用于降低非特異性擴增的方法和試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于核酸擴增的方法和試劑。與使用未經修飾的寡核苷酸進行的擴增相比較，使用含有N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸進行的擴增和檢測可以導致更少的涉及探針的非特異性擴增，可能這是由于在模板中大量N2-芐基-dG小溝結合劑的存在防止通過DNA聚合酶的互補鏈的延伸。
【專利說明】用于降低非特異性擴增的方法和試劑
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學和核酸化學領域。更具體而言，它涉及用于改進核酸擴增反應的可靠性的方法和試劑。
[0002]發(fā)明背景
聚合酶鏈反應(PCR)的發(fā)明使得核酸序列的體外擴增成為可能。PCR在美國專利號 4，683，195 ;4，683，202 ；和 4，965，188 ；Saiki 等人，1985，Science 230:1350-1354 ；Mullis 等人，1986, Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273 ;以及 Mullis 和Faloona, 1987，Methods Enzymo1.155:335-350中描述。PCR的開發(fā)和應用在文獻中廣泛描述。例如，一系列 PCR相關主題在 PCR Technology - principles and applications for DNAamplification, 1989, (H.A.Erlich編輯)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guideto methods and applications, 1990, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego ；和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego 中討論。商業(yè)供應商例如Applied Biosystems (Foster City, CA)銷售PCR試劑和公開PCR方案。 [0003]自從核酸擴增的原始出版物以后，多種基于引物的核酸擴增方法已得到描述，包括但不限于鏈置換測定(Walker 等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:392-396，Walker 等人，1992，Nucleic Acids Res.20:1691-1696 和美國專利號 5，455，166)和基于轉錄的擴增系統(tǒng)，包括美國專利號5，437，990 ;5，409，818 ;和5，399,491中所述的方法；轉錄擴增系統(tǒng)(TAS ) (Kwoh 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1173-1177);和自主序列復制(3SR) (Guatelli 等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874-1878和 WO 92/08800)。擴增系統(tǒng)的調查在 Abramson 和 Myers, 1993, Current Opinion inBiotechnology 4:41-47 中提供。
[0004]基于引物的擴增反應的特異性在很大程度上依賴引物雜交和延伸的特異性。在典型擴增中使用的高溫下，引物僅與預期靶序列雜交。然而，擴增反應混合物通常在室溫下組合，遠低于確保引物雜交特異性所需的溫度。在此類較不嚴格的條件下，引物可以與其他僅部分互補的核酸序列或與其他引物非特異性結合，并且起始不希望的延伸產物的合成，其可以沿靶序列擴增。非特異性引物延伸產物的擴增可以與所需靶序列的擴增競爭，并且可以顯著降低所需序列的擴增效率。
[0005]一種經常觀察到的類型的非特異性擴增產物是被稱為“引物二聚體”的模板不依賴性擴增反應假象(artifact)。引物二聚體是這樣的雙鏈片段，其長度通常接近于兩條引物長度總和，并且看起來當一條引物在另一條引物上延伸時發(fā)生。所得到的延伸產物形成不希望的模板，因為其短長度，所以所述不希望的模板被有效擴增。
[0006]非特異性擴增可以通過在反應開始前降低引物延伸產物形成而降低。在被稱為“熱啟動”方案的一種方法中，一種或多種關鍵試劑從反應混合物中扣留，直至溫度足夠升高以提供所需雜交特異性時。其中反應管在初始高溫溫育步驟后打開并加入缺少的試劑的手動熱啟動方法是費力的，并且增加反應混合物污染的風險。或者，熱敏感材料例如蠟可以用于分開或隔離反應組分，如美國專利號5，411，876和Chou等人，1992，Nucl.Acids Res.20 (7):1717-1723中所述。在這些方法中，高溫反應前溫育熔化熱敏感材料，由此允許試劑混合。
[0007]在反應開始前降低引物延伸產物形成的另一種方法依賴DNA聚合酶的熱可逆失活。美國專利號5，773，258和5，677，152描述了通過改性劑基團(modifier group)的共價連接可逆修飾的DNA聚合酶。失活的DNA聚合酶在高溫下溫育導致改性劑(modifier)-酶鍵的斷裂，由此使酶再活化。
[0008]DNA聚合酶通過DNA聚合酶特異性抗體的非共價可逆抑制在美國專利號5，338，671 中描述。
