌(F.0xysporum)、粗糙脈孢菌(N.crassa)、嗜熱毛殼菌(C.thermophilum)、嗜熱枝頂抱菌(A.thermophilum)、禾生小叢殼菌(G.graminicola)、嗜熱毀絲霉(M.thermophila)、嗜熱側(cè)孢霉(S.thermophile)、太瑞斯梭孢殼霉(T.terrestris)、異梭孢殼霉(T.heterothallica)、嗜熱金孢子菌(C.thermophile)、大麗花輪枝孢菌(V.dahlia)、蛹蟲草(C.militaris)、紅球叢赤殼菌(N.heamatococca)或稻痕病菌(M.0rzyae)。
[0015]另一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的發(fā)酵方法，其包括提供如上所述的分離的真菌細(xì)胞，將所述分離的真菌細(xì)胞在浸沒的液體補(bǔ)料分批(fed-batch)或連續(xù)培養(yǎng)物中培養(yǎng)；以及為該補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物提供包含碳源的給料液。與利用親本真菌細(xì)胞的等同方法相比，這樣的發(fā)酵方法導(dǎo)致真菌細(xì)胞群的cel-表型降低 50%。
[0016]在一個實(shí)施方案中，如上所述的發(fā)酵方法的特征在于，其持續(xù)生產(chǎn)率與利用所述分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞的等同方法相比，提高了至少50%。
[0017]第三方面，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的分離的真菌細(xì)胞，其包含與所述分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞相比拷貝數(shù)或表達(dá)降低的編碼多肽之多核苷酸，所述多肽表現(xiàn)出與SEQ ID NO:1具有約40%至100%的同一性；或者與SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ IDNO:14的氨基酸序列具有約50%至約100%的同一性。
[0018]在一個實(shí)施方案中， 所述真菌細(xì)胞包含與該分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞相比拷貝數(shù)或表達(dá)降低的多核苷酸的，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下任意一種雜交:(i)SEQ ID NO:2的多肽編碼序列；(ii)包括SEQ ID NO:2之多肽編碼序列的基因組DNA序列；和(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈，其中高嚴(yán)格條件是在5XSSPE、0.3% SDS、200 μ g/mL經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA和50%甲醛胺中在42°C下預(yù)雜交和雜交12至24小時，雜交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分鐘。
[0019]在另一個實(shí)施方案中，所述真菌細(xì)胞是以下的物種:木霉屬、肉座菌屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬、脈孢菌屬、毛殼菌屬、枝頂孢菌屬、小叢殼屬、毀絲霉屬、側(cè)孢霉屬、梭孢殼屬、金孢子菌屬、棒囊殼屬、櫛霉屬、輪枝孢菌屬、蟲草屬、叢赤殼屬或大角間座殼屬。例如，所述真囷細(xì)胞可以是:里氏木霉、紅揭肉座囷、黑曲霉、煙曲霉、米曲霉、構(gòu)桌曲霉、尖抱鐮刀菌、粗糙脈孢菌、嗜熱毛殼菌、嗜熱枝頂孢菌、禾生小叢殼菌、嗜熱毀絲霉、嗜熱側(cè)孢霉、太瑞斯梭孢殼霉、異梭孢殼霉、嗜熱金孢子菌、大麗花輪枝孢菌、蛹蟲草、紅球叢赤殼菌或稻瘟病菌。
[0020]第四方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的發(fā)酵方法，其包括:提供第三方面的分離的真菌細(xì)胞；將所述分離的真菌細(xì)胞在浸沒的液體補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物中培養(yǎng)；以及為該補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物提供包含碳源的給料液。這樣的發(fā)酵方法與利用親本真菌細(xì)胞的等同方法相比，表現(xiàn)出最大單位生產(chǎn)率(specific productivity, qp)提高至少約50%。在該發(fā)酵方法的一個實(shí)施方案中，以每升每小時至少0.4克碳的碳添加速率提供所述給料液。在另一實(shí)施方案中，以每升每小時至少0.8克碳的碳添加速率提供所述給料液。
[0021]在上述任一發(fā)酵方法的另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)步驟期間所提供的給料液中的碳源由以下組成:一種或更多種纖維素酶誘導(dǎo)性碳水化合物(例如纖維素、乳糖、纖維二糖、槐糖、龍膽二糖，及其組合)、一種或更多種來自于半纖維素的碳水化合物(例如木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、D-木糖、木二糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖，及其組合)、一種或更多種非誘導(dǎo)碳水化合物(例如葡萄糖、右旋糖、鹿糖、糖蜜(molasses)、果糖，及其任意組合)；纖維素酶誘導(dǎo)和來自于半纖維素的碳水化合物的混合物，纖維物酶誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)性碳水化合物的混合物，來自于半纖維素和非誘導(dǎo)性碳水化合物的混合物，或纖維素酶誘導(dǎo)、來自于半纖維素和非誘導(dǎo)性碳水化合物的混合物。
