用于檢測(cè)微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌的存在的方法，其包括使自環(huán)境樣品獲得的核酸與引物接觸的步驟，所述引物與存在于銅綠微囊藻、魚(yú)腥藻和阿氏浮絲藻中的mcyB基因的核酸序列特異性雜交。本發(fā)明進(jìn)一步提供了設(shè)計(jì)用于本發(fā)明方法的引物、引物對(duì)和探針。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌的方法和引物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)來(lái)自環(huán)境樣品的微囊藻素生成性毒性（microcystin-producing toxic)藍(lán)細(xì)菌的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)所述毒性藍(lán)細(xì)菌的基于聚合酶鏈 式反應(yīng)（PCR)的測(cè)定方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了設(shè)計(jì)用于本發(fā)明方法的材料，諸如引物、弓丨 物對(duì)和探針。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在近幾年，毒性藍(lán)細(xì)菌水華在全世界已經(jīng)越來(lái)越引起科學(xué)團(tuán)體、官方和一般公 眾的關(guān)注。由藍(lán)細(xì)菌塊發(fā)生產(chǎn)生的毒素已經(jīng)引起野生生物和家畜的死亡（關(guān)于綜述，參 見(jiàn)Stewart等，2008)，并且已經(jīng)與人生病和死亡關(guān)聯(lián)起來(lái)（Turner等，1990 ;Pi lotto 等，1997 Jochimsen等，1998)。微囊藻素，形成具有超過(guò)90種已知結(jié)構(gòu)變體的主要 藍(lán)毒素 （cyanotoxin)組的環(huán)狀七肽肝毒素（Welker和von Ddhren, 2006)，是由魚(yú) 腥藻屬（Anabaena)、微囊藻屬（Microcystis)、浮絲藻屬（Planktothrix)和念珠藻屬 0^〇81：〇〇)品系生成的（5；^〇11611和]〇1168，1999)，盡管已經(jīng)描述了微囊藻素生成性軟管藻 屬（Hapalosiphon) (Prinsep 等，1992)、席藻屬（Phormidium) (Izaguirre 等，2007)和費(fèi) 氏藻屬（Fischerella)的孤立發(fā)生（Fiore等，2009)。這8種屬中，通常，魚(yú)腥藻屬、微囊 藻屬和浮絲藻屬引起淡水肝毒性水華。為了更好了解藍(lán)細(xì)菌水華的動(dòng)力學(xué)和毒素生成的機(jī) 制，以及預(yù)測(cè)與這些現(xiàn)象有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，需要用于不同微囊藻素變體和毒素生成性藍(lán)細(xì)菌的 容易使用的檢測(cè)方法。已經(jīng)將對(duì)微囊藻素連續(xù)低水平的暴露與升高的肝癌風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來(lái) (Yu, 1995 ;Ueno等，1996 ;Svircev等，2009)，這進(jìn)一步加劇這這些方法的需要。
[0004] 微囊藻素和非微囊藻素生成性藍(lán)細(xì)菌的可靠鑒定可以是挑戰(zhàn)性的。同一物種的形 態(tài)學(xué)難于辨認(rèn)的毒性和無(wú)毒性品系的混合水華是常見(jiàn)的（Vezie等，1998)。mcyS基因簇的 發(fā)現(xiàn)揭示了 一組用于基于PCR的微囊藻素生產(chǎn)者檢測(cè)的潛在靶物。與毒素結(jié)構(gòu)中的非蛋白 質(zhì)生成性的罕見(jiàn)氨基酸殘基聯(lián)系的基因特別好地適合于此目的（Mbedi等，2005)。許多研 究描述了檢測(cè)微囊藻素生產(chǎn)性藍(lán)細(xì)菌的基于核酸的方法，及其嘗試評(píng)估與毒性水華有關(guān)的 風(fēng)險(xiǎn)的用途（關(guān)于綜述，參見(jiàn)Sivonen，2008)。例如，W02011003184披露了設(shè)計(jì)用于檢測(cè)微 囊藻素生成性藍(lán)細(xì)菌的引物。公開(kāi)的引物與銅綠微囊藻株UTCC299的mcyD基因的ss-酮 脂酰合酶（KS)域的保守區(qū)，或與銅綠微囊藻UTCC300的mcyD基因的第一個(gè)脫水酶域的保 守區(qū)互補(bǔ)。在W02006128230中，披露了另一種用于檢測(cè)肝毒性藍(lán)細(xì)菌的基于PCR的方法。 擴(kuò)增的靶序列位于源自微囊藻素合成酶基因復(fù)合物的mcyE基因和節(jié)球藻素（nodularin) 合成酶基因復(fù)合物的ndaF基因的肝毒素關(guān)聯(lián)氨基轉(zhuǎn)移酶域序列中。
[0005] 然而，已經(jīng)描述了能夠檢測(cè)超過(guò)一種微囊藻素生成性屬的少數(shù)實(shí)時(shí)定量 PCR(Al_Tebrineh 等，2011 ;Vaitomaa 等，2003 ;Briand 等，2008),并且目前大多數(shù) 發(fā)表的qPCR法僅集中于一種屬，最常是微囊藻屬（Foulds等，2002 ;Kurmayer and Kutzenberger, 2003 ;Rinta_Kanto 等，2005 ;Furukawa 等，2006 ;Fortin 等，2010)。
[0006] 樣品制備和標(biāo)記物技術(shù)選擇在qPCR中是重要的。與由PCR抑制劑的不完全除去 引起的低效擴(kuò)增組合的在多步驟DNA提取方法期間的樣品損失可以導(dǎo)致重大的量化誤差 (Wilson，1997)。解決這些問(wèn)題會(huì)改善PCR可靠性。升高的特異性繼而可以用經(jīng)標(biāo)記的序列 特異性探針（例如TaqMan)實(shí)現(xiàn)，并且與更常用的瞬發(fā)突光團(tuán)（prompt fluorophore)不同， 鑭系螯合物標(biāo)記物容許時(shí)間分辨熒光測(cè)定法檢測(cè)，由于較低的背景信號(hào)而導(dǎo)致改善的靈敏 性，因?yàn)槿魏巫陨頍晒庠诩ぐl(fā)和測(cè)量之間的時(shí)間窗期間衰變（Soini and L6vgren，1987)。
[0007] 本研究的目的是開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)潛在微囊藻素生成性魚(yú)腥藻屬、微囊藻屬和浮絲藻 屬的定量實(shí)時(shí)PCR方法。為了實(shí)現(xiàn)可靠的量化，就qPCR性能和模板產(chǎn)率而言比較DNA提取 和簡(jiǎn)單的細(xì)胞裂解。開(kāi)發(fā)的qPCR測(cè)定法適用于環(huán)境樣品分析，并且檢查基因拷貝數(shù)目和微 囊藻素濃度之間的關(guān)聯(lián)。
[0008] 附圖簡(jiǎn)述
[0009] 圖1 :mcyB qPCR測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將基數(shù)101og mcyB拷貝數(shù)相對(duì)于a)魚(yú)腥藻 屬，b)微囊藻屬和c)浮絲藻屬的其相應(yīng)閾值循環(huán)（Ct)繪圖。可以對(duì)每個(gè)目標(biāo)屬檢出范圍 為10 1 - 107個(gè)拷貝的mcyB靶序列。擴(kuò)增效率對(duì)于所有靶物是相似的（92. 7 - 94. 2% )。4 個(gè)重復(fù)反應(yīng)內(nèi)的Ct變化是非常低的，標(biāo)準(zhǔn)差以通常在符號(hào)內(nèi)部隱藏的誤差棒顯示。
