胚珠特異性啟動子及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于調(diào)節(jié)異源核苷酸序列在植物中的表達的組合物和方法。組合物包含擬南芥(AT?SVL3)啟動子的核苷酸序列。還提供了使用本文公開的啟動子序列在植物中表達異源核苷酸序列的方法。
【專利說明】胚珠特異性啟動子及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體而言涉及植物中基因表達的調(diào)節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0002]異源DNA序列在植物宿主中的表達有賴于在該植物宿主中有功能的可操作連接的調(diào)節(jié)元件的存在。啟動子序列的選擇將決定在生物體中何時和何處表達異源DNA序列。需要在特定組織或者器官中表達的情況下，可以使用組織優(yōu)選啟動子。需要應(yīng)答于刺激而表達基因的情況下，誘導(dǎo)型啟動子是首選的調(diào)節(jié)元件。相比之下，在需要在植物的整個細胞中持續(xù)表達的情況下，采用組成型啟動子?？梢栽谵D(zhuǎn)化載體的表達構(gòu)建體中包括位于核心啟動子序列上游和/或下游的另外調(diào)節(jié)序列，以便引起異源核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中不同水平的表達。
[0003]常常需要在植物的特定組織或器官中表達DNA序列。例如，可以通過遺傳操縱植物的基因組以包含可操作連接到異源病原體抗性基因的組織優(yōu)選啟動子，從而在所需植物組織中產(chǎn)生病原體抗性蛋白質(zhì)，實現(xiàn)植物對土源和空氣源病原體感染的抗性增加?；蛘撸赡苄枰种浦参锝M織內(nèi)的天然DNA序列的表達以實現(xiàn)所需的表型。在這種情況中，可以如下實現(xiàn)這種抑制:將植物轉(zhuǎn)化以使其包含可操作連接到反義核苷酸序列的組織優(yōu)選啟動子，從而該反義序列的表達產(chǎn)生了干擾天然DNA序列的mRNA翻譯的RNA轉(zhuǎn)錄物。
[0004]此外，可能需要在處于特定生長或發(fā)育階段(例如細胞分裂或伸長)的植物組織中表達DNA序列。這種DNA序列可用于促進或抑制植物生長過程，從而影響植物的生長速率或架構(gòu)。
[0005]為了影響植物的各種性狀以及為了與可評分標志物一起使用，需要分離和表征胚珠優(yōu)選的啟動子，特別是能在種子發(fā)育早期充當目的分離核苷酸序列的表達的調(diào)節(jié)元件的啟動子。
[0006]發(fā)明概沭
[0007]提供用于調(diào)節(jié)植物中基因表達的組合物和方法。組合物包含在授粉之前、授粉過程中和授粉之后在胚珠組織中活躍的啟動子的新型核苷酸序列。此類優(yōu)選表達對于篩選不定胚生殖是特別合乎需要的。更具體而言，該啟動子在胚珠中活躍，大約在受精時和在受精之前直至球形胚形成為止主要在擬南芥(Arabidopsis)的內(nèi)珠被的珠孔端。本發(fā)明的某些實施例包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列及其功能片段，其驅(qū)動可操作連接的核苷酸序列的胚珠優(yōu)選表達。本發(fā)明的實施例還包括包含可操作連接到目的異源核苷酸序列的啟動子的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子能夠驅(qū)動所述核苷酸序列在植物細胞中的表達，并且所述啟動子包含本文公開的核苷酸序列中的一個。本發(fā)明的實施例還提供表達載體，以及在其基因組中穩(wěn)定摻入了如上所述的DNA構(gòu)建體的植物或植物細胞。另外，組合物包括這種植物的轉(zhuǎn)基因種子。具有這種優(yōu)選的空間和時序表達的啟動子對于通過雙子葉植物中種子的無性繁殖是特別合乎需要的。通過種子的無性繁殖將會用于保持經(jīng)多代的穩(wěn)定的基于雜交的雜種優(yōu)勢。[0008]另外的實施例包括在植物中選擇性表達核苷酸序列的方法，該方法包括用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，并從所述植物細胞再生出轉(zhuǎn)化植物，所述DNA構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟動子和可操作連接到所述啟動子的異源核苷酸序列，其中所述啟動子啟動所述核苷酸序列在再生的植物中的胚珠優(yōu)選轉(zhuǎn)錄。按這種方式，啟動子序列可用于以組織優(yōu)選方式控制可操作連接的編碼序列的表達。
[0009]在啟動子的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的下游將是目的序列，其將提供對植物的表型的修飾。這種修飾包括調(diào)節(jié)內(nèi)源產(chǎn)物的生成(數(shù)量、相對分布等方面)或者外源表達產(chǎn)物的生成，以在植物中提供新穎的或者經(jīng)調(diào)節(jié)的功能或產(chǎn)物。例如，涵蓋編碼這樣的基因產(chǎn)物的異源核苷酸序列，該基因產(chǎn)物賦予對除草劑、鹽、寒冷、干旱、病原體、線蟲或昆蟲的抗性或耐受性。