[0022]本發(fā)明的分離的真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶。在一些實(shí)施方案中，所述一種或更多種生物質(zhì)降解酶選自:纖維素酶、纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纖維素酶增強(qiáng)蛋白、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β -甘露聚糖酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、木質(zhì)素降解酶及其任意組合。
[0023]在一些實(shí)施方案中，一種或更多種生物質(zhì)降解酶中的至少一種為真菌細(xì)胞內(nèi)源性的。在另一些實(shí)施方案中，一種或更多種生物質(zhì)降解酶中的至少一種是真菌細(xì)胞異源性的。
[0024]最后一方面，本發(fā)明提供用于用生物質(zhì)降解酶處理生物質(zhì)底物的方法，所述酶由上文所述的發(fā)酵方法 或分離的真菌細(xì)胞產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，生物質(zhì)底物為木素纖維素原料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1的顯示了用于從分離的里氏木霉細(xì)胞缺失PtaB基因的pJET-ptaB-delta_ura3 載體圖。PptaB-ptaB 啟動子和 5’ 側(cè)翼序列；TptaB_ptaB 終止子和3’側(cè)翼序列；ura3-編碼里氏木霉乳清酸核苷-5'- 一磷酸脫羧酶的真菌選擇標(biāo)記盒；AmpR-賦予氨節(jié)青霉素抗性的細(xì)菌選擇標(biāo)記；rep(pMBl)-復(fù)制起始點(diǎn)；pLacUV5_LacUV5啟動子。
[0026]圖2描述了用PCR證實(shí)從里氏木霉轉(zhuǎn)化體缺失了 PtaB基因。A-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠，采用PtaB啟動子和終止子特異性引物以及從親本M2C38aux株(泳道2)和推定PtaB缺失株(泳道4-10)分離的基因組DNA。泳道3為空白。在泳道I上加載了 DNA大小標(biāo)記物(Fermentaslkb plus ladder)。每個DNA標(biāo)記物片段的大小在左邊顯示。右邊的黑色箭頭表示缺失了 PtaB的、對應(yīng)于預(yù)期大小片段的條帶。B-在ptaB缺失的菌株中的基因組ptaB座位(頂部)和完整ptaB座位(底部)的示意圖。PptaB-ptaB啟動子和5’側(cè)翼序列、TptaB-ptaB終止子和3’側(cè)翼序列、ptaB_PtaB蛋白編碼序列、ura3_編碼里氏木霉乳清酸核苷-5'-—磷酸脫羧酶的真菌選擇標(biāo)記盒。PCR擴(kuò)增中使用的引物用雜交位點(diǎn)處的線箭頭表示；PCR產(chǎn)物用點(diǎn)線表示，每個片段的大小在每條線的頂部表示。
[0027]圖3顯示了 ptaB缺失菌株⑷及其親本菌株⑶的試驗(yàn)性發(fā)酵曲線(profile)。如實(shí)施例5中所述實(shí)施補(bǔ)料分批發(fā)酵，碳添加速率為每升每小時約I克碳。發(fā)酵開始后每24小時測量生物質(zhì)(短劃線、空心符號)和總蛋白質(zhì)(實(shí)線、實(shí)心符號)的積累。作為每克生物質(zhì)每小時產(chǎn)生的分泌蛋白的mg數(shù)測量單位生產(chǎn)率(點(diǎn)線和實(shí)心三角形)。
[0028]圖4顯示了 ptaB缺失菌株⑷及其親本菌株⑶的試驗(yàn)性發(fā)酵曲線。如實(shí)施例5中所述實(shí)施補(bǔ)料分批發(fā)酵,碳添加速率為每升每小時~0-4克碳。發(fā)酵開始后每24小時測量生物質(zhì)(點(diǎn)線，空心菱形)和總蛋白質(zhì)(實(shí)線、實(shí)心圓形)的積累。作為每克生物質(zhì)每小時所分泌的蛋白mg數(shù)測量單位生產(chǎn)率(點(diǎn)線和實(shí)心三角形)。
[0029]圖5顯示了在ptaB缺失菌株及其親本菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)束時不產(chǎn)生纖維素酶(cel-)表型的累積。發(fā)酵開始后165小時收集生物質(zhì)樣品。按照實(shí)施例6所述，評價纖維素酶產(chǎn)生表型。
[0030]圖6 的顯示了含有 ptaB 過表達(dá)盒的 pTrbxll-ptaB-7at_ura3 載體圖。Pbxll-bxll啟動子；Tcel7a_cel7a 終止子，ptaB cds-PtaB 編碼序列；Pura3, ura3cds, Tura3_ 編碼里氏木霉乳清酸核苷-5'-—磷酸脫羧酶的真菌選擇標(biāo)記盒(分別為啟動子、編碼序列和終止子)；AmpR-賦予氨芐青霉素抗性的細(xì)菌選擇標(biāo)記。
[0031]圖7顯示了 ptaB過表達(dá)菌株(A)及其親本菌株(B)的試驗(yàn)性發(fā)酵曲線。如實(shí)施例5中所述實(shí)施補(bǔ)料分批發(fā)酵，碳添加速率為每升每小時~1.0g碳，使用纖維素酶誘導(dǎo)和來自于半纖維素的碳水化合物的混合物。發(fā)酵開始后每24小時測量生物質(zhì)(點(diǎn)線，空心菱形)和總蛋白質(zhì)(實(shí)線、實(shí)心圓形)的積累。作為每小時每g真菌細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的mg數(shù)測量單位生產(chǎn)率(點(diǎn)線和實(shí)心三角形)。
[0032]圖8顯示了 ptaB過表達(dá)菌株(A)及其親本菌株(B)的試驗(yàn)性發(fā)酵曲線。如實(shí)施例5中所述實(shí)施補(bǔ)料分批發(fā)酵，碳添加速率為每升每小時~0.4g碳，使用纖維素酶誘導(dǎo)和來自于半纖維素的碳水化合物 的混合物。發(fā)酵開始后每24小時測量生物質(zhì)(點(diǎn)線，空心菱形)和總蛋白質(zhì)(實(shí)線、實(shí)心圓形)的積累。作為每小時每克真菌細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的mg數(shù)測量單位生產(chǎn)率(點(diǎn)線和實(shí)心三角形)。
[0033]圖9顯示了在ptaB過表達(dá)菌株㈧及其親本菌株⑶的補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)束時不產(chǎn)生纖維素酶(cel-)表型的累積。分別從高和低CAR發(fā)酵開始后的168小時和144小時收集生物質(zhì)樣品。按照實(shí)施例6所述，評價纖維素酶產(chǎn)生表型。
