用于干細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了用于細(xì)胞生長(zhǎng)、維持和誘導(dǎo)回復(fù)至較不成熟狀態(tài)的包含MUC1*激活配體的細(xì)胞培養(yǎng)基。
【專利說明】用于干細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)的培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本申請(qǐng)還涉及用于誘導(dǎo)成熟細(xì)胞或體細(xì)胞回復(fù)(revert)至較不成熟狀態(tài)(lessmature state)的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞療法持有不僅能夠治療而且能夠治愈許多后天疾病、可遺傳癥狀以及創(chuàng)傷損傷后果的前景。然而，在干細(xì)胞療法的前景能夠變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)之前，在目前的科學(xué)知識(shí)以及需要克服的技術(shù)和監(jiān)管障礙中存在許多差距。首要問題涉及監(jiān)管問題。FDA將施加方針政策以確保在針對(duì)傳統(tǒng)藥物需要的那些之后期望被模型化的患者安全和產(chǎn)品再現(xiàn)性。這將意味著將需要從第I天使用確定的、可以計(jì)量的試劑并且在可再現(xiàn)性條件下生成開始作為干細(xì)胞的任何治療細(xì)胞。在干細(xì)胞衍生的細(xì)胞用于治療的情況下，這已經(jīng)不可能。傳統(tǒng)上，使用大量不確定組分的復(fù)雜混合物，人胚胎干(ES)細(xì)胞以及人誘導(dǎo)多能性干(iPS)細(xì)胞已經(jīng)體外繁殖。盡管也已經(jīng)使用人類飼養(yǎng)細(xì)胞，現(xiàn)行方法仍是在通常為鼠源(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞:MEF)的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)ES和iPS細(xì)胞。許多人認(rèn)為使用來自另一物種的細(xì)胞是不安全的。除了不同動(dòng)物物種的問題之外，需要飼養(yǎng)細(xì)胞層將另一非再現(xiàn)性層引入系統(tǒng)；干細(xì)胞的生長(zhǎng)需要由成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的因子。這些需要的因子尚未確定或量化。在遠(yuǎn)離使用飼養(yǎng)細(xì)胞的嘗試中，干細(xì)胞已經(jīng)在基質(zhì)膠層上生長(zhǎng)，所述基質(zhì)膠層是獲得自小鼠肉瘤細(xì)胞的未確定和不可量化因子的混合物。然而，只有加入來自飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，干細(xì)胞才能夠在基質(zhì)膠層上生長(zhǎng)。因此，基質(zhì)膠方法不能提供用于產(chǎn)生細(xì)胞的確定條件。
[0003] 通常已知的能夠使人類干細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF，也稱為FGF-2或簡(jiǎn)單的FGF)。在開發(fā)能夠滿足針對(duì)人類干細(xì)胞治療的期望的FDA監(jiān)管的干細(xì)胞生長(zhǎng)條件的努力中，近來的研究文章報(bào)導(dǎo)使用稱為“ES”且不包含動(dòng)物組分但包含極高水平的bFGF(與標(biāo)準(zhǔn)4 ng/mL相比的100 ng/mL)加TGF-β的確定的培養(yǎng)基，人胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。該培養(yǎng)基和所有其他基于FGF的培養(yǎng)基的主要問題在于稱為“基”態(tài)或“原始(naive) ”態(tài)細(xì)胞的真正多能性干細(xì)胞在FGF中不穩(wěn)定(J.Hanna, A.ff.Cheng, K.Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A107 (20), 9222 (2010), JacobH.Hanna, Krishanu Saha, and Rudolf Jaenisch, Celll43(4), 508(2010),J.NicholsandA.Smith, Cell Stem Cell4 (6)，487 (2009))。這些報(bào)導(dǎo)總結(jié):使用FGF或bFGF驅(qū)動(dòng)人類干細(xì)胞從原始狀態(tài)進(jìn)入“致敏(始發(fā)，primed)”狀態(tài)?！爸旅簟笔钦`稱。盡管致敏干細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行了一定程度的分化，然而這不會(huì)“致敏”它們或設(shè)置它們以分化成功能的人細(xì)胞。與此相反的是正確的。目前，科學(xué)研究表明致敏干細(xì)胞不能夠分化成針對(duì)使用干細(xì)胞用于大多數(shù)(如果不是所有)治療應(yīng)用需要的人體內(nèi)的任何細(xì)胞(FGF信號(hào)抑制人胚胎干細(xì)胞中的神經(jīng)誘導(dǎo)° Boris Greber, Philippe Coulon, Miao Zhang, Soren Moritz, Stefan Frank, ArnoldoJose MuIler—MoI ina, Marcos J Arauzo-Bravo, Dong Wook Han, Hans-Christian Pape andHans RScholer0 EMBO期刊(2011)30,4874-4884)。例如，F(xiàn)GF生長(zhǎng)干細(xì)胞不能夠分化成針對(duì)治療神經(jīng)變性疾病如Parkinson' s或Alzheimer' s或治療外傷性脊髓損傷需要的所有類型的神經(jīng)元細(xì)胞。此外，研究者還不能夠使人類干細(xì)胞以協(xié)調(diào)方式分化，因此，它們隨機(jī)分化為許多細(xì)胞類型而用于療法，人類想要針對(duì)那種治療需要的單一類型的細(xì)胞。由于小鼠干細(xì)胞處于原始狀態(tài)，當(dāng)使用它們工作時(shí)研究者沒有這些問題。ES培養(yǎng)基的另一問題是不被認(rèn)為是生理相關(guān)的bFGF和TGF-β的異常高水平，因此，引起質(zhì)疑的是生長(zhǎng)因子的這些不自然的高水平是否將會(huì)引起另外的無法預(yù)料的問題。
[0004]總之，對(duì)于致敏和原始或基態(tài)干細(xì)胞之間的區(qū)別的近期研究的主體概括為FGF不是使得真正多能性人類干細(xì)胞生長(zhǎng)的天然生長(zhǎng)因子。在FGF存在下，不能夠維持處于真正多能性狀態(tài)(基態(tài)或原始態(tài))的人類干細(xì)胞的事實(shí)表明在本領(lǐng)域中存在鑒別和使用支持真正的多能性人類原始干細(xì)胞生長(zhǎng)的真正的生長(zhǎng)因子用于產(chǎn)生或維持用于人類治療法的人類干細(xì)胞的需要。用于原始干細(xì)胞的真正生長(zhǎng)因子應(yīng)該能夠在多種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下起作用，包括期望藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求的那些。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在一個(gè)方面，本發(fā)明旨在用于細(xì)胞生長(zhǎng)、維持和誘導(dǎo)回復(fù)至較不成熟狀態(tài)且包含MUC1*激活配體(activating ligand)的細(xì)胞培養(yǎng)基。在其中期望細(xì)胞增殖而不發(fā)生分化的情況下，細(xì)胞可以 是干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或細(xì)胞可以是體細(xì)胞、成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中期望成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞被誘導(dǎo)為多能性細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞可以是人細(xì)胞。優(yōu)選地，培養(yǎng)基可以不含bFGF、TGF-13、或兩者。進(jìn)一步地，在另一個(gè)方面，培養(yǎng)基可以不含血清。培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含胰島素、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-抗壞血酸或非必需氨基酸。
[0006]在另一個(gè)方面，MUC1*配體可以是NME家族蛋白。優(yōu)選地，NME家族蛋白可以是NMEl0 NMEl可以以二聚或設(shè)計(jì)(engineer)為具有兩個(gè)亞基(subunit)的單鏈的兩種單體存在?？商鎿Q地，NME家族蛋白可以是NME7或NME6。