[0009]非特異性擴增還可以使 用美國專利號5，418，149中描述的方法，通過在反應開始前酶促降解形成的延伸產物而降低。新近合成的延伸產物的降解通過下述實現(xiàn):將dUTP和UNG摻入反應混合物內，并且在進行擴增反應前，使反應混合物在45-60°C下溫育。引物延伸導致形成含尿嘧啶DNA，其在擴增前條件下由UNG降解。該方法的缺點是延伸產物的降解與延伸產物的形成競爭，并且非特異性引物延伸產物的消除可能是較不完全的。該方法的優(yōu)點是作為來自先前反應的污染引入反應混合物內的含尿嘧啶DNA也被降解，并且因此該方法還降低PCR由來自先前反應的擴增核酸污染的問題。
[0010]在反應開始前降低引物延伸產物形成的另一種方法依賴于使用在3’端處或附近通過將基團加入環(huán)外胺(exocyclic amine)而修飾的引物,如美國專利號6，001，611中所述。
[0011]在本領域技術內的分子生物學和核酸化學的常規(guī)技術在文獻中充分說明。參見例如，Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait,編輯，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames 和 S.J.Higgins.編輯，1984) ；PCRTechnology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (H.A.Erlich編輯)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guide to methods and applications,1990, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego ;和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego。
[0012]發(fā)明概述
本發(fā)明基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn):在某些擴增反應中，特別是在含有多條引物和探針用于擴增和檢測多種靶核酸的反應(例如多重PCR反應)中，一條或多條探針可能充當可能導致非特異性擴增的模板，所述非特異性擴增依次又產生假陽性的信號。為了降低PCR中基于探針的非特異性擴增，可以使用干擾DNA聚合酶活性但仍能夠與互補核苷酸堿基配對的小溝改性劑。一個小溝改性劑的此類實例是脫氧鳥苷類似物，N2-芐基鳥苷(N2-芐基-dG)，其是如本文描述的本發(fā)明的主題。
[0013]因此，本發(fā)明的一個方面涉及在采用以模板依賴性方式的引物延伸的測定中，防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結合劑摻入模板核苷酸序列上，其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出小溝結合劑位置多于2個核苷酸。在一個實施方案中，小溝結合劑是經修飾的核苷。在另一個實施方案中，經修飾的核苷是N2-芐基-脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)。
[0014]本發(fā)明的另一個方面涉及降低或防止在擴增反應過程中核酸的非特異性擴增的方法，其包括提供能夠擴增靶核酸序列的至少一對引物寡核苷酸；提供摻入小溝結合劑的探針寡核苷酸，當引物寡核苷酸與探針寡核苷酸雜交時，所述小溝結合劑阻斷引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸超出小溝結合劑位置多于2個核苷酸。在一個實施方案中，小溝結合劑是經修飾的核苷。在另一個實施方案中，經修飾的核苷是N2-芐基-脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)。
[0015]本發(fā)明的第三個方面涉及用于核酸擴增的反應混合物，其包含至少一對引物寡核苷酸和至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸。
[0016]本發(fā)明的第四個方面涉及用于核酸擴增的試劑盒，其包含至少一對引物寡核苷酸、至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸、至少一種核苷酸摻入生物催化劑、核苷三磷酸、適合于通過所述核苷酸摻入生物催化劑的核酸擴增的緩沖液、和用于進行核酸擴增的一套說明書。
[0017]附圖簡述
圖1顯示(A) N2-芐基脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)的結構和(B) N2-芐基脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)和脫氧胞嘧唳(deoxycytosine) (dC)之間的堿基配對。
[0018]是使用含有N2-芐基-dG的模板核酸的引物延伸阻斷的圖示:(A)顯示不含修飾的模板，(B)和(C)顯示具有修飾的模板，其中X是N2-芐基-dG。
[0019]圖3顯示在O分鐘(A)和5分鐘(B)時間點，實施例1的引物延伸反應的結果。
[0020]Si顯示針對三種測試寡核苷酸，一種未經修飾的對照寡核苷酸和具有與對照寡核苷酸相同的序列但在N-4或N-9位置處具有N2-芐基-dG修飾的兩種寡核苷酸的互補寡核苷酸的熔解溫度。
[0021]S5顯示與具有相同序列的對照TaqMan?探針相比較，含有N2-芐基-dG殘基的TaqMane探針的切割效率。
[0022]發(fā)明詳述 定義
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。在描述和請求保護本發(fā)明中，將使用下述定義。
