體液的細胞分析的制作方法
【專利摘要】本文提供在血液學分析器上進行細胞分析的方法。在各種方面，所述方法提供紅細胞(RBC)與白細胞(WBC)之間的分離和/或區(qū)分，其利用熒光染料來選擇性染色WBC以使得其發(fā)出更強的熒光信號。所述方法提供對于WBC和RBC的最佳檢測極限，從而允許分析具有稀少細胞濃度的樣品?？墒褂脙H僅一種試劑來制備用于體液分析的單一稀釋液，從而簡化所述體液分析。使用本公開的多個方面中描述的無溶胞方法來實現(xiàn)對于WBC的最小破壞。
【專利說明】體液的細胞分析
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年12月27日提交的美國臨時專利申請序號61/580，623的優(yōu)先權權益；所述美國臨時專利申請的整個公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。
【背景技術】
[0003]各種方法用于細胞分析，包括經(jīng)由光或熒光顯微術的目測和/或自動檢驗。通常實施這些類型的細胞檢查和分析以便獲得關于樣品中的細胞譜系、成熟階段和細胞計數(shù)的信息。
[0004]流式細胞術是在非均質(zhì)樣品中的不同細胞類型之間進行識別和區(qū)分的方法。在流式細胞儀中，細胞一次一個或幾乎一次一個穿過感測區(qū)域，其中每個細胞被能量源照射。典型地，單一波長光源(例如，激光器等)用作能量源并且各種傳感器中的一個或多個基于細胞與施加能量的相互作用來記錄數(shù)據(jù)。流式細胞術普遍地用于血液學并且已經(jīng)尤其成功地診斷血液癌癥。除了流式細胞術以外，其它分析方法用于血液學中并且表征細胞群體。
[0005]血液樣品傾向于具有高濃度的細胞。不論通過流式細胞術或其它技術，具有顯著較低濃度細胞的樣品的分析較困難并且因此不太常見。另外，被設計成測量全血樣品的傳統(tǒng)血液學分析器傾向于具有對于低端細胞濃度的有限檢測靈敏度。在一些情況下，樣品的手動檢查是細胞分析的唯一可用方法。在醫(yī)學、微生物學和其它領域需要分析具有低細胞計數(shù)的樣品的改進方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]在一方面，本公開提供分析含有細胞的體液的方法，所述方法包括:用熒光染料將體液染色，其中熒光染料滲透細胞膜并且結合至核酸以在細胞內(nèi)形成染料復合物；用來自能量源的能量照射染色體液；并且測量染色體液中的由染料復合物發(fā)出的熒光信號。
[0007]在一些這類方面，體液包含少于約20個細胞/微升。
[0008]在一些這類方面，體液包含超過約20個細胞/微升。
[0009]在一些這類方面，核酸選自DNA和RNA。
[0010]在一些這類方面，能量源提供具有可見光譜中的波長的單色光，并且其中單色光的波長和熒光信號的波長是不同的。
[0011]在一些這類方面，與染料復合物相比，未結合熒光染料在用來自能量源的能量照射時發(fā)出較少熒光。
[0012]在一些這類方面，在未結合至核酸時，未結合熒光染料在用來自能量源的能量照射時不發(fā)熒光，以使得沒有染料復合物的細胞不發(fā)出熒光信號。
[0013]在一些這類方面，所述方法包括基于存在或不存在熒光染料來區(qū)分具有細胞核的細胞與沒有細胞核的細胞。
[0014]在一些這類方面,測量涉及點計(enumerating,計算、計數(shù))和區(qū)分RBC和WBC。
[0015] 在一些這類方面，所述方法在測量之前不涉及使RBC溶解(Iysing)。[0016]在一些這類方面，體液包含完整WBC和RBC。
[0017]在一些這類方面，測量使用自動血液分析器、流式細胞儀或體液樣品的其它診斷分析器來執(zhí)行。
[0018]在一些這類方面，測量包括使體液流經(jīng)血細胞計數(shù)器中的流槽(flow cell，流動室)。
[0019]在一些這類方面，熒光染料提供在進一步包括水的組合物中。
[0020]在另一方面，本公開提供分析流體的方法，其中所述流體含有少于約40個細胞/微升，所述方法包括:使流體與熒光染料接觸，其中熒光染料滲透細胞膜并且結合至核酸以在細胞內(nèi)形成染料復合物；用來自能量源的能量照射流體；并且測量流體中的由染料復合物發(fā)出的熒光信號。
[0021]在一些這類方面，所述流體含有少于約20個細胞/微升。
[0022]在一些這類方面，所述流體含有小于約5個細胞/微升。
[0023]在一些這類方面，所述流體是體液。
[0024]在一些這類方面，所述流體是生物流體。
[0025]在另一方面， 本公開提供區(qū)分細胞的方法，所述方法包括:使細胞與包含熒光染料的溶液接觸，其中熒光染料是水溶性的，能夠滲透細胞膜，并且能夠結合至核酸；用來自激發(fā)光源的激發(fā)光照射細胞；并且測量來自細胞的光發(fā)射，并且基于測量來區(qū)分含有核酸的細胞與沒有核酸的細胞。
[0026]在另一方面，本公開提供分析體液的組合物，所述組合物包括水和熒光染料，其中熒光染料是水溶性的，能夠滲透細胞膜，并且能夠結合至核酸。
[0027]在另一方面，本公開提供血液學系統(tǒng)，其包括:用于保持將要分析的樣品的樣品保持器；用于將至少一部分將要分析的樣品與染色組合物混合的混合容器；用于存儲染色組合物的存儲容器，其中染色組合物包含能夠滲透細胞膜并且結合至核酸的染料，并且其中染料在結合至核酸時發(fā)熒光；流槽；用于將電磁能施加至流槽的至少一個能量源；用于檢測來源于流槽內(nèi)的熒光的一個或多個檢測器；和用于檢測散射的可見光的一個或多個可見光檢測器。
[0028]在一些這類方面，所述系統(tǒng)包括抽吸機構，其用于將至少一部分將要分析的樣品從樣品保持器抽吸至混合容器。