[0007]在另一個(gè)方面，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含rho相關(guān)激酶抑制劑。細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含鳥嘌呤交換因子抑制劑。鳥嘌呤交換因子抑制劑可以是六聚體形式的NMEl或獲得自(衍生自)NME1的肽。
[0008]在進(jìn)一步的其他方面，細(xì)胞培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含其他生長(zhǎng)因子，如但不限于FGF-2 或 TGF- β。
[0009]在另一個(gè)方面，本發(fā)明旨在包括使細(xì)胞與NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細(xì)胞或祖細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞回復(fù)至較不成熟狀態(tài)的方法。
[0010]在該方法中，在其中期望細(xì)胞增殖而不發(fā)生分化的情況下，細(xì)胞可以是干細(xì)胞或祖細(xì)胞，或細(xì)胞可以是體細(xì)胞、成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中期望成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞被誘導(dǎo)為多能性。優(yōu)選地，細(xì)胞可以是人細(xì)胞。優(yōu)選地，培養(yǎng)基可以不含bFGF、TGF-β、或兩者。進(jìn)一步地，在另一個(gè)方面，培養(yǎng)基可以不含血清。培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含胰島素、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-抗壞血酸或非必需氨基酸。
[0011]優(yōu)選地，NME家族蛋白可以是NMEl。NMEl可以以二聚或設(shè)計(jì)為具有兩個(gè)亞基的單鏈的兩種單體存在。可替換地，NME家族蛋白可以是ΝΜΕ7或ΝΜΕ6。
[0012]在本發(fā)明方法的另一個(gè)方面，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含rho相關(guān)激酶抑制劑。細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含鳥嘌呤交換因子抑制劑。鳥嘌呤交換因子抑制劑可以是六聚體形式的NMEl或獲得自NMEl的肽。在進(jìn)一步的其他方面，細(xì)胞培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含其他生長(zhǎng)因子，如但不限于FGF-2或TGF- β。
[0013]在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及NME家族蛋白加上用于生長(zhǎng)或維持干細(xì)胞或誘導(dǎo)為成熟細(xì)胞多能性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和非必需氨基酸的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0014]在另一個(gè)方面，本發(fā)明旨在包括使細(xì)胞與處于無血清最小培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基，minimal media)的NME家族蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細(xì)胞或祖細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞回復(fù)至較不成熟狀態(tài)的方法。
[0015]在又一個(gè)方面，本發(fā)明旨在包含干細(xì)胞群的組合物，其中，組合物進(jìn)一步包含含有NME家族蛋白的無血清培養(yǎng)基。
[0016]在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在其上是結(jié)合至祖細(xì)胞或干細(xì)胞的配體的表面上生長(zhǎng)干細(xì)胞的方法，包括使細(xì)胞與包含NME家族蛋白的培養(yǎng)基接觸。
[0017]在另一個(gè)方面，本發(fā)明旨在制造原始干細(xì)胞的純?nèi)后w(pure population)的方法，包括:(i)使細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的單集落(single colony) ； (ii)分離原始干細(xì)胞的單集落；以及(iii)使集落與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的純?nèi)后w。在以上步驟(i)中，可以獲得約25%至60%、或30%至50%的原始狀態(tài)的細(xì)胞。在以上方法中，在步驟(iii)中，原始干細(xì)胞群體的純度可以是至少約80%、90%、99%或100%。
[0018]在另一個(gè)方面，本發(fā)明旨在由誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞制造原始干細(xì)胞的純?nèi)后w的方法，包括:(i)使成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的單集落；(ii)分離原始干細(xì)胞的單集落；以及(iii)使群體與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的純?nèi)后w。步驟(i)中成熟細(xì)胞可以用多能性基因轉(zhuǎn)染。成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞可以是體細(xì)胞、成真皮細(xì)胞(dermablast)或成纖維細(xì)胞。在以上步驟(i)中，可以獲得約25%至60%、或30%至50%的原始狀態(tài)的細(xì)胞。在以上方法中，在步驟
(iii)中，原始干細(xì)胞群體的純度可以是至少約80%、90%、95%、99%或100%。
[0019]在一個(gè)方面，細(xì)胞培養(yǎng)基和使用以上指出的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法可以包括含具有約25kDa或約30kDa的分子量的NME7的細(xì)胞培養(yǎng)基。NME7蛋白可以是NME7-AB。細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含rho相關(guān)激酶抑制劑、在PI3K或RAC通路中并且優(yōu)選不存在rho激酶抑制劑下的信號(hào)蛋白的激活劑。或，細(xì)胞培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含抑制NMEl或NME2表達(dá)的核酸。
[0020]在又一個(gè)方面，本發(fā)明旨在產(chǎn)生人胚胎干細(xì)胞系的方法，包括:(i)使獲得自胚泡的細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸；(ii)分離具有干細(xì)胞樣(stem-like)形態(tài)的長(zhǎng)出物(outgrowth) ；(iii)使分離的長(zhǎng)出物與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸；以及(iv)以及分離具有期望核型以及表明細(xì)胞是多能性的多能性基因和原始基因(na'ivegene)的表達(dá)水平(express level)的克隆。在該方法中,NME家族成員可以是NME7。NME7可以是NME7-AB。優(yōu)選地，包含NME家族成員的培養(yǎng)基可以不含F(xiàn)GF。以上方法可以包括抑制細(xì)胞中的NMEl和NME2的步驟。
[0021] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明旨在產(chǎn)生人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞系的方法，包括:(i)使獲得自供體或患者的細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸；(ii)使細(xì)胞與誘導(dǎo)表達(dá)多能性基因0CT4、S0X2、NANOG, KLF4、c-Myc或LIN28的試劑接觸；(iii)分離具有干細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞；(iv)使分離的細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸；(V)分離具有期望的核型以及表明細(xì)胞是多能性的多能性基因的表達(dá)水平的克隆(克隆，clone);以及(vi)以及在包含NME家族成員的培養(yǎng)基中繁殖克隆。在該方法中，NME家族成員可以是NME7。NME7可以是NME7-AB。包含NME家族成員的培養(yǎng)基優(yōu)選不包含F(xiàn)GF。以上方法可以包括抑制細(xì)胞中的NMEl和NME2的步驟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]由本文中以下給出的詳細(xì)描述以及僅通過說明給出而并非限制本發(fā)明的附圖，將更充分地理解本發(fā)明，并且，其中:
[0023]圖1示出了在匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑，Y27632的最小(基本，minimal)干細(xì)胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的完全融合(匯合，confluent)的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0024]圖2示出了在匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑，Y27632的最小干細(xì)胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0025]圖3示出了具有bFGF、來自人類飼養(yǎng)細(xì)胞的50%條件培養(yǎng)基、HS27，加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小干細(xì)胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的完全融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0026]圖4示出了具有bFGF、來自人類飼養(yǎng)細(xì)胞的50%條件培養(yǎng)基、HS27，而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小干細(xì)胞培養(yǎng)基“MM”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0027]圖5示出了具有匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的完全確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基(completely defined stem cellmedia) “MN6”中培養(yǎng)的融合的未分化人類干細(xì)胞放大的照相圖像。
[0028]圖6示出了具有匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的完全確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基“MN6”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0029]圖7示出了具有匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子加上如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小的完全確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基“MN2”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0030]圖8示出了具有匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小的完全確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基“MN2”中培養(yǎng)的較差連接并分化的人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0031]圖9示出了為MN6加100ng/mL下的bFGF和TGF-β加如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的完全確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基“E8”中培養(yǎng)的部分融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0032]圖10示出了為MN6加100ng/mL下的bFGF和TGF- β而不存在如描述的玻連蛋白表面上的Rho激酶 抑制劑Υ27632的完全確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基“Ε8”中培養(yǎng)的較差連接且分化的人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0033]圖11A-11D示出了均具有匪23作為唯一的生長(zhǎng)因子加抗-MUC1*抗體表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的最小干細(xì)胞培養(yǎng)基“MM”、A、C或MN6培養(yǎng)基B、D中培養(yǎng)的完全融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0034]圖12A-12D示出了具有均具有抗-MUC1*抗體表面上的Rho激酶抑制劑Y27632的匪23B、D的mTeSRA、C或MN6培養(yǎng)基中培養(yǎng)的完全融合的未分化人類干細(xì)胞的放大的照相圖像。
[0035]圖13A-13D示出了與飼養(yǎng)細(xì)胞、基質(zhì)膠(Matrigel)、玻連蛋白或抗-MUC1*涂覆的表面上的基于NME的培養(yǎng)基相比,用于基于FGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞的多能性基因以及原始和致敏(始發(fā)態(tài)，primed)基因的RT-PCR測(cè)量結(jié)果的曲線圖。
[0036]圖14A-D示出了其中來自人類 干細(xì)胞和癌細(xì)胞的NME7結(jié)合至具有PSMGFR肽序列的合成肽的拉下試驗(yàn)(pull-down assay)的蛋白質(zhì)印跡。
[0037]圖15是以二價(jià)或一價(jià)抗體濃度的函數(shù)測(cè)定的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的曲線圖，表明刺激生長(zhǎng)的MUC1*受體的二聚。MUCl陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的生長(zhǎng)通過加入二價(jià)(Ab)抗-MUC1*刺激并且通過加入一價(jià)Fab抑制。二價(jià)抗體的加入產(chǎn)生表明生長(zhǎng)因子受體二聚化的特征鐘形生長(zhǎng)曲線。MUCl陰性HEK 293細(xì)胞的生長(zhǎng)不受二價(jià)或一價(jià)Fab抗-MUC1*的影響。當(dāng)過量加入二價(jià)抗體時(shí)，存在結(jié)合至每一個(gè)受體的一個(gè)二價(jià)抗體而不是二聚每?jī)蓚€(gè)受體的一個(gè)二價(jià)抗體，從而抑制生長(zhǎng)。
[0038]圖16示出了 FPLC跡線的疊加(overlay)，其表征野生型NM23 (WT)或突變體匪23-S120G的三種不同制劑的不同多聚化狀態(tài)。野生型匪23示出了相應(yīng)于六聚體的分子量的單峰和相應(yīng)于較高階多聚體的肩(shoulder)。沒有復(fù)性(再折疊)的匪23-S120G(標(biāo)記為“混合的”)的一種制劑具有相應(yīng)于二聚體的主峰和四聚體的次峰。也沒有復(fù)性的匪23-S120G( “六聚體”)的另一種制劑具有具備較高階多聚體的肩的六聚體的主峰。NM23-S120G( “二聚體”)的復(fù)性制劑主要由二聚體組成。
[0039]圖17A 示出了 NM23-WT、混合的 NM23-S120G、NM23-S120G-六聚體和匪23-S120G- 二聚體的非還原性凝膠的照片，示出了野生型蛋白和S120G突變體的三種不同制劑的多聚化狀態(tài)。圖17B示出了結(jié)合連接至SPR芯片表面的MUC1*胞外結(jié)構(gòu)域肽(PSMGFR)的不同的匪23多聚體的表面等離子體共振(SPR)測(cè)量結(jié)果。圖17C示出了表明僅匪23 二聚體結(jié)合至同源受體MUC1*的納米顆粒實(shí)驗(yàn)的照片。MUC1*胞外結(jié)構(gòu)域肽固定在金納米顆粒上。圖17D-G示出了針對(duì)它們支持多能性干細(xì)胞生長(zhǎng)的能力測(cè)試的不同匪23-H1多聚體。
[0040]圖18示出了表明匪23-WT的多聚化狀態(tài)對(duì)重組NM23-S120G的三種不同制劑的天然非變性凝膠。
[0041]圖19示出了 A)NM23野生型(WT)和B)產(chǎn)生60%二聚體的“混合”NM23-S120G的制劑的SPR測(cè)量結(jié)果。
[0042]圖20示出了基質(zhì)膠(a、b、d、e)以及用抗-MUC1*抗體、MN_C3 (C、f)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)板上的最小干細(xì)胞培養(yǎng)基中的8nM的匪23變體中培養(yǎng)的人類ES細(xì)胞、BGOlv/hOG系的照片，(a-c)變體是P96SAC2，(d_f)變體是P96SAC6。這些變體不能復(fù)性或純化，表明在使用之前它們不需要復(fù)性或純化。
[0043]圖21示出了 NM23-S120G(復(fù)性的，“RS”)的主要群體以FPLC跡線(a)中示出并且通過非還原PAGE (b)驗(yàn)證的二聚體存在。混合并且以8nM在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基下使用僅通過FPLC純化部分的二聚體以生長(zhǎng)人ES細(xì)胞、BGOlv/hOG系。人類干細(xì)胞的(c_e)照片示出:在8nM的匪23變體中培養(yǎng)，是否在基質(zhì)膠(c、f)或在用抗-MUC1*抗體、麗-C3 (e)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)基板上產(chǎn)生多能性干細(xì)胞。