[0023]術語“核酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等)聚合物，并且包含脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA雜交物、寡核苷酸、多核苷酸、適體、肽核酸(PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等，其包含以線性(linear)或分支(branched)方式共價連接在一起的核苷酸。核酸一般是單鏈或雙鏈的，并且一般含有磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，包括可以具有替代骨架的核酸類似物，包括例如磷酰胺(Beaucage 等人 (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925)；硫代憐酸酯(Mag 等人(1991)Nucleic Acids Res.19:1437 ;和美國專利號 5，644，048)、二硫代磷酸酯(Briu 等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321 )、O-甲基亞憐酸胺(0-methyIphophoroamidite)連接(參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford UniversityPress (1992))、和肽核酸骨架和連接(參見 Egholm (1992) J.Am.Chem.Soc.114:1895)。其他類似物核酸包括具有帶正電荷骨架的類似物核酸(Denpcy等人(1995) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92: 6097);非離子骨架的類似物核酸(美國專利號5，386，023，5，637，684，5，602，240，5，216，141和4，469,863)和非核糖骨架的類似物核酸，包括在美國專利號5，235，033和5，034，506中描述的類似物核酸。含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義內(參見Jenkins等人(1995)Chem.Soc.Rev.第169-176頁),并且類似物還在例如Rawls，C & E News 1997年6月2日，第35頁中描述。可以完成磷酸核糖骨架的這些修飾，以促進另外部分例如標記的添加，或以改變此類分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。
[0024]除了一般在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外，核苷酸類似物也可以包括非天然存在的雜環(huán)堿基，例如在如Seela等人(1999)Helv.Chim.Acta 82:1640中所述的那些。在核苷酸類似物中使用的某些堿基充當熔解溫度(Tm)改性劑。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等，參見例如美國專利號5，990，303。其他代表性雜環(huán)堿基包括例如次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤；以下堿基的8-氮雜衍生物:2_氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；以下堿基的7-脫氮-8-氮雜衍生物:腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；6_氮雜胞苷；5_氟胞苷；5_氯胞苷；5-碘胞苷；5_溴胞苷；5-甲基胞苷；5_丙炔基胞苷；5_溴乙烯基尿嘧啶；5_氟尿嘧啶；5_氯尿嘧啶；5_碘尿嘧啶；5_溴尿嘧啶；5_三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。
[0025]“核苷”指包含與糖部分(核糖或脫氧核糖)、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物(例如碳環(huán))共價連接的堿基或堿性基團(包含至少一個同素環(huán)、至少一個雜環(huán)、至少一個芳基，等等(and/or the like))的核酸組分。例如，當核苷包括糖部分時，堿基一般連接至該糖部分的I’-位置。如上所述，堿基可以是天然存在的堿基或非天然存在的堿基。示例性核苷包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、雙脫氧核糖核苷和碳環(huán)核苷。 [0026]“核苷酸”指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，其具有共價連接至核苷糖部分的5’位置的一個、兩個、三個或更多個磷酸基。
[0027]“嘌呤核苷酸”指包含嘌呤堿基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指包含嘧啶堿基的核苷酸。
[0028]“經修飾的核苷酸”指罕見或較少的核酸堿基、核苷酸和常規(guī)堿基或核苷酸的修飾、衍生或類似物，并且包括具有經修飾的堿基部分和/或經修飾的糖部分的合成核苷酸(參見 Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology,第 26卷(Suhier AgrawaI,編輯，Humana Press, Totowa,N.J., (1994));和 Oligonucleotides andAnalogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein,編輯，IRL Press, Oxford UniversityPress, Oxford)。
