用于治療巨細(xì)胞病毒的組合物和方法
【專利摘要】本公開提供了可用于治療HCMV感染的組合物和方法。如本文所述，所述組合物和方法基于開發(fā)包含病毒樣顆粒(VLP)的免疫原性組合物，所述病毒樣顆粒包含一個(gè)或更多個(gè)莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)核心蛋白并且包含一個(gè)或更多個(gè)HCMV表位，例如來自HCMV的包膜糖蛋白gB和/或gH和/或被膜蛋白pp65。除了其他方面以外，本發(fā)明涵蓋了可導(dǎo)致有益免疫應(yīng)答的抗原(例如，包膜糖蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白)之組合的識(shí)別，所述免疫應(yīng)答包括例如體液應(yīng)答(例如中和抗體的產(chǎn)生)和細(xì)胞應(yīng)答(例如T細(xì)胞活化)二者。
【專利說明】用于治療巨細(xì)胞病毒的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2011年11月11日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/558, 800和于2012 年6月1日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/654, 157的優(yōu)先權(quán)，二者的內(nèi)容通過引用整體并入本 文。

【背景技術(shù)】
[0003] 人巨細(xì)胞病毒（HCMV) ( 0-皰疹病毒）是一種無所不在的病原體。在免疫正常的 人中HCMV感染通常被忽視，其具有最溫和的且非特異性的癥狀。相比之下，某些高危人群， 例如在免疫抑制患者（例如AIDS患者或移植受者）中，以及產(chǎn)前感染后，HCMV感染具有 嚴(yán)重的表現(xiàn)（StarasSA等，2006ClinInfectDis43(9):1143-51;HebartH等，2004Hum 1臟11]1〇165(5):432-6;1?〇￥811&111六1'等，20051'四118卩1&1^&1:;[01179(4):381-6)?，F(xiàn)有的治療 方法包括使用免疫球蛋白和抗病毒制劑（例如更昔洛韋及其衍生物），其在高危人群中預(yù) 防性使用或在非常早期的感染過程中使用時(shí)是最有效的。然而，現(xiàn)有療法的特征為顯著的 毒性和有限的療效，尤其是對晚發(fā)性疾?。˙oeckhM.，2004PediatrTransplants(增刊5): 19-27;LimayeAP.，2004Transplantation78 (9) : 1390-6)，而且他們對先天性HCMV疾病尚 無影響。開發(fā)有效的疫苗來防止HCMV疾病被認(rèn)為是重要的公共衛(wèi)生優(yōu)先事項(xiàng)（ArvinAM 等，2004ClinInfectDis39(2) :233-9)。
[0004] 發(fā)明概述
[0005] 除了其他方面以外，本發(fā)明提供了可用于預(yù)防、治療和/或研究人巨細(xì)胞病毒 (HCMV)感染的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP)，其包含一個(gè)或更多個(gè)莫洛尼鼠白血病病毒（MoloneyMurineleukemia virus，MMLV)核心蛋白并且包含一個(gè)或更多個(gè)HCMV表位，例如來自HCMV的包膜糖蛋白gB 和/或gH和/或被膜蛋白pp65。除了其他方面以外，本發(fā)明涵蓋了抗原（例如，包膜糖蛋 白和結(jié)構(gòu)蛋白）之組合可導(dǎo)致有益的免疫應(yīng)答之誘導(dǎo)改善，所述免疫應(yīng)答包括例如體液應(yīng) 答（例如中和抗體的產(chǎn)生）和細(xì)胞應(yīng)答（例如T細(xì)胞活化）二者?？商峁┑腣LP特征在于 他們不含有病毒DNA并且無感染性。
[0006] 在一些實(shí)施方案中，提供的VLP被脂質(zhì)膜包圍，任選地含有來自病毒包膜糖蛋白 (例如gB和/或gH)的一個(gè)或更多個(gè)表位，其是在病毒中和抗體的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用的抗原。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，提供的VLP含有來自病毒結(jié)構(gòu)蛋白（例如pp65)的一個(gè)或更 多個(gè)表位，其是在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答（例如T細(xì)胞應(yīng)答）中發(fā)揮作用的抗原。在一些實(shí)施 方案中，利用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白（例如PP65)不僅刺激T輔助細(xì)胞的形成還誘導(dǎo)抗HCMV的細(xì) 胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了病毒包膜糖蛋白（例如gB和/或gH)的變體。 在一些實(shí)施方案中，變體病毒包膜糖蛋白為融合蛋白或包含融合蛋白。在一些實(shí)施方案中， 病毒糖蛋白的變體包含異源蛋白結(jié)構(gòu)域（例如，來自不同蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域）。 在一些實(shí)施方案中，病毒結(jié)構(gòu)蛋白的變體包含異源抗原或表位。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明 提供了包含病毒結(jié)構(gòu)蛋白之變體的VLP。在一些實(shí)施方案中，病毒結(jié)構(gòu)蛋白的變體為融合蛋 白或包含融合蛋白。
[0009] 本申請中所用的術(shù)語"約"和"大約"等同使用。在本申請中使用的帶有或不帶有 約/大約的任意數(shù)值意味著涵蓋被相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解的任何正常波動(dòng)。
[0010] 本發(fā)明的其他特性、目的和益處在以下的詳細(xì)描述中將變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理 解，盡管所述詳細(xì)描述顯示了本發(fā)明的實(shí)施方案，其僅通過舉例說明的方式給出而非限制。 從該詳細(xì)描述，本發(fā)明范圍內(nèi)的多種改變和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 附圖僅用于舉例說明目的而非限制。
[0012] 圖1示出DNA表達(dá)質(zhì)粒圖譜⑷和示例性重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（B)。
[0013] 圖2示出HEK293包裝細(xì)胞上示例性異源表面抗原的FACS分析（A)和示例性VLP 組合物中異源抗原表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析（B)。
[0014] 圖3 (A)和（B)示出兩種示例性VLP組合物的顆粒大小測定和多分散指數(shù)。
[0015]圖 4 示出在用示例性gB/pp65 (A)、gH-G/pp65 (B)或gB/gH-G/pp65 (C)VLP組合物 處理之小鼠中的ELISA效價(jià)。
[0016] 圖5示出用示例性VLP組合物處理的小鼠中的中和抗體活性（在人成纖維細(xì)胞中 測定）。
[0017] 圖6示出用示例性VLP組合物處理的小鼠中的中和抗體活性（在人上皮細(xì)胞中測 定）。
[0018] 圖7示出用示例性VLP組合物相對于重組gB蛋白處理的小鼠中的中和抗體活性 (在人成纖維細(xì)胞中測定）。
[0019] 圖8示出用HEK293細(xì)胞中表達(dá)的示例性VLP組合物處理之小鼠中的抗原特異性 CTL應(yīng)答，其描述為基于CFSE衰減、選通⑶3+⑶8+T細(xì)胞的CTL頻率（A)或pp65-特異性CTL 增殖的頻率（B)。
[0020] 圖9示出用HEK293細(xì)胞中表達(dá)的示例性VLP組合物處理的兔中的抗-gB和中和 抗體效價(jià)（在人成纖維細(xì)胞中測定）。
[0021] 圖10示出用HEK293細(xì)胞中表達(dá)的示例性VLP組合物處理的兔中的中和抗體效價(jià) (在人上皮細(xì)胞中測定）。
[0022] 圖11示出通過（A)切向流過濾（TFF)或⑶陰離子交換（AEX)色譜純化的CH0 細(xì)胞中表達(dá)的示例性VLP組合物之負(fù)染電子顯微鏡（EM)圖像。
[0023] 圖12示出用在CH0細(xì)胞中表達(dá)并通過切向流過濾（TFF)和陰離子交換（AEX)色 譜純化的示例性VLP組合物處理之兔中的中和抗體效價(jià)（在人成纖維細(xì)胞中測定）。
[0024] 圖13示出用通過切向流過濾（TFF)和陰離子交換（AEX)色譜純化的CH0細(xì)胞中 表達(dá)的示例性VLP組合物處理之兔中的中和抗體效價(jià)（在人上皮細(xì)胞中測定）。
[0025] 圖14示出用在CH0細(xì)胞中表達(dá)并通過切向流過濾（TFF)和陰離子交換（AEX)色 譜純化的示例性VLP組合物處理之兔中產(chǎn)生的抗體之親和力指數(shù)。
[0026] 定義
[0027] 為了本發(fā)明變得更易于理解，下文中首先對某些術(shù)語進(jìn)行定義。以下術(shù)語和其他 術(shù)語的另外定義列在整個(gè)說明書中。
[0028] 氨基酸：本文所用的術(shù)語"氨基酸"以其最廣泛的含義，指可被并入多肽鏈的任何 化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，氨基酸具有通式結(jié)構(gòu)!1#-〇〇1)〇〇-(1)011。在一些 實(shí)施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，氨基酸是合成的氨基酸；在 一些實(shí)施方案中，氨基酸是d_氨基酸；在一些實(shí)施方案中，氨基酸是1-氨基酸。"標(biāo)準(zhǔn)氨 基酸"指任何在天然存在之肽中常規(guī)存在的20種標(biāo)準(zhǔn)1-氨基酸。"非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸"指除了 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外的任何氨基酸，無論其是合成制備的還是從天然來源獲得的。本文所用的 "合成氨基酸"涵蓋化學(xué)修飾的氨基酸，包括但不限于鹽、氨基酸衍生物（例如酰胺）和/或 取代。氨基酸（包括肽中羧基和/或氨基末端氨基酸）可通過甲基化、酰胺化、乙?；?、保 護(hù)基團(tuán)和/或用其他化學(xué)基團(tuán)取代進(jìn)行修飾，這可改變肽的循環(huán)半衰期且不負(fù)面影響其活 性。氨基酸可以參與二硫鍵。氨基酸可以包含一種或更多種翻譯后修飾，例如與一種或更多 種化學(xué)實(shí)體（例如甲基基團(tuán)、乙酸鹽/酯基團(tuán)、乙酰基基團(tuán)、磷酸鹽/酯基團(tuán)、甲?；糠帧?類異戊二烯基團(tuán)、硫酸鹽/酯基團(tuán)、聚乙二醇部分、脂質(zhì)部分、碳水化合物部分、生物素部分 等）結(jié)合。術(shù)語"氨基酸"與"氨基酸殘基"可互換使用，并且可以指游離的氨基酸和/或 肽的氨基酸殘基。從使用該術(shù)語的上下文中，指游離氨基酸還是指肽的殘基將會(huì)是顯而易 見的。
[0029] 抗原：本文所使用的術(shù)語"抗原"是指包含有一種或更多種被抗體識(shí)別的表位（線 性表位、構(gòu)象表位或兩者）的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，抗原是或包含病毒或病毒多肽。在 一些實(shí)施方案中，術(shù)語"抗原"指亞單位抗原（即從完整病毒分開或分離的抗原，所述抗原 與所述完整病毒本質(zhì)上相關(guān)；例如與病毒樣顆粒相關(guān)的抗原）。或者或此外，在一些實(shí)施方 案中，術(shù)語"抗原"指殺死的、減毒或滅活的病毒。在某些實(shí)施方案中，抗原是"免疫原"。