[0010] 圖2 :兩種qPCR樣品制備方法的比較。比較顯微鏡測(cè)定的細(xì)胞量（有圖案的柱） 以檢測(cè)提取的基因組DNA(白色柱）和過(guò)濾且受到破壞的細(xì)胞（灰色柱）中的mcyB基因拷 貝。對(duì)微囊藻素生成性銅綠微囊藻NIVA-CYA140、水華魚(yú)腥藻（Anabaena cf.flos-aquae) NIVA-CYA267/4和阿氏浮絲藻NIVA-CYA299進(jìn)行比較。與自相同量的細(xì)胞提取的DNA相比， 過(guò)濾和細(xì)胞裂解產(chǎn)生高得一致的拷貝數(shù)。誤差棒標(biāo)示樣品間和樣品內(nèi)拷貝數(shù)變化二者。
[0011] 圖 3 :在 2008 年 4 月-6 月期間在 Hauninen 水庫(kù)（reservoir) (Raisio, Finland) 中浮絲藻mcyB基因拷貝數(shù)（，實(shí)線）、浮絲藻細(xì)胞數(shù)目（▲，點(diǎn)線）、和通過(guò)LC-MS測(cè)定 的總微囊藻素濃度（□，虛線）的形成。細(xì)胞數(shù)目基于lOOym細(xì)絲單元的顯微鏡計(jì)數(shù)和 每一個(gè)此類單元30個(gè)細(xì)胞的估值。觀察到mcyB拷貝數(shù)目和總微囊藻素濃度（dmMC-RR和 dmMC-LR)之間的明顯正相關(guān)聯(lián)。沒(méi)有檢測(cè)到潛在毒性的微囊藻或魚(yú)腥藻。
[0012] 圖4 :魚(yú)腥藻屬（Anabaena sp.)、銅綠微囊藻和阿氏浮絲藻的mcyB基因中的革巴序 列，和實(shí)施例中使用的引物和探針。
[0013] 圖5 :mcyB基因的總基因拷貝數(shù)與通過(guò)ELISA測(cè)量的環(huán)境水生樣品中微囊藻素濃 度[MC]的關(guān)聯(lián)。
[0014] 圖6 :mcyB基因的總基因拷貝數(shù)與通過(guò)HPLC測(cè)量的環(huán)境水生樣品中微囊藻素濃度 [MC]的關(guān)聯(lián)。
[0015] 圖7 :mcyB基因的總基因拷貝數(shù)與通過(guò)LC-MS測(cè)量的環(huán)境水生樣品中微囊藻素濃 度[MC]的關(guān)聯(lián)。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌的存在的方法，其包括下 列步驟：
[0018] a)對(duì)所述樣品中的細(xì)胞實(shí)施裂解；
[0019] b)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物中使從裂解細(xì)胞獲得的核酸與引物接觸，所述引物與 銅綠微囊藻、阿氏浮絲藻和魚(yú)腥藻屬中存在的mcyB基因的核酸序列特異性雜交，其中所述 引物擴(kuò)增mcyB基因中如SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2,和/或SEQ ID N0:3中列出的靶序列 的至少一部分；
[0020] c)用自步驟b)獲得的反應(yīng)混合物實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而所述mcyB基因的序 列在所述序列存在于樣品時(shí)得到特異性擴(kuò)增；并
[0021] d)檢測(cè)擴(kuò)增核酸序列的存在，其中擴(kuò)增mcyB基因序列的存在指示所述樣品中存 在微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌。
[0022] 優(yōu)選地，包含藍(lán)細(xì)菌材料的制備用于本發(fā)明方法的樣品是環(huán)境樣品，諸如水樣品， 其可以是海水樣品或淡水樣品或其它合適的環(huán)境樣品。
[0023] 雖然方法主要涉及檢測(cè)毒性藍(lán)細(xì)菌，諸如銅綠微囊藻、阿氏浮絲藻和魚(yú)腥藻屬，但 是其也可以用于量化所述樣品中的微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌。這可以通過(guò)使用本發(fā)明的 引物對(duì)提取的DNA實(shí)施定量-PCR(qPCR)，并測(cè)定mcyB基因的基因拷貝數(shù)來(lái)完成。此外，也 可以通過(guò)將通過(guò)qPCR獲得的所述基因拷貝數(shù)與相應(yīng)的微囊藻素濃度關(guān)聯(lián)來(lái)監(jiān)測(cè)樣品中的 毒性微囊藻素濃度。
[0024] 在步驟a)中，可以通過(guò)常規(guī)方法將在步驟b)的PCR中用作模板的核酸從裂解細(xì) 胞提取并純化。然而，優(yōu)選地，直接使用從裂解細(xì)胞獲得的懸浮液作為PCR模板。因而，在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，首先可以過(guò)濾懷疑包含毒性藍(lán)細(xì)菌的未稀釋的水樣品。然后，將 過(guò)濾的細(xì)胞在無(wú)菌去離子水中懸浮，并通過(guò)熱處理實(shí)施細(xì)胞裂解。因而，獲得的懸浮液和其 中的核酸可以用于步驟b)的反應(yīng)混合物。
[0025] 在步驟b)中，所述引物擴(kuò)增mcyB基因中靶序列的至少一部分，所述靶序列如SEQ ID NO: 1中所列且對(duì)應(yīng)于圖4中描述的銅綠微囊藻基因組的位置6147-6251，或如SEQ ID N0:2中所列對(duì)應(yīng)于圖4中描述的銅綠微囊藻基因組的位置6203-6305,或如SEQ ID N0:3 中所列對(duì)應(yīng)于圖4中描述的魚(yú)腥藻屬藻的位置6170-6272。
[0026] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟b)中擴(kuò)增的擴(kuò)增子（即靶序列）包含如由SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3限定的靶序列的至少20,優(yōu)選至少50,更優(yōu)選至少80， 且最優(yōu)選103或105個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0027] 優(yōu)選地，用于方法的引物包含下列一種引物或由下列一種引物組成：
[0028] 5,-GCTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3,（SEQ ID N0:4)
[0029] 5'-AGATTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3'（SEQ ID N0:5)
[0030] 5,-GGTTTAATCAACAAGAGGCTTTATTAGC-3,（SEQ ID N0:6)
[0031] 5'-CTGTTGCCTCCTAGTTCAAAAAATGACT-3'（SEQ ID N0:7)。
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法以可用幾種商業(yè)試劑盒的實(shí)時(shí)聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)施。
[0033] 對(duì)于在實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用，本發(fā)明還提供了與銅綠微囊藻、阿氏浮絲藻 和魚(yú)腥藻屬中存在的mcyB基因的核酸序列特異性雜交的寡核苷酸探針，其中所述探針具 有序列：