[0029]“寡核苷酸”指包括至少兩個，但一般為5-50個核苷酸且更一般為15-35個核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的確切大小通常取決于多種因素，包括寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過本領域已知的任何合適方法進行制備，包括例如合適序列的克隆和限制性消化，或通過諸如下述方法的直接化學合成:Narang等人(1979) Meth.Enzymol.68:90-99 的憐酸三酯法；Brown 等人(1979) Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯法；Beaucage 等人(1981) Tetrahedron Lett.22:1859-1862 的二乙基亞憐酸胺法；Matteucci等人(1981 )J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191的三酯法；自動合成法；美國專利號4，458，066的固體載體法或本領域已知的任何其他化學方法。[0030]“Watson-Crick堿基配對”或簡寫的“堿基配對”指在雙鏈核酸分子內的“常規(guī)的”氫鍵成鍵。Watson-Crick堿基配對是腺嘌呤和胸腺嘧啶之間、鳥嘌呤和胞嘧啶之間、腺嘌呤和尿嘧啶之間、以及這些堿基的類似物之間的氫鍵成鍵。
[0031 ] 如本文使用的，術語“雜交”和“退火”等等可互換使用，并且指一種多核苷酸與另一種多核苷酸(通常為反向平行的多核苷酸)的堿基配對相互作用，其導致通常稱為雜交復合物的雙鏈體或其他更高級結構的形成。反向平行的多核苷酸分子之間的一級相互作用通常為堿基特異性的，例如A/T和G/C，通過Watson/Crick和/或Hoogsteen型氫鍵成鍵。不需要兩種多核苷酸在其全長上具有100%互補性以實現(xiàn)雜交。在一些方面，雜交復合物可以由分子間相互作用形成，或者，可以由分子內相互作用形成。
[0032]如本文使用的,術語“擴增(amplification)”、“擴增(amplifying)”等等一般指導致分子或相關分子組的拷貝數(shù)中的增 加的任何過程。當它應用于多核苷酸分子時，擴增意指通常從少量多核苷酸(例如病毒基因組)開始產生多核苷酸分子或多核苷酸分子的部分的多個拷貝，其中擴增材料(例如病毒PCR擴增子)通常是可檢測的。多核苷酸的擴增包含多個化學和酶促過程。在聚合酶鏈反應(PCR)、鏈置換擴增(SDA)反應、轉錄介導的擴增(TMA)反應、基于核酸序列的擴增(NASBA)反應或連接酶鏈反應(LCR)過程中，由一個或少數(shù)拷貝的模板DNA分子生成多個DNA拷貝是擴增形式。擴增并不限于起始分子的嚴格復制。例如，使用RT-PCR由樣品中有限量的病毒RNA生成多重cDNA分子是擴增形式。此外，在轉錄過程期間由單一 DNA分子生成多重RNA分子也是擴增形式。
[0033]在一些實施方案中，擴增任選隨后為另外的步驟，例如但不限于標記、測序、純化、分離、雜交、大小分辨、表達、檢測和/或克隆。
[0034]如本文使用的，術語“聚合酶鏈反應”(PCR)指本領域眾所周知的用于增加樣品中的靶多核苷酸區(qū)段的濃度的擴增方法，其中該樣品可以是單一多核苷酸種類，或多種多核苷酸。一般地，PCR過程由下述組成:將摩爾過量的兩種或更多種可延伸的寡核苷酸引物引入包含一種或多種所需靶序列的反應混合物內，其中該引物與雙鏈靶序列的相反鏈互補。對反應混合物實施在DNA聚合酶的存在下的熱循環(huán)程序，導致側翼為DNA引物的所需靶序列的擴增。逆轉錄酶PCR (RT-PCR)是使用RNA模板和逆轉錄酶、或具有逆轉錄酶活性的酶的PCR反應，以首先在DNA依賴性DNA聚合酶引物延長的多個循環(huán)之前生成單鏈DNA分子。多重PCR指通常通過在單一反應中包括多于兩條引物，在單一反應中產生多于一種擴增產物的PCR反應。廣泛多樣的PCR應用的方法是本領域廣泛已知的，并且在許多來源例如 AusubeI等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, Section 15, John Wiley& Sons, Inc., New York (1994)中描述。
[0035]“引物核酸”或“引物”是可以與模板核酸雜交且允許使用核苷酸摻入生物催化劑的鏈延伸或延長的寡核苷酸。盡管有時利用其他引物長度，但引物一般范圍為15-35個核苷酸。短引物核酸一般利用更冷的溫度，以與模板核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。與模板核酸的子序列至少部分互補的引物核酸一般足以與模板核酸雜交以發(fā)生延伸。然而，延伸的成功通常需要在引物的3’端處更大的互補性(即與模板的更少錯配)。需要時，引物核酸可以通過摻入標記進行標記，所述標記可通過放射學、光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學技術檢測。
[0036]“延伸的引物”指一個或多個另外的核苷酸已加入其中的引物?！耙镅由臁笔橇硗獾暮塑账嵬ㄟ^其加入引物中的酶的作用。