[0030] 大約或約：本文所用的應(yīng)用至一個(gè)或更多個(gè)目的值的術(shù)語"大約"或"約"，指類似 于所述參考值的值。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語"大約"或"約"指落入所述參考值之任意方 向（大于或小于）的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小之內(nèi)（除了這樣的數(shù)字將超過可能值的 100%的情況）的一系列值。
[0031] 改善：本文所用的術(shù)語"改善"意味著預(yù)防、減少或減輕狀態(tài)，或改進(jìn)對象的狀態(tài)。 改善包括但不需要完全恢復(fù)或完全預(yù)防疾病、病癥或病狀（例如HCMV感染）。術(shù)語"預(yù)防" 指延緩疾病、病癥或病狀的發(fā)作。當(dāng)疾病、病癥或病狀的發(fā)作已經(jīng)被延遲了預(yù)定的時(shí)間段 時(shí)，可以視為完成了預(yù)防。
[0032] 特征部分：本文所用的術(shù)語物質(zhì)的"特征部分"，以最廣泛的含義，是享有完整物質(zhì) 的指定程度之結(jié)構(gòu)同一性的一部分。在某些實(shí)施方案中，特征部分享有完整物質(zhì)的至少一 個(gè)功能特征。例如，蛋白質(zhì)或多肽的"特征部分"是含有氨基酸之連續(xù)延伸，或者氨基酸連 續(xù)延伸之集合的一部分，其一起構(gòu)成了蛋白質(zhì)或多肽的特征。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)這種 連續(xù)延伸通常含有至少2、5、10、15、20、50或更多個(gè)氨基酸。一般而言，物質(zhì)（例如蛋白質(zhì) 或抗體等）的特征部分是（除以上詳細(xì)說明的序列和/或結(jié)構(gòu)同一性）享有相關(guān)的完整物 質(zhì)之至少一個(gè)功能特征的部分。在一些實(shí)施方案中，特征部分可以為生物學(xué)活性。
[0033] 特征序列："特征序列"是指存在于多肽或核酸家族的所有成員中的序列，并且由 此可被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員用來定義家族的成員。
[0034] 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域：如本領(lǐng)域已知的，多肽有時(shí)具有跨膜、胞質(zhì)和/或胞外結(jié)構(gòu)域。一般 而言，本文所用的"胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域"指具有存在于胞質(zhì)中的性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解，不需要 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)氨基酸都存在于胞質(zhì)中。例如，在一些實(shí)施方案中，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的特 征在于蛋白質(zhì)的指定延伸或部分基本上位于胞質(zhì)中。如本領(lǐng)域中公知的，可以使用多種算 法分析氨基酸或核酸序列以預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位（例如胞質(zhì)定位）。示例性的這樣的程序 包括psort(PSORT.org)、Prosite(prosite,expasy.org)等等。
[0035] 劑型：本文所用的術(shù)語"劑型"和"單位劑型"指用于待治療之患者的治療劑的物 理不連續(xù)單位。各個(gè)單位含有預(yù)定量的經(jīng)計(jì)算活性物質(zhì)以產(chǎn)生期望的治療效果。然而，應(yīng) 當(dāng)理解，組合物的總劑量將由主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。
[0036]給藥方案：本文所用的術(shù)語"給藥方案"（或"治療方案"）是單獨(dú)施用至對象的通 常被時(shí)間段隔開的一組單位劑量（通常多于一個(gè)）。在一些實(shí)施方案中，給定的治療劑具 有推薦的給藥方案，其可涉及一個(gè)或更多次給藥。在一些實(shí)施方案中，給藥方案包括多次給 藥，各次之間被相同長度的時(shí)間段相互隔開；在一些實(shí)施方案中，給藥方案包括多次給藥以 及將各次給藥分開的至少兩種不同的時(shí)間段。
[0037] 表達(dá)：如本文使用的核酸序列的"表達(dá)"指一個(gè)或更多個(gè)以下事件：⑴從DNA序 列產(chǎn)生RNA模板（例如通過轉(zhuǎn)錄）；（2)加工RNA轉(zhuǎn)錄物（例如通過剪切、編輯、5'帽形成 和/或3'尾形成）；（3)將RNA翻譯成多肽或蛋白；和/或⑷多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修 飾。
[0038] 胞外結(jié)構(gòu)域：如本領(lǐng)域已知的，多肽有時(shí)具有跨膜、胞質(zhì)和/或胞外結(jié)構(gòu)域。一般 而言，本文所用的"胞外結(jié)構(gòu)域"指具有存在于細(xì)胞之外部的性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解，不 需要胞外結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)氨基酸都存在于細(xì)胞的外部。例如，在一些實(shí)施方案中，胞外結(jié)構(gòu) 域的特征在于蛋白的指定延伸或部分基本上位于細(xì)胞外。如本領(lǐng)域中公知的，可以使用多 種算法分析氨基酸或核酸序列以預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位（例如細(xì)胞外定位）。示例性的這樣 的程序包括psort(PS0RT.org)、Prosite(prosite,expasy.org)等等。
[0039] 融合蛋白：本文所用的術(shù)語"融合蛋白" 一般指包含至少兩個(gè)片段的多肽，所述片 段各自顯示出與（1)天然存在的和/或（2)代表多肽的功能結(jié)構(gòu)域的肽部分具有高度的氨 基酸同一性。通常，含有至少兩個(gè)這樣的片段的多肽被認(rèn)為是融合蛋白，如果所述兩個(gè)片段 是這樣的部分：（1)不包括在天然的同一肽中，和/或（2)之前在單個(gè)多肽中未相互連接， 和/或（3)已經(jīng)通過人手工作用相互連接。
[0040] 基因：術(shù)語"基因"具有其本領(lǐng)域理解的含義。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 術(shù)語"基因"可以包括基因調(diào)控序列（例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等）和/或內(nèi)含子序列。還應(yīng)當(dāng) 理解，基因的定義包括涉及不編碼蛋白而編碼功能RNA分子（例如tRNA、RNAi-誘導(dǎo)劑等） 的核酸。出于澄清的目的，我們注釋本說明書中使用的術(shù)語"基因"一般指編碼蛋白的核酸 部分；本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將從上下文中明白，該術(shù)語可任選地涵蓋調(diào)控序列。這一定義 不旨在排除將術(shù)語"基因"應(yīng)用于非蛋白編碼表達(dá)單位，而是為了澄清在大多數(shù)情況下，在 本文中使用的該術(shù)語指編碼蛋白的核酸。
[0041] 基因產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物：本文所用的術(shù)語"基因產(chǎn)物"或"表達(dá)產(chǎn)物"一般指從基因 (加工前和/或加工后）轉(zhuǎn)錄的RNA或者由從該基因轉(zhuǎn)錄的RNA編碼的多肽（修飾前或修 飾后）。
[0042] 異源：對于蛋白或多肽，本文所用的術(shù)語"異源"指非天然存在于特定有機(jī)體中的 蛋白或多肽，例如反轉(zhuǎn)錄病毒或VLP。在一些實(shí)施方案中，異源蛋白或多肽在特定的反轉(zhuǎn)錄 病毒病毒體中是非天然存在的。對于蛋白結(jié)構(gòu)域，本文所用的術(shù)語"異源"一般指在特定蛋 白中非天然存在的蛋白結(jié)構(gòu)域。
[0043] 免疫原性：本文所用的術(shù)語"免疫原性"意味著能夠在宿主動(dòng)物中針對非宿主實(shí)體 (例如HCMV抗原）產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在某些是實(shí)施方案中，這種免疫應(yīng)答形成了通過針對特 定感染性生物（例如HCMV)的疫苗引起之保護(hù)性免疫的基礎(chǔ)。
[0044]免疫應(yīng)答：本文所用的術(shù)語"免疫應(yīng)答"指在動(dòng)物中引起的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以指 細(xì)胞免疫、體液免疫或者可以涉及二者。還還可免疫應(yīng)答限制在免疫系統(tǒng)的一部分。例如， 在某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物可以誘導(dǎo)IFNy應(yīng)答增加。在某些實(shí)施方案中，免疫原 性組合物可以誘導(dǎo)黏膜IgA應(yīng)答（例如，在鼻和/或直腸清洗液中測量的）。在某些實(shí)施方 案中，免疫原性組合物可以誘導(dǎo)全身的IgG應(yīng)答（例如，在血清中測量的）。在某些實(shí)施方 案中，免疫原性組合物可以誘導(dǎo)病毒中和抗體或者中和抗體應(yīng)答。
[0045] 改善、增加或減少：本文所用的術(shù)語"改善"、"增加"或"減少"或語法等價(jià)物，指示 相對于基線測量的值，所述基線測量例如在本文所述的處理開始之前在相同的個(gè)體中的測 量或在缺乏本文所述之處理的情況下在對照個(gè)體（或多個(gè)對照個(gè)體）中的測量。
[0046] 個(gè)體、對象、患者：本文所用的術(shù)語"對象"、"個(gè)體"或"患者"指人或非人哺乳動(dòng)物 對象。在一些實(shí)施方案中，被治療的個(gè)體（也稱為"患者"或"對象"）是患有疾?。ɡ?HCMV感染）的個(gè)體（胎兒、嬰兒、兒童、青少年或成人）。在一些實(shí)施方案中，對象有HCMV 感染的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述對象是免疫抑制的對象。例如，在一些實(shí)施方案中， 免疫抑制的對象選自HIV感染的對象、AIDS患者、移植受者、兒童對象以及妊娠對象。在一 些實(shí)施方案中，所述對象已經(jīng)暴露于HCMV感染。在一些實(shí)施方案中，所述對象是人。
[0047] 分離的：本文所用的術(shù)語"分離的"指如下物質(zhì)和/或?qū)嶓w，其已經(jīng)（1)從在初始 產(chǎn)生（無論在自然和/或在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中）時(shí)與其相關(guān)聯(lián)的至少一些組分分離，和/或（2)通 過人手工產(chǎn)生、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可以從初始與其相關(guān)的其他組分的 約 10%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 91 %、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大于約99%分離。在一 些實(shí)施方案中，分離的藥劑為約80%、約85%、約90%、約91 %、約92%、約93%、約94%、 約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或者大于約99 %純的。如果物質(zhì)基本上沒有其 他組分，那么該物質(zhì)是"純的"。如本文所述的，分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w之百分比純度的計(jì)算 不應(yīng)當(dāng)包括賦形劑（例如，緩沖液、溶劑、水等）。