[0034] 5'-ACTGAATTATTGGAGGTAGAGGTGAGTGATAC-3'（SEQ ID N0:8)
[0035] 5'-CCTCTACCTCCAATAATTCA-3'（SEQ ID N0:9)
[0036] 5' -GGGTGAGTTATTAGAAGCAGAAGTTAGTAACAG-3, （SEQ ID N0:10)
[0037] 5, -TTCTGCTTCTAATAACTCACC-3' （SEQ ID N0:11)
[0038] 5' -GGGGTGAATTATTAGAAATAGAAGTAAGTGACAA-3, （SEQ ID N0:12)
[0039] 5, -TTACTTCTATTTCTAATAATTCACC-3' （SEQ ID N0:13)。
[0040] 本發(fā)明還涉及引物，其包含如SEQ ID N0:4-7中所列的任一種序列或由如SEQ ID N0:4-7中所列的任一種序列組成。優(yōu)選地，引物具有28-40個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，引物包含 小于30、35或40個(gè)核苷酸。
[0041] 此外，本發(fā)明提供了探針，其包含如SEQ ID N0:8-13中所列的任一種序列或由如 SEQ ID N0:8-13中所列的任一種序列組成。優(yōu)選地，探針具有小于40個(gè)核苷酸。
[0042] 本發(fā)明的寡核苷酸引物和探針是短的核苷酸（諸如RNA或DNA，優(yōu)選DNA)序列，通 常具有25至30或更小的堿基。然而，自動(dòng)合成儀容許合成多達(dá)160至200個(gè)堿基的寡核 苷酸，并且目前的寡核苷酸可以延長(zhǎng)以將例如限制酶切割位點(diǎn)添加至寡核苷酸。優(yōu)選地，弓丨 物的典型長(zhǎng)度是26-32,更優(yōu)選28-30個(gè)核苷酸。
[0043] 本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌存在的試劑盒。試劑盒可以 包含如上文定義的引物和探針。
[0044] 上文和下文實(shí)施例中描述此類引物和探針。
[0045] 優(yōu)選地，所述試劑盒包含用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的手段，諸如標(biāo)記的探針、酶聚 合酶、緩沖液和核苷酸。
[0046] 本領(lǐng)域中公知的是，同一基因的序列在微生物物種的菌株中略有變化，如此，銅綠 微囊藻、阿氏浮絲藻和魚(yú)腥藻屬中存在的mcyB基因的序列在物種的所有菌株中不是100% 相同的。然而，從本文中的描述，特別是從下文實(shí)施例看清楚的是基于這些基因序列的相似 性和同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)識(shí)別出任何相關(guān)菌株中的mcyB基因序列。
[0047] 在本文中，術(shù)語(yǔ)"特異性雜交"意味著寡核苷酸和靶序列之間的互補(bǔ)雜交。術(shù)語(yǔ) "同源性"指由容許寡核苷酸與序列之間的微小錯(cuò)配的互補(bǔ)雜交顯示的特異性，所述微小錯(cuò) 配不能危及用于檢測(cè)雜交信號(hào)的退火。
[0048] 本文中用于說(shuō)明本發(fā)明背景，且特別是用于提供關(guān)于其實(shí)施的更多詳情的出版物 和其它材料通過(guò)提及并入本文。本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不意圖限 制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0049] 材料和方法
[0050] 1. 1.藍(lán)細(xì)菌菌株和環(huán)境樣品
[0051] 表1中列出用于此研究的藍(lán)細(xì)菌菌株。菌株購(gòu)自巴斯德培養(yǎng)物保藏中心（Pasteur Culture Collection) (PCC, Paris, France)和挪威水質(zhì)研究所（Norwegian Institute for Water Research)藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)物保藏中心（NIVA, Oslo, Norway),并且根據(jù)提供者的推薦維 持。將所有NIVA株在Z8中培養(yǎng)（Staub, 1961，修飾的NIVA1972, 1976)。使用由PCC描述 的配方，將來(lái)自PCC的菌株在BG11 (Sigma)、省去硝酸鹽的BG1L、或添加 NaN03和NaHC03的 BG1L中培養(yǎng)。還維持來(lái)自其它資源的三種額外的菌株。將銅綠微囊藻NIES-107 (National Institute of Environmental Studies, Tsukuba, Japan)在 Z8 中培養(yǎng)。將拉普魚(yú)渥藻 (Anabaena lapponica)菌株 966 (Finnish Environment Institute, Dr. Jarkko Rap a la) 及魚(yú)渥藻 90 (University of Helsinki, Prof. Kaarina Sivonen)在不添加氮的改良 Z8 中 培養(yǎng)。使用P〇werGlo20W水族館燈泡（Hagen，Japan)作為光源將所有培養(yǎng)物維持于23°C。 用顯微鏡從NIVA-CYA267/4、NIVA-CYA140和NIVA-CYA299的2. 5周齡培養(yǎng)物計(jì)算藍(lán)細(xì)菌 細(xì)胞。將樣品在去離子水中以1:100 - 1:200稀釋，并且在魯戈（Lugol)氏碘中保存。在 10ml樣品等分試樣的16小時(shí)沉積后，在具有10x和40x物鏡的Nikon TE-200倒置顯微鏡 (Nikon，Japan)上實(shí)施計(jì)數(shù)。收獲來(lái)自計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基的細(xì)胞以進(jìn)行mcyB量化。在2008年 4月_6月期間從Hauninen水庫(kù)，Raisio, Finland(ll份樣品）及在2008年7月期間從 Aland島的淡水湖（13份樣品）收集環(huán)境樣品。所有樣品（包括提取的DNA和其它PCR模 板）于-20°C保持冷凍，直至進(jìn)一步分析。將培養(yǎng)物和環(huán)境樣品快速冷凍或冷凍干燥。
[0052] 1. 2.微囊藻素的提取
[0053] 用 1. 2ml75 % 甲醇（HPLC 級(jí)；Rathburn, Walkerburn, UK)提取 8-lOmg 冷凍干 燥的藍(lán)細(xì)菌材料或含有過(guò)濾的藍(lán)細(xì)菌材料的冷凍干燥的GF/C纖維玻璃濾紙（0 25mm ; Whatman, Maidstone, UK)的樣品。將提取物在水浴超聲發(fā)生器（Bandelin Sonorex RK156, Berlin, Germany)中處理15分鐘，且另外用探頭超聲波儀（probe sonicator)(具 有 3mm 微尖端（microtip)的 Bandelin Sonopuls 1^)2070,30%脈沖，30%能量）處理 1 分 鐘。在以10, 000xg離心10分鐘后，將上清液分成等分試樣，并于40°C用氬氣蒸發(fā)至干燥。 將意圖通過(guò)HPLC-DAD和LC-ESI-MS-MS進(jìn)行微囊藻素分析的提取物在75%甲醇中重懸，而 那些以ELISA為目的的提取物在水中重懸。
[0054] 1. 3. HPLC 及二極管陣列 UV 檢測(cè)（HPLC-DAD)