[0037]“模板核酸”、“模板”或“靶”指引物核酸在合適條件下可以與之雜交且延伸的核酸。在核酸擴增的背景下，“靶”優(yōu)選是雙鏈核酸的區(qū)域，由與至少兩條引物序列至少部分互補的序列及間插序列組成。靶還可以是單鏈核酸，由與一條引物至少部分互補的序列和與第二條引物部分相同的序列組成。模板核酸可以作為分離的核酸片段存在或可以是大核酸片段的部分。靶核酸可以衍生自或分離自基本上任何來源，例如培養(yǎng)的微生物、未培養(yǎng)的微生物、復雜的生物混合物、組織、血清、古老的或保存的組織或樣品、環(huán)境分離物等。進一步地，模板核酸任選包括或來源于cDNA、RNA、基因組DNA、克隆的基因組DNA、基因組DNA文庫、酶促斷裂的DNA或RNA、化學斷裂的DNA或RNA、物理斷裂的DNA或RNA等。模板核酸還可以使用本領域已知的技術化學合成。
[0038]如本文使用的，術 語“探針”通常指能夠與目的靶核酸雜交的多核苷酸。通常但非唯一地，探針與合適標記或報道分子部分結合，使得探針(和因此其靶)可以得到檢測、顯現(xiàn)、測量和/或定量。標記探針的檢測系統(tǒng)包括但不限于熒光檢測、熒光猝滅(例如當使用FRET對檢測系統(tǒng)時)、酶促活性、吸光度、分子質量、放射性、發(fā)光或允許報道分子(例如當報道分子是抗體時)的特異性結合的結合特性。在一些實施方案中，探針可以是抗體而不是多核苷酸，其對于目的核酸核苷酸序列具有結合特異性。不旨在本發(fā)明限制于任何具體標記探針或探針檢測系統(tǒng)。在探針中使用的多核苷酸來源不受限制，并且可以在非酶促系統(tǒng)中合成產生，或可以是使用生物(例如酶促)系統(tǒng)(例如在細菌細胞中)產生的多核苷酸(或多核苷酸的部分)。
[0039]通常，探針與核酸中含有的特定靶序列充分互補，以在所選雜交條件例如但不限于嚴格雜交條件下與靶序列形成穩(wěn)定的雜交復合物。在充分嚴格的雜交條件下使用探針進行的雜交測定允許選擇性檢測特定靶序列。
[0040]如本文使用的，如果在引物序列和靶序列之間存在的錯配數(shù)目小于引物序列和樣品中可能存在的非靶序列之間存在的錯配數(shù)目，則引物對于模板序列是“特異性的”。雜交條件可以選擇為僅在存在的錯配數(shù)目不多于引物序列和靶序列之間存在的錯配數(shù)目時，在其下形成穩(wěn)定雙鏈體的條件。在此類條件下，引物可以僅與靶序列形成穩(wěn)定雙鏈體。因此，在含有靶弓丨物結合位點的那些靶序列的適當嚴格擴增下使用靶特異性引物。序列特異性擴增條件的使用使得能夠特異性擴增含有確切互補的引物結合位點的那些靶序列。
[0041]術語“非特異性擴增”指除靶序列外的核酸序列的擴增，其產生于引物與除靶序列外的序列雜交并且隨后充當引物延伸的底物。引物與非靶序列的雜交被稱為“非特異性雜交”，并且可以在較低溫度、降低的嚴格性、預擴增條件過程中發(fā)生。
[0042]如本文使用的，術語“擴增子”指在特定靶核酸擴增后產生的多核苷酸分子(或共同地多種分子)。用于生成擴增子的擴增方法可以是任何合適方法，最通常地，例如通過使用PCR方法。擴增子通常但非唯一地是DNA擴增子。擴增子可以是單鏈或雙鏈的，或在其以任何濃度比的混合物中。
[0043]如本文使用的，表達“擴增子累積的實時檢測”指當一種或多種擴增子產生(通常通過PCR)時，一種或多種特定擴增子的檢測和通常的其定量，而無需在擴增完成后的檢測或定量步驟。術語“實時PCR”或“動態(tài)PCR”指在PCR中生成的擴增子的實時檢測和/或定量。[0044]擴增子累積的實時檢測的常見方法是通過5’ -核酸酶測定，也稱為熒光5’ -核酸酶測定，例如 TaqMan 分析；參見，Holland 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:7276-7280(1991);和 Heid 等人，Genome Research 6:986-994 (1996)。在 TaqMan PCR 程序中，兩種寡核苷酸引物用于生成對PCR反應特異性的擴增子。設計第三寡核苷酸(TaqMan探針)與位于兩種PCR引物之間的擴增子中的核苷酸序列雜交。該探針可以具有無法通過PCR反應中使用的DNA聚合酶延伸的結構，并且通常(但不一定)由彼此緊密接近的熒光報道染料和猝滅劑部分共標記。當熒光劑和猝滅劑緊密接近時，如它們在探針上時，來自報道染料的發(fā)射由猝滅部分猝滅。在一些情況下，該探針可以僅由熒光報道染料或另一種可檢測部分標記。
[0045]TaqMan PCR反應使用熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶，其具有5’ _3’核酸酶活性。在PCR擴增反應過程中，DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性切割以模板依賴性方式與擴增子雜交的標記探針。所得的探針片段從引物/模板復合物中解離，并且報道染料隨后免于猝滅劑部分的猝滅效應。對于合成的每個新擴增子分子釋放大約一分子的報道染料，并且未猝滅的報道染料的檢測提供數(shù)據定量解釋的基礎，使得釋放的熒光報道染料的量與擴增子模板的量直接成比例。
[0046]TaqMan測定數(shù)據的一個量度通常表示為閾值循環(huán)(CT )。熒光水平在每個PCR循環(huán)過程中進行記錄，并且與擴增反應中的那個點擴增的產物量成比例。當熒光信號首先記錄為統(tǒng)計學上顯著的時，或其中熒光信號超過一些其他任意水平(例如任意熒光水平，或AFL)的PCR循環(huán)是閾值循環(huán)(CT )。