[0034]圖10顯示了 SEQ ID NO:1與其他真菌物種的同源氨基酸序列的比對?？傮w同一性為42.77%。用框顯示相同的氨基酸，在比對下顯示一致的序列。采用DNAman程序進(jìn)行比對，空位罰分為3，K串(K-tuple)為2。
[0035]圖11顯示了十三種真菌PtaB樣蛋白的氨基酸序列彼此之間的同一性矩陣。
[0036]發(fā)明詳述
[0037]本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶的真菌細(xì)胞和發(fā)酵方法。
[0038]更特別地，本發(fā)明涉及分離的真菌細(xì)胞和利用所述分離的真菌細(xì)胞產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的發(fā)酵方法，所述真菌細(xì)胞表現(xiàn)出由SEQ ID NO:1編碼之多肽的表達(dá)或活性的提高或降低。
[0039]以下描述僅僅是通過舉例的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其對實(shí)施本發(fā)明所必需特征的組合沒有限制。所提供的標(biāo)題并不意味著對本發(fā)明不同實(shí)施方案的限制。術(shù)語例如“包含”和“包括”并不旨在限制。此外，沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種，并且“或”意味著“和/或”，除非另有說明。數(shù)值范圍包括了限定該范圍的數(shù)值。
[0040]除非本文另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)施涉及分子生物學(xué)、發(fā)酵、微生物學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域中常用的、本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的常規(guī)技術(shù)。盡管在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以使用類似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是本文描述了一些合適的方法和材料。除非另有說明，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。除非另有說明，否則核酸從左向右按照5’向3’的方向書寫；氨基酸序列從左向右按照氨基端向羧基端的方向書寫。
[0041]本文中提及的所有專利和出版物(包括所述專利和出版物中所公開的所有序列)明確地通過引用并入本文。
[0042]分離的真菌細(xì)胞
[0043]本文中使用的“分離的真菌細(xì)胞”是已經(jīng)經(jīng)過修飾以與其來源的親本真菌細(xì)胞相t匕，表現(xiàn)出編碼PtaB樣蛋白之多核苷酸的表達(dá)或拷貝數(shù)提高或降低或者PtaB樣蛋白的表達(dá)提高或降低的真菌細(xì)胞。
[0044]本文中使用的“親本真菌細(xì)胞”是指沒有經(jīng)過修飾以表現(xiàn)出編碼PtaB樣蛋白之多核苷酸的表達(dá)或拷貝數(shù)提高或降低或者PtaB樣蛋白的表達(dá)提高或降低的真菌細(xì)胞。親本真菌細(xì)胞可以是見于自然界的、沒有經(jīng)過任何突變或遺傳修飾的“野生型”或“天然”真菌細(xì)胞，或者其可以是包含一種或更多種遺傳修飾的真菌細(xì)胞，包括但不限于重組真菌細(xì)胞。例如，親本真菌細(xì)胞可以包含一個或更多個突變，其在誘導(dǎo)條件或在例如葡萄糖的抑制性碳水化合物存在(包括例如ere基因的突變)的情況下或在分泌應(yīng)激(包括例如hacl或irel基因的突變)下允許生物質(zhì)降解酶之產(chǎn)生提高。
[0045]親本真菌細(xì)胞還可以被修飾從而使一種或更多種生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生提高或降低，或降低蛋白酶的產(chǎn)生。因此，“分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞”基本上與分離的真菌細(xì)胞相同，只是編碼PtaB樣蛋白的多核苷酸的表達(dá)或拷貝數(shù)提高或降低，或者PtaB樣蛋白的表達(dá)提高或降低。
[0046]本文中使用的“重組真菌細(xì)胞”是通過故意的人為干預(yù)或“重組手段”將一個或更多個多核苷酸引入其中的真菌細(xì)胞。
[0047]本文中使用的“遺傳修飾”或“突變”包括但不限于，(a)例如通過隨機(jī)突變和選擇、適應(yīng)或表觀遺傳(epigenetic)改變而對真菌細(xì)胞的基因組DNA序列或結(jié)構(gòu)的可遺傳改變，和(b)使用重組手段將多核苷酸序列引入真菌細(xì)胞的遺傳修飾。
[0048]對于本文中所述目的而言，術(shù)語“拷貝數(shù)提高”是指，與分離的真菌細(xì)胞所來源于的親本真菌細(xì)胞的相同基因的拷貝數(shù)相比，分離的真菌細(xì)胞中存在給定基因的至少多肽編碼序列的至少一個額外拷貝。例如，與親本真菌細(xì)胞的相同基因的拷貝數(shù)相比，分離的真菌細(xì)胞可以含有給定基因的至少多肽編碼序列的1、2、3、4、5、10或更多個的額外拷貝數(shù)。給定基因的額外拷貝可以被整合至分離的真菌細(xì)胞的基因組，或者可以存在于分離的真菌細(xì)胞中的一個或更多個獨(dú)立復(fù)制的載體或質(zhì)粒中。
[0049]對于本文中所述目的而言，術(shù)語“拷貝數(shù)降低”是指，與分離的真菌細(xì)胞所來自于的親本真菌細(xì)胞的相同基因的拷貝數(shù)相比，分離的真菌細(xì)胞的基因組中給定基因的至少多肽編碼序列的拷貝至少少一個。
[0050]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過公知的手段測量基因拷貝數(shù)的調(diào)節(jié)，例如對基因組DNA 進(jìn)行比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)、Southern 印跡雜交或定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)。