[0029]在一些這類方面，所述系統(tǒng)包括抽吸機構，其用于將染色組合物從存儲容器抽吸至混合容器。
[0030]在一些這類方面，至少一個能量源提供波長λ I下的單色光。
[0031]在一些這類方面，當染料結合至核酸時，染料吸收波長λ I下的光并且發(fā)出波長λ 2下的光。
[0032]在一些這類方面，檢測器檢測波長λ 2下的光。
[0033]在一些這類方面，所述系統(tǒng)包括用于提供非單色可見光的至少一個額外能量源。
[0034]在一些這類方面，將要分析的樣品是體液。
[0035]在另一方面，本公開提供用于制備血液學系統(tǒng)的方法，該方法包括:提供用于將至少一部分將要分析的樣品與染色組合物混合的混合容器；提供用于存儲染色組合物的存儲容器，其中染色組合物包含能夠滲透細胞膜并且結合至核酸的染料，并且其中染料在結合至核酸時發(fā)熒光；提供流槽；定位用于將電磁能提供至流槽的能量源；定位用于檢測從流槽內(nèi)發(fā)出的熒光的檢測器。
[0036]在另一方面，本公開提供制備用于分析體液的容器的方法，所述方法包括將包含能夠滲透細胞膜并且結合至核酸的染料的組合物添加至容器，其中染料在結合至核酸時發(fā)熒光，并且其中容器是血液學系統(tǒng)的一體化或模塊化部分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1提供本文描述的體液分析方法的方面的示意性圖像。在DNA-染料相互作用和隨后發(fā)出熒光后，WBC與RBC分離。熒光信息，以及其它光學散射信號，用于體液樣品的細胞分析。FLl指示用530±20nm帶通濾波器來收集的熒光。ALL和IAS是分別在O至I度和3至10度收集的光散射信號。
[0038]圖2A是體液樣品的細胞分析的散布圖(ALL相比于IAS)。WBC = 89/ μ L(參考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L (參考=1733/μ L)。
[0039]圖2B是體液樣品的細胞分析的散布圖(FLl相比于ALL)。WBC和RBC在熒光(FLl)中完全分離。WBC = 89/μ L(參考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L(參考=1733/μ L)。
[0040]圖3A是另一個體液樣品的細胞分析的散布圖(ALL相比于IAS)。WBC = 0.95/μ L (參考=0.33/ μ L) ；RBC = 142/μ L (參考=122/μ L)。 [0041]圖3B是另一個體液樣品的細胞分析的散布圖(FLl相比于ALL)。WBC和RBC在熒光(FLl)中完全分離。WBC = 0.95/μ L(參考=0.33/ μ L) ；RBC = 142/μ L(參考=122/μ L)。
[0042]圖4A是血沉棕黃層樣品的六個水平連續(xù)稀釋的第一稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測量。
[0043]圖4Β是血沉棕黃層樣品的六個水平連續(xù)稀釋的第二稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測量。
[0044]圖4C是血沉棕黃層樣品的六個水平連續(xù)稀釋的第三稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測量。
[0045]圖4D是血沉棕黃層樣品的六個水平連續(xù)稀釋的第四稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測量。
[0046]圖4Ε是血沉棕黃層樣品的六個水平連續(xù)稀釋的第五稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來制備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測量。
[0047]圖4F是血沉棕黃層樣品的六個水平連續(xù)稀釋的第六稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測量。
[0048]圖5提供所有六個水平的稀釋血沉棕黃層樣品(A)和僅三個低端樣品(B)之間的WBC(測量相比于計算)的相關圖。每個水平下的多個點指示執(zhí)行多個操作?？傮w相關性為:對于所有六個水平來說，Y=L 0239Χ-4.9 (R2 = 0.9984)，并且對于具有最低細胞濃度的三個水平來說，Y=L 0787Χ-1.5 (R2 = 0.9598)。
[0049]圖6提供91個體液樣品的WBC(當前方法相比于參考)的相關圖。相關性在不同范圍中作圖:(A)完全范圍(約 40，000/μ L)，(B)〈2，000/μ L，(C)〈200/μ L 和(D)〈50/μ L。稀釋比是1:35(樣本相比于標記試劑)。 [0050]圖7提供91個體液樣品的RBC (當前方法相比于參考)的相關圖。相關性在不同范圍中作圖:(A)完全范圍(約 200，000/μ L)，(B)〈3，000/μ L，(C)〈200/μ L 和(D)〈50/μ L。具有許多RBC影的樣品未包括于相關分析中。稀釋比是1:35(樣本相比于標記試劑)。
[0051]圖8是具有極低細胞濃度(WBC〈50/ μ L)的72個體液樣品的WBC(發(fā)明方法相比于參考)的相關圖表。稀釋比是1:10(樣本相比于標記試劑)。
[0052]圖9是具有極低細胞濃度(RBC〈50/ μ L)的38個體液樣品的RBC (當前方法相比于參考)的相關圖表。具有許多RBC影的樣品未包括于相關分析中。稀釋比是1:10(樣本相比于標記試劑)。