[0047]5’ -核酸酶測定的方案和試劑是本領域技術人員眾所周知的，并且在多個來源中描述。例如，5’-核酸酶反應和探針在下述中描述:于2001年4月10日授予Gelfand等人,名稱為“HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM”的美國專利號6，214，979 ;于1998年9月8日授予 Gelfand 等人，名稱為 “REACTION MIXTURES FOR DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACIDS”的美國專利號5,804，375 ;于1996年I月30日授予Gelfand等人，名稱為“NUCLEIC ACIDDETECTION BY THE 5’ -3’ EXONUCLEASE ACTIVITY OF POLYMERASES ACTING ON ADJACENTLYHYBRIDIZED OLIGONUCLEOTIDES” 的美國專利號 5，487，972 ;和于 1993 年 5 月 11 日授予Gelfand 等人，名稱為 “HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF ANUCLEIC ACID POLYMERASE” 的美國專利號 5，210, 015。
[0048]實時擴增子檢測的方法中的變化也是已知的，并且特別地，當5’ -核酸酶探針替換為雙鏈DNA嵌入染料時，導致依賴擴增反應中存在的雙鏈擴增子量的熒光，參見例如于2001 年 I 月 9 日授予 Hi guchi，名稱為 “METHODS AND DEVICES FOR HEM0GENE0US NUCLEICACID AMPLIFICATION AND DETECTOR”的美國專利號 6，171,785 ;和于 1999 年 11 月 30 日授予Higuchi，名稱為 “HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION”的美國專利號5，994，056。
[0049]TaqMan? PCR可以使用商購可得的試劑盒和設備進行，所述設備例如ABI PRISMs7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)、 或LightCycIer? (Roche Applied Sciences, Mannheim,德國)。在優(yōu)選實施方案中，5’ 核酸酶測定程序在實時定量PCR裝置例如ABI PRISMs 7700 Sequence Detection System上運行。該系統(tǒng)由熱循環(huán)儀、激光器、電荷耦合器件(CCD)、照相機和計算機組成。該系統(tǒng)擴增在熱循環(huán)儀上的96孔微量滴定板形式中的樣品。在擴增過程中，激光誘導的熒光信號對于所有96孔通過光纖電纜實時收集，并且在CCD照相機上檢測。該系統(tǒng)包括用于運行儀器和分析數(shù)據的軟件。
[0050]如本文使用的，“基因”指與生物功能相關的DNA的任何區(qū)段。因此，基因包括編碼序列并任選包括編碼序列表達所需的調節(jié)序列。
[0051]當另外的核苷酸例如通過核苷酸摻入生物催化劑在核酸的3’端處摻入核酸內時，核酸被“延伸”或“延長”。
[0052]“部分(moiety) ”或“基團(group) ”指某些事物例如分子分裂成的部分之一(例如官能團、取代基等)。例如，核苷酸一般包含堿基基團(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或類似物)、糖部分、和一個或多個磷酸基。
[0053]“芐基”指具有式C6H5CH2-的單價芳香族基團，并且可與術語“苯基甲基”互換使用。
[0054]“基因型”指細胞或個體或者細胞或個體的組的全部或部分遺傳組成。例如，基因型包括存在于給定基因座上或分布在基因組中的特定突變和/或等位基因(例如多態(tài)性，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)等)?！盎蚍中汀敝笢y定細胞或個體的基因型的測定。
[0055]“核苷酸摻入生物催化劑”或“核苷酸摻入酶”指催化核苷酸摻入核酸內的催化劑(或酶)。示例性核苷酸摻入酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端轉移酶、逆轉錄酶、端粒末端轉移酶等。
[0056]“熱穩(wěn)定酶”指 當將其置于高溫下所選的時間段時是穩(wěn)定的(即抵抗斷裂或變性)且保留足夠催化活性的酶。例如，當將其置于高溫下雙鏈核酸變性所需的時間時，熱穩(wěn)定聚合酶保留實現(xiàn)隨后的引物延伸反應的足夠活性。核酸變性所需的加熱條件是本領域眾所周知的且在美國專利號4，683，202和4，683，195中例示。如本文使用的，熱穩(wěn)定聚合酶一般適合于在溫度循環(huán)反應例如聚合酶鏈反應(“PCR”)中使用。熱穩(wěn)定核酸聚合酶的實例包括水生棲熱菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、棲熱菌屬物種(Thermus sp.)Z05聚合酶、黃棲熱菌(Thermus fIavus)聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶例如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
[0057]“經修飾的”酶指包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一個單體不同于參考序列，例如酶的天然或野生型形式或酶的另一種修飾形式。示例性修飾包括單體插入、缺失和取代。經修飾的酶還包括具有來源于兩個或更多個親本的可鑒定組分序列(例如結構或功能結構域等)的嵌合酶。在經修飾的酶的定義內還包括的是包含參考序列的化學修飾的那些。經修飾的聚合酶的實例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA 聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA 聚合酶、G46E E678G CS6 DNA 聚合酶、ΛΖ05 聚合酶、Λ Z05_Gold 聚合酶、Λ Z05R 聚合酶、E615G TaqDNA聚合酶、E678G ΤΜΑ-25聚合酶、E678G ΤΜΑ-30聚合酶等。