[0051] 對于本文中所述目的而言，術(shù)語“表達(dá)提高”或“過表達(dá)”意味著，與在培養(yǎng)基組成、溫度、pH、細(xì)胞密度和培養(yǎng)時間的相同或幾乎相同條件下生長的親本真菌細(xì)胞相比，分離的真菌細(xì)胞在給定基因所編碼的轉(zhuǎn)錄物或多肽水平或者所得到的多肽活性表現(xiàn)出至少約1.2倍的提高。例如，與在相同或幾乎相同的培養(yǎng)條件下生長或培養(yǎng)的親本真菌細(xì)胞相比，分離的真菌細(xì)胞給定基因所編碼的轉(zhuǎn)錄物或多肽水平或者所得到的多肽的活性至少提高1.3、1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0 或 10 倍或更多。
[0052]對于本文中所述目的而言，術(shù)語“表達(dá)降低”意味著，與在培養(yǎng)基組成、溫度、pH、細(xì)胞密度和培養(yǎng)時間相同或幾乎相同條件下生長的親本真菌細(xì)胞相比，分離的真菌細(xì)胞在給定基因所編碼的轉(zhuǎn)錄物或多肽水平或者所得到的多肽的活性表現(xiàn)出至少約20%的降低。例如，與在相同或基本相同的培養(yǎng)條件下生長或培養(yǎng)的親本真菌細(xì)胞相比，分離的真菌細(xì)胞中給定基因所編碼的轉(zhuǎn)錄物或多肽水平或者所得到的多肽的活性表現(xiàn)出可至少降低20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或其間的任意量。
[0053]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還可以通過公知手段對選定mRNA或轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，從而測量基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，例如定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)、Northern印跡雜交、或使用cDNA或寡陣列雜交進(jìn)行全基因表達(dá)譜測定。
[0054]可以用例如免疫化學(xué)方法例如使用單個酶特異抗體的ELISA (Van ffeemen,B.K.等(1971)FEBS Lettersl5:232-236)或者通過特異性檢測和測量多肽活性的測定來測量給定基因的多妝廣生的提聞。
[0055]在本發(fā)明的至少某些實(shí)施方案中，分離的真菌細(xì)胞中編碼PtaB樣蛋白的基因拷貝數(shù)或表達(dá)的提高或降低可以通過大量的隨機(jī)突變和選擇技術(shù)來產(chǎn)生。例如，親本真菌細(xì)胞可以經(jīng)受輻射或者化學(xué)誘變以產(chǎn)生突變細(xì)胞文庫，然后對其篩選以獲得期望的經(jīng)改變的表型或基因型。隨機(jī)突變和選擇技術(shù)還包括“適應(yīng)進(jìn)化技術(shù)”或“進(jìn)化工程技術(shù)”。本文中使用的術(shù)語“適應(yīng)進(jìn)化技術(shù)”是指采用的通過應(yīng)用暴露于環(huán)境挑戰(zhàn)而影響真菌細(xì)胞或生物體的表型或遺傳譜的任何方法或程序，之后選擇經(jīng)修飾和/或分離的真菌細(xì)胞，其具有期望的經(jīng)改變的表型 和對應(yīng)的經(jīng)改變的遺傳譜。
[0056]本文中使用的“隨機(jī)突變和選擇”是指通過天然或人工手段(包括使真菌細(xì)胞接受輻射或化學(xué)誘變)產(chǎn)生突變株文庫的過程，之后篩選所需的經(jīng)改變的表型。適應(yīng)，也稱為“適應(yīng)進(jìn)化”或“進(jìn)化工程”，是指采用的通過應(yīng)用暴露于環(huán)境挑戰(zhàn)而影響真菌細(xì)胞表型或遺傳譜的任何方法或程序，之后選擇具有期望的經(jīng)改變表型的經(jīng)修飾真菌細(xì)胞?！氨碛^遺傳改變”定義為改變生物體一個或更多個基因表達(dá)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的可遺傳改變，包括但不限于:組蛋白甲基化、組蛋白乙?；⒎核鼗?ubiquitination)、磷酸化或蘇素化(sumoylation)和DNA甲基化。
[0057]在本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案中，可以通過多種遺傳工程技術(shù)或重組手段中的任何一種實(shí)現(xiàn)分離的真菌細(xì)胞中編碼PtaB樣蛋白的基因的拷貝數(shù)或表達(dá)的提高或降低。本文中使用的“遺傳工程技術(shù)”是指直接操控生物體基因或基因組的數(shù)種公知技術(shù)中的任意一種。例如，基因敲除(將不起作用的DNA序列插入生物體的染色體中，通常替換或中斷內(nèi)源性的起作用序列)、基因敲入(將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入生物體的染色體)、和基因敲低(插入編碼反義RNA或小干擾RNA (即RNA干擾(RNAi))的DNA序列)技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。
[0058]降低或減低基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域中公知的，可以使用本領(lǐng)域中多種已知方法中的任意一種進(jìn)行。例如，可以對基因進(jìn)行修飾以破環(huán)轉(zhuǎn)錄或翻譯啟動序列，或在編碼多肽的轉(zhuǎn)錄物中引入移碼突變。其他降低基因表達(dá)的方法包括轉(zhuǎn)錄后RNA沉默法，例如反義RNA和RNA干擾(RNAi)。反義技術(shù)涉及引入與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列，從而所述互補(bǔ)反義核苷酸序列與靶基因轉(zhuǎn)錄雜交，由此降低或消除可以被翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的數(shù)目。表達(dá)反義 RNA 的實(shí)例在 Ngiam 等(2000) Appl.Environ.Microbiol.66 (2):775-82 ;和 Zrenner 等(1993)Planta.190(2):247-52 中公開。RNAi 方法包括本領(lǐng)域人員知曉的雙鏈RNA(dsRNA)、短發(fā)夾RNAs (shRNAs)和小干擾RNA (siRNA)，例如Fire等(1998)Nature391:806-11 ；Paddison 等(2002)Genes Dev.16:948-58 ；和 Miyagishi 等(2002)Nat.Biotechnol.20:497-500 的技術(shù)。