【具體實施方式】
[0053]定義
[0054]除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。盡管類似于或等效于本文所描述的那些的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明的實踐或測試，但是本文描述了代表性的說明性方法和材料。應理解的是，如果有矛盾，本公開內(nèi)容取代所并入公開文獻的任何公開內(nèi)容。
[0055]應注意的是，如本文所用并且在隨附權利要求中，除非上下文清楚地另外指出，否則單數(shù)形式“一個/種(a/an)”和“所述(the) ”包括復數(shù)個指示物。還應注意，所述權利要求可以起草為排除任何任選的要素。因此，對于使用諸如“唯一”、“僅”等與權利要求要素的敘述相關的排他性術語或使用“負面”限制而言，該敘述旨在起到前提基礎的作用。
[0056]術語“典型地”用于指示本發(fā)明的通常做法。此術語指示這類公開對于本發(fā)明的材料和方法來說是示例性的，而不是必需的(除非另外指示)。因此，術語“典型地”應理解為“典型地，但是不一定”。類似地，如在任選存在的材料或組分中，術語“任選地”指示本發(fā)明包括材料或組分存在的情況，也包括材料或組分不存在的情況。
[0057]如本文使用，術語“體液”是指存在或從動物獲得的流體，包括流體如腦脊液、腹膜液、心包液、胸膜液、滑液、尿液、唾液、眼淚、精液、羊膜水、痰等，以及從包囊、腫瘤等獲得的流體。除非另外規(guī)定，否則術語“體液”不包括全血，雖然體液可含有紅細胞(RBC)和/或白細胞(WBC)。[0058]在一些方面，本公開提供分析具有低細胞計數(shù)的流體的方法和材料。低細胞計數(shù)是指流體具有少于約100個細胞/微升，或少于約80個細胞/微升，或少于約60個細胞/微升，或少于約40個細胞/微升，或少于約30個細胞/微升，或少于約20個細胞/微升，或少于約10個細胞/微升，或少于約5個細胞/微升。在一些實施方案中，這類低細胞計數(shù)是濃度較高原始樣品的稀釋結果。在其它實施方案中，這類低細胞計數(shù)是將要分析的流體的自然特性(即，不需要稀釋以獲得低細胞計數(shù))。
[0059]在一些實施方案中，將要使用本文描述的方法和材料來分析的流體選自體液。在其它實施方案中，將要分析的流體在性質(zhì)上是生物的，但是并非體液。在一些實施方案中，將要分析的流體是“合成的”，意指細胞群體添加至流體，其中流體生物學相容但是不是細胞通常發(fā)現(xiàn)于其中的流體。這類流體的實例包括緩沖水溶液等。
[0060]材料
[0061]在一些實施方案中 ，所感興趣的方法涉及使細胞群體與適合于幫助細胞的所需表征的標記組合物接觸。在一些實施方案中，標記組合物包括突光染料，并且任選地進一步包括如本文以下描述的那些額外組分。標記組合物的組分和這類組分的相對濃度可根據(jù)預定用途的需要和要求來改變。在存在或不存在染料的情況下，標記組合物可替代地在本文中稱為“試劑”。
[0062]所感興趣的方法和材料涉及熒光染料(在本文中也稱為“染料”)。熒光染料可為具有執(zhí)行所感興趣的方法需要或合適特性的任何合適染料。舉例來說，在一些實施方案中，染料是水溶性的。舉例來說，在一些實施方案中，熒光染料具有至少I μ g/L或至少5μ g/L或至少10 μ g/L或至少20 μ g/L或至少50 μ g/L的水溶性。在一些實施方案中，染料在水溶液中是穩(wěn)定的，意指染料在適合于本文描述的分析方法的時間尺度內(nèi)不顯著降解。舉例來說，染料在周圍溫度(例如，近似20-25°C )下、在緩沖水溶液(例如，細胞試劑)中穩(wěn)定至少30分鐘，或至少I小時或至少6小時，或至少12小時，或至少24小時，或至少2天，或至少7天，或至少I個月。還例如，染料在冷藏(例如，低于近似10°C )下、在緩沖水溶液(例如，細胞試劑)中穩(wěn)定至少I小時，或至少12小時，或至少24小時，或至少2天，或至少7天，或至少I個月，或至少6個月，或至少12個月。
[0063]在一些實施方案中，染料能夠滲透細胞膜，如血細胞的壁等。在一些實施方案中，一旦在細胞內(nèi)部,染料進一步能夠滲透細胞核。
[0064]在一些實施方案中，染料結合至核酸。在一些實施方案中，染料結合至DNA。在一些實施方案中，所感興趣的染料結合至DNA但是不結合至RNA。在一些實施方案中，所感興趣的染料優(yōu)先結合至DNA而非RNA。在一些實施方案中，染料結合至DNA分子涉及氫鍵合或另一種非共價相互作用。在一些實施方案中，染料結合至DNA的單鏈或雙鏈DNA復合物的單鏈。在一些實施方案中，染料結合至雙鏈DNA復合物的兩個鏈。
[0065]在本說明書通篇，結合至DNA的染料被稱為染料復合物。在一些實施方案中，染料以高親和力和高結合常數(shù)來結合至DNA。在一些實施方案中，并且如本文中提到，染料的親和力和濃度足夠大以致于染料足以“染色”(在滲透和DNA結合后)至少250，000個細胞/微升。
[0066]在一些實施方案中，染料是發(fā)熒光的。因此，染料吸收一個波長或圍繞峰吸收波長(也稱為峰激發(fā)波長)的一組波長下的入射光，并且發(fā)出另一個波長或圍繞峰發(fā)射波長的一組波長下的光。在一些實施方案中，峰吸收波長不同于峰發(fā)射波長。此外，在一些實施方案中，峰吸收波長和/或峰發(fā)射波長取決于染料環(huán)境。舉例來說，在一些實施方案中，結合至DNA的染料(即，染料復合物)的峰吸收波長和/或峰發(fā)射波長不同于未結合染料的峰吸收波長和/或峰發(fā)射波長。