[0055] 使用由脫氣器、四元泵（quaternary pump)、40 °C的恒溫柱室（thermostatted column compartment)和以200 - 300nm運(yùn)行的二極管陣列檢測(cè)儀（以238nm量 化）組成的Agilent (Waldbronn, Germany) 1100系列HPLC系統(tǒng)分析樣品。固定相是 來(lái)自 Merck (Darmstadt, Germany)的 Purospher STAR 柱，3 μ m 顆粒，55mmx4mm 或來(lái) 自 Supelco (Bellefonte, PA, USA)的 Ascentis RP-醜胺柱，3 μ m 顆粒，100mm x4. 6mm I. D.。流動(dòng)相由乙腈（HPLC S 級(jí)，Rathburn, Walkerburn, UK)(溶劑 B) -Milli-Q 超純 水（Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)(溶劑A)組成，兩者都含有0· 05 %三氟乙酸（TFA ; Fluka, Buchs, Switzerland)，線性梯度程序如下：0 分鐘 25% B，7 分鐘 70% B，10 分鐘 70% B，10. 1分鐘25% B ;停止時(shí)間15分鐘；流速lml/分鐘。注射體積是10 μ 1。另外，在具有 3 μ m 顆粒的 Merck Purospher STAR RP_18e 柱，55mm x4mm I. D.上分析樣品（Spoof and MerilU〇t〇,2005)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室純化的微囊藻素和以下參照樣品用于鑒定微囊藻素：a)銅 綠微囊藻PCC7820的提取物和b)如（Spoof等，2003)中描述的銅綠微囊藻NIES-107的提 取物。
[0056] 1. 4. LC-MS 和 LC-MS-MS
[0057] 在Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)上實(shí)施LC-MS實(shí)驗(yàn)，所述Agilent 1100系列HPLC系 統(tǒng)與裝備有電噴霧接口的Waters Micromass (Manchester, UK) Quattro Micro三級(jí)四極質(zhì) 譜儀偶聯(lián)。在Merck Purospher STAR RP-18封端柱（30mmx4mm，3 μ m顆粒）上量化毒素。 流動(dòng)相由0. 1 %含水甲酸（溶劑A)和乙腈（溶劑B)的梯度組成，線性梯度程序如下：在10 分鐘里25% B至70% B，然后在2分鐘里至90% B，其中其保持1分鐘。注射時(shí)間間隔是 16分鐘，注射體積是10 μ 1，流速是0. 5ml/分鐘，并且柱爐溫度是40°C。毛細(xì)管電壓設(shè)置為 3.8kV，且錐電壓（cone voltage)設(shè)置為40V(dmMC-RR和MC-RR)或75V (微囊藻素和節(jié)球藻 素的剩余部分）。去溶劑化氣體（氮?dú)猓囟群土魉俜謩e設(shè)置為300°C和650L/h。離子源溫 度設(shè)置為150°C。以正電噴霧離子化模式檢測(cè)離子。選擇離子記錄（SIR)模式的監(jiān)測(cè)信號(hào) 是 m/z[dmMC-RR+2H]2+512. 8、[MC-RR+2H]2+519. 8、[MC-LF+H]+986. 5 和[MC-LF+Na]+1008. 5、 [dmMC-LR+H]+986.5、[MC-LR+H]+995.5、[MC-LY+H]+1002.5、[MC-LW+H]+1025.5 和 [MC-LW+Na]+1047. 5、[MC-YR+H]+1045. 5、[dmNod+H]+811. 5 和[Nod+H]+825. 5。用 Masslynx v. 4. 0軟件（Micromass)完成數(shù)據(jù)采集。在Agilentl200快速解析（RR)LC上實(shí)施LC-MS-MS 實(shí)驗(yàn)，所述Agilentl200快速解析（RR)LC與具有電噴霧離子（ESI)源的Bruker Daltonics HCT超離子講質(zhì)譜儀（Bremen, Germany)偶聯(lián)。1200RR LC系統(tǒng)包括二元泵（binary pump)、 真空除氣器、SL自動(dòng)采樣器、和恒溫柱室。以正電噴霧離子模式操作離子阱。離子源參數(shù) 如下設(shè)置：干燥溫度350°C，霧化器壓力40psi，干氣流動(dòng)10.0L/min，毛細(xì)管電壓4.0kV。采 用具有 Smart Parameter Setting(SPS)功能的 500-1200m/z 的 MS 掃描范圍。ICC 祀標(biāo)設(shè) 置于300000,最大積累時(shí)間是100ms。通過(guò)SmartFrag設(shè)置輔助豐富的MS-MS片段化。在 具有3μηι顆粒的Ascentis C18,50_ x3mm I.D.柱（Supelco)上于40°C實(shí)現(xiàn)毒素的分離。 注射體積是5μ 1。流動(dòng)相由水-乙腈-甲酸（99:1:0. 1 ;溶劑A)和乙腈-甲酸（100:0. 1 ; 溶劑Β)組成，線性梯度程序如下：0分鐘25 % Β，5分鐘70 % Β，6分鐘70 % Β，6. 1分鐘25 % Β ;停止時(shí)間10分鐘；流速0. 5ml/min。主要監(jiān)測(cè)信號(hào)與用Quattro Micro儀相同，但是用 HCT Ultra儀獲得的質(zhì)譜容許基于片段化樣式鑒定別的毒素。用Bruker Compassl. 3軟件 完成數(shù)據(jù)采集。
[0058] 1. 5. ELISA
[0059] 用 Quantiplate 微囊藻素試劑盒（Envirologix, Portland, ME, USA)使用由制造商 提供的方案分析樣品。依照HPLC結(jié)果用水稀釋提取物以調(diào)節(jié)微囊藻素濃度至測(cè)定法的工 作范圍。對(duì)一些樣品生成兩個(gè)不同稀釋物。
[0060] 1.6. PCR 樣品制備
[0061] 使用兩種方法制備樣品以進(jìn)行PCR分析。使用NucleoSpin Plant II DNA提取 試劑盒（Macherey-Nagel, Diiren, Germany)依照制造商的說(shuō)明書(shū)從培養(yǎng)菌株的冷凍干燥細(xì) 胞或冷凍干燥的Aland,島環(huán)境樣品提取基因組DNA。用分光光度法（ND-1000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE，USA)測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量。如下實(shí)施過(guò)濾和細(xì)胞裂解：將 l〇ml收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物在90ml無(wú)菌去離子水中懸浮，并且在玻璃纖維濾紙（0 47mm GF/ C, Whatman)上真空過(guò)濾。在Hauninen水庫(kù)樣品的情況中，將50ml未稀釋的水過(guò)濾。將每個(gè) 濾紙切出段，并在100 μ 1無(wú)菌去離子水中懸浮。于80°C將細(xì)胞裂解實(shí)施5分鐘。此后，直 接使用懸浮液作為PCR模板。為了量化目的，記錄濾紙段尺寸。在有幾處修改的情況下使用 上文描述的兩種方法處理顯微鏡計(jì)數(shù)的培養(yǎng)物樣品：將細(xì)胞以5ml和10ml二者的等分試樣 收獲，并且經(jīng)受過(guò)濾或DNA提取。對(duì)新鮮收獲的細(xì)胞實(shí)施樣品制備。通過(guò)離心（4°C，3220g ，20min, Eppendorf5810R, Hamburg, Germany)收集細(xì)胞以提取 DNA。