[0059]降低或減低基因表達(dá)的方法還包括部分或完全缺失該基因、破壞或替換該基因的啟動子從而大大降低或甚至抑制該基因的轉(zhuǎn)錄。例如，該基因的啟動子可以被弱啟動子替換，例如美國專利N0.6，933，133中所舉例的。這樣，當(dāng)弱啟動子與內(nèi)源性多肽的編碼序列可操作連接時，該基因的轉(zhuǎn)錄將被大大降低或甚至抑制。
[0060]在一些實(shí)施方案中，分離的真菌細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾從而至少部分地缺失編碼PtaB樣蛋白的一個或更多個基因。本文中使用的基因缺失或缺失突變是組成該基因的一個或更多個核苷酸丟失的突變。因此，缺失是遺傳材料的丟失或替換，其導(dǎo)致構(gòu)成該基因的DNA序列的全部或部分破壞?？梢匀笔我鈹?shù)量的核苷酸，從一個堿基到整個染色體。在一些實(shí)施方案中，考慮完全 或接近完全缺失基因序列。例如，基因的缺失可以是缺失至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的基因。
[0061]在一些實(shí)施方案中，分離的真菌細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾以提高PtaB樣蛋白的表達(dá)。PtaB樣蛋白可以是與真菌細(xì)胞同源或異源的。對于本文中的目的而言，同源PtaB樣蛋白由與真菌細(xì)胞相同或分類學(xué)上等同的分類物種天然的多核苷酸序列編碼，或者從其分離或從其得到。而且，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識的，同源蛋白可以含有一個或更多個插入、缺失和替換，仍然被認(rèn)為是“來自于”與分離的真菌細(xì)胞相同的物種。所述一個或更多個插入、缺失和替換可以導(dǎo)致同源PtaB樣蛋白的表達(dá)或活性的提高或降低。類似地，編碼同源PtaB樣蛋白的多核苷酸可以含有一個或更多個插入、缺失和替換(包括優(yōu)化密碼子使用而不改變所編碼蛋白的序列的替換)。
[0062]異源PtaB樣蛋白由與真菌細(xì)胞不同的分類物種天然的多核苷酸序列編碼，或者從其分離或從其得到。而且，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識的，異源蛋白可以含有一個或更多個插入、缺失和替換，仍然被認(rèn)為是“來自于”與分離的真菌細(xì)胞不同的分類學(xué)物種。所述一個或更多個插入、缺失和替換可以導(dǎo)致異源PtaB樣蛋白的表達(dá)或活性的提高或降低。類似地，編碼異源PtaB樣蛋白的多核苷酸可以含有一個或更多個插入、缺失和替換(包括優(yōu)化密碼子使用而不改變所編碼蛋白的序列的替換)。
[0063]本文中使用的就多核苷酸序列而言的“來自于”是指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的一種或更多種分子生物學(xué)技術(shù)將靶多核苷酸序列分離出來，包括但不限于:多肽或氨基酸序列的逆翻譯、克隆、亞克隆、PCR擴(kuò)增、體外合成等。而且，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識的，來自于靶多核苷酸序列的多核苷酸序列可以通過一個或更多個插入、缺失和替換而修飾，其仍然被認(rèn)為“來自于”靶核苷酸序列。所述一個或更多個插入、缺失和替換可以導(dǎo)致該多核苷酸序列所編碼的目標(biāo)蛋白的表達(dá)或活性提高或降低，并且可以位于啟動子序列、5’或3’未翻譯區(qū)內(nèi)，或者位于目標(biāo)蛋白的編碼區(qū)內(nèi)。[0064]本文中就多核苷酸序列而言的“分離的”或“分離”意指通過將該核酸序列從與其自然締合的某些或全部天然核酸序列中分離出來而從其天然狀態(tài)發(fā)生改變。
[0065]在另一些實(shí)施方案中，可以用PtaB遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞從而對真菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。本文中使用的“PtaB遺傳構(gòu)建體”是指分離的多核苷酸，其包含使PtaB樣蛋白表達(dá)提高或降低所必需的元件。這些元件可以包括但不限于:編碼PtaB樣蛋白的多核苷酸序列(編碼序列)、與編碼序列可操作連接并且包含引導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯之多核苷酸序列的啟動子。
[0066]本發(fā)明的分離的真菌細(xì)胞可以進(jìn)一步包含一個或更多個遺傳構(gòu)建體，其引導(dǎo)一種或更多種同源或異源生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生。所述構(gòu)建體包含多核苷酸要素，其包括但不限于:生物質(zhì)降解酶的編碼序列、與編碼序列可操作連接并且包含引導(dǎo)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄之多核苷酸序列的啟動子、和編碼與編碼序列可操作連接的分泌信號肽的序列、以及引導(dǎo)將構(gòu)建體同源重組到真菌細(xì)胞基因組中的靶多核苷酸序列。術(shù)語“分泌信號肽”、“分泌信號”和“信號肽”是指可以參與所分泌蛋白的成熟或前體形式的分泌的任意核苷酸和/或氨基酸序列。該信號序列相對于真菌細(xì)胞可以是內(nèi)源性或外源性的。該信號序列可以通常與目標(biāo)蛋白或編碼另一分泌蛋白的基因連接。該信號序列還可以是含有編碼分泌蛋白的兩個或更多個基因的部分序列的“雜交信號序列”。