[0067]在一些實施方案中，染料復合物的峰吸收波長和峰發(fā)射波長不同達至少10nm，或至少15nm,或至少20nm,或至少25nm,或至少30nm,或至少35nm,或至少40nm,或至少45nm,或至少50nm。在一些實施方案中，染料復合物的峰吸收波長在400_700nm范圍內(nèi)。舉例來說，在一些實施方案中，峰吸收在425-550nm范圍內(nèi)，或在450_525nm范圍內(nèi)，或在475-500nm范圍內(nèi)，或在480_495nm范圍內(nèi)，或在485_490nm范圍內(nèi)。還例如，在一些實施方案中，峰吸收在500-700nm范圍內(nèi)，或在550_675nm范圍內(nèi)，或在600_650nm范圍內(nèi)，或在620_640nm 范圍內(nèi)。
[0068]在一些實施方案中，染料復合物的峰發(fā)射波長在425_800nm范圍內(nèi)，如在425-700nm范圍內(nèi)。舉例來說，在一些實施方案中，峰發(fā)射在450_650nm范圍內(nèi)，或在475-625nm范圍內(nèi)，或在500_550nm范圍內(nèi)，或在510_540nm范圍內(nèi)，或在520_530nm范圍內(nèi)。
[0069]舉例來說，在一些實施方案中，熒光染料選自噻唑橙或1-甲基-4_[(3-甲基-2-(3H)_苯并噻唑亞基)甲基]喹啉鎗對甲苯磺酸鹽、噻唑藍、4-[(3_甲基-2-(3H)_苯并噻唑亞基)甲基]-1-[3-(三甲基銨)丙基]喹啉鎗二碘化物、3，3’-二甲基氧雜碳菁碘化物或3-甲基-2-[3 (3-甲基-2 (3H)-苯并噻唑亞基-1-丙烯基]苯并噁唑碘化物、硫黃素T、染色劑SYTO?和TOTO? (Life Technologies)、溴化乙錠、碘化丙啶、吖啶橙、科里膦O、金胺O、染色劑H0ECHST33258 (2’ - (4-羥苯基)-5- (4甲基-1-哌嗪基)-2，5’ -雙-1H-苯并咪唑三鹽酸鹽水合物)和H0ECHST 33342? (2’-(4-乙氧苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2，5’-雙- 1H-苯并咪唑三鹽酸鹽)、4’6-二氨基-2-苯基吲哚鹽酸鹽(DAPI)、4’，6-( 二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚鹽酸鹽(DIPI)、7_氨基放線菌素D、放線菌素D和LDS751 (2- (4- (4- 二甲氨基苯基)-1，3- 丁二烯基)-3-乙基苯并噻唑聞氯酸鹽)、或以商標SYBR? (Life Technologies，例如 SYBR Green、SYBR Gold、SYBRll 等)出售的染料等。
[0070]在一些實施方案中，除了如上所述染料以外，所感興趣的標記組合物進一步包括以下段落中識別的一個或多個組分。應認識到以下列表只是代表性的，并且在需要時可使用化學和/或生物學等效材料來進行取代。
[0071]在一些實施方案中,標記組合物含有表面活性劑或洗滌劑?？墒褂秒x子和中性表面活性劑。舉例來說，可使用兩性離子表面活性劑如類固醇糖苷(例如，Big CHAP,Big DoxyCHAP等)和吡喃葡萄糖苷，以及在本領域中已知的其它表面活性劑。表面活性劑可以任何合適量存在于標記組合物中，如0.0001-0.1% (w/v)。
[0072]在一些實施方案中，標記組合物進一步含有緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑。緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑的實例包括但不限于PBS、MOPS和HEPES。緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑的額外實例包括:酸如鹽酸、氫溴酸、醋酸、磷酸等；堿如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、有機胺(例如咪唑、三乙基胺等)及其類似物；和鹽如氯化鈉、氯化鈣等。舉例來說，有機緩沖劑材料如咪唑可以約0.001-3% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在于標記組合物中。還例如，無機材料如HCl可以約0.001-5% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。類似地，鹽如NaCl可以約0.001-3% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。如前所述，這類材料的等效物是已知的并且可在適當情況下取代。
[0073]在一些實施方案中，所感興趣的方法和材料進一步涉及必要或需要的額外組分。這類額外組分的實例包括著色劑、防腐劑、抗微生物劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和輔溶劑。
[0074]舉例來說,可存在抗微生物劑如Proclin (例如,Proclinl50、200、300等)、萬古霉素、青霉素等?？刮⑸飫┛梢约s0.001-0.5% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。
[0075]在一些實施方案中，可在制備所感興趣的標記組合物期間制成各種組分的儲備溶液。舉例來說，可制成任何組分(例如，染料化合物等)的儲備溶液，以例如幫助溶解組分或精確地測量組分體積。儲備溶液可使用水作為溶劑，或使用有機溶劑如二甲亞砜、異丙醇、乙醇或甲醇，或使用其組合來制成。