[0010]在另一個實施例中，提供了調(diào)芐基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物中的表達的方法，該方法包括以下步驟:(a)用包含與至少一個核苷酸序列可操作連接的本發(fā)明的啟動子的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞；(b)使該植物細胞在植物生長條件下生長，以及(C)從其中該連接的核苷酸序列的表達改變該植物的表型的植物細胞再生出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1(A和B)示出了可操作連接到啟動子AT-SLV3(PHP43852)的異源基因(OTS)在處于四核大配子體階段的幼胚珠中的表達模式。表達在胚珠珠孔所在半部(micropylarhalf)處的珠被中發(fā)生，而不在胚囊中發(fā)生。圖1A為透明的擬南芥胚珠的彩色微分干涉差(DIC)圖像，示出了藍色的GUS染色。圖1B為使用亮場光學(xué)器件獲得的相同胚珠的灰度圖，靛藍GUS晶體作為小的黑色顆?？梢姟?br> [0012]圖2(A和B)示出了可操作連接到啟動子AT-SLV3(PHP43852)的異源基因(OTS)在處于八核大配子體階 段 的胚珠中的表達模式。表達在整個胚珠的珠被中發(fā)生，不同的是合點的四分之一僅顯示弱表達。現(xiàn)在可在胚囊中看到一些表達。圖2A為透明的擬南芥胚珠的彩色DIC圖像，示出了藍色的GUS染色。圖2B為使用亮場光學(xué)器件獲得的相同胚珠的灰度圖。
[0013]圖3(A和B)示出了可操作連接到啟動子AT-SLV3(PHP43852)的異源基因(CTS)在處于接合子階段的胚珠中的表達模式。表達在胚珠珠孔所在半部處的珠被和胚囊中發(fā)生。圖3A為透明的擬南芥胚珠的彩色DIC圖像，示出了藍色的⑶S染色。圖3B為使用亮場光學(xué)器件獲得的相同胚珠的灰度圖。
[0014]圖4(A和B)示出了可操作連接到啟動子AT-SLV3(PHP43852)的異源基因(CTS)在處于接合子階段的胚珠中的表達模式。表達在除珠柄之外的整個胚珠的珠被中觀察到。表達在珠孔的珠被中尤其強烈。表達在胚囊內(nèi)也很顯著。只有珠柄未顯示出表達。圖4A為透明的擬南芥胚珠的彩色DIC圖像，示出了藍色的GUS染色。圖4B為使用亮場光學(xué)器件獲得的相同胚珠的灰度圖。
[0015]圖5(A和B)示出了可操作連接到啟動子AT-SLV3(PHP43852)的異源基因(CTS)在處于早期球形胚階段的胚珠中的表達模式。弱表達在除珠柄之外的整個胚珠的珠被中和胚囊內(nèi)發(fā)生。圖5A為透明的擬南芥胚珠的彩色DIC圖像，示出了藍色的⑶S染色。圖5B為使用亮場光學(xué)器件獲得的相同胚珠的灰度圖。
[0016]圖6(A-D)示出了包含連接到⑶S(PHP43852)的AT-SLVL3啟動子的表達盒的活性。啟動子AT SVL3 (AT3G20520)在大配子體發(fā)生過程(megagametogenesis)的早期顯示出表達(A和B)。在四核大配子體階段，表達最初在珠孔的內(nèi)珠被和外珠被中較強，且遍布整個胚珠的珠被。通過接合子階段(C和D)，表達強度已在珠被組織中增大。另外，胚乳和胚現(xiàn)在顯示出弱表達。表達在珠柄中不存在。圖6A和C為透明的擬南芥胚珠的彩色DIC圖像，示出了藍色的GUS染色。圖6B和D為使用亮場光學(xué)器件獲得的相同胚珠的灰度圖。
[0017]發(fā)明詳沭
[0018]本發(fā)明涉及針對植物啟動子的組合物和方法以及它們的應(yīng)用方法。組合物包含被稱為AT SVL3的胚珠體細胞組織優(yōu)選啟動子的核苷酸序列。組合物還包含DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含可操作連接至目的異源核苷酸序列的AT SVL3啟動子區(qū)的核苷酸序列。具體地講，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列以及其片段、變體和互補序列的分尚的核酸分子。
[0019]本發(fā)明的AT SVL3啟動子序列包括可以在植物中引發(fā)轉(zhuǎn)錄的核苷酸構(gòu)建體。在具體的實施例中，AT SVL3啟動子序列可以以組織優(yōu)選方式、更具體地講以胚珠體細胞組織優(yōu)選方式引發(fā)轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的這種構(gòu)建體包括與植物發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。因此，本發(fā)明的組合物包括包含可操作連接到植物啟動子的目的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體，該植物啟動子具體地講是胚珠體細胞組織優(yōu)選啟動子序列，更具體而言是擬南芥SVL3啟動子序列。包含擬南芥SVL3啟動子區(qū)的序列在SEQ ID NO:9中示出。
[0020] 表1
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種分尚的核酸分子,所述分尚的核酸分子包含選自以下的多核苷酸: (a)包含SEQID NO:9核苷酸序列的核苷酸序列； (b)包含SEQID NO:9核苷酸序列的片段或變體的核苷酸序列，其中所述序列在植物細胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄； (C)與(a)或(b)的所述多核苷酸互補的多核苷酸。
2.一種表達盒，所述表達盒包含可操作連接到目的異源多核苷酸的權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
3.一種載體,所述載體包含權(quán)利要求2所述的表達盒。
4.一種植物細胞,所述植物細胞包含權(quán)利要求2所述的表達盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物細胞，其中所述表達盒被穩(wěn)定整合到所述植物細胞的基因組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物細胞，其中所述植物細胞來自單子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物細胞，其中所述單子葉植物選自包含下列的組:玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱、粟、甘蔗和裸麥。