[0048]接頭：本文所用的術(shù)語"接頭"指（例如在融合蛋白中）非在天然蛋白的特定位置 出現(xiàn)的適當(dāng)長度的氨基酸序列，并且一般被設(shè)計(jì)為柔性和/或插入結(jié)構(gòu)（例如兩個(gè)蛋白部 分之間的a-螺旋）。一般而言，接頭允許融合蛋白的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域保留各自結(jié)構(gòu)域 之 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的生物活性。接頭還可 以指間隔子。
[0049]核酸：本文所用的術(shù)語"核酸"，以其最廣泛的含義，指被并入或能夠并入寡核苷酸 鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，核酸是通過磷酸二酯鍵被并入或能夠 并入寡核苷酸鏈的化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，"核酸"指單個(gè)核苷酸殘基（例 如核苷酸和/或核苷）。在一些實(shí)施方案中，"核酸"指包含單個(gè)核酸殘基的寡核苷酸鏈。 本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"和"多核苷酸"可互換使用。在一些實(shí)施方案中，"核酸"涵蓋 RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或eDNA。此外，術(shù)語"核酸"、"DNA"、"RNA"和/或類似 的術(shù)語包括核酸類似物，例如具有非磷酸二酯骨架的類似物。例如，在本領(lǐng)域已知并且在骨 架中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵的所謂的"肽核酸"被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語"編碼 氨基酸序列的核苷酸序列"包括為彼此間的兼并版本（degenerateversion)和/或編碼 相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白和/或RNA的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子。 核酸可以從天然來源純化，使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生并任選地純化，化學(xué)地合成等。其中，例 如在化學(xué)合成分子的情況下，合適的核酸分子可包括核苷酸類似物，例如具有經(jīng)化學(xué)修飾 的堿基或糖、骨架修飾等的類似物。除非另有說明，核酸序列以5'至3'方向給出。本文所 用的術(shù)語"核酸片段"是指為較長核酸序列之一部分的核酸序列。在許多實(shí)施方案中，核酸 片段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，核酸是或包含天然核 苷（例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷）；核苷 類似物（2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔 基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔 基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧 代腺苷、8-氧代鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷）；化學(xué)修飾的堿基；生物修飾的堿 基（例如甲基化的堿基）；插入的堿基；修飾的糖（例如2' -氟核糖、核糖、2' -脫氧核糖、 阿拉伯糖和己糖）；和/或經(jīng)修飾的磷酸鹽/酯基團(tuán)（例如硫代磷酸鹽/酯和5' -N-亞磷 酰胺鍵）。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明具體地涉及"未經(jīng)修飾的核酸"，意指核酸（例如多核 苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷）尚未被化學(xué)修飾以利于或?qū)崿F(xiàn)遞送。
[0050] 可藥用：本文所用的術(shù)語"可藥用"指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適合用于與人類 和動(dòng)物的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理的利 益/風(fēng)險(xiǎn)比相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)。
[0051] 多肽：本文所用的"多肽"一般而言是至少兩個(gè)氨基酸通過肽鍵彼此連接的串。在 一些實(shí)施方案中，多肽可以包含至少3至5個(gè)氨基酸，每一個(gè)通過至少一個(gè)肽鍵與其他相連 接。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，任選地，多肽有時(shí)包括"非天然"氨基酸或者仍能夠 并入多肽鏈的其他部分。
[0052] 多蛋白：本文所用的術(shù)語"多蛋白"一般指在合成后可以被切割以產(chǎn)生幾個(gè)功能不 同的多肽的蛋白。多蛋白通常由單個(gè)氨基酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，未切割的多蛋 白保留其組成部分的生物活性。一些病毒產(chǎn)生這樣的多蛋白，例如，Gag多蛋白，其可作為 功能多蛋白保留或者可被加工成幾個(gè)功能不同的多肽。功能上，Gag多肽被分成3個(gè)結(jié)構(gòu) 域：膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其使Gag多蛋白祀向細(xì)胞膜；相互作用結(jié)構(gòu)域，其促進(jìn)Gag聚合；以及晚 期結(jié)構(gòu)域，其利于新生病毒體從宿主細(xì)胞釋放。一般而言，介導(dǎo)病毒顆粒組裝的Gag蛋白的 形式是多蛋白。
[0053]自組裝部分：一般而言，本文所用的"自組裝部分"指采取限定的排列而無需來自 外源的指導(dǎo)或管理之實(shí)體的相關(guān)延伸。在一些實(shí)施方案中，實(shí)體是蛋白。在一些實(shí)施方案 中，實(shí)體是多蛋白。在一些這樣的實(shí)施方案中，相關(guān)延伸為至少1〇、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、 375、400、425、450、475、500或更多個(gè)殘基。自組裝可以在例如在細(xì)胞的內(nèi)容物內(nèi)（例如體 內(nèi)）展示?；蛘呋虼送?，自組裝可以在細(xì)胞內(nèi)容物外部（例如體外）展示。自組裝可以為 分子內(nèi)（例如折疊）和/或分子間。在一些實(shí)施方案中，自組裝可以是巨大分子，實(shí)體由 此自組裝成復(fù)合物和/或延展的巨大分子結(jié)構(gòu)。自組裝實(shí)體可以表現(xiàn)出廣泛的結(jié)構(gòu)模體 (motif)，包括但不限于顆粒、纖維、片層和帶。在一些實(shí)施方案中，實(shí)體的自組裝對于實(shí)體 的生物學(xué)功能是重要的。例如，在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)的自組裝導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的形成。 在一些實(shí)施方案中，蛋白（例如病毒結(jié)構(gòu)蛋白）的自組裝導(dǎo)致顆粒結(jié)構(gòu)（例如，病毒顆粒結(jié) 構(gòu)）的形成。例如，病毒結(jié)構(gòu)多蛋白可以含有靶向序列，其能夠引導(dǎo)其定位至其宿主細(xì)胞的 細(xì)胞膜（例如質(zhì)膜、內(nèi)體等），病毒結(jié)構(gòu)多蛋白可以從所述宿主細(xì)胞出芽形成VLP，其含有包 圍病毒結(jié)構(gòu)多蛋白的宿主細(xì)胞膜材料。
[0054] 基本同源性（Substantialhomology):本文所用的短語"基本同源性"指氨基酸 或核酸序列之間的比較。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果兩個(gè)序列在對應(yīng)的位置含有同 源殘基，那么他們一般被認(rèn)為是"基本同源"。同源殘基可以為相同殘基。或者，同源殘基可 以為具有大致相似的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的非相同殘基。例如，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公 知，某些氨基酸通常分類為"疏水的"或"親水的"氨基酸，和/或具有"極性"或"非極性" 側(cè)鏈。相同類型的一個(gè)氨基酸對另一個(gè)的替代經(jīng)?？梢哉J(rèn)為是同源替代。
[0055] 如本領(lǐng)域所公知的，可以用多種算法的任一種進(jìn)行氨基酸或核酸序列的比較，包 括那些市售的計(jì)算機(jī)程序，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、 缺口的BLAST和PSI-BLAST。示例性的這樣的程序描述于Altschul，等，Basiclocal alignmentsearchtool,J.Mol.Biol. ,215(3) ：403-410,1990 ；Altschul,等，Methods inEnzymology266 :460_480(1996) ;Altschul，等，"GappedBLASTandPSI-BLAST: anewgenerationofproteindatabasesearchprograms" ,NucleicAcidsRes. 25 ： 3389-3402,1997 ;Baxevanis,等，Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysis ofGenesandProteins,Wiley, 1998;andMisener,等，（編輯），BioinformaticsMethods andProtocols(MethodsinMolecularBiology，132卷），HumanaPress，1999。除了鑒 別同源序列，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些實(shí)施方案中，如果在殘基的相關(guān) 延伸中其對應(yīng)殘基的至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多為同源，那么兩個(gè)序列被認(rèn)為是基本同源。 在一些實(shí)施方案中，相關(guān)延伸是整個(gè)序列。在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)延伸為至少10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500 或更多個(gè)殘基。