[0062] 1.7.引物和探針
[0063] 從GenBank 核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)檢索mcyB 序列（Nishizawa 等，1999 ;Tillett 等，2000 ; Christiansen 等，2003 ;Rouhiainen 等，2004 ;Kaneko 等，2007)，并且基于序列比對(duì)設(shè)計(jì)引 物和探針。寡核苷酸由 Thermo Scientific (Ulm, Germany)和 biomers. net (Ulm, Germany)制 備（表2)。合成具有5 ' -C6-氨基接頭和3 ' -磷酸根基團(tuán)的探針。在5 '端氨基接頭用有機(jī)Tb3+ 螯合物（2,2'，2"，2"'-{{6,6'-{4"-[2-(4-異硫氰基苯）乙基]吡唑-1"，3"-二基}二（批 啶）-2,2'_二基}二（亞甲基次氮基）}四（乙酰）}鋱（111))(2,2'，2"，2"'-{{6,6'-{4"_ [2-(4_Isothiocyanatophenyl)ethyl]pyratzole_l"，3"_diyl}bis(pyridine)_2, S'-diyl} bis (methylenenitrilo)} tetrakis (acetato)} terbium(III))標(biāo)記所有檢測(cè)探針，如先 前描述的（Nurmi等，2002)。所有淬滅劑探針具有在其3'端由寡核苷酸制造商綴合的 BHQ1 (Black hole淬滅劑? 1)分子。對(duì)表1中列出的藍(lán)細(xì)菌菌株測(cè)試引物特異性。各個(gè) PCR 反應(yīng)含有 5nmol dNTP (Finnzymes, Espoo, Finland)、2. 67pmol 每種正向引物和 8pmol 反向引物、0.5 個(gè)單位的 DyNAzyme II HotStart DNA 聚合酶（Finnzymes)、lX DyNAzyme II HotStart緩沖液和1 μ 1模板，S卩l(xiāng)ng基因組DNA或1 μ 1含有裂解細(xì)胞的懸浮液。用無(wú)菌 Mi 11 i-Q 水充滿反應(yīng)體積 20 μ 1。使用 PTC-200 熱循環(huán)儀（MJ Research, Watertown, ΜΑ, USA) 實(shí)施熱循環(huán)，以于95°C 10分鐘開(kāi)始，接著是于95°C 30秒，于58°C 30秒和于72°C 1分鐘的 35個(gè)循環(huán)，且以于72°C 10分鐘結(jié)束。在用溴化乙啶（0.5ng Γ1)染色的2%瓊脂糖凝膠上 分析PCR產(chǎn)物。
[0064] 1. 8. qPCR
[0065] 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的原則已經(jīng)詳細(xì)記載于別處（Nurmi等，2002)。簡(jiǎn)言之，通 過(guò)測(cè)量熒光半衰期檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物積累，所述熒光通過(guò)由DNA聚合酶的5' 一 3'外切核酸 酶活性從檢測(cè)探針釋放的螯合物模塊獲得。借助于淬滅劑探針，將背景熒光保持于最小。 使用qPCR和來(lái)自所有培養(yǎng)菌株的純化的基因組DNA確認(rèn)檢測(cè)探針特異性。每個(gè)qPCR反 應(yīng)含有4nmol dNTP、2pmol每個(gè)正向引物和6pmol反向引物、0.2個(gè)單位的DyNAzyme II HotStart DNA 聚合酶、IX DyNAzyme II HotStart 緩沖液、0.25pmol 檢測(cè)探針（mcyB-mP、 mcyB-pP 或 mcyB-aP)、2· 5pmol 相應(yīng)的淬滅劑探針（mcyB-mQ 或 mcyB-pQ，對(duì)于 mcyB-aQ，使用 3.0pm〇l的量）和lng模板DNA。用無(wú)菌Milli-Q水將反應(yīng)充滿至20μ1。在具有Applied Biosystems 光學(xué)帽（Optical Caps) (Foster City, CA, USA)的 ThermoFast96Robotic PCR 板（Abgene，Surrey, UK)上運(yùn)行所有反應(yīng)。qPCR運(yùn)行以于95 °C 5分鐘開(kāi)始，接著是于95 °C 30 秒和于62°C 1分鐘的8個(gè)循環(huán)。在循環(huán)8后，將溫度降低到35°C達(dá)15秒，用于熒光測(cè)量。 每隔一個(gè)循環(huán)重復(fù)測(cè)量，直到循環(huán)40后，并且用Vict 〇r21420多標(biāo)記物計(jì)數(shù)器（Multilabel Counter) (PerkinElmer Life Sciences Wallac, Turku, Finland)使用制造商的標(biāo)準(zhǔn)方案 實(shí)施以進(jìn)行Tb熒光的時(shí)間解析測(cè)量。
[0066] 1.9.標(biāo)準(zhǔn)曲線形成
[0067] 從魚(yú)腥藻90、PCC7806 (微囊藻）和NIVA-CYA299 (浮絲藻）中通過(guò)PCR生成雙鏈 DNA標(biāo)準(zhǔn)品，如上文描述的。使用Qiaquick PCR純化試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany)實(shí)施 mcyB 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，隨后使用 Quantlt PicoGreen 試劑盒（Invitrogen, Eugene, OR, USA) 純化，兩者均依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。計(jì)算純化的擴(kuò)增產(chǎn)物的摩爾濃度，并且制備每種屬 特異性標(biāo)準(zhǔn)品的一系列10倍稀釋（η = 7)。將標(biāo)準(zhǔn)品保持于-20°c，直至使用。如上文描 述的那樣運(yùn)行qPCR。將閾值循環(huán)（Ct)相對(duì)于對(duì)數(shù)mcyB拷貝數(shù)繪圖，并從線性回歸的斜率 計(jì)算擴(kuò)增效率（E) (E = 10_1/#w-l，其中數(shù)值1. 00對(duì)應(yīng)于100%的效率）。
[0068] 1. 10.通過(guò)qPCR分析環(huán)境和培養(yǎng)物樣品
[0069] 制備從顯微鏡計(jì)算的培養(yǎng)物樣品制備的模板的一系列10倍稀釋物（η = 4)。目 的是比較qPCR量化和細(xì)胞密度并且評(píng)估擴(kuò)增效率和可能的PCR抑制。除了增加的模板量 (4ng DNA或4μ1熱處理的樣品）外，如上文描述的那樣實(shí)施所有qPCR。在四個(gè)重復(fù)反應(yīng) 中分析培養(yǎng)物樣品，一式三份分析未稀釋的環(huán)境樣品。通過(guò)將lng魚(yú)腥藻90基因組DNA添 加至每個(gè)反應(yīng)，并且在溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)PCR產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物mcyB陰性結(jié)果的 環(huán)境樣品測(cè)試PCR抑制，如上文描述的。
[0070] 結(jié)果
[0071] 2. 1.引物和探針特異性