[0076]在一些實施方案中，所感興趣的方法和材料涉及以上識別組分的水溶液。應認識到存在于標記組合物中的各種組分的濃度可根據(jù)預定用途來變化。以上和以下段落提供存在于標記組合物中的材料濃度的一些準則。如在本文中指示，在一些實施方案中，標記組合物與將要分析的流體(例如，體液)組合。因此，雖然本文提供的準則涉及如存在于標記組合物中的各種組分的量，應認識到這類準則也可適用于標記組合物與將要分析的流體的組合(即，在一些實施方案中，如在本文描述的血液分析器中實際上分析的材料含有類似百分比和相對量的各種組分)。
[0077]在一些實施方案中，染料以預定濃度存在于標記組合物中。應認識到預定濃度可取決于染料特性(即，化學結構、對于核酸目標的結合親和力等)以及所使用的分析器的操作參數(shù)而變化。在一些實 施方案中，染料組分以至少染色存在于體液中的細胞量的所需量存在，如10個細胞/微升或更多，或50個細胞/微升或更多。舉例來說，染料以染色100，000個細胞/微升或更多，或200，000個細胞/微升或更多，或250，000個細胞/微升或更多的所需量存在。在一些實施方案中，存在的染料化合物的量在0.000001-0.5%，或0.00001-0.5%，或 0.0001-0.5%，或 0.001-0.1% (w/v)范圍內(nèi)。
[0078]在一些實施方案中，有機緩沖劑存在于標記組合物中。這類材料的實例包括有機胺，如三乙胺、三甲胺，和環(huán)胺如咪唑等。有機緩沖劑(與任何其它緩沖劑)可以產(chǎn)生和保持分析物組合物中的所需PH的所需量存在。
[0079]在一些實施方案中，含有所感興趣的染料的標記組合物等滲或大致上等滲(即，等滲的約20%內(nèi)，或等滲的約10%內(nèi)，或等滲的約5%內(nèi))。在一些實施方案中，含有所感興趣的染料的標記組合物具有中性PH或大致上中性pH(即，在約6-8，或約6.5-7.5的pH范圍內(nèi))。標記組合物的這些特性有助于減少樣品制備和分析期間對于任何類型的細胞的破壞，因此導致體液樣品的更精確細胞分析。
[0080]方法
[0081]在一些實施方案中，所感興趣的方法涉及使細胞群體與標記組合物接觸。在一些此類實施方案中，接觸涉及使標記組合物與含有將要分析的細胞的流體(例如，體液)混合。因此，在一些實施方案中，所感興趣的方法涉及將含有細胞的流體樣品用標記組合物稀釋，其中標記組合物包括水和染料，并且任選地包括如本文提供的那些其它組分。在一些此類實施方案中，所述方法涉及預定稀釋比下的單一稀釋步驟(即將標記組合物添加至流體樣品僅一次)，所述稀釋比提供用于熒光檢測和測量的分析物的最佳濃度。
[0082]在一些實施方案中，因為所感興趣的染料結合至DNA，所以沒有DNA的細胞在暴露于染料時不能夠形成染料復合物。因此，暴露于染料的沒有DNA的細胞在使用本文描述的方法分析時(例如，在暴露于熒光激發(fā)能量源時)不展現(xiàn)染料復合物的發(fā)射特性或由于自體熒光只發(fā)射最少或微弱熒光。相比之下，含有DNA的細胞能夠形成染料復合物。在用所感興趣的染料染色時，這類細胞在使用本文描述的方法分析時展現(xiàn)染料復合物的發(fā)射特性?？紤]到此區(qū)別，在一些實施方案中，所感興趣的方法提供區(qū)分含有DNA的細胞與沒有DNA的細胞的手段。在一些實施方案中，所感興趣的方法還提供區(qū)分含有細胞核的細胞與沒有細胞核的細胞的手段，尤其在細胞核含有DNA時。在一些實施方案中，基于熒光測量來提供區(qū)分，所述熒光測量觀察到來自細胞的熒光(指示存在DNA并且可能指示存在細胞核)或未觀察到熒光細胞(指示沒有DNA并且可能指示細胞中沒有細胞核)。另外，存在于所分析的流體中的非細胞事件(例如，沒有DNA的非細胞對象)通過不存在特有熒光發(fā)射來區(qū)分。
[0083]舉例來說，在RBC暴露于染料，成熟RBC (沒有細胞核并且沒有DNA)不形成染料復合物。因此，在使用本文描述的方法分析時，暴露于染料的RBC不展現(xiàn)染料復合物的發(fā)射特性。相比之下，WBC含有細胞核和DNA，并且因此在暴露于染料時形成染料復合物。因此，在一些實施方案中，所感興趣的方法允許在含有這類細胞的樣品中區(qū)分WBC與RBC。區(qū)分基于存在或不存在指示形成染料復合物的熒光信號。
[0084]除了如上所述的區(qū)分以外，所感興趣的染料與DNA之間的染料復合物的形成還允許在含有細胞的流體樣品中點計含有DNA的細胞。舉例來說，所感興趣的方法包括在含有這類細胞的流體樣品中點計WBC。點計基于在適合于計數(shù)細胞的方法中觀察到指示形成染料復合物的熒光。合適方法包括自動血液學分析器如流式細胞儀和其它基于熒光的細胞計數(shù)方法。
[0085]如在本文中提到，所感興趣的方法允許在含有WBC和其它對象(例如，RBC和非細胞事件)的樣品中點計和區(qū)分WBC。在一些實施方案中，樣品是流體如體液，并且含有極低濃度細胞，如在本文中更詳 細地描述。在一些實施方案中，本公開的方法進一步允許使用多角度散射技術將WBC分類成2部分、3部分或5部分區(qū)分。在某些實施方案中，RBC可使用多角度散射技術來進一步與其它非RBC顆粒分離。
[0086]在一些實施方案中，所感興趣的方法不涉及溶解劑并且在記錄數(shù)據(jù)之前不涉及使細胞溶解。舉例來說，所感興趣的方法在分析流體樣品之前不涉及將溶解劑添加至含有細胞的流體樣品。因此，在一些實施方案中，標記組合物不含有溶解劑。所分析的流體樣品不是溶解產(chǎn)物并且不含有經(jīng)由溶解從細胞釋放的細胞內(nèi)含物。在一些實施方案中，將要分析的流體樣品含有完整RBC并且這類RBC在熒光測量之前未溶解?！叭芙鈩币庥▽е嘛@著細胞溶解，尤其(但是不限于)RBC溶解的任何材料。溶解劑包括但不限于本領域中已知或后來發(fā)現(xiàn)的各種類型的表面活性劑、酶、抗體、PH調(diào)整劑、滲透劑(滲透壓調(diào)整劑)等。