[0067]正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，編碼序列、啟動子和/或分泌信號可以來自于親本真菌細(xì)胞、不同的生物體，和/或體外合成。例如，啟動子和分泌信號可以來自于編碼蛋白質(zhì)的一個或更多個基因，當(dāng)親本細(xì)胞在以下所限定的發(fā)酵方法中生長時所述蛋白質(zhì)高表達(dá)和分泌例如編碼纖維素酶、β -葡糖苷酶、纖維素酶增強(qiáng)蛋白、半纖維素酶及其組合的基因。相對于天然多核苷酸，這些多核苷酸元件還可以通過替代、替換、添加或消除一個或更多個核酸而改變或改造。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的實(shí)施并不限于PtaB遺傳構(gòu)建體的啟動子的選擇或者不限于表達(dá)生物質(zhì)降解酶的遺傳構(gòu)建體的啟動子和分泌信號的選擇。
[0068]如上所述的遺傳構(gòu)建體可以含有用于鑒定被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記。該選擇標(biāo)記可以存在于遺傳構(gòu)建體上，或者選擇標(biāo)記可以是與遺傳構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化的單獨(dú)的分離的多核苷酸。選擇標(biāo)記的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括這樣的基因(合成或天然的)，所述基因向被轉(zhuǎn)化細(xì)胞賦予利用通常不能被微生物代謝的代謝物的能力(例如，編碼乙酰胺酶并賦予在作為唯一氮源的乙酰胺中生長的能力的構(gòu)巢曲霉amdS基因)或抗生素抗性(例如，編碼潮霉素-β -磷酸轉(zhuǎn)移酶并賦予抗潮霉素抗性的大腸桿菌hph基因)?；蛘?，如果真菌細(xì)胞表達(dá)很少或不表達(dá)所選擇的標(biāo)記物活性，那么可以將對應(yīng)的基因用作標(biāo)記物。所述標(biāo)記物的實(shí)例包括trp、pyr4、pyrG、argB、Ieu等。對應(yīng)的宿主株由此必須缺少對應(yīng)于所選擇的標(biāo)記物的功能基因，即缺少trp、pyr4、pyrG、argB、leu等的表達(dá)。
[0069]遺傳構(gòu)建體可以含有在真菌細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止子，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的。轉(zhuǎn)錄終止子可以位于編碼序列的正下游。本發(fā)明的實(shí)施不受制于足以引導(dǎo)宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄終止的轉(zhuǎn)錄終止子 的選擇。
[0070]遺傳構(gòu)建體可以含有位于本文所述的多種序列元件之間的額外多核苷酸序列。這些序列可以是天然或合成的，可以在構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)中添加一個或更多個氨基酸。本發(fā)明的實(shí)施不受存在額外多核苷酸序列的限制，所述額外多核苷酸序列位于真菌細(xì)胞中遺傳構(gòu)建體的多種序列元件之間。
[0071]將遺傳構(gòu)建體引入真菌細(xì)胞的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，包括但不限于:用氯化鈣處理真菌原生質(zhì)體從而使細(xì)胞膜變薄弱、添加聚乙二醇從而使細(xì)胞膜融合、通過電穿孔使細(xì)胞膜去極化、或使用顆粒槍通過微彈轟擊(microprojectilebombardment)射出構(gòu)建體使其通過細(xì)胞壁和膜。本發(fā)明的實(shí)施不受將遺傳構(gòu)建體引入真菌細(xì)胞的方法的限制。
[0072]在一些實(shí)施方案中，分離的真菌細(xì)胞可以是以下屬之物種的絲狀真菌:木霉屬、肉座菌屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬、脈孢菌屬、毛殼菌屬、枝頂孢菌屬、小叢殼屬、毀絲霉屬、側(cè)孢霉屬、梭孢殼屬、金孢子菌屬、棒囊殼屬、櫛霉屬、輪枝孢菌屬、蟲草屬、叢赤殼屬或大角間座殼屬。例如，所述真菌細(xì)胞可以是以下真菌物種的菌株:里氏木霉、紅褐肉座菌、黑曲霉、煙曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、尖孢鐮刀菌、粗糙脈孢菌、嗜熱毛殼菌、嗜熱枝頂孢菌、禾生小叢殼菌、嗜熱毀絲霉、嗜熱側(cè)孢霉、太瑞斯梭孢殼霉、異梭孢殼霉、嗜熱金孢子菌、大麗花輪枝孢菌、蛹蟲草、紅球叢赤殼菌或稻瘟病菌。
[0073]應(yīng)當(dāng)理解的是，對于前述物種，不管它們?yōu)槿怂奈锓N名稱，本文中的分離的真菌細(xì)胞包括完全(perfect)和不完全(imperfect)狀態(tài)，以及其他分類學(xué)等同物,例如無性型(anamorph)和有性型(teleomorph)?？梢栽诶?Cannon, Mycopathological 11:75-83，1990 ；Moustafa 等，Persoonial4: 173-175,1990 ；Stalpers, Stud.Myco1.24，1984 ； Upadhyay 等，Mycopatho1gia87:71-80,1984 ；Guarro 等，Mycotaxon23:419-427,1985 ；Awao 等，Mycotaxonl6:436-440,1983 ；von Klopotek,Arch.Microbiol.98:365-369,1974 ；和 Long 等，1994,ATCC Names of Industrial Fungi,ATCC,Rockville Md 中找到分類學(xué)等同物的其他實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易識別適當(dāng)?shù)韧锏纳矸?。因此，?yīng)當(dāng)理解的是，除非另有說明，在本公開內(nèi)容中使用的特定種屬和/或物種名稱也指通過無性或有性關(guān)系而相關(guān)的屬和物種，被認(rèn)為是同義的屬和物種，以及已經(jīng)或者未來可能被重新分類成所聲稱的屬或物種中的一種的那些。
[0074]PtaB樣蛋白和PtaB多核苷酸