[0056] 基本同一性：本文所用的短語"基本同一性"指氨基酸或核酸序列之間的比較。 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果兩個(gè)序列在對應(yīng)位置含有相同的殘基，那么他們 一般被認(rèn)為是"基本同一"。本領(lǐng)域公知，可以用多種算法中的任一種進(jìn)行氨基酸或核酸 序列的比較，包括那些市售的計(jì)算機(jī)程序，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸 序列的BLASTP、缺口的BLAST和PSI-BLAST。示例性的這樣的程序描述于Altschul，等， Basiclocalalignmentsearchtool,J.Mol.Biol. , 215(3) ：403-410,1990 ；Altschul, 等，MethodsinEnzymology266:460_480 (1996) ;Altschul，等，NucleicAcidsRes. 25: 3389-3402,1997 ;Baxevanis,等，Bioinformatics:APracticalGuidetotheAnalysis ofGenesandProteins,Wiley, 1998;andMisener,等，（編輯），BioinformaticsMethods andProtocols(MethodsinMolecularBiology，132 卷），HumanaPress，1999。除了鑒 別相同序列，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些實(shí)施方案中，如果在殘基的相關(guān) 延長中其對應(yīng)殘基的至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多為同一，兩個(gè)序列被認(rèn)為是基本同一的。在 一些實(shí)施方案中，相關(guān)延伸是整個(gè)序列。在一些實(shí)施方案中，相關(guān)延伸為至少10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500 或更多個(gè)殘基。
[0057] 患有："患有"疾病、病癥或病況（例如HCMV感染）的個(gè)體已經(jīng)被診斷為具有和/ 或表現(xiàn)出該疾病、病癥或病況的一種或更多種癥狀。
[0058] 易感："易感"疾病、病癥或病況（例如HCMV感染）的個(gè)體具有發(fā)生疾病、病癥或 病況的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，易感疾病、病癥或病況的個(gè)體不表現(xiàn)出疾病、病癥或病況 的任何癥狀。在一些實(shí)施方案中，易感疾病、病癥或病況的個(gè)體已經(jīng)被診斷為具有疾病、病 癥和/或病況。在一些實(shí)施方案中，易感疾病、病癥或病況的個(gè)體是已經(jīng)暴露于與該疾病、 病癥或病況的發(fā)生相關(guān)之條件的個(gè)體（例如個(gè)體已經(jīng)暴露于HCMV)。
[0059]癥狀減輕：根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)特定疾病、病癥或病況的一種或更多種癥狀的程度（強(qiáng) 度、嚴(yán)重程度等）或頻率降低時(shí)，則"癥狀減輕"。出于澄清的目的，特定癥狀之發(fā)作的延遲 被認(rèn)為是減少所述癥狀之頻率的一種形式。不旨在將本發(fā)明僅限制為癥狀消除的情況。本 發(fā)明具體地考慮到使得雖然未完全消除，但一種或更多種癥狀減輕（并且對象的病癥由此 "改善"）的治療。
[0060] 治療有效量：本文所用的術(shù)語"治療有效量"指以可應(yīng)用于任何醫(yī)療治療的合理 的益處/風(fēng)險(xiǎn)比，足以對所治療的對象產(chǎn)生治療效果的量。治療效果可為客觀的（例如可 通過某種測試或標(biāo)志物測量）或主觀的（例如對象給出效果的指示或感覺到效果）。特別 地，"治療有效量"指有效地治療、改善或預(yù)防期望的疾病或病癥或者表現(xiàn)出可檢測的治療 或預(yù)防效果（例如通過改善與疾病相關(guān)的癥狀、預(yù)防或延遲疾病的發(fā)作、和/或還減輕疾病 癥狀之嚴(yán)重程度或頻率）的治療蛋白或組合物的量。治療有效量通常以可以包含多種單位 劑量的給藥方案施用。對于任何特定的免疫原性組合物，治療有效量（和/或有效給藥方 案內(nèi)的適當(dāng)單位劑量）可以根據(jù)（例如）施用途徑或與其他藥劑的組合變化。此外，對于 任何特定患者，具體的治療有效量（和/或單位劑量）可以取決于多種因素，包括：被治療 的病癥和病癥的嚴(yán)重程度；所采用的具體藥劑的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、 體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用時(shí)間、施用途徑、和/或所采用的具體免疫原性組合 物的排泄或代謝速率；治療的持續(xù)時(shí)間；以及醫(yī)藥領(lǐng)域中公知的類似因素。
[0061]跨膜結(jié)構(gòu)域：本領(lǐng)域中已知，多肽有時(shí)具有跨膜、胞質(zhì)和/或胞外結(jié)構(gòu)域。一般而 言，本文所用的"跨膜結(jié)構(gòu)域"指具有存在于膜（例如跨越細(xì)胞膜的一部分或全部）中之性 質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解，不需要跨膜結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)氨基酸都存在于膜中。例如，在一些實(shí) 施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域的特征在于蛋白的指定延伸或部分基本上定位于膜中。本領(lǐng)域中公 知，可以使用多種算法分析氨基酸或核酸序列以預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位（例如跨膜定位）。示 例性的這樣的程序包括psort(PS0RT.org)、Prosite(prosite,expasy.org)等等。
[0062] 治療：本文所用的術(shù)語"治療"指對于特定疾病、病癥和/或病況（例如HCMV感染） 的一種或更多種癥狀或特征或者對該疾病的易感性予以部分或完全地減輕、改善、緩解、抑 制、延遲其發(fā)作、減輕其嚴(yán)重程度、和/或減輕其發(fā)生率的免疫原性組合物的任何施用。這 樣的治療可以對不表現(xiàn)出相關(guān)疾病、病癥和/或病況之病征的對象進(jìn)行，和/或僅表現(xiàn)出該 疾病、病癥和/或病況之早期病征的對象進(jìn)行?；蛘呋虼送?，這樣的治療可以對表現(xiàn)出相關(guān) 疾病、病癥和/或病況之一種或更多種已確定病征的對象進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語 "治療"指患者的接種疫苗。
[0063] 接種疫苗：本文所用的術(shù)語"接種疫苗"指旨在對例如致病劑（例如，HCMV)產(chǎn)生 免疫應(yīng)答的組合物的施用。出于本發(fā)明的目的，接種疫苗可以在暴露于致病劑之前、期間和 /或之后施用，并且在某些實(shí)施方案中，在暴露于致病劑之前、期間和/或不久之后施用。在 一些實(shí)施方案中，接種疫苗包括疫苗組合物以適當(dāng)間隔的時(shí)間多次施用。
[0064] 載體：本文所用的"載體"指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其締合的另一個(gè)核酸的核酸分子。在一些 實(shí)施方案中，載體能夠染色體外復(fù)制和/或表達(dá)在宿主細(xì)胞（例如真核和/或原核細(xì)胞） 中與其相連接的核酸。能夠引導(dǎo)有效連接的基因之表達(dá)的載體在本文中稱作"表達(dá)載體"。 [0065] 某些實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0066] 除了其他方面以外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療和/或研究人巨細(xì)胞病毒 (HCMV)感染的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP)，其包含一個(gè)或更多個(gè)莫洛尼鼠白血病病毒（MoloneyMurineleukemia virus，MMLV)核心蛋白并且包含一個(gè)或更多個(gè)HCMV表位，例如來自HCMV的包膜糖蛋白gB 和/或gH和/或被膜蛋白（tegumentprotein)pp65。除了其他方面以外，本發(fā)明涵蓋了以 下認(rèn)識(shí)：抗原（例如，包膜糖蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白）之組合可導(dǎo)致改善的有益免疫應(yīng)答之誘導(dǎo)， 所述有益免疫應(yīng)答包括例如體液應(yīng)答（例如中和抗體的產(chǎn)生）和細(xì)胞應(yīng)答（例如T細(xì)胞活 化）二者。所提供的VLP特征可在于他們不含有病毒RAN或DNA并且無感染性。在一些實(shí) 施方案中，提供的VLP確實(shí)含有病毒RNA或DNA并且有感染性。在一些這樣的實(shí)施方案中， 提供的VLP可用作DNA疫苗。
[0067] 在一些實(shí)施方案中，對象中的體液免疫應(yīng)答持續(xù)至少約1個(gè)月、至少約2個(gè)月、至 少約3個(gè)月、至少約4個(gè)月、至少約5個(gè)月、至少約6個(gè)月、至少約7個(gè)月、至少約8個(gè)月、至 少約9個(gè)月、至少約10個(gè)月、至少約11個(gè)月、至少約12個(gè)月、至少約13個(gè)月、至少約14個(gè) 月、至少約15個(gè)月、至少約16個(gè)月、至少約17個(gè)月、至少約18個(gè)月、至少約19個(gè)月、至少 約20個(gè)月、至少約21個(gè)月、至少約22個(gè)月、至少約23個(gè)月、至少約24個(gè)月、至少約28個(gè) 月、至少約32個(gè)月、至少約36個(gè)月、至少約40個(gè)月、至少約44個(gè)月、至少約48個(gè)月或更長。 在一些實(shí)施方案中,對象中的細(xì)胞免疫應(yīng)答持續(xù)至少約1個(gè)月、至少約2個(gè)月、至少約3個(gè) 月、至少約4個(gè)月、至少約5個(gè)月、至少約6個(gè)月、至少約7個(gè)月、至少約8個(gè)月、至少約9個(gè) 月、至少約10個(gè)月、至少約11個(gè)月或至少12個(gè)月。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，所提供的VLP被脂質(zhì)膜包圍，所述脂質(zhì)膜任選地含有來自病 毒包膜糖蛋白（例如gB和/或gH)的一種或更多種表位，其是在病毒中和抗體的誘導(dǎo)中發(fā) 揮作用的抗原。
[0069] 在一些實(shí)施方案中，所提供的VLP含有來自病毒結(jié)構(gòu)蛋白（例如pp65)的一個(gè)或 更多個(gè)表位，其是在細(xì)胞免疫應(yīng)答（例如，T細(xì)胞應(yīng)答）的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用的抗原。在一些 實(shí)施方案中，所利用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白（例如PP65)不僅刺激T輔助細(xì)胞（TH)的形成而且還 誘導(dǎo)針對HCMV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)。