[0044]圖22示出已經(jīng)在用m LIF或NM23-S120G-RS補(bǔ)充的小鼠ES細(xì)胞最小培養(yǎng)基中的失活的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)兩天的小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。圖像表明在具有mLIF作為堿性生長(zhǎng)因子的標(biāo)準(zhǔn)小鼠干細(xì)胞培養(yǎng)基中小鼠ES細(xì)胞與使用匪23 二聚體作為唯一的生長(zhǎng)因子一樣生長(zhǎng)。
[0045]圖23示出檢測(cè)匪23-S120G 二聚體中培養(yǎng)、MEF上的bFGF中培養(yǎng)的人類干細(xì)胞或人類乳腺癌細(xì)胞中NME1(A、D)、NME6(B、E)或NME7(C、F)的存在或MUC1*拉下試驗(yàn)中的NME同種型的存在的蛋白質(zhì)印跡的照片。
[0046]圖24示出了針對(duì)NME7特異性的抗體所探測(cè)的人胚胎干細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡的照片。
[0047]圖25示出了在大腸桿菌中表達(dá)的NME7-1⑷和NME7-2⑶的SDS-PAGE的照片。
[0048]圖25.1是來自NME7-1和NME7-2表達(dá)并且通過NTA-Ni柱純化的非還原SDS-PAGE凝膠，表明在~40kDa的期望分子量下有很少或沒有蛋白表達(dá)。
[0049]圖25.2是通 過NTA-Ni柱的NME7-1和NME7-2純化的洗脫物的蛋白質(zhì)印跡，表明在~40kDa的期望分子量下有一些NME7-1和NME7-2表達(dá)。
[0050]圖26是來自NME7-AB和NME7-A表達(dá)并且通過NTA-Ni柱純化的非還原SDS-PAGE凝膠，表明對(duì)于NME7-AB在~30kDa的期望分子量下有良好表達(dá)(A)，但對(duì)于NME7-A在~14kDa的期望分子量下沒有良好表達(dá)(B)。
[0051]圖27 (A)是NME7-AB的尺寸排阻色譜法純化的洗脫曲線；⑶是來自NME7-AB峰部分的非還原SDS-PAGE凝膠；(C)是純化的NME7-AB的尺寸排阻色譜法的洗脫曲線。
[0052]圖28A-28D是涂板后(接種后，post-plating) I天的重組NME7-AB或重組匪23 (NMEl)純化二聚體中培養(yǎng)的人類iPS干細(xì)胞的放大的照片。
[0053]圖29A-29D是涂板后2天的重組NME7-AB或重組匪23 (NMEl)純化二聚體中培養(yǎng)的人類iPS干細(xì)胞的放大的照片。
[0054]圖30A-30D是涂板后3天的重組NME7-AB或重組匪23 (NMEl)純化二聚體中培養(yǎng)的人類iPS干細(xì)胞的放大的照片。
[0055]圖31A-31G示出了在基于FGF的培養(yǎng)基或基于NME的培養(yǎng)基中進(jìn)行多能性誘導(dǎo)的體細(xì)胞的曲線圖和照片。A-C是示出多能性誘導(dǎo)過程的第4天和第20天下的多能性標(biāo)記的RT-PCR測(cè)量結(jié)果的曲線圖。D-G示出了使用利用標(biāo)準(zhǔn)FGF培養(yǎng)基或省去一個(gè)多能性基因并且在NMEl 二聚體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法將代表性細(xì)胞誘導(dǎo)至多能性的共焦顯微鏡圖像的照片。
[0056]圖32A-32E示出了由癌細(xì)胞和干細(xì)胞的MUC1*拉下試驗(yàn)導(dǎo)致的蛋白質(zhì)印跡，其中，用針對(duì)NME1、NME6和NME7的抗體探測(cè)由MUC1*抗體拉下(pull down)的物種。
[0057]圖33A-33C示出了納米顆粒結(jié)合試驗(yàn)的照片，其中，將MUC1*胞外結(jié)構(gòu)域肽固定至SAM涂覆的納米顆粒上并且將NME蛋白以游離態(tài)添加至溶液中。由粉紅色至藍(lán)色的顏色變化表明溶液中的游離蛋白能夠同時(shí)結(jié)合至兩種不同納米顆粒的兩種肽上。
[0058]圖34A-34F示出了在標(biāo)準(zhǔn)FGF培養(yǎng)基或NME7培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后針對(duì)DAP1、0CT4和H3K27me3染色(如果細(xì)胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時(shí)，其染色在細(xì)胞核(紅點(diǎn))中濃縮的組蛋白-3)的人胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。
[0059]圖35示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后針對(duì)DAP1、0CT4和H3K27me3(如果細(xì)胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時(shí)，其染色在細(xì)胞核(紅點(diǎn))中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。
[0060]圖36A-36H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后針對(duì)DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細(xì)胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時(shí)，其染色在細(xì)胞核(紅點(diǎn))中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。
[0061]圖37A-37D示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后針對(duì)DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細(xì)胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時(shí)，其染色在細(xì)胞核(紅點(diǎn))中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。
[0062]圖38A-38H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后針對(duì)DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細(xì)胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時(shí)，其染色在細(xì)胞核(紅點(diǎn))中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。
[0063]圖39A-39H示出了在NME1(NM23-S120G 二聚體)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后針對(duì)DAP1、0CT4和H3K27me3 (如果細(xì)胞具有表明其不再是完全原始態(tài)的失活X染色體時(shí)，其染色在細(xì)胞核(紅點(diǎn))中濃縮的組蛋白-3)染色的人胚胎干(ES)細(xì)胞的照片。
[0064]圖40示出了前X染色體失活(pre-X-1nactivation)作為傳代數(shù)和細(xì)胞是否在NMEl或NME7中培養(yǎng)的函數(shù)的自動(dòng)計(jì)數(shù)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的條形圖。
[0065]圖41A示出了來自其中起于1，000,3, 000或5，000單個(gè)接種細(xì)胞的離散群體用表明在基于NME的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞具有~20%的克隆效率的堿性磷酸酶染色的克隆效率(克隆效率，cloning efficiency)試驗(yàn)的人胚胎干細(xì)胞的照片。
[0066]圖41B示出了來自其中起于1，000,3, 000或5，000單個(gè)接種細(xì)胞的離散群體用表明在基于FGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞具有~I %的克隆效率的堿性磷酸酶染色的克隆效率試驗(yàn)的人胚胎干細(xì)胞的照片。
[0067]圖41C示出了用于克隆效率試驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的表格。
[0068]圖42示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NMEl 二聚體(“^23-RS”)中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第2天的照片(4X)。
[0069]圖43示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NMEl 二聚體(“^23-RS”)中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第2天的照片(IOX)。