[0072] 對(duì)30種藍(lán)細(xì)菌菌株的提取DNA和熱處理的細(xì)胞測(cè)試mcyB引物和檢測(cè)探針的特 異性。表1中列出了探針特異性、微囊藻素和由菌株生成的其它毒素。沒(méi)有觀察到假陰 性。除了節(jié)球藻素生成性夏威夷節(jié)球藻（Nodularia harveyana)PCC7804外，沒(méi)有從非微囊 藻素生成性菌株觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。然而，通過(guò)qPCR中的任何檢測(cè)探針沒(méi)有檢測(cè)到節(jié)球藻 (Nodularia)擴(kuò)增產(chǎn)物。如此，所有屬特異性檢測(cè)探針以100%特異性和靈敏性運(yùn)行?？梢?使用三種可能的引物組合中的每種從不依賴于屬的所有微囊藻素生成性菌株擴(kuò)增靶mcyB 序列，但是擴(kuò)增效率在菌株間有所變化（數(shù)據(jù)未顯示）。在三種正向引物一起使用時(shí)，實(shí)現(xiàn) 有效的擴(kuò)增。
[0073] 2. 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率
[0074] 使用從純化PCR產(chǎn)物制備的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定靈敏性和擴(kuò)增效率。對(duì)于所有三種靶標(biāo) 屬，分析靈敏性是每個(gè)反應(yīng)10個(gè)mcyB拷貝和對(duì)數(shù)線性范圍10至10 7個(gè)拷貝的mcyB (圖1)。 對(duì)于魚(yú)腥藻、微囊藻和浮絲藻，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別是93. 8% (r2 = 0· 997)、91· 7% (r2 = 0· 999)和 95. 3% (r2 = 0· 998)。
[0075] 2. 3.樣品制備方法的比較
[0076] 為了比較兩種樣品制備方法，從已知細(xì)胞密度的培養(yǎng)物樣品制備PCR模板。從通 過(guò)過(guò)濾和熱處理制備的模板獲得的擴(kuò)增效率是較高的或者等于相應(yīng)純化的DNA模板的那 些擴(kuò)增效率（分別為89 - 100%，平均值r2 = 0, 9993±0, 0008和83 - 97%，平均值r2 = 0, 9976±0, 0018)。提取DNA的質(zhì)量有所變化，A26(l/A28。比率范圍為1. 7至2. 0。經(jīng)熱處理的 樣品太稀以致不能用分光光度法檢查。樣品的過(guò)濾和熱處理產(chǎn)生相應(yīng)提取DNA的mcyB拷貝 數(shù)的4 - 330倍（圖2)。在NIVA-CYA299( -種阿氏浮絲藻菌株）觀察到最大的差異，其中 過(guò)濾樣品的檢出的拷貝數(shù)僅是細(xì)胞計(jì)數(shù)的1，5倍，但是是相應(yīng)DNA提取樣品的拷貝數(shù)的330 倍。對(duì)于魚(yú)腥藻，DNA的拷貝數(shù)和細(xì)胞裂解物與細(xì)胞計(jì)數(shù)具有相同的量級(jí)。對(duì)于微囊藻，其 適合于細(xì)胞計(jì)數(shù)和來(lái)自提取DNA的拷貝數(shù)，而細(xì)胞的過(guò)濾和熱破壞產(chǎn)生細(xì)胞量大致30倍的 拷貝數(shù)。
[0077] 2. 4.對(duì)環(huán)境樣品的qPCR分析
[0078] 分析總共24份環(huán)境樣品。大多數(shù)Aland島湖樣品（9/13)含有源自僅微囊藻，或 微囊藻以及魚(yú)腥藻或浮絲藻的mcyB基因拷貝（表3)。微囊藻素存在于所有樣品中，其在 qPCR中對(duì)mcyB產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。然而，不能建立總拷貝數(shù)和毒素濃度之間的線性關(guān)系。4份 樣品不含靶標(biāo)屬mcyB拷貝，也沒(méi)有顯示可以已經(jīng)引起假陰性結(jié)果的PCR抑制的證據(jù)。ELISA 結(jié)果對(duì)于所有mcyB陰性Aland島樣品呈陽(yáng)性，而相同樣品的HPLC-DAD結(jié)果均呈陰性，并且 LC-MS-MS分析產(chǎn)生范圍為每g樣品（干重）0至0. 67 μ g微囊藻素的濃度。
[0079] 11份Hauninen水庫(kù)樣品中的5份在mcyB方面呈陽(yáng)性。與顯微鏡檢查一致，群體 以浮絲藻占優(yōu)勢(shì)，并且沒(méi)有檢出潛在毒性的微囊藻或魚(yú)腥藻。自從摻雜樣品獲得的擴(kuò)增產(chǎn) 物的視覺(jué)檢查后沒(méi)有觀察到PCR抑制。發(fā)現(xiàn)浮絲藻mcyB拷貝數(shù)和總微囊藻素濃度之間的明 顯正相關(guān)（圖3)。細(xì)絲量從4月3日起逐漸增加，并且在5月29日達(dá)到峰值，之后觀察到 快速的下降?？偽⒛以逅貪舛群透〗z藻特異性mcyB拷貝數(shù)同時(shí)達(dá)到峰值與觀察到的最高 的浮絲藻群體密度不一致。兩種主要的微囊藻素變體存在于含有毒素的樣品中，即dmMC-RR 和 dmMC-LR。
[0080] 討論
[0081] 3. 1. mcyB qPCR 和遺傳背景
[0082] 適合于檢測(cè)幾種毒性屬的靶物的鑒定是至關(guān)重要的。在本文描述的qPCR測(cè)定法 中，靶序列位于肽基載體蛋白域編碼序列（用來(lái)將生長(zhǎng)的多肽鏈從McyB轉(zhuǎn)移至McyC以進(jìn) 一步延長(zhǎng)的域）中mcyB的第二硫醇化基序內(nèi)（Nishizawa等，1999 ;Tillett等，2000)。據(jù) 我們所知，其用作qPCR檢測(cè)的靶物是第一次。與許多研究中靶定的mcyB第一腺苷酸化域 (例如（Mbedi 等，2005 ;Kurmayer and Kutzenberger, 2003 ;Nonnemann and Zimba, 2002 ; Mikalsen等，2003)不同，第二硫醇化基序不可能受到微囊藻素結(jié)構(gòu)變化影響。因此，不依 賴于毒素譜，幾種潛在毒性的屬的同時(shí)檢測(cè)是有可能的。通過(guò)從節(jié)球藻素生成性夏威夷節(jié) 球藻PCC7804擴(kuò)增與mcyB同源的ndA證明一大批檢測(cè)的潛在肝毒素生產(chǎn)者。mcyB的第二 縮合（condensation)、腺苷酸化和硫醇化基序在ndaA基因中具有其對(duì)應(yīng)物（Moffitt and Neilan，2004)，并且節(jié)球藻中的擴(kuò)增子與魚(yú)腥藻、微囊藻和浮絲藻中的相應(yīng)擴(kuò)增子分別共 享80^^75%和76%序列同一性。然而，由于顯示檢測(cè)探針僅與其意圖的靶物雜交，mcyB qPCR特異性不受ndaA的擴(kuò)增危害。
[0083] 大多數(shù)現(xiàn)有的定量mcyB qPCR測(cè)定法基于幾種探針（若使用TaqMan檢測(cè)化學(xué)） 和弓I物對(duì)（Kurmayer and Kutzenberger, 2003 ；Nonnemann and Zimba, 2002 ；Kaebernick 等，2002)，其具有單一靶標(biāo)屬。憑借設(shè)計(jì)為檢測(cè)同一基因的不同部分的新引物和屬特異性 探針，定量mcyB檢測(cè)擴(kuò)展為還包括魚(yú)腥藻和浮絲藻，并且對(duì)設(shè)計(jì)為檢測(cè)超過(guò)一種微囊藻素 生成性屬的全集測(cè)定法（repertoir assay)進(jìn)行新靶物的添加。雖然通用引物提供關(guān)于 所有毒性物種的豐度的信息（Al-Tebrineh等，2011)，屬特異性檢測(cè)具有群體動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 的添加益處。使用的靈敏性標(biāo)記物技術(shù)（Nurmi等，2002)給測(cè)定法提供良好的靈敏性和較 寬的量化范圍。憑借檢測(cè)限每個(gè)反應(yīng)10個(gè)mcyB拷貝和7個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍，目前的測(cè)定法 非常類似于先前發(fā)表的方法（Al-Tebrineh等，2011 ;Vaitomaa等，2003 ;Foulds等，2002 ; Kurmayer and Kutzenberger, 2003 ;Rinta_Kanto 等，2005 ;Furukawa 等，2006)。