[0087]因為溶解劑不涉及將要分析的流體樣品的制備，所以存在于流體中的WBC不受損，如果使用溶解劑，則其會或可能受損。這在含有WBC的體液中是尤其有利的，因為與全血中的WBC相比，其中包含的WBC通常更脆弱。
[0088]如上所述，在一些實施方案中，所感興趣的方法涉及用預定量標記組合物稀釋以提供所需稀釋比和所需分析物濃度。預定量可基于用于分析流體樣品的設備中的檢測極限來確定。在一些實施方案中，檢測極限通過相對于樣品注入速率(相對于流槽速率)、測量持續(xù)時間等來調(diào)整而進行優(yōu)化。舉例來說，具有1:10 (血液:試劑)稀釋比、4.0微升/秒注入速率和60秒樣品測量(數(shù)據(jù)收集)的原型分析器導致收集10個細胞/微升的樣品的近似240個事件，其足以支持精確細胞分析。
[0089]在一些實施方案中，所感興趣的方法適合于分析具有WBC的任何流體樣品。如前所述，這類流體樣品包括體液，并且也包括其它流體樣品，如細胞的制備水溶液，基于植物和從植物獲得的溶液等，尤其當這類樣品流體含有低細胞計數(shù)(例如，少于40個細胞/微升，或少于30個細胞/微升等)。
[0090]在一些實施方案中，所感興趣的方法提供在含有WBC并且任選地含有RBC的樣品流體中點計和區(qū)分WBC的簡單、可靠和精確手段。使用自動血液學分析器的熒光檢測確保精確度和可靠性，并且使用單一步驟稀釋提供樣品制備的簡單性。含有細胞的樣品流體用標記組合物中包含的熒光標記來染色，其中熒光標記滲透細胞壁并且結合至DNA以產(chǎn)生染料復合物。染色WBC發(fā)出指示染料復合物的熒光發(fā)射信號，而RBC不發(fā)出這類信號或發(fā)出顯著較低強度的這類信號。標記組 合物不含溶解劑并且沒有溶解劑添加至樣品流體，從而保護所存在的WBC。最佳檢測極限通過調(diào)整變量包括樣品流速、檢測頻率等來確定。
[0091]分析WBC的方法和執(zhí)行這類方法的系統(tǒng)的額外方面可發(fā)現(xiàn)于2011年5月4日提交的共同待決美國臨時專利申請序列號61/482，541，以及2011年5月4日提交的共同待決美國臨時專利申請序列號61/482，549中，其公開內(nèi)容以引用方式整體并入本文。
[0092]輸出和優(yōu)勢
[0093]在一些實施方案中，分析染色流體產(chǎn)生適合于多維度數(shù)據(jù)分析、圖表等的各種信息。舉例來說，在一些實施方案中，本文描述的方法提供精確總WBC計數(shù)。在一些實施方案中，所述方法提供關于樣品中的不同類型WBC的相對比例(例如，嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和/或單核細胞或其各種組合的細胞計數(shù))的數(shù)據(jù)。這類數(shù)據(jù)可用作例如治療患者的診斷信息。
[0094]如在本文中提到，在一些實施方案中，所感興趣的方法涉及通過引入染料來將流體樣品中的WBC選擇性染色，所述染料選擇性結合至DNA并且在以這種方式結合時發(fā)出熒光。因此，染色樣品流體的分析包括與來源于沒有染料復合物的細胞(例如，RBC)的微弱或不存在的熒光發(fā)射比較，記錄到來源于含有染料復合物的細胞(例如，WBC)的更強的熒光發(fā)射。熒光測量可使用，例如，多通道光學散射分析器來獲得。
[0095]在一些實施方案中，所感興趣的材料和方法允許體液和適用于例如醫(yī)用診斷的其它流體的細胞分析。通過本文中的方法能夠進行具有極低細胞計數(shù)(例如，少于40/μ L，或少于lO/yL等)的流體樣品的細胞分析，包括具有特別脆弱細胞的體液。所述方法的簡單性允許從患者抽取樣品之后1-2小時內(nèi)分析這類樣品，從而也有助于分析脆弱細胞。本文描述的組合物和方法中不存在細胞溶解劑進一步增加分析含有脆弱細胞的樣品的能力。所感興趣的流體中的脆弱細胞的破壞潛在地導致不精確的分析如不精確的細胞計數(shù)和細胞區(qū)分。
[0096]本文描述的方法提供的最佳稀釋比率是優(yōu)于傳統(tǒng)血液學分析的進一步改進。舉例來說，傳統(tǒng)血液學分析器所使用的稀釋比率(即對于RBC稀釋來說血液:稀釋劑=1:300)不足夠敏感以支持測量具有極低細胞濃度的樣品。相比之下，在一些實施方案中，本文中的方法允許單一稀釋提供最佳熒光檢測的最佳稀釋比。
[0097]本公開的方法是簡單的，例如，在一些實施方案中，只需要單一試劑和單一稀釋。在一些實施方案中，稀釋比率可容易地調(diào)整和/或優(yōu)化。此外，本公開的方法簡單實施，并且可在不需要廣泛調(diào)整和/或修改的情況下例如在傳統(tǒng)血液分析器上執(zhí)行。
[0098]基于本文提供的公開內(nèi)容，包括以下實施例，這些和其它優(yōu)勢是本領域技術人員顯而易知的。
[0099]實施例
[0100]一般試驗程序:(A)改變CELL-DYN Sapphire血液分析器的流動腳本和算法以允許它用于體液測定。(B)所有體液(BF)測定使用(稍微改變)WBC擴展計數(shù)模式來進行:BF樣品抽吸(約120 μ L)，隨后樣品(BF)與試劑(Sapphire網(wǎng)織紅細胞試劑)混合，比率為I比35，隨后將混合樣品孵育(40°C x25秒)，隨后將孵育樣品傳輸至流槽以測量(32秒測量)，隨后數(shù)據(jù)收集，原始數(shù)據(jù)記錄為.fcs文件，隨后使用軟件如FCS Express來分析原始數(shù)據(jù)。