[0070]圖44示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第2天的照片(4X)。
[0071] 圖45示出了用抗-MUC1*抗體(MN-C3或MN-C8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第2天的照片(IOX)。
[0072]圖46示出了用基質(zhì)膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第2天的照片(4X)。
[0073]圖47示出了用基質(zhì)膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第2天的照片(IOX)。
[0074]圖48示出了用基質(zhì)膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人類iPS細(xì)胞第4天的照片(IOX)。
[0075]圖49示出了用基質(zhì)膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人胚胎干(ES)細(xì)胞第3天的照片(IOX)。
[0076]圖50示出了用基質(zhì)膠涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在最小干細(xì)胞培養(yǎng)基(MM)或甚至更小的稱為MN6的培養(yǎng)基中的NMEl 二聚體(“^23-RS”)中培養(yǎng)的6孔組織培養(yǎng)板上接種的人胚胎干(ES)細(xì)胞第3天的照片(10X)。
[0077]圖51示出了在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，用于接種在基于FGF的培養(yǎng)基(MM或E8中的標(biāo)準(zhǔn)bFGF)、或添加至MM培養(yǎng)基的NME7、或MN6培養(yǎng)基中培養(yǎng)的基質(zhì)膠上的干細(xì)胞的多能性基因以及原始和致敏(primed)基因的RT-PCR測(cè)量結(jié)果的曲線圖。
[0078]圖52示出了用于接種在用識(shí)別MUC1*胞外結(jié)構(gòu)域(MN-C3)的抗體涂覆并且在向其加入匪23 二聚體(NME1 S120G 二聚體)或NME 7的麗最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)的塑料制品(plasticware)上的人胚胎干細(xì)胞的原始和致敏基因的RT-PCR測(cè)量結(jié)果的曲線圖。
[0079]圖53示出了用于接種在用抗-MUC1*抗體(C3)、MEF飼養(yǎng)細(xì)胞涂覆的塑料制品或基質(zhì)膠上的人類ES細(xì)胞的多能性基因以及原始和致敏基因的RT-PCR測(cè)量結(jié)果的曲線圖。在最小培養(yǎng)基(MM)加NM23 (NMEI 二聚體)或NME7-AB中培養(yǎng)VITA/C3抗體表面上的細(xì)胞。在MM加FGF中培養(yǎng)通過MEF接種的細(xì)胞。在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在MM培養(yǎng)基或MN6培養(yǎng)基中的NME7中培養(yǎng)基質(zhì)膠上的細(xì)胞用于單次傳代。
[0080]圖54示出了用于接種在用抗-MUC1*抗體(C3)、MEF飼養(yǎng)細(xì)胞涂覆的塑料制品或基質(zhì)膠上的人類ES細(xì)胞的多能性基因以及原始和致敏基因的RT-PCR測(cè)量結(jié)果的曲線圖。在最小培養(yǎng)基(MM)加NM23 (NMEI 二聚體)或NME7-AB中培養(yǎng)VITA/C3抗體表面上的細(xì)胞。在MM加FGF中培養(yǎng)通過MEF接種的細(xì)胞。在存在或不存在rho激酶抑制劑(ROCi)的情況下，在MM培養(yǎng)基或MN6培養(yǎng)基中的匪23 (NMEI 二聚體)中培養(yǎng)基質(zhì)膠上的細(xì)胞用于單次傳代。
[0081]圖55A-55C示出了表明NME7物種在干細(xì)胞溶解產(chǎn)物(A、C)和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(B)中表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡的照片。
[0082]圖56示出了探測(cè)其中一些0CT4、NME1、NME6或NME7被抑制而細(xì)胞在包含NME7的培養(yǎng)基中被培養(yǎng)的人類干細(xì)胞中的NME7物種的蛋白質(zhì)印跡的照片。
[0083]圖57示出了其中由NME7拉下試驗(yàn)獲得的蛋白質(zhì)在凝膠、離體帶上分離并且通過質(zhì)譜分析的SDS-PAGE凝膠的照片。質(zhì)譜表明由NME7抗體拉下的低分子量(~23kDa)物種也是NME7，但是NME7物種中的肽序列均映射至NME7的NDPK A結(jié)構(gòu)域。
[0084]圖58示出了來自表明NME7-AB使MUCI*胞外結(jié)構(gòu)域肽二聚化的ELISA夾心式試驗(yàn)的HRP信號(hào)的曲線圖。
[0085]圖59A-59B示出了表明NME6在大腸桿菌中表達(dá)和純化的SDS-PAGE凝膠的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0086]定義
[0087]主要通過PSMGFR 序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQID NO:6))定義MUC1*胞外結(jié)構(gòu)域。由于MUCl裂解的確切部位取決于修剪其的酶，并且裂解酶根據(jù)細(xì)胞類型、組織類型或細(xì)胞進(jìn)化的時(shí)間變化，MUC1*胞外結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)確序列可以在
N-端變化。
[0088]為數(shù)1-10個(gè)的NME家族蛋白是由于它們均具有至少一個(gè)NDPK (核苷二磷酸激酶)結(jié)構(gòu)域而分組在一起的蛋白。在一些情況下，NDPK結(jié)構(gòu)域在能夠催化ATP轉(zhuǎn)化為ADP方面不起作用。NME蛋白被正式稱為匪23蛋白、編號(hào)H1、H2等。在此，術(shù)語(yǔ)匪23和NME可互換。在此，術(shù)語(yǔ)NMEl、NME2、NME6和NME7用于指原始蛋白以及NME變體(變異體)。在一些情況下，這些變體在大腸桿菌中更易溶解、表達(dá)更好或比原始序列蛋白更易溶解。例如，如在說明書中使用的NME7可以指原始蛋白或變體，如由于變異使得可溶解、適當(dāng)復(fù)性的蛋白在大腸桿菌中高產(chǎn)率表達(dá)的具有優(yōu)越的商業(yè)應(yīng)用的NME7-AB。如本文中論及的“NME1”可與“匪23-H1”互換。還預(yù)期的是本發(fā)明不受限于NME蛋白的確切序列。貫穿本申請(qǐng)，可互換地使用也稱為匪23-S120G的突變體NME1-S120G。由于它們對(duì)于二聚體(但本文中可論及的是作為匪23 二聚體或NMEl 二聚體)形成的優(yōu)先性，優(yōu)選S120G突變體和P96S突變體。
[0089]如在本文中所論及的NME7旨在指原始NME7或增加產(chǎn)率、可溶解性或使得NME7更有效或商業(yè)更可行的其他性能的變體。
[0090]如在本文中使用的，F(xiàn)GF、FGF_2、或bFGF是指成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0091] 如在本文中使用的，Rho相關(guān)激酶抑制劑可以是小分子肽或蛋白(Rath N，OlsonMF.Rho-associated kinases in tumorigenesis: re-considering ROCK inhibition forcancer therapy.EMBO Rep.2012 ；13(10):900-8)。rho 相關(guān)激酶抑制劑的實(shí)例是 Y27632、HA-1077 (也稱為法舒地爾)、H-1152 和 thiazovivin (Olson MF.(針對(duì) ROCK 激酶抑制劑的應(yīng)用)Application for ROCK kinase inhibition.Curr Opin Cell Biol.2008 ；20(2):242-8 ;Watanabe K，Ueno M，Kamiya D，et al.(ROCK 抑制劑允許相關(guān)人胚胎干細(xì)胞的生存)A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stemcells.Nat Bio techno 1.2007 ；25 (6): 681-6 ;Brei ten lechner C，Gassel M，Hidaka H，etal.Protein kinase A in complex with Rho-kinase inhibitors Y—27632，F(xiàn)asudil，andH-1152P:structural basis of selectivity.Structure.2003 ； 11 (12):1595-607 ；LinT，Ambasudhan R，Yuan X，et al.A chemical platform for improved induction of humaniPSCs.Nat Methods.2009 ；6(11):805-8)。