[0084] 3. 2.樣品制備
[0085] qPCR標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的擴(kuò)增效率之間的差異對(duì)量化結(jié)果可以具有實(shí)質(zhì)性影響 (Wilson，1997)。通過(guò)不同方法制備的樣品間也存在相同的誤差來(lái)源，并且需要注意進(jìn)行任 何比較。在此研究中，由觀察到的擴(kuò)增效率的變化引起的樣品類型間的理論拷貝數(shù)差異仍 然在3-5倍的范圍中。這不能解釋檢出的拷貝數(shù)的1-2個(gè)數(shù)量級(jí)的差異（對(duì)于微囊藻和浮 絲藻），顯示了藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的簡(jiǎn)單裂解和基因組DNA的提取和純化產(chǎn)生的每個(gè)細(xì)胞的可用 模板量間存在有實(shí)際的顯著差異。許多原因可以引起此類結(jié)果，可能是DNA提取期間的樣 品材料損失和低效的細(xì)胞裂解。也可能的是，基因拷貝數(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)間的差異在一定程度 上是由顯微鏡量化的誤差引起的，盡管專業(yè)人員實(shí)施的計(jì)數(shù)會(huì)使其變得可能性相當(dāng)小。
[0086] 基于我們的觀察，若假設(shè)每個(gè)細(xì)胞1個(gè)基因拷貝，在熱處理樣品中微囊藻mcyB數(shù) 目會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞濃度的估計(jì)過(guò)高。然而，在相同的假設(shè)下，從純化的基因組DNA量化mcyB會(huì) 導(dǎo)致細(xì)胞濃度的估計(jì)不足，特別是在阿氏浮絲藻的情況下。對(duì)于魚(yú)腥藻和微囊藻，先前已經(jīng) 觀察到導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目估計(jì)過(guò)高的定量PCR結(jié)果（Vaitomaa等，2003)，并且研究支持含有多 個(gè)基因組的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞（Labarre等，1989 ;BeCker等，2002)。若情況如此，則它會(huì)解釋估 計(jì)過(guò)高，但是同時(shí)使估計(jì)不足變得更嚴(yán)重。因此，我們選擇在只要可能時(shí)在環(huán)境樣品的分析 中使用過(guò)濾和熱處理，并且直接比較拷貝數(shù)與毒素濃度，避免成問(wèn)題的基因拷貝轉(zhuǎn)化成細(xì) 胞數(shù)。
[0087] 先前對(duì)于定性分析已經(jīng)報(bào)告了本文進(jìn)行比較的類似結(jié)果，備選的樣品制備方法已 經(jīng)產(chǎn)生與純化的DNA相當(dāng)?shù)哪０澹℉isbergues等，2003 ;0uahid等，2005)。不同樣品制 備方法的定量性能評(píng)估已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA的酚-氯仿提取比DNA提取的商業(yè)試劑盒產(chǎn)生更高 的拷貝數(shù)，以及因此產(chǎn)生較高的細(xì)胞濃度評(píng)估（Schober and Kurmayer, 2006)。Rasmussen 等，2008發(fā)現(xiàn)了在去污劑溶液中的超聲處理和微波處理與由商業(yè)試劑盒進(jìn)行的DNA提取一 樣好地運(yùn)行。我們的觀察結(jié)果與先前發(fā)表的結(jié)果一致，所述先前發(fā)表的結(jié)果指示在不純化 的情況下的細(xì)胞裂解和DNA釋放是mcy基因靶物的檢測(cè)和量化前用于樣品制備的有效方 法。
[0088] 3. 3.環(huán)境樣品
[0089] 通過(guò)在2008年秋季和初夏量化mcyB拷貝數(shù)和總微囊藻素濃度追蹤Hauninen水 庫(kù)中的藍(lán)細(xì)菌群體。雖然在理論上微囊藻素合成酶基因的存在僅揭示毒素生成的潛力，阿 氏浮絲藻mcyB拷貝和毒素濃度之間的正相關(guān)是明顯的。由于兩種其它靶定毒素生產(chǎn)者都 沒(méi)有被檢出，假設(shè)阿氏浮絲藻是水庫(kù)的唯一微囊藻素生產(chǎn)屬。此結(jié)論得到樣品中找到的微 囊藻素變體MC-dmLR和MC-dmRR (其對(duì)于阿氏浮絲藻是典型的）支持（Fastner等，1999)。 細(xì)絲計(jì)數(shù)與mcyB拷貝數(shù)或毒素濃度沒(méi)有明顯聯(lián)系，這指示Hauninen水庫(kù)中的阿氏浮絲藻 群體是毒性和無(wú)毒性菌株的混合物，其相對(duì)比例在監(jiān)測(cè)期期間廣泛變化。已經(jīng)報(bào)告了阿氏 浮絲藻中的無(wú)活性mcy基因型，并且它們似乎相當(dāng)常見(jiàn)（Kurmayer等，2004 ;0stermaier and Kurmayer, 2009)?；谟^察到的毒素濃度和基因拷貝數(shù)，不能推論Hauninen水庫(kù)中的 此類基因型的存在，并且因此假設(shè)忽略不計(jì)。
[0090] 與Hauninen水庫(kù)形成對(duì)比，從Aland島上的不同淡水湖收集的單一樣品沒(méi)有顯 示微囊藻素濃度和mcyB拷貝數(shù)之間的明顯關(guān)聯(lián)，盡管沒(méi)有觀察到假陽(yáng)性定性mcyB結(jié)果 (即檢出基因拷貝，但是樣品中不存在微囊藻素）。環(huán)境因素可以將變化引入mcy基因表達(dá) 樣式和毒素生成中（Kaebernick等，2000 ;Sevilla等，2008)，因此湖環(huán)境的差異最可能促 成此結(jié)果。另一種可能的影響因素是樣品制備?？紤]關(guān)于由不同方法生成的模板的qPCR 性能的結(jié)果，可能的是降低的DNA提取產(chǎn)率將方法依賴性誤差引入量化結(jié)果。
[0091] 4份Aland樣品在用HPLC-DAD和LC-MS-MS方法分析時(shí)一起顯示非常低的微囊藻 素濃度或無(wú)毒素，并且在qPCR中不產(chǎn)生信號(hào)。然而，ELISA測(cè)定法指示這些樣品中不同微 囊藻素量的存在。由于微囊藻素免疫測(cè)定法可以不受樣品基質(zhì)影響（Metcalf等，2000)，采 用的其它兩種方法沒(méi)有指示高毒性濃度，評(píng)估過(guò)高的或假陽(yáng)性的ELISA結(jié)果不能作為可能 性排除。微囊藻素是相對(duì)穩(wěn)定的，并且可以在水中持續(xù)幾周（Lahti等，1997)，如此樣品中 可以存在痕量，即使在不再有生成性生物體后。
[0092] 結(jié)論