[0075]本文中使用的“PtaB樣蛋白”(或“PtaB蛋白”或“PtaB”)是指表現(xiàn)出與SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有約40%至100%同一性或者與SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:14 的氨基酸序列具有約50%至約100%同一性的多肽。例如，Pta-B類蛋白可以表現(xiàn)出與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或 100% 的同一性或其間的任意％ 同一性，或者可以表現(xiàn)出與 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:11 或 SEQ ID NO:14 的氨基酸序列具有 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的同一性或其間的任意％同一性。
[0076]SEQ ID NO:I 的多妝表現(xiàn)出與 Conlon 等，2001, Molecular Microbiology40:361所鑒定的曲霉屬PtaB基因所編碼的多肽具有顯著的序列同源性(“pta”代表“推定轉(zhuǎn)錄激活子(putative transcriptional activator ) ”。在選擇用于抑制areA (曲霉屬中氮代謝的主要調(diào)節(jié)子)突變的曲霉屬菌株中，曲霉中的Pta基因被發(fā)現(xiàn)與areB (編碼氮代謝調(diào)節(jié)子的基因)融合?；騪taA、ptaB和ptaC被鑒定為與激活抑制表型的areB融合。正如它們的名稱和歷史所暗示，Pta基因的實(shí)際功能是未知的。除了曲霉屬之外的屬的同源物通過與曲霉屬原型相比進(jìn)行命名，例如木霉屬和毀絲霉屬。被鑒定為推定PtaB同源物的真菌多肽列表及其來源生物體見表1。
[0077]表1:真菌的PtaB樣蛋白
[0078]
【權(quán)利要求】
1.能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的分離的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞與所述分離的真菌細(xì)胞所來自于的親本真菌細(xì)胞相比，表現(xiàn)出編碼如下多肽之多核苷酸的拷貝數(shù)或表達(dá)提高，所述多肽表現(xiàn)出與SEQ ID NO:1具有約40%至100%的同一性，或者與SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有約50%至約100%的同一性。
2.能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的分離的真菌細(xì)胞，其與所述分離的真菌細(xì)胞所來自于的親本真菌細(xì)胞相比，包含編碼如下多肽之多核苷酸的拷貝數(shù)或表達(dá)的降低，所述多肽表現(xiàn)出與SEQ ID NO:1具有約40%至100%的同一性，或者與SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:16 的氨基酸序列具有約50%至約100%的同一性。
3.權(quán)利要求1或2所述的真菌細(xì)胞，其中所述多肽表現(xiàn)出與SEQID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有約60%至約100%的同一性。
4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的真菌細(xì)胞，其中所述一種或更多種生物質(zhì)降解酶選自:纖維素酶、纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β_葡糖苷酶、纖維素酶增強(qiáng)蛋白、木聚糖酶、β -木糖苷酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、β -甘露聚糖酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、木質(zhì)素降解酶，及其組合。
5.權(quán)利要求1至4中任一項所述的真菌細(xì)胞，其中所述一種或更多種生物質(zhì)降解酶中的至少一種是所述真菌細(xì)胞內(nèi)源性的。
6.權(quán)利要求1至4中任一項所述的真菌細(xì)胞，其中所述一種或更多種生物質(zhì)降解酶中的至少一種是所述真菌細(xì)胞異源性的。
7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞是以下的物種:木霉屬(Trichoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、曲霉屬(Aspergillus)、鍵刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)、脈孢菌屬(Neurospora)、毛殼菌屬(Chaetomium)、枝頂孢菌屬(Acremonium)、小叢殼屬(Glomerella)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、側(cè)抱霉屬(Sporotrichum)、梭孢殼屬(Thielavia)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、棒囊殼屬(Corynascus)、柿霉屬(Ctenomyces)、輪枝抱菌屬(Verticillium)、蟲草屬(Cordyceps)、叢赤殼屬(Nectria)或大角間座殼屬(Magnaporthe)。
8.權(quán)利要求7所述的真菌細(xì)胞,其中所述真菌細(xì)胞是:里氏木霉(T.reesei)、紅褐肉座菌(H.jecorina)、黑曲霉(A.niner)、煙曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.0rzyae)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、尖孢鐮刀菌(F.0xysporum)、粗糙脈孢菌(N.crassa)、嗜熱毛殼菌(C.thermophilum)、嗜熱枝頂抱菌(A.thermophilum)、禾生小叢殼菌(G.graminicola)、嗜熱毀絲霉(M.thermophila)、嗜熱側(cè)孢霉(S.thermophile)、太瑞斯梭孢殼霉(T.terrestris)、異梭孢殼霉(T.heterothallica)、嗜熱金孢子菌(C.thermophile)、大麗花輪枝孢菌(V.dahlia)、蛹蟲草(C.militaris)、紅球叢赤殼菌(N.heamatococca)或稻痕病菌(M.0rzyae)。