除了 Rho激酶抑制劑之外，本發(fā)明想象使用代替Rho激酶抑制劑的相關(guān)路徑的抑制劑。例如，在相同路徑中，鳥嘌呤交換因子(GEF)是Rho激酶的上游。GEF活化Rho激酶。因此，代替使用rho激酶抑制劑，本發(fā)明想象使用GEF抑制劑。由于當(dāng)結(jié)合至GDP時(shí)，rho激酶處于失活狀態(tài)，可以使用增加存在于細(xì)胞如RAD、GEM、和RhoE以及其他中的GDP的量的任何試劑代替rho激酶抑制劑以幫助干細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和連接至它們所在位置處的表面(Riento K, Guasch RM, Garg R, Jin B, Ridley AJ (2003)(RhoE 結(jié)合至 ROCKI 并抑制下游信號(hào))RhoE binds to ROCKI and inhibits downstreamsignaling.Mol Cell Biol 23:4219-4229 ；Komander D, Garg R, Wan PT, Ridley AJ, BarfordD (2008)來自ROCK-1:RhoE復(fù)合物結(jié)構(gòu)的多位憐酸化機(jī)理(Mechanism of mult1-sitephosphorylation from a ROCK-1:RhoE complex structure).EMBO J27:3175-3185 ；ffardY, Yap SF, Ravichandran V, Matsumura F, Ito M, Spinelli B, Kelly K(2002)GTP 結(jié)合蛋白Gem 和 Rad 是 Rho-Rho 激酶路徑的隱性調(diào)節(jié)(The GTP binding proteins Gem and Rad arenegative regulators of the Rho-Rho kinase pathway).J Cell Biol 157:291-302)。肌球蛋白也處于與Rho激酶一樣的路徑中。肌球蛋白間接地由Rho激酶活化并且因此在相同路徑中作為Rho激酶的下游。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，也可以使用肌球蛋白抑制劑代替rho激酶抑制劑以幫助干細(xì)胞存活和/或幫助干細(xì)胞連接至表面。Blebbistatin是肌球蛋白抑制劑并且可以用于代替根據(jù)本發(fā)明的方法使用的任何rho激酶抑制劑(Ohgushi M, MatsumuraM, Eiraku M, Murakami K, Aramaki T, Nishiyama A, et al.負(fù)責(zé)人類多能性干細(xì)胞中的離解-誘導(dǎo)凋亡的分子路徑和細(xì)胞狀態(tài)(Molecular pathway and cell state responsiblefor dissociation-1nduced apoptosis in human pluripotent stem cells).Cell StemCell2010 ；7:225-39 ；Ohata H, Ishiguro T, Aihara Y, et al.通過 Rho 激酶抑制劑引入干細(xì)胞樣細(xì)胞調(diào)節(jié)劑⑶44有助于維持結(jié)腸癌癥起始細(xì)胞(Induction of the Stem-like CellRegulator CD44by Rho Kinase Inhibition Contributes to the Maintenance of ColonCancer-1nitiating Cells).Cancer Res.2012 ；72 (19): 5101-10)。
[0092]在此處和其他地方，Rho激酶抑制劑簡(jiǎn)稱為ROCi或ROCKi。具體的rho激酶抑制劑的使用旨在示例性的并且可以 替換為任何其他的rho激酶抑制劑。
[0093]序列表自由文本(sequence listing free text)
[0094]關(guān)于除a、g、c、t的核苷酸符號(hào)的使用，它們遵循WIPO標(biāo)準(zhǔn)ST.25，附錄2，表1中列出的規(guī)則，其中，k代表t或g ;n代表a、C、t、或g ；m代表a或c ;r代表a或g ;s代表c或g 代表a或t,并且Y代表c或t。
[0095]MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSATQRSSVPSSTE KNAVSMTSSVLSSHSPGSGS STTQGQDVTLAPATEPASGS AATffGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTSASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGffG IALLVLVCVLVALAIVYLIA LAVCQCRRKNYGQLDIFPAR DTYHPMSEYPTYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA
[0096]ASANL(SEQ ID NO:1)描述了全長(zhǎng)MUCl受體(粘蛋白I前體，Genbank登錄號(hào):P15941)。
[0097]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO:2)
[0098]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO: 3)
[0099]MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO: 4) [0100]SEQ ID NOS:2、3和4描述了用于將MUCl受體和截短的同種型指向細(xì)胞膜表面的N-端MUC-1信號(hào)序列。在由SEQ ID NOS:2、3和4中的變體指明的C-端可以缺失多達(dá)3個(gè)
氨基酸殘基。
[0101]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSRYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 5)描述了在其N-端具有nat-PSMGFR并且包括跨膜和全長(zhǎng)MUCl受體的細(xì)胞質(zhì)序列的截短MUCl受體同種型。
[0102]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)描述了 MUCl生長(zhǎng)因子受體(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的實(shí)例)的天然一級(jí)序列(primary sequence)。
[0103]TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:7)描述了 MUCl 生長(zhǎng)因子受體(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的實(shí)例)的天然一級(jí)序列，在SEQ ID NO:6的N-端具
有單一的氨基酸缺失。
[0104]GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:8)描述了具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的MUCl生長(zhǎng)因子受體(var-PSMGFR- “PSMGFR”的實(shí)例)的天然一級(jí)序列的“SPY”功能變體。
[0105]TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:9)描述了具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的MUCl生長(zhǎng)因子受體(var-PSMGFR- “PSMGFR”的實(shí)例)的天然一級(jí)序列的“SPY”功能變體，在SEQ ID NO: 8的C-端具有單一的氨基酸缺失。
[0106]tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQ IDNO: 10)描述了 MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域核苷酸序列。
[0107]CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO: 11)描述了 MUCl 細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。
[0108]Gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQ ID NO: 12)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7:GENBANKACCESSIONAB209049)。
[0109]DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO: 13)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7:GENBANK ACCESSION AB209049)。