[0058]術語“5’至3’核酸酶活性”或“5’-3’核酸酶活性”指一般與核酸鏈合成相關的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5’端去除，例如大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I具有這種活性，而Klenow片段則沒有。
[0059]“基本上缺乏5’ -3’核酸酶活性”的聚合酶指具有Taq DNA聚合酶的50%或更低的(例如〈25%、〈20%、〈15%、〈10%) 5’-3’核酸酶活性的聚合酶。測量5’-3’核酸酶活性的方法和用于測量的條件是本領域眾所周知的，參見例如美國專利號5，466，591?；旧先狈?’到3’核酸酶活性的DNA聚合酶的實例包括大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N末端235個氨基酸的水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(例如如美國專利號5，616，494中描述的且在本領域中通常被稱為“Stoffel片段”)。其他實例包括具有足夠缺失(例如N末端缺失)、突變或修飾，以消除或失活負責5’ -3’核酸酶活性的結構域的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，參見例如美國專利號5，795，762。
[0060]“標記”指(共價或非共價)連接至分子且能夠提供關于分子的信息的部分。示例性標記包括突光標記、比色法標記、化學發(fā)光標記、生物發(fā)光標記、放射性標記、質量修飾基團、抗體、抗原、生物素、半抗原和酶(包括過氧化物酶、磷酸酶等)。
[0061]在核酸擴增反應的背景下，“熱啟動”指其中至少一種關鍵試劑從反應混合物中被扣留(或如果存在于反應混合物中，則試劑保持無活性)，直至溫度足夠升高以提供一條或多條引物的必需雜交特異性的方案。“熱啟動酶”是能夠在熱啟動方案中充當“扣留”或無活性試劑的酶，一般為核酸聚合酶。
[0062]術語“反應混合物”指含有進行給定反應所需的試劑的溶液?！皵U增反應混合物”指含有進行擴增反應所需的試劑的溶液，通常含有在合適緩沖液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶或連接酶。“PCR反應混合物”通常含有在合適緩沖液中的寡核苷酸引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、dNTP’ s和二價金屬陽離子。如果反應混合物含有實現(xiàn)反應所需的所有試劑，則它被稱為完全的，并且如果反應混合物僅含有必需試劑子集，則它被稱為不完全的。本領域技術人員應當理解反應組分照常規(guī)作為各自含有全部組分的子集的分離的溶液貯存，為了方便、貯存、穩(wěn)定性、或以允許組分濃度的應用依賴性調整的原因，并且反應組分在反應前組合以產生完全反應混合物。
[0063]如本文使用的，術語“試劑盒”用于提及物品組合，所述物品組合促進樣品的處理、方法、測定、分析或操作。試劑盒可以含有描述如何使用試劑盒的書面說明書(例如描述本發(fā)明的方法的說明書)、 法所需的化學試劑或酶、引物和探針、以及任何其他組分。
[0064]本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn):當存在于模板核酸上時，某些經修飾的核苷酸能夠防止或抑制引物寡核苷酸通過DNA聚合酶的延伸，但仍可以維持與其在引物上的互補堿基的Watson-Crick堿基配對。一種此類經修飾的核苷酸是脫氧鳥苷類似物，N2-芐基-脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)，其如圖1A中所示，含有在環(huán)外氨基的C-2氮上的芐基。具有環(huán)外氨基的共價修飾的核苷酸已在美國專利號6，001，611中描述。此類核苷酸的合成和摻入此類核苷酸的寡核苷酸也在‘611專利中描述。
[0065]雖然不受理論束縛，但認為N2-芐基-dG能夠通過占據雙鏈DNA的小溝而防止引物延伸，由此表現(xiàn)為“小溝結合劑”，并且干擾DNA聚合酶的活性位點。然而，與互補脫氧胞嘧啶(dC)核苷酸的堿基配對仍可以發(fā)生，因為三個氫鍵不受芐基部分存在的影響(圖1B)。
[0066]因此，在一個方面，本發(fā)明涉及防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結合劑摻入模板核苷酸序列上，其中小溝結合劑是經修飾的核苷酸，并且經修飾的核苷酸是N2-芐基-dG，并且其中引物不能延伸超出N2-芐基-dG核苷酸位置多于2個核苷酸。該方法可應用于進行PCR擴增、核酸測序、基因分型和采用以模板依賴性方式的引物延伸的其他應用。
[0067]N2-芐基-dG的獨特特性也允許其用于降低或防止基于引物的擴增反應中的非特異性擴增。認為當不穩(wěn)定的、瞬時雜交雙鏈體在引物和非靶分子之間形成時，發(fā)生非特異性擴增，其中引物的3’端與其他分子中的互補堿基暫時配對。初始引物延伸導致形成互補序列，其穩(wěn)定雙鏈體且允許進一步延伸。美國專利號6，001，611公開了含有經修飾的核苷酸的引物用于防止非特異性擴增的用途，所述非特異性擴增產生于引物二聚體的形成，在所述引物二聚體中在引物和另一條引物之間形成瞬時雜交雙鏈體。N2-芐基-dG將不用于引物中以防止非特異性擴增，因為它在引物延伸產物中的存在將引起引物延伸的終止，所述引物延伸產物用作后續(xù)擴增循環(huán)中的模板。然而，在利用探針(例如Taqman PCR測定中的5’核酸酶探針)的擴增反應中，N2-芐基-dG的摻入已導致降低或防止產生于在引物和探針之間發(fā)生的雜交的非特異性擴增。