9.用于產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的發(fā)酵方法，所述方法包括: (a)提供權(quán)利要求1所述的分離的真菌細(xì)胞； (b)將所述分離的真菌細(xì)胞在浸沒的液體補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物中培養(yǎng)；以及(C)為該補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物提供包含碳源的給料液， 其中所述方法導(dǎo)致與利用所述分離的真菌細(xì)胞所來自于的親本真菌細(xì)胞的等同方法相比，真菌細(xì)胞群中Ce 1-表型降低至少50%。
10.權(quán)利要求9所述的發(fā)酵方法，其中所述方法的特征在于持續(xù)生產(chǎn)率與利用所述親本真菌細(xì)胞的等同方法相比，提高至少50%。
11.權(quán)利要求10所述的發(fā)酵方法，其中所述給料液以約0.4克碳/升/小時的碳添加速率提供。
12.用于產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的發(fā)酵方法，所述方法包括: (a)提供權(quán)利要求2所述的分離的真菌細(xì)胞； (b)將所述分離的真菌細(xì)胞在浸沒的液體補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物中培養(yǎng)；以及 (c)為該補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)物提供包含碳源的給料液， 其中所述方法的特征在于最大單位生產(chǎn)率(qp)與利用所述分離的真菌細(xì)胞所來源的親本真菌細(xì)胞的等同方法相比，提高至少約50%。
13.權(quán)利要求12所述的發(fā)酵方法，其中碳添加速率至少為0.8克碳/升/小時。
14.權(quán)利要求9至13中任一項所述的發(fā)酵方法，其中為培養(yǎng)步驟提供包含由以下組成之碳源的給料液: (a)—種或更多種纖維素酶誘導(dǎo)性碳水化合物； (b)一種或更多種來自于半纖維素的碳水化合物； (C) 一種或更多種非誘導(dǎo)性碳水化合物； (d)(a)和(b)的混合物； (e)(a)和(C)的混合物； (f)(b)和(C)的混合物；或 (g)(a)、(b)和(C)的混合物。
15.權(quán)利要求14所述的發(fā)酵方法，其中 (a)所述纖維素酶誘導(dǎo)性碳水化合物選自:纖維素、乳糖、纖維二糖、槐糖、龍膽二糖，及其組合； (b)所述來自于半纖維素的碳水化合物選自:木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、D-木糖、木二糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖，及其組合；以及 (c)所述非誘導(dǎo)性碳水化合物選自:葡萄糖、右旋糖、蔗糖、糖蜜、果糖、甘油、一種或更多種有機(jī)酸，及其任意組合。
16.用于水解生物質(zhì)底物的方法，其包括將所述底物與由權(quán)利要求9至15中任一項所述的發(fā)酵方法產(chǎn)生的生物質(zhì)降解酶接觸。
17.用于水解生物質(zhì)底物的方法，其包括將所述底物與由權(quán)利要求1至8中任一項所述的真菌細(xì)胞產(chǎn)生的生物質(zhì)降解酶接觸。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述底物為木素纖維素。
19.能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的分離的真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞與所述分離的細(xì)胞所來自于的親本真菌細(xì)胞相比，表現(xiàn)出多核苷酸的拷貝數(shù)或表達(dá)提高，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下任一種雜交:(i)SEQ ID NO:2的多肽編碼序列，(ii)包括SEQ ID NO:2之多肽編碼序列的基因組DNA序列，以及(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈，其中高嚴(yán)格條件為在5XSSPE、0.3% SDS、200y g/mL經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA、以及50%甲酰胺中在42°C下預(yù)雜交和雜交12至24小時，雜交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分鐘。
20.能夠產(chǎn)生一種或更多種生物質(zhì)降解酶的分離的真菌細(xì)胞，其與所述分離的真菌細(xì)胞所來自于的親本真菌細(xì)胞相比，包含多核苷酸的拷貝數(shù)或表達(dá)降低，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下任一種雜交:(i) SEQ ID NO:2的多肽編碼序列，(ii)包含SEQ IDNO:2之多肽編碼序 列的基因組DNA序列，以及(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈，其中高嚴(yán)格條件為在5XSSPE、0.3%SDS、200y g/mL經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA、以及50%甲酰胺中在42°C下預(yù)雜交和雜交12至24小時，雜交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分鐘。
【文檔編號】C12N9/14GK103987838SQ201280061415
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月14日
【發(fā)明者】菲利普·J·迪弗雷納, 亞當(dāng)·H·科爾維爾, 芭芭拉·弗呂祖克, 洛雷塔·古迪奈特-薩維奇, 克里斯托弗·M·D·欣德勒, 博古斯瓦夫·普洛赫, 約翰·J·托馬舍克 申請人:艾歐基能源公司