[0110]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtcca ttctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO: 14)描述了 NM23-H1 核苷酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0111]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAlKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLffFHPEEL VDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO: 15)NM23-H1 描述了氨基酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0112]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO: 16)描述了 NM23-H1 S120G突變體核苷酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSIONAF487339)。
[0113]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHG⑶SVESAEKEIGLWFHPEEL VDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 17)描述了 NM23-H1 S120G 突變體氨基酸序列(NM23-H1:GENBANK ACCESSION AF487339)。
[0114]atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO: 18)描述了 NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2:GENBANK ACCESSIONAK313448)。
[0115]MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGE11KRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDffVYE(SEQ ID NO: 19)描述了 NM23-H2 氨基酸序列(NM23-H2:GENBANK ACCESSIONAK313448)。
[0116]最佳用于大腸桿菌表達(dá)的人匪23-H7-2序列。
[0117](DNA)
[0118]atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:20)
[0119](氨基酸)
[0120]MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAlRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:21)
[0121]人NME7-A:
[0122](DNA)
[0123]Atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO:22)
[0124](氨基酸)
[0125]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIΑΜΕ ILRDDAI CEffKRLLGPANSGVARTDASES IRALFGTDGIR NAAHGPDSFASAAREMELFF- (SEQ ID NO:23)
[0126]人NME7-A1:
[0127](DNA)
[0128]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQ IDNO:24)
[0129](氨基酸)
[0130]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR N A AHGPD SFAS A AREMELFFPS S GGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:25)
[0131]人NME7-A2:
[0132](DNA)
[0133]atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct tttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO: 26)
[0134](氨基酸)
[0135]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:27)
[0136]人NME7-A3:
[0137](DNA)
[0138] atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgt
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞生長(zhǎng)、維持和誘導(dǎo)回復(fù)至較不成熟狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)基，包含MUC1*激活配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述細(xì)胞是成熟細(xì)胞、體細(xì)胞或祖細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基不含bFGF、TGF-β、或兩者。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基不含血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含胰島素、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-抗壞血酸、或非必需氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述MUC1*配體是NME家族蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是NMEl。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，NMEl以二聚化或設(shè)計(jì)為具有兩個(gè)亞基的單鏈的兩種單體存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是ΝΜΕ7。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述ΝΜΕ7具有約25kDa或約30kDa的分子量。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是NME7-AB。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述NME家族蛋白是NME6。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)一步包含rho相關(guān)激酶抑制劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)一步包含在PI3K或RAC通路中并且不存在rho激酶抑制劑下的信號(hào)蛋白激活劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)一步包含抑制NMEl或NME2表達(dá)的核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)一步包含其他生長(zhǎng)因子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述其他生長(zhǎng)因子是FGF-2和/或TGF- β。
20.一種包括使細(xì)胞與含有NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細(xì)胞或祖細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞回復(fù)至較不成熟狀態(tài)的方法。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細(xì)胞是體細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基不含bFGF、TGF-β、或兩者。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基不含血清。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含胰島素、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-抗壞血酸、或非必需氨基酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NMEl。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，NMEl以二聚化或設(shè)計(jì)為具有兩個(gè)亞基的單鏈的兩種單體存在。
29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是ΝΜΕ7。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述ΝΜΕ7具有約25kDa或約30 kDa的分子量。
31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME7-AB。
32.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述NME家族蛋白是NME6。