[0093] 隨著毒性藍(lán)細(xì)菌團(tuán)出現(xiàn)的健康風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)增長(zhǎng)，監(jiān)測(cè)方法的需要增加。至今為止 與目前的科學(xué)知識(shí)一起提出了關(guān)于藍(lán)細(xì)菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指導(dǎo)和立法。與有效的樣品制備結(jié)合 的檢測(cè)和量化三種主要水華形成屬的所有潛在微囊藻素生成性成員的qPCR方法提供了快 速的預(yù)警監(jiān)測(cè)的手段。響應(yīng)環(huán)境中細(xì)胞密度的重大變化，可以以良好的靈敏性和較寬的量 化范圍檢測(cè)潛在微囊藻素生成性藍(lán)細(xì)菌。雖然與層析數(shù)據(jù)的定性一致性較好，Aland島基 因量化結(jié)果顯示小的分開(kāi)樣品收集點(diǎn)不足以為我們提供一般性的基因拷貝數(shù)準(zhǔn)則。此類準(zhǔn) 則僅在分析較大的樣品數(shù)目后才能建立。Hauninen水庫(kù)阿氏浮絲藻群體展示顯微鏡量化在 毒素濃度評(píng)估中的不可靠性，并且強(qiáng)調(diào)qPCR檢測(cè)的益處。所有結(jié)果共同鼓勵(lì)在微囊藻素生 成性藍(lán)細(xì)菌的環(huán)境監(jiān)測(cè)中使用分子方法。
[0094]
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測(cè)樣品中微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌的存在的方法，其包括下列步驟： a) 對(duì)所述樣品中的細(xì)胞實(shí)施裂解； b) 在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物中使自裂解細(xì)胞獲得的核酸與引物接觸，所述引物與存在 于銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa)、阿氏浮絲藻（Planktothrix agardhii)和魚(yú)渥 藻屬的藻（Anabaena sp.)中的mcyB基因的核酸序列特異性雜交，其中所述引物擴(kuò)增所述 mcyB基因中如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、或SEQ ID N0:3列出的靶序列的至少一部分； c) 用自步驟b)獲得的反應(yīng)混合物實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而使得在所述序列存在于 樣品時(shí)所述mcyB基因的序列得到特異性擴(kuò)增；并 d) 檢測(cè)擴(kuò)增核酸序列的存在，其中擴(kuò)增mcyB基因序列的存在指示所述樣品中存在微 囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌。
2. 依照權(quán)利要求1的方法，其中至少一種所述引物包含一種下述序列： 5' -GCTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3' （SEQ ID N0:4)， 5' -AGATTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3' （SEQ ID N0:5)， 5' -GGTTTAATCAACAAGAGGCTTTATTAGC-3' （SEQ ID N0:6)， 5' -CTGTTGCCTCCTAGTTCAAAAAATGACT-3' （SEQ ID N0:7)。
3. 依照權(quán)利要求1或2的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)。
4. 依照權(quán)利要求3的方法，其中在所述反應(yīng)中使用至少一種下述探針： 5' -ACTGAATTATTGGAGGTAGAGGTGAGTGATAC-3' （SEQ ID N0:8)， 5' -CCTCTACCTCCAATAATTCA-3' （SEQ ID N0:9)， 5' -GGGTGAGTTATTAGAAGCAGAAGTTAGTAACAG-3, （SEQ ID N0:10)， 5' -TTCTGCTTCTAATAACTCACC-3' （SEQ ID N0:11)， 5' -GGGGTGAATTATTAGAAATAGAAGTAAGTGACAA-3, （SEQ ID N0:12)， 5' -TTACTTCTATTTCTAATAATTCACC-3' （SEQ ID N0:13)。
5. 依照權(quán)利要求3或4的方法，其中所述實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是定量PCR反應(yīng)，且所述 方法進(jìn)一步包括測(cè)定所述樣品中所述mcyB基因的基因拷貝數(shù)的步驟。
6. 依照權(quán)利要求5的方法，其進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)所述樣品中毒性微囊藻素濃度的步驟， 其通過(guò)將由定量PCR獲得的所述基因拷貝數(shù)與相應(yīng)的微囊藻素濃度關(guān)聯(lián)進(jìn)行。
7. -種核苷酸引物，其包含如SEQ ID N0:4-7中列出的任一種序列。
8. 依照權(quán)利要求7的引物，其由如SEQ ID N0:4-7中列出的任一種序列組成。
9. 依照權(quán)利要求7的引物，其中所述引物具有28-40個(gè)核苷酸。
10. -種核苷酸探針，其包含如SEQ ID N0:8-13中列出的任一種序列。
11. 依照權(quán)利要求10的探針，其由如SEQ ID N0:8-13中列出的任一種序列組成。
12. 依照權(quán)利要求10的探針，其中所述探針具有小于40個(gè)核苷酸。
13. 選自由SED ID N0:4-13組成的組的核苷酸引物或探針用于檢測(cè)樣品中微囊藻素生 成性毒性藍(lán)細(xì)菌的存在的用途。
14. 依照權(quán)利要求13的用途，其中所述微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌選自下組：銅綠微 囊藻、阿氏浮絲藻和魚(yú)腥藻的藻。
15. 用于檢測(cè)樣品中微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌的存在的試劑盒，其包含依照權(quán)利要 求7-9的至少一種引物。
16. 依照權(quán)利要求15的試劑盒，其進(jìn)一步包含依照權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的探針。
17. 依照權(quán)利要求16的試劑盒，其用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
18. 依照權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì)菌選自下組：銅綠 微囊藻、阿氏浮絲藻和魚(yú)腥藻的藻。
19. 依照權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的試劑盒用于檢測(cè)樣品中微囊藻素生成性毒性藍(lán)細(xì) 菌的存在的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104145025SQ201280066592
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月9日
【發(fā)明者】H·薩維拉, M·維尼亞南 申請(qǐng)人:圖爾庫(kù)大學(xué)