8.一種植物,所述 植物包含權(quán)利要求2所述的表達盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物，其中所述單子葉植物選自包含下列的組:玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱、粟、甘鹿和裸麥。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物，其中所述雙子葉植物選自包含下列的組:大豆、蕓苔屬物種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-12中任一項所述的植物，其中所述表達盒被穩(wěn)定整合到所述植物的所述基因組中。
14.一種權(quán)利要求8所述的植物的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述種子包含所述表達盒。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述目的異源多核苷酸編碼參與器官發(fā)育、干細胞發(fā)育、細胞生長刺激、器官發(fā)生、胚發(fā)生啟動、自繁殖植物和頂端分生組織發(fā)育的基因產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植物，其中所述基因選自:WUS、CLAVATA、Babyboom、LECdeafy cotyledon)、MYBl 15 和 MYBl 18 基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述目的異源多核苷酸編碼賦予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草劑耐受性、病原體抗性或昆蟲抗性的基因產(chǎn)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸的表達改變所述植物的表型。
19.一種在植物或植物細胞中表達多核苷酸的方法，所述方法包括將包含可操作連接到目的異源多核苷酸的啟動子的表達盒引入到所述植物或所述植物細胞中，其中所述啟動子包含選自以下的核苷酸序列: (a)包含SEQID NO:9核苷酸序列的核苷酸序列； (b)包含SEQID NO:9核苷酸序列的片段或變體的核苷酸序列，其中所述序列在植物細胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄； (C)與(a)或(b)互補的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述目的異源多核苷酸編碼參與器官發(fā)育、干細胞發(fā)育、細胞生長刺激、器官發(fā)生、胚發(fā)生啟動、自繁殖植物和頂端分生組織發(fā)育的基因產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述基因選自:WUS、CLAVATA、Babyboom、LECdeafy cotyledon)、MYBl 15 和 MYBl 18 基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述目的異源多核苷酸編碼賦予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草劑耐受性、病原體抗性或昆蟲抗性的基因產(chǎn)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述目的異源多核苷酸優(yōu)先在所述植物的早期胚珠體細胞組織中表達。
25.一種優(yōu)先在植物的胚珠組織中表達多核苷酸的方法，所述方法包括將表達盒引入到植物細胞中并從所述植物細胞再生出植物，所述植物在其基因組中穩(wěn)定摻入了所述表達盒，所述表達盒包含可操作連接到目的異源多核苷酸的啟動子，其中所述啟動子包含選自以下的核苷酸序列: (a)包含SEQID NO:9核苷酸序列的核苷酸序列； (b)包含SEQID NO:9核苷酸序列的片段或變體的核苷酸序列，其中所述序列在植物細胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄； (C)與(a)或(b)互補的核苷酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目的異源多核苷酸編碼影響器官發(fā)育、干細胞發(fā)育、細胞生長刺激、器官發(fā)生、胚發(fā)生啟動、自繁殖植物和頂端分生組織發(fā)育的基因產(chǎn)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因選自:WUS、CLAVATA、Babyboom、LECdeafy cotyledon)、MYBl 15 和 MYBl 18 基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述目的異源多核苷酸編碼賦予干旱耐受性、寒冷耐受性、除草劑耐受性、病原體抗性或昆蟲抗性的基因產(chǎn)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
【文檔編號】C12N15/82GK104039966SQ201280066342
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月6日
【發(fā)明者】M.A.錢伯林, S.J.拉維特 申請人:先鋒國際良種公司