[0070] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多種病毒包膜糖蛋白（例如gB和/或gH)。在 一些實(shí)施方案中，變體病毒包膜糖蛋白是或者包含融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，病毒糖蛋 白的變體包含異源蛋白結(jié)構(gòu)域（例如，來自不同蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域）。在一些實(shí) 施方案中，病毒結(jié)構(gòu)蛋白的變體包含異源抗原或表位。在一些實(shí)施方案中，本大明提供了包 含病毒結(jié)構(gòu)蛋白之變體的VLP。在一些實(shí)施方案中，病毒結(jié)構(gòu)蛋白的變體是或者包含融合蛋 白。
[0071]I?病毒樣顆粒（VLP)
[0072] 反轉(zhuǎn)錄病毒是包膜的RNA病毒，其屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae)。宿主 細(xì)胞被反轉(zhuǎn)錄病毒感染后，RNA經(jīng)酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為DNA。然后DNA通過整合酶并入宿 主細(xì)胞的基因組并且之后作為宿主細(xì)胞DNA的一部分復(fù)制。反轉(zhuǎn)錄病毒科包括以下屬： a反轉(zhuǎn)錄病毒屬（Alpharetrovirus)、0反轉(zhuǎn)錄病毒屬（Betaretrovirus)、Y反轉(zhuǎn)錄 病毒屬(Gammearetrovirus) > 6反轉(zhuǎn)錄病毒屬（Deltaretrovirus)、e反轉(zhuǎn)錄病毒屬 (Epsilonretrovirus)、慢病毒屬（Lentivirus)和泡沫病毒屬（Spumavirus)。反轉(zhuǎn)錄病毒 科的宿主一般為脊椎動(dòng)物。反轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生感染性病毒體，其含有被來自宿主細(xì)胞膜的脂 質(zhì)雙層包圍的球形核殼（與病毒結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合的病毒基因組）。
[0073] 反轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于產(chǎn)生包膜的病毒體，其是感染性的并且有復(fù)制能力或者復(fù) 制缺陷的。有復(fù)制能力的感染性反轉(zhuǎn)錄病毒載體含有用于病毒體合成的所有必需基因并且 一旦發(fā)生宿主細(xì)胞的感染后持續(xù)增殖自身。復(fù)制缺陷的感染性反轉(zhuǎn)錄病毒載體在初始感染 后不傳播。這通過用待轉(zhuǎn)移的基因或核苷酸序列替換反轉(zhuǎn)錄病毒的大多數(shù)編碼區(qū)完成；使 得載體能夠制造另外的復(fù)制循環(huán)所述的蛋白。
[0074] 或者或此外，反轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于產(chǎn)生病毒樣顆粒（VLP)，其缺乏來自反轉(zhuǎn)錄病 毒的基因組并且是非感染性和非復(fù)制的。由于VLP有益的性質(zhì)，VLP可以用作抗原遞送系 統(tǒng)。此外，因?yàn)閂LP是非感染性的，它們可作為免疫原性組合物（例如，疫苗）安全地施用。 VLP通常結(jié)構(gòu)類似于上述的包膜的病毒體，但缺乏來自反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組，使得病毒復(fù)制 將不太可能發(fā)生。一些病毒（例如鼠白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV))的衣 殼蛋白（例如Gag)的表達(dá)導(dǎo)致自組裝成類似于相應(yīng)天然病毒的顆粒，該顆粒沒有病毒遺傳 物質(zhì)。
[0075] 已經(jīng)制備了各種各樣的VLP。例如，已經(jīng)制備了包含單種或多種衣殼蛋白，有或 者沒有包膜蛋白和/或表面糖蛋白的VLP。在一些情況下，VLP是非包膜的并且通過僅表 達(dá)一種主要衣殼蛋白裝配，如所示的從嗜肝DNA病毒（例如Engerix?，GSK和Recombivax HB?，Merck)、乳頭狀瘤病毒（例如Cervarix?，GSK和Gardasil?，Merck)、細(xì)小病毒 (paroviruse)或多瘤病毒制備的VLP。在一些實(shí)施方案中，VLP是包膜的并且可包含存在 于相應(yīng)的天然病毒中的多個(gè)抗原蛋白。VLP通常類似于其對應(yīng)的天然病毒并且可為多價(jià)的 顆粒結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，抗原蛋白可以存在于VLP內(nèi)作為VLP結(jié)構(gòu)的組分和/或在 VLP的表面上。本發(fā)明涵蓋了以下認(rèn)識(shí)：與其他形式的抗原呈遞（例如不與VLP締合的可溶 性抗原）相比，在VLP的情形中的抗原呈遞有利于誘導(dǎo)針對該抗原的中和抗體。中和抗體 大多數(shù)經(jīng)常識(shí)別三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，這經(jīng)常需要以其天然病毒構(gòu)象呈遞抗原蛋白（如包膜糖 蛋白）?；蛘呋虼送?，VLP可用于在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫（例如T細(xì)胞應(yīng)答）的情形下呈遞抗原。 本發(fā)明還涵蓋了這樣的觀點(diǎn)，在VLP系統(tǒng)中使用抗原組合可產(chǎn)生改進(jìn)的免疫應(yīng)答。
[0076]A?結(jié)構(gòu)蛋白
[0077] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明利用由一種或更多種反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白（例如Gag) 組成的VLP。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所使用的結(jié)構(gòu)蛋白為a反轉(zhuǎn)錄病毒屬（例如 禽白血病病毒）、0反轉(zhuǎn)錄病毒屬（小鼠乳腺瘤病毒）、Y反轉(zhuǎn)錄病毒屬（鼠白血病病毒）、 S反轉(zhuǎn)錄病毒屬（牛白血病病毒）、e反轉(zhuǎn)錄病毒屬（大眼梭S盧皮膚肉瘤病毒，walley dermalsarcomavirus)、慢病毒屬（人免疫缺陷病毒1)和泡沫病毒屬（黑猩猩泡沫病毒） 結(jié)構(gòu)蛋白。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)蛋白為鼠白血病病毒（MLV)結(jié)構(gòu)蛋白。這些反轉(zhuǎn)錄病 毒的基因組在數(shù)據(jù)庫中可容易地得到。所有這些反轉(zhuǎn)錄病毒的Gag基因具有整體上類似的 結(jié)構(gòu)并且在各個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒群中在氨基酸水平是保守的。反轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白主要功能為 病毒組裝。多蛋白形式的Gag基因產(chǎn)生VLP的核心結(jié)構(gòu)蛋白。MLVGag基因編碼65kDa多 蛋白前體，其在成熟的病毒體中由MLV蛋白酶蛋白水解切割為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（基質(zhì)（MA); pl2 ;衣殼（CA)和核殼（NC))。反轉(zhuǎn)錄病毒組裝不成熟衣殼，其由從Gag多肽形成的Gag多 蛋白組成但缺乏其他病毒元件（如病毒蛋白酶），Gag作為該未成熟病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白。 功能上，Gag多蛋白分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域：膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其將Gag多蛋白靶向細(xì)胞膜；相互作用 結(jié)構(gòu)域，其促進(jìn)Gag聚合；以及晚期結(jié)構(gòu)域，其利于新生病毒體從宿主細(xì)胞的釋放。介導(dǎo)病 毒顆粒組裝的Gag蛋白之形式為多蛋白。
[0078] 在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白為Gag多肽。本文所 用的術(shù)語"Gag多肽"為來自反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)多肽，其負(fù)責(zé)本文所述的VLP的形成并且指 其氨基酸序列包括Gag之至少一個(gè)特征序列的多肽序列。本領(lǐng)域和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已 知來自多種反轉(zhuǎn)錄病毒的各種各樣的Gag序列，參考這樣的序列，可容易地鑒別一般Gag蛋 白和/或特定Gag多肽的特征性序列。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明使用的示例性Gag多肽如以下SEQIDN0 :1所示。在一些實(shí)施方案中， 合適的Gag多肽與已知的反轉(zhuǎn)錄病毒Gag多肽基本同源。例如，Gag多肽可以為經(jīng)修飾的反 轉(zhuǎn)錄病毒Gag多肽，其與野生型或天然存在的Gag多肽（例如SEQIDNO: 1)相比含有一個(gè) 或更多個(gè)氨基酸替代、缺失和/或插入，同時(shí)基本上保留自組裝活性。因此，在一些實(shí)施方 案中，適合用于本發(fā)明的Gag多肽基本上與MMLVGag多肽（SEQIDN0 :1)同源。在一些實(shí) 施方案中，適合用于本發(fā)明的Gag多肽具有與SEQIDNO: 1有至少50 %、55 %、60 %、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同 源性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，適合用于本發(fā)明的Gag多肽與MMLVGag多肽（SEQ IDN0 :1)基本同一。在一些實(shí)施方案中，適合用于本發(fā)明的Gag多肽具有與SEQIDN0 :1 有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %、99 %或更高同一性的氨基酸序列。
[0080]MMLVGag氨某酸序列（SEQIDN0 :1)
[0081]MGQTVTTPLSLTLGHWKDVERIAHNQSVDVKKRRWVTFCSAEWPTFNVGWPRDGTFN
[0082]RDLITQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPPSAPSLPL
[0083]EPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRPPPSDRDGNGG
[0084]EATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQYWPFSSSDLYNW
[0085]KNNNPSFSEDPGKLTALIESVLITHQPTWDDCQQLLGTLLTGEEKQRVLLEARKAVRGD
[0086]DGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGRNHLVHYRQLLLAGLQNAGRSPTNLAKV
[0087]KGITQGPNESPSAFLERLKEAYRRYTPYDPEDPGQETNVSMSFIWQSAPDIGRKLERLED
[0088]LKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETEEKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREM
[0089] SKLLATVVSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQT
[0090] SLLTLDD(SEQ ID NO：1)
[0091] MMLV Gag核苷酸序列（SEQ ID NO :2)

【權(quán)利要求】
1. 病毒樣顆粒（VLP)，其包含： 第一多肽，所述第一多肽為鼠白血病病毒（MLV) gag多肽，其中其氨基酸序列包含與具 有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的參考MLV gag蛋白之自組裝部分顯示至少70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300或更多個(gè)氨基酸的 部分，以及 第二多肽，其氨基酸序列包含被結(jié)合人巨細(xì)胞病毒（HCMV)蛋白的一種或更多種抗體 識(shí)別的表位。
2. 權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含被HCMV糖蛋白B(gB)蛋白的一 種或更多種抗體識(shí)別之表位的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含被HCMV糖蛋白H (gH)蛋白的一 種或更多種抗體識(shí)別之表位的氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì) 結(jié)構(gòu)域或二者的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域不天然地存在于HCMV蛋白中。
6. 權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 蛋白中。
7. 權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域具有不同于SEQ ID N0:7和SEQ ID NO :13中所存在氨基酸序列的氨基酸序列。
8. 權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域具有選自以下的氨基酸序列：存在于 SEQ ID NO :7中的跨膜結(jié)構(gòu)域，存在于SEQ ID NO: 13中的跨膜結(jié)構(gòu)域和存在于SEQ ID NO: 16中的跨膜結(jié)構(gòu)域。
9. 權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO :10中752至795位殘 基的氨基酸序列。
10. 權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域具有由SEQ ID NO :20中2152至2622 位核苷酸編碼的氨基酸序列。
11. 權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含以下的氨基酸 序列：1)存在于SEQ ID NO : 13中的表位；以及2)包含SEQ ID NO : 10中752至795位殘基 之跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
12. 權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述第二多肽具有包含以下的氨基酸 序列：1)存在于SEQ ID NO : 13中的表位；以及2)包含由SEQ ID NO :20中2152至2622位 核苷酸所編碼氨基酸序列之跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
13. 權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的VLP，其中所述第二多肽具有氨基酸序列，其包 含存在于SEQ ID NO :13中的除所述表位外的一個(gè)或更多個(gè)序列，其中所述一個(gè)或更多個(gè)序 列不包含完整的跨膜結(jié)構(gòu)域。
14. 權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述第一多肽為融合蛋白或包含融合 蛋白。
15. 權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述第二多肽為融合蛋白或包含融合 蛋白。
16. 跨膜的經(jīng)修飾的gH多肽。
17. 權(quán)利要求16所述的多肽，其包含存在于HCMV中的gH蛋白之N端胞外結(jié)構(gòu)域。
18. 權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的多肽，其包含跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者。
19. 權(quán)利要求18所述的多肽，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者不天然地存在 于所述gH蛋白中。
20. 權(quán)利要求18所述的多肽，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者天然地存在于 VSV蛋白中。
21. 權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者天然地存在于 gB蛋白中。
22. 權(quán)利要求16所述的多肽，其包含SEQ ID NO : 16。
23. 權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽存在于VLP中。
24. 多核苷酸，其編碼權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)所述的多肽。
25. 載體，其包含權(quán)利要求24所述的多核苷酸。
26. 病毒樣顆粒（VLP)，其包含多肽，所述多肽包含存在于HCMV中的gB蛋白之表位。
27. 權(quán)利要求26所述的VLP，其中所述多肽包含存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外 結(jié)構(gòu)域。
28. 權(quán)利要求26或27所述的VLP，其中所述多肽包含跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二 者。
29. 權(quán)利要求28所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二者不天然地存在 于gB蛋白中。
30. 權(quán)利要求28所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二者天然地存在于 VSV蛋白中。
31. 權(quán)利要求26所述的VLP，其中所述多肽包含SEQ ID NO :7。
32. 權(quán)利要求30所述的VLP，其中所述多肽包含SEQ ID NO : 10。
33. 融合蛋白，其包含： a) 第一多肽，所述第一多肽為MLV gag多肽，其中其氨基酸序列包含與具有SEQ ID NO : 1氨基酸序列的參考MLV gag蛋白之自組裝部分顯示至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300或更多個(gè)氨基酸的部分，以及 b) 第二多肽，所述第二多肽為包含pp65表位的HCMV pp65多肽，其中其氨基酸序列包 含與具有SEQ ID NO :4中539至1099位殘基之氨基酸序列的參考pp65蛋白顯示至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300 或更多 個(gè)氨基酸的部分。
34. 包含融合蛋白的病毒樣顆粒（VLP)，其包含： a) 第一多肽，所述第一多肽為MLV gag多肽，其中其氨基酸序列包含與具有SEQ ID NO : 1氨基酸序列的參考MLV gag蛋白之自組裝部分顯示至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300或更多個(gè)氨基酸的部分，以及 b) 第二多肽，所述第二多肽為包含pp65表位的HCMV pp65多肽，其中其氨基酸序列包 含與具有SEQ ID NO :4中539至1099位殘基之氨基酸序列的參考pp65蛋白顯示至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300 或更多 個(gè)氨基酸的部分。
35. 病毒樣顆粒（VLP)，其包含： 第一多肽，其包含存在于HCMV中的gB蛋白之表位；和 第二多肽，其包含跨膜的經(jīng)修飾的gH多肽。
36. 權(quán)利要求35所述的VLP，其中所述第一多肽包含存在于HCMV中的gB蛋白之N端 胞外結(jié)構(gòu)域。
37. 權(quán)利要求36所述的VLP，其中所述第一多肽包含跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二 者。
38. 權(quán)利要求37所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二者不天然地存在 于gB蛋白中。
39. 權(quán)利要求38所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二者天然地存在于 VSV蛋白中。
40. 權(quán)利要求35所述的VLP，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO :7。
41. 權(quán)利要求39所述的VLP，其中所述第一多肽包含SEQ ID N0:10。
42. 權(quán)利要求35所述的VLP，其中所述第二多肽包含天然地存在于HCMV中的gH蛋白 之N端胞外結(jié)構(gòu)域。
43. 權(quán)利要求35或42所述的VLP，其中所述第二多肽包含跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或 者二者。
44. 權(quán)利要求43所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二者不天然地存在 于gH蛋白中。
45. 權(quán)利要求43所述的VLP，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或者二者天然地存在于 VSV蛋白中。
46. 權(quán)利要求35所述的VLP，其中所述第二多肽包含SEQ ID N0:16。
47. 病毒樣顆粒（VLP)，其包含： 融合蛋白，其包含： a) 第一多肽，所述第一多肽為MLV gag多肽，其中其氨基酸序列包含與具有SEQ ID NO : 1氨基酸序列的參考MLV gag蛋白之自組裝部分顯示至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300或更多個(gè)氨基酸的部分，以及 b) 第二多肽，所述第二多肽為包含pp65表位的HCMV pp65多肽，其中其氨基酸序列包 含與具有SEQ ID NO :4中539至1099位殘基之氨基酸序列的參考pp65蛋白顯示至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的長度為至少100、200、300 或更多 個(gè)氨基酸的部分；以及 存在于HCMV中的第二蛋白之表位。
48. 權(quán)利要求47所述的VLP，其中所述融合蛋白設(shè)置并構(gòu)建為使得其自組裝以形成 VLP，從而所述pp65表位位于所述VLP內(nèi)部。
49. 權(quán)利要求47或權(quán)利要求48所述的VLP，其設(shè)置和構(gòu)建為使得第二HCMV蛋白表位 位于VLP表面上。 50. VLP，其包含： 融合蛋白，其包含融合在HCMV中所存在pp65蛋白之表位上游的MLV中所存在gag蛋 白之N端部分；以及 多肽，其包含存在于HCMV中的gB蛋白之表位。