[0101]所有參考結果使用標準手冊腔室計數(shù)程序來測量。
[0102]試劑使用以下組分和濃度來配制:
[0103]
13?濃度1

咪唑0.3400%

IN HCl2.5325%

NaCl0.6800%
Proclin300 0.0315%
BIGCHAP 0.0050%
SYBRll 0.0002%
DMSO20.0220%


至 100%
[0104]1IV0= lg/1 OOmL
[0105]2DMSO (二甲亞砜)用于制得染料組分的儲備溶液。
[0106]實施例1
[0107]分析低細胞計數(shù)樣品
[0108]具有1:35 (血液:試劑)稀釋比、2.3微升/秒注入速率和32秒樣品測量(數(shù)據(jù)收集)的原型分析器導致收集10細胞/微升的樣品的超過20個事件。
[0109]圖2A和2B展示體液樣品的細胞分析的散點圖。細胞在分析之后加以點計:WBC=89/μ L (參考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L (參考=1733/μ L)。圖 3Α 和 3B 展示另一個體液樣品的細胞分析的散點圖。細胞在分析之后加以點計=WBC = 0.95/μ L(參考=0.33/μ L) ；RBC = 142/μ L (參考=122/μ L)。[0110]實施例2
[0111]分析極低細胞計數(shù)樣品
[0112]在使用稀釋血沉棕黃層樣品的研究中進一步驗證檢測極限。使用連續(xù)稀釋來制備六個水平的稀釋血沉棕黃層樣品。六個水平稀釋血沉棕黃層樣品的FLl相比于IAS散點圖展示于圖4A-4F。圖5展示W(wǎng)BC的相關性(測量相比于計算)。獲得很好相關性:(A)對于所有六個水平來說，Y = 1.0239X-4.9 (R2 = 0.9984)，并且(B)對于具有最低細胞濃度的三個水平來說，Y=L 0787X-1.5 (R2 = 0.9598)。
[0113]實施例3
[0114]1: 35稀釋比的體液樣品的細胞分析
[0115]進行綜合體液研究以評估本文提供的方法?？偣?1個體液樣本，包括CSF液、胸膜液、腹膜液和腹水，在原型分析器上以1:35(血液:試劑)稀釋比、2.3微升/秒注入速率和32秒樣品測量(數(shù)據(jù)收集)來進行測量和分析。WBC和RBC的參考值通過手動腔室計數(shù)來獲得。
[0116]在如上所述方法與參考方法之間獲得WBC的極好相關性(圖6) =(A)Y = 1.1305X-9.8411，R2 = 0.997(完全范圍，多達近似 40，000/μ L) ； (B) Y = 1.017Χ+7.1395，R2=0.9765 ?2, 000/μ L) ； (C)Y = 1.0899X+1.1253, R2 = 0.9663 ?200/μ L)；和(D)Y =
1.149X+1.1461，R2 = 0.8459 (〈50/μ L)。在如上所述方法與參考方法之間獲得RBC的很好相關性(圖 7) =(A)Y = 0.8996X+403.62, R2 = 0.9595 (完全范圍，多達近似 200，000/μ L) ； (B) Y = 1.0833Χ-11.427, R2 = 0.9513 ?3, 000/μ L) ； (C) Y = 0.979X-1.0747，R2 =
0.8284 ?200/μ L);和(D) Y = 0.9994X+0.5951，R2 = 0.6917 (〈50/μ L)。對于 RBC 分析，具有許多RBC影的樣品未包括于相關分析中。
[0117]實施例4
[0118]1:10稀釋比的體液樣品的細胞分析
[0119]進行另一個綜合體液研究以評估本文提供的方法。總共155個體液樣本，包括CSF液、胸膜液、腹膜液和腹水，在原型分析器上以1:10(血液:試劑)稀釋比、2.3微升/秒注入速率和32秒樣品測量(數(shù)據(jù)收集)來進行測量和分析。WBC和RBC的參考值通過手動腔室計數(shù)來獲得。
[0120]甚至對于具有低端WBC濃度的樣品，在如上所述方法與參考方法之間獲得WBC的極好相關性(圖 8):Y = 1.1327Χ+1.1937，R2 = 0.8195 (WBC<50/μ L, 72 個樣品)。甚至對于具有低端RBC濃度的樣品，在如上所述方法與參考方法(圖9)之間獲得WBC的很好相關性:Y = 0.8244Χ+0.6128，R2 = 0.7465 (RBC〈50/ μ L, 38 個樣品)。對于 RBC 分析，具有許多RBC影的體液樣品未包括于相關分析中。
【權利要求】
1.一種用于分析含有細胞的體液的方法，所述方法包括: 用熒光染料將所述體液染色，其中所述熒光染料滲透細胞膜并且結合至核酸以在所述細胞內(nèi)形成染料復合物； 用來自能量源的能量照射所述染色體液；并且 測量所述染色體液中的由所述染料復合物發(fā)出的熒光信號。
2.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述體液包含少于約20個細胞/微升。
3.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述體液包含大于約20個細胞/微升。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述能量源產(chǎn)生具有所述可見光譜中的波長的單色光，并且其中所述單色光的所述波長與所述熒光信號的所述波長是不同的。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中與所述染料復合物相比，未結合熒光染料在用來自能量源的能量照射時發(fā)出較少熒光。