33.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括胰島素、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-抗壞血酸，使用NaHCO3 調(diào)節(jié) pH。
34.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含rho激酶抑制劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含在PI3K或RAC通路中并且不存在rho激酶抑制劑下的信號(hào)蛋白激活劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含抑制NMEl或NME2表達(dá)的核酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含鳥嘌呤交換因子抑制劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述鳥嘌呤交換因子抑制劑是六聚體形式的NMEl0
39.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述鳥嘌呤交換因子抑制劑是獲得自NMEl的肽。
40.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含其他生長(zhǎng)因子。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述其他生長(zhǎng)因子是FGF-2和/或TGF-β。
42.一種細(xì)胞培養(yǎng)基，基本上由NME家族蛋白，加上用于生長(zhǎng)或維持干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和非必需氨基酸組成。
43.一種包括使細(xì)胞與基本上由NME家族蛋白組成的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以刺激干細(xì)胞或祖細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞回復(fù)至較不成熟狀態(tài)的方法。
44.一種包含干細(xì)胞群的組合物，其中，所述組合物進(jìn)一步包含含有NME家族蛋白的無血清培養(yǎng)基。
45.一種在其上是結(jié)合至祖細(xì)胞或干細(xì)胞的配體的表面上增殖干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，包括使所述細(xì)胞與包括NME家族蛋白的培養(yǎng)基接觸。
46.一種制造原始干細(xì)胞的純?nèi)后w的方法，包括: (i)使細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的單集落； (?)分離原始干細(xì)胞的所述單集落；以及 (iii)使所述集落與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的純?nèi)后w。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，在步驟⑴中，獲得約25%至60%的原始狀態(tài)的細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，獲得約30%至50%的所述原始狀態(tài)的細(xì)胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，在步驟(iii)中，所述原始干細(xì)胞群體的純度為至少約80%。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述原始干細(xì)胞群體的純度為至少約90%。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述原始干細(xì)胞群體的純度為至少約95%。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述原始干細(xì)胞群體的純度為至少約99%。
53.一種由誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞制造原始干細(xì)胞的純?nèi)后w的方法，包括: (i)使成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的單集落； (?)分離原始干細(xì)胞的所述單集落；以及 (iii)使所述集落與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸以獲得原始干細(xì)胞的純?nèi)后w。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，步驟(i)中，所述成熟細(xì)胞用多能性基因轉(zhuǎn)染。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述成熟細(xì)胞或祖細(xì)胞是體細(xì)胞、成真皮細(xì)胞、或成纖維細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，在步驟(i)中，獲得約25%至60%的原始狀態(tài)的細(xì)胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，獲得約30%至50%的所述原始狀態(tài)的細(xì)胞。
58.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，在步驟(iii)中，所述原始干細(xì)胞的群體的純度為至少約80%。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述原始干細(xì)胞的群體的純度為至少約90%。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述原始干細(xì)胞的群體的純度為至少約95%。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述原始干細(xì)胞的群體的純度為至少約99%。
62.一種生成人胚胎干細(xì)胞系的方法，包括: (i)使獲得自胚泡的細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸； (?)分離具有干細(xì)胞樣形態(tài)的長(zhǎng)出物； (iii)使所述分離的長(zhǎng)出物與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸；以及 (iv)并且分離具有期望的核型以及表明所述細(xì)胞是多能性的多能性基因和原始基因的表達(dá)水平的克隆。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述NME家族成員是NME7。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述NME7是NME7-AB。
65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，包含所述NME家族成員的所述培養(yǎng)基不包含F(xiàn)GF。
66.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，包括抑制所述細(xì)胞中的NMEl和NME2。
67.一種生成人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞系的方法，包括: (i)使獲得自供體或患者的細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸； (ii)使所述細(xì)胞與誘導(dǎo)多能性基因0CT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-Myc或LIN28表達(dá)的試劑接觸； (iii)分離具有干細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞； (iv)使所述分離的細(xì)胞與包含NME家族蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸； (v)分離具有期望的核型以及表明所述細(xì)胞是多能性的多能性基因的表達(dá)水平的克隆；以及 (vi)并且在包含NME家族成員的培養(yǎng)基中繁殖克隆。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述NME家族成員是NME7。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述NME7是NME7-AB。
70.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中，包含所述NME家族成員的所述培養(yǎng)基不包含F(xiàn)GF。
71.根據(jù)權(quán)利要 求67所述的方法，包括抑制所述細(xì)胞中的NMEl和NME2。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK103998598SQ201280062509
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月17日
【發(fā)明者】辛西婭·巴姆達(dá)德, 貝努瓦·J·斯馬格 申請(qǐng)人:米納瓦生物技術(shù)公司