51. 權(quán)利要求50所述的VLP，其中所述gag蛋白之N端部分不包含存在于MLV中的C 端聚合酶序列。
52. 權(quán)利要求50或權(quán)利要求51所述的VLP，其中所述gag蛋白之N端部分包含全長蛋 白的1至538位殘基。
53. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位存在于全長gB蛋 白中。
54. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被結(jié)合全長gB中 表位的抗體識(shí)別。
55. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被結(jié)合SEQ ID NO: 7中表位的抗體識(shí)別。
56. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含全 長gB蛋白中1至751位殘基的氨基酸序列。
57. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7之至少15個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列。
58. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7的氨基酸序列。
59. 權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽包含融合蛋 白。
60. 權(quán)利要求59所述的VLP，其中所述融合蛋白包含與第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含來自存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV中的跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者。
61. 權(quán)利要求60所述的VLP，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 中。
62. 權(quán)利要求60的VLP，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO :10。 63. VLP，其包含： 融合蛋白，其包含與存在于HCMV中的pp65蛋白之表位融合的存在于MLV中的gag蛋 白之N端部分；以及 多肽，其包含存在于HCMV中的gH蛋白之表位。
64. 權(quán)利要求63所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分不包含存在于MLV中的C 端聚合酶序列。
65. 權(quán)利要求63或權(quán)利要求64所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分包含全長蛋 白的1至538位殘基。
66. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位存在于全長gH蛋 白中。
67. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被結(jié)合全長gH中 表位的抗體識(shí)別。
68. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被結(jié)合SEQ ID NO: 13中表位的抗體識(shí)別。
69. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含全 長gH蛋白中1至751位殘基的氨基酸序列。
70. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13之至少15個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列。
71. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
72. 權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽包含融合蛋 白。
73. 權(quán)利要求72所述的VLP，其中所述融合蛋白包含與第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含來自存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV蛋白中的跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者。
74. 權(quán)利要求73所述的VLP，其中所述第二多肽為gB蛋白。
75. 權(quán)利要求73所述的VLP，其中所述在第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 中。 76. VLP，其包含： 融合蛋白，其包含融合在人巨細(xì)胞病毒（HCMV)中所存在pp65蛋白之表位上游的鼠白 血病病毒（MLV)中所存在gag蛋白之N端部分； 多肽，其包含存在于HCMV中的糖蛋白B(gB)蛋白之表位；以及 多肽，其包含存在于HCMV中的糖蛋白H(gH)蛋白之表位。
77. 權(quán)利要求76所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分不包含存在于鼠白血病病 毒（MLV)中的C端聚合酶序列。
78. 權(quán)利要求76或權(quán)利要求77所述的VLP，其中所述gag蛋白的N端部分包含全長蛋 白的1至538位殘基。
79. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位存在于全長gB蛋 白中。
80. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被結(jié)合全長gB中 表位的抗體識(shí)別。
81. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gB蛋白的表位被結(jié)合SEQ ID NO: 7中表位的抗體識(shí)別。
82. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含全 長gB蛋白中1至751位殘基的氨基酸序列。
83. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7之至少15個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列。
84. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 7的氨基酸序列。
85. 權(quán)利要求76至78中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gB表位的所述多肽包含融合蛋 白。
86. 權(quán)利要求85所述的VLP，其中所述融合蛋白包含與第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含來自存在于HCMV中的gB蛋白之N端胞外結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV蛋白中的跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者。
87. 權(quán)利要求86所述的VLP，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV) 中。
88. 權(quán)利要求86所述的VLP，其中所述融合蛋白包含SEQ ID N0:10。
89. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位存在于全長gH蛋 白中。
90. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被結(jié)合全長gH中 表位的抗體識(shí)別。
91. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述gH蛋白的表位被結(jié)合SEQ ID NO: 13中表位的抗體識(shí)別。
92. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含全 長gH蛋白中1至717位殘基的氨基酸序列。
93. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13之至少15個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列。
94. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽具有包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
95. 權(quán)利要求76至88中任一項(xiàng)所述的VLP，其中包含gH表位的所述多肽包含融合蛋 白。
96. 權(quán)利要求95所述的VLP，其中所述融合蛋白包含與第二多肽融合的第一多肽，所述 第一多肽包含來自存在于HCMV中的gH蛋白之N端胞外結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含不天然 地存在于HCMV蛋白中的跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者。
97. 權(quán)利要求96所述VLP，其中所述第二多肽為gB蛋白。
98. 權(quán)利要求96所述VLP，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒（VSV)中。
99. 權(quán)利要求1至15、26至32和34至98中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述VLP的特征 在于其直徑范圍的下限由20、30、40、50、60、70、80、90或100nm界定并且上限由300、290、 280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180 或 170nm 界定。
100. 根據(jù)權(quán)利要求1至15、26至32和34至98中任一項(xiàng)所述VLP的群體，其中所述群 體中VLP平均直徑范圍的下限由20、30、40、50、60、70、80、90或10011111界定并且上限由300、 290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180 或 170nm 界定。
101. 根據(jù)權(quán)利要求1〇〇所述的VLP之群體，其中所述群體中VLP的多分散指數(shù)小于 0· 5〇
102. 權(quán)利要求1至15、26至32和34至98中任一項(xiàng)所述的VLP，其中所述VLP的特征 在于所述糖蛋白的表位暴露在VLP的表面上并且所述融合蛋白位于VLP的被膜/內(nèi)腔中。
103. 免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1至15、26至32和34至98中任一項(xiàng)所述的 VLP。
104. 權(quán)利要求103所述的免疫原性組合物，其中所述組合物的特征在于當(dāng)施用至對象 時(shí)其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答二者。
105. 權(quán)利要求104所述的免疫原性組合物，其中所述體液免疫應(yīng)答在對象中持續(xù)至少 約1個(gè)月、至少約2個(gè)月、至少約3個(gè)月、至少約4個(gè)月、至少約5個(gè)月、至少約6個(gè)月、至少 約7個(gè)月、至少約8個(gè)月、至少約9個(gè)月、至少約10個(gè)月、至少約11個(gè)月或至少12個(gè)月。