7.如前述權利要求中任一項所述的方法，在未結合至所述核酸時，未結合熒光染料在用來自所述能量源的能量照射時不發(fā)熒光，以使得沒有所述染料復合物的細胞不發(fā)出熒光信號。
8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其進一步包括基于所述熒光染料的存在或不存在，來區(qū)分具有細胞核的細胞與沒有細胞核的細胞。
9.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述測量涉及點計并且區(qū)分紅細胞(RBC)與白細胞(WBC)。
10.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述方法在所述測量之前不涉及使RBC溶解。
11.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述體液包含完整WBC和RBC。
12.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述測量使用自動血液分析器、流式細胞儀，或用于體液樣品的另一種診斷分析器來執(zhí)行。
13.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述測量包括使所述體液流經(jīng)血細胞計數(shù)器中的流槽。
14.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述熒光染料提供于組合物中，所述組合物進一步包括水。
15.一種用于分析流體的方法，其中所述流體含有少于約40個細胞/微升，所述方法包括: 使所述流體與熒光染料接觸，其中所述熒光染料滲透細胞膜并且結合至核酸以在所述細胞內(nèi)形成染料復合物； 用來自能量源的能量照射所述流體；并且 測量所述流體中的由所述染料復合物發(fā)出的熒光信號。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述流體含有少于約20個細胞/微升。
17.如權利要求15至16中任一項所述的方法，其中所述流體含有少于約5個細胞/微升。
18.如權利要求15至17中任一項所述的方法，其中所述流體是體液。
19.如權利要求15至18中任一項所述的方法，其中所述流體是生物流體。
20.一種用于區(qū)分細胞的方法，所述方法包括: 使所述細胞與包含熒光染料的溶液接觸，其中所述熒光染料是水溶性的、滲透細胞膜，并且結合至核酸； 用來自激發(fā)光源的激發(fā)光照射所述細胞； 測量來自所述細胞的光發(fā)射； 基于所述測量的光發(fā)射來區(qū)分含有核酸的所述細胞與沒有核酸的所述細胞；并且基于使用一個或多個光散射檢測器從所述樣品獲得的多個光學數(shù)據(jù)，將所述細胞分類為白細胞(WBC)或紅細胞(RBC)。
21.一種用于分析體液的組合物，所述組合物包含水和熒光染料，其中所述熒光染料是水溶性的、滲透細胞膜，并且結合至核酸。
22.—種血液學系統(tǒng),其包括: 用于保持樣品的樣品保持器； 用于將染色組合物與至少一部分所述樣品混合的混合容器； 用于存儲所述染色組合物的存儲容器，其中所述染色組合物包含滲透細胞膜并且結合至核酸的染料，并且 其中所述染料在結合至核酸時發(fā)熒光； 流槽； 用于將電磁能施加至所述流槽的至少一個能量源； 用于檢測來源于所述流槽內(nèi)的熒光的檢測器；和 用于檢測散射的可見光的一個或多個可見光檢測器。
23.如權利要求22所述的血液學系統(tǒng)，其進一步包括抽吸機構，所述抽吸機構用于抽吸至少一部分來自所述樣品保持器的所述樣品并且將其移動至所述混合容器。
24.如權利要求22至23中任一項所述的血液學系統(tǒng)，其進一步包括抽吸機構，所述抽吸機構用于抽吸所述染色組合物并且將其從所述存儲容器移動至所述混合容器。
25.如權利要求22至24中任一項所述的血液學系統(tǒng)，其中所述至少一個能量源產(chǎn)生波長λ I下的單色光。
26.如權利要求22至25中任一項所述的血液學系統(tǒng)，其中當所述染料結合至核酸時，所述染料吸收波長λ I下的光并且發(fā)出波長λ 2下的光。
27.如權利要求22至26中任一項所述的血液學系統(tǒng)，其中所述檢測器檢測波長λ2下的光。
28.如權利要求22至27中任一項所述的血液學系統(tǒng)，其進一步包括用于提供非單色可見光的至少一個額外能量源。
29.如權利要求22至28中任一項所述的血液學系統(tǒng)，其中所述樣品是體液。
30.一種用于制備血液學系統(tǒng)的方法,所述方法包括: 提供用于將至少一部分將要分析的樣品與染色組合物混合的混合容器； 提供用于存儲所述染色組合物的存儲容器，其中所述染色組合物包含滲透細胞膜并且結合至核酸的染料，并且其中所述染料在結合至核酸時發(fā)熒光； 提供流槽； 建立穩(wěn)定核心流以允許所述樣品穿過所述流槽；定位用于將電磁能提供至所述流槽的能量源；并且 定位用于檢測從所述流槽內(nèi)發(fā)出的熒光的檢測器。
31.一種制備用于分析體液的容器的方法，所述方法包括將包含能夠滲透細胞膜并且結合至核酸的染料的組合物添加至所述容器，其中所述染料在結合至核酸時發(fā)熒光，并且其中所述容器是血液 學系統(tǒng)的一體化或模塊化部分。
【文檔編號】C12M3/00GK104024437SQ201280064502
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權日:2011年12月27日
【發(fā)明者】吳炯, 艾米麗·H.·林, 楊金平 申請人:雅培制藥有限公司