[0068]因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及降低或防止在擴增反應過程中核酸的非特異性擴增的方法，其包括提供能夠擴增靶核酸序列的至少一對引物寡核苷酸；提供摻入小溝結合劑的探針寡核苷酸，當引物與探針寡核苷酸雜交時，所述小溝結合劑阻斷引物通過DNA聚合酶延伸超出小溝結合劑位置多于2個核苷酸。在一個實施方案中，小溝結合劑是經修飾的核苷酸。在另一個實施方案中，經修飾的核苷酸是N2-芐基-dG。
[0069]在另一個方面，本發(fā)明提供了用于核酸擴增的反應混合物，其包含至少一對引物寡核苷酸和至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸。在一些實施方案中，反應混合物進一步包含核酸擴增一般所需的試劑和溶液，包括核苷酸摻入生物催化劑、核酸前體即核苷三磷酸、以及適合于支持核苷酸摻入生物催化劑活性的有機和無機離子。
[0070]在另一個方面，本發(fā)明提供了用于進行根據本發(fā)明的擴增反應的試劑盒。試劑盒一般包括測定特異性組分以及進行DNA擴增測定一般所需的組分。作為測定特異性組分，本發(fā)明的擴增試劑盒通常包括至少一對引物寡核苷酸、至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸、和用于進行本發(fā)明的擴增反應的一套說明書。在一些實施方案中，試劑盒包括兩對或更多對引物 寡核苷酸和兩條或更多條探針寡核苷酸，其中每條探針寡核苷酸摻入N2-芐基-dG核苷酸。作為核酸擴增一般所需的組分，本發(fā)明的試劑盒通常包括下述中的一種或多種:核苷酸摻入生物催化劑、核酸前體例如核苷三磷酸(脫氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸)、任選的用于使核酸的焦磷酸解降到最低的焦磷酸酶、用于保護不受擴增反應的攜帶污染(carry-over contamination)的尿嘧唳N-糖基化酶(UNG)、以及擴增反應和檢測所需的預制試劑和緩沖液。
[0071]提供下述實施例和附圖以幫助本發(fā)明的理解，本發(fā)明的真實范圍在附加的權利要求中闡述。
實施例
[0072]年施例I引物延伸
為了證實如圖2中圖解描述的，含有N2-芐基-dG的模板核酸能夠阻斷通過DNA聚合酶的引物延伸，使用FAM標記的引物寡核苷酸和三種互補模板寡核苷酸設置引物延伸實驗，其序列顯示于下文:
【權利要求】
1.在采用以模板依賴性方式的引物延伸的測定中，防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結合劑摻入所述模板核苷酸序列上，并且其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出N2-芐基-dG核苷酸位置多于2個核苷酸。
2.權利要求1的方法，其中所述小溝結合劑是經修飾的核苷酸。
3.權利要求3的方法，其中所述經修飾的核苷酸是N2-芐基-脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)。
4.權利要求1的方法，其中所述測定選自PCR擴增、DNA測序和基因分型。
5.權利要求4的方法，其中所述測定是PCR擴增。
6.降低或防止在擴增反應過程中核酸的非特異性擴增的方法，其包括提供能夠擴增靶核酸序列的至少一對引物寡核苷酸；和提供摻入小溝結合劑的探針寡核苷酸，當所述引物寡核苷酸與所述探針寡核苷酸雜交時，所述小溝結合劑阻斷所述引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸超出經修飾的核苷酸位置多于2個核苷酸。
7.權利要求6的方法，其中所述小溝結合劑是經修飾的核苷酸。
8.權利要求7的方法，其中所述經修飾的核苷酸是N2-芐基-dG。
9.權利要求6的方法，其中所述擴增反應是TaqmanPCR測定，并且所述探針寡核苷酸是5’核酸酶探針。
10.用于核酸擴增的反應混合物，其包含至少一對引物寡核苷酸和至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷 酸。
11.權利要求10的反應混合物，其進一步包含核苷酸摻入生物催化劑、核苷三磷酸、和適合于通過所述核苷酸摻入生物催化劑的核酸擴增的緩沖液。
12.用于核酸擴增的試劑盒，其包含至少一對引物寡核苷酸、至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸、至少一種核苷酸摻入生物催化劑、核苷三磷酸、適合于通過所述至少一種核苷酸摻入生物催化劑的核酸擴增的緩沖液、和用于進行核酸擴增的一套說明書。
13.權利要求12的試劑盒,其進一步包含一對或多對引物寡核苷酸和一條或多條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK104011224SQ201280062833
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權日:2011年12月22日
【發(fā)明者】V.博德普迪, N.J.舍恩布倫納, S.威爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司