106. 權(quán)利要求104所述的免疫原性組合物，其中所述細(xì)胞免疫應(yīng)答在對象中持續(xù)至少 約1個(gè)月、至少約2個(gè)月、至少約3個(gè)月、至少約4個(gè)月、至少約5個(gè)月、至少約6個(gè)月、至少 約7個(gè)月、至少約8個(gè)月、至少約9個(gè)月、至少約10個(gè)月、至少約11個(gè)月或至少12個(gè)月。
107. 免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求50所述之VLP與權(quán)利要求63所述之重組VLP 的混合物。
108. 免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求50所述之VLP與權(quán)利要求75所述之VLP的混 合物。
109. 載體，其包含： 編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含融合在人巨細(xì)胞病毒（HCMV)中所存在 PP65蛋白之表位上游的鼠白血病病毒（MLV)中所存在gag蛋白之N端部分； 其中所述編碼融合蛋白的多核苷酸在單個(gè)啟動(dòng)子的控制之下；并且 其中所述載體包含在編碼融合蛋白載體之多核苷酸下游的多聚腺苷酸化信號(hào)。
110. 權(quán)利要求109所述的載體，其中所述gag蛋白的N端部分不包含存在于鼠白血病 病毒（MLV)中的C端聚合酶序列。
111. 權(quán)利要求109或權(quán)利要求110所述的載體，其中所述gag蛋白的N端部分包含全 長蛋白的1至538位殘基。
112. 權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所述的載體，其包含SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或 SEQ ID NO :22的多核苷酸序列。
113. 權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體如圖1中所描繪。
114. 載體，其包含： 編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含存在于HCMV中的糖蛋白B(gB)蛋白之表位； 其中所述多核苷酸在單個(gè)啟動(dòng)子的控制之下；并且 其中所述載體包含所述多核苷酸上游的信號(hào)序列和所述多核苷酸下游的多聚腺苷酸 化信號(hào)。
115. 權(quán)利要求114所述的載體，其中包含所述gB蛋白之表位的所述多肽包含全長gB 蛋白的1至751位殘基。
116. 權(quán)利要求114或權(quán)利要求115所述的載體，其包含SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9 的多核苷酸序列。
117. 權(quán)利要求114至116中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體如圖1中所描繪。
118. 載體，其包含： 編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含存在于HCMV中的糖蛋白H(gH)蛋白之表位； 其中所述多核苷酸在單個(gè)啟動(dòng)子的控制下；并且 其中所述載體包含所述多核苷酸上游的信號(hào)序列和所述多核苷酸下游的多聚腺苷酸 化信號(hào)。
119. 權(quán)利要求118所述的載體，其中包含所述gH蛋白之表位的所述多肽不包含來自存 在于HCMV中的gH蛋白之跨膜結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
120. 權(quán)利要求118或權(quán)利要求119所述的載體，其中包含所述gH蛋白之表位的所述多 肽包含融合蛋白。
121. 權(quán)利要求120所述的載體，其中所述融合蛋白包含融合在第二多肽上游的來自 HCMV的gH蛋白質(zhì)之N端胞外結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含不天然地存在于HCMV蛋白中的跨 膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或二者。
122. 權(quán)利要求121所述的載體，其中所述第二多肽為gB蛋白。
123. 權(quán)利要求121所述的載體，其中所述第二多肽天然地存在于水泡性口炎病毒 (VSV)中。
124. 權(quán)利要求118至123中任一項(xiàng)所述的載體，其中包含gH表位的所述多肽包含全長 gH蛋白的1至717位殘基。
125. 權(quán)利要求118至124中任一項(xiàng)所述的載體，其包含SEQ ID NO : 14中1至2148位 核苷酸或SEQ ID NO : 15中1至2148位核苷酸的多核苷酸序列。
126. 權(quán)利要求118至125中任一項(xiàng)所述的載體，其中載體如圖1所描繪。
127. 細(xì)胞，其包含權(quán)利要求109至126中任一項(xiàng)所述的一種或更多種載體。
128. 權(quán)利要求127所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞用一種或更多種所述載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
129. 權(quán)利要求127所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞用一種或更多種所述載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
130. 用于生產(chǎn)VLP的方法，所述方法包括： 用權(quán)利要求109至113中任一項(xiàng)所述的載體和權(quán)利要求114至117中任一項(xiàng)所述的載 體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；以及 在合適的培養(yǎng)基中于允許表達(dá)由所述載體編碼之蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
131. 用于生產(chǎn)VLP的方法，所述方法包括： 用權(quán)利要求109至113中任一項(xiàng)所述的載體和權(quán)利要求118至126中任一項(xiàng)所述的載 體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；以及 在合適的培養(yǎng)基中于允許表達(dá)由所述載體編碼之蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
132. 用于生產(chǎn)VLP的方法，所述方法包括： 用權(quán)利要求109至113中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求114至117中任一項(xiàng)所述的載 體以及權(quán)利要求118至126中任一項(xiàng)所述的載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；以及 在合適的培養(yǎng)基中于允許表達(dá)由所述載體編碼之蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
133. 權(quán)利要求130至132中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括從所述培養(yǎng)基和/或所述宿 主細(xì)胞回收VLP的步驟。
134. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至15、26至32和34至98中任一項(xiàng)所述的VLP和 可藥用載體。
135. 權(quán)利要求134所述的藥物組合物，其還包含佐劑。
136. 權(quán)利要求135所述的藥物組合物，其中所述佐劑選自細(xì)胞因子、凝膠型佐劑、微生 物佐劑、油乳劑和基于乳化劑的佐劑、顆粒佐劑、合成佐劑、聚合物佐劑和/或其組合。
137. 用于在對象中減少HCMV感染之癥狀的頻率、嚴(yán)重程度或延遲所述癥狀發(fā)作的方 法,所述方法包括施用權(quán)利要求134至136中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
138. 權(quán)利要求137所述的方法，其中所述對象處于HCMV感染的風(fēng)險(xiǎn)中。
139. 權(quán)利要求138所述的方法，其中所述對象為免疫抑制的對象。
140. 權(quán)利要求139所述的方法，其中所述免疫抑制的對象選自：HIV感染的對象、AIDS 患者、移植受者、兒童對象和妊娠對象。
141. 權(quán)利要求137至140中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對象已經(jīng)暴露于HCMV感染。
142. 權(quán)利要求137至141中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對象為人。
143. 權(quán)利要求137所述的方法，其中與施用所述藥物組合物前所述對象中HCMV感染之 癥狀的頻率、嚴(yán)重程度或發(fā)作相比，所述對象中HCMV感染之癥狀的頻率、嚴(yán)重程度或發(fā)作 減少約50 %或更多。
144. 權(quán)利要求143所述的方法，其中與施用所述藥物組合物前所述對象中HCMV感染之 癥狀的頻率、嚴(yán)重程度或發(fā)作相比，所述對象中HCMV感染之癥狀的頻率、嚴(yán)重程度或發(fā)作 減少約60 %或更多、約70 %或更多、或約75 %或更多。
145. 權(quán)利要求137至144中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥物組合物以初始劑量和至 少一次加強(qiáng)劑量施用。
146. 權(quán)利要求145所述的方法，其中所述藥物組合物以初始劑量和兩次加強(qiáng)劑量施 用。
147. 權(quán)利要求145所述的方法，其中所述藥物組合物以初始劑量和三次加強(qiáng)劑量施 用。
148. 權(quán)利要求145所述的方法，其中所述藥物組合物以初始劑量和四次加強(qiáng)劑量施 用。
149. 權(quán)利要求145所述的方法，其中所述藥物組合物以初始劑量和在所述初始劑量后 約1個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4個(gè)月、約5個(gè)月或約6個(gè)月的至少一次加強(qiáng)劑量施用。
150. 權(quán)利要求149所述的方法，其中所述藥物組合物在所述初始劑量后約6個(gè)月、約7 個(gè)月、約8個(gè)月、約9個(gè)月、約10個(gè)月、約11個(gè)月或約1年以第二加強(qiáng)劑量施用。
151. 權(quán)利要求137至150中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥物組合每1年、每2年、每 3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年以加強(qiáng)劑量施用。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK104271745SQ201280066355
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月11日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·E·安德森, 安妮-凱瑟琳·弗盧基格 申請人:變異生物技